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Kultivierung einer dreidimensional rekonstruierten menschlichen Epidermis im großen Maßstab

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DOI:

10.3791/61802

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28. Mai 2021

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1Adolphe Merkle Institute, University of Fribourg, 2Dow Silicones Belgium SRL, 3Department of Biomedical and Specialist Surgical Sciences, University of Ferrara, 4Department of Animal Sciences, Plants for Human Health Institute, North Carolina State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode, um dreidimensionale rekonstituierte menschliche Epidermis reproduzierbar und robust zu kultivieren. Zusätzlich charakterisiert es die Struktur-Funktions-Beziehung des epidermalen Barrieremodells. Die biologischen Reaktionen der rekonstituierten menschlichen Epidermis auf proinflammatorische Reize werden ebenfalls vorgestellt.

Zusammenfassung

Ein dreidimensionales menschliches Epidermismodell, das aus neonatalen primären Keratinozyten rekonstruiert wurde, wird vorgestellt. Hierin wird ein Protokoll für den Kultivierungsprozess und die Charakterisierung des Modells beschrieben. Neonatale primäre Keratinozyten werden auf durchlässigen Polycarbonateinsätzen eingetaucht gezüchtet und drei Tage nach der Aussaat an die Luft-Flüssig-Grenzfläche gehoben. Nach vierzehn Tagen Stimulation mit definierten Wachstumsfaktoren und Ascorbinsäure in calciumreichem Kulturmedium ist das Modell vollständig differenziert. Die histologische Analyse ergab eine vollständig geschichtete Epidermis, die die Morphologie der einheimischen menschlichen Haut nachahmt. Zur Charakterisierung des Modells und seiner Barrierefunktionen wurden Proteinspiegel und Lokalisation, die spezifisch für die Keratinozytendifferenzierung im Frühstadium (d. h. Keratin 10), die Differenzierung im Spätstadium (d. H. Involucrin, Loricrin und Filaggrin) und die Gewebeadhäsion (d. H. Desmoglein 1) sind, durch Immunfluoreszenz untersucht. Die Integrität der Gewebebarriere wurde durch die Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands weiter bewertet. Reconstructed human epidermis reagierte auf proinflammatorische Reize (d. h. Lipopolysaccharid und Tumornekrosefaktor alpha), was zu einer erhöhten Zytokinfreisetzung führte (d. h. Interleukin 1 alpha und Interleukin 8). Dieses Protokoll stellt eine einfache und reproduzierbare In-vitro-Methode zur Kultivierung rekonstruierter menschlicher Epidermis als Instrument zur Bewertung von Umweltauswirkungen und einer breiten Palette von hautbezogenen Studien dar.

Einleitung

Die Epidermis ist die äußerste Schicht der Haut, an der direkten Schnittstelle zwischen dem menschlichen Körper und der äußeren Umgebung. Seine Hauptfunktionen sind Schutz und Hydratation1. Die Epidermis wirkt als wirksame physikalische Barriere gegen äußere Einflüsse und verhindert übermäßigen Wasserverlust aus dem Körper. Diese Hautfunktionen hängen hauptsächlich von der zellulären Anordnung in den äußersten Hautschichten, der Zusammensetzung und Organisation der interzellulären Lipideab 2. Die Epidermis besteht hauptsächlich aus Keratinozyten, die nach oben zur Außenseite des Gewebes wandern und eine Differenzierung durchlaufen. Es gibt 4-5 epidermale Schichten, die durch ihr Differenzierungsstadium gekennzeichnet sind. Von innen nach außen beginnen die epidermalen Schichten von der lebensfähigen Epidermis, d.h. dem Stratum basale (SB), dem Stratum spinosum (SS) und dem Stratum granulosum (SG), bis zur nicht lebensfähigen obersten Schicht, d.h. dem Stratum corneum (SC)3. Die Basalschicht besteht hauptsächlich aus proliferierenden keratinangereicherten Keratinozyten, die bei Differenzierung durch die SS wandern4. Während der Reifung der Keratinozyten treten verschiedene Veränderungen in der Proteinexpression und -struktur auf. Keratinozyten haften durch die Bildung von desmosomale Verbindungen5. Im SG wird die Erzeugung von Lamellenkörpern eingeleitet. Sie bestehen aus Lipidvorstufen und Enzymen, die für die Bildung der Hautbarrierefunktion entscheidend sind6. Das SG ist auch durch das Vorhandensein von Keratohyalin-Granula im Zytoplasma der Keratinozyten gekennzeichnet. An der Grenzfläche zum SC wird der Gehalt der Lamellenkörper in die Interzellularräume extrudiert und die unpolaren Lipide wie Ceramide, Cholesterin und freie Fettsäuren organisieren sich zu gestapelten lamellaren Lipiddoppelschichten, um die extrazelluläre Lipidmatrix zu bilden7. Im SC verlieren Zellen aufgrund enzymatischer Abbauprozesse alle Zellulären Organellen einschließlich des Kerns und nehmen eine abgeflachte Morphologie an. Sie sind von einer verhornten Hülle aus vernetzten Proteinschichten umgeben und werden als Korneozyten8,9bezeichnet. Desmosomale Komponenten sind mit der verhornten Hülle vernetzt, um Corneodesmosomen zu bilden und die Korneozyten miteinander zu verbinden. Das resultierende Epithel wird kontinuierlich aus Stammzellen erneuert, mit einer Umsatzzeit von ca. 5-6 Wochen10. Der Differenzierungsprozess der Keratinozyten, der zu einer vollständig geschichteten Epidermis führt, ist entscheidend für die Bildung der Barrierefunktion der Haut11.

Während der Verwundung und Entzündung induzieren Keratinozyten Veränderungen in Adhäsionsmolekülen und Oberflächenrezeptoren und lösen proinflammatorische Reaktionen durch sekretion von Zytokinen, Chemokinen und antimikrobiellen Peptidenaus 12. Die Haut ist nicht nur eine physische Barriere gegen exogene Substanzen; Es wirkt auch als Immunsensor bei Exposition gegenüber Krankheitserregern. Darüber hinaus reguliert es die Diffusion mehrerer Substanzen über seine Schichten, wie z.B. den Wassergehalt, um den menschlichen Körper vor Austrocknung zu schützen. Die Haut ist auch an der Synthese von Vitamin D beteiligt und hat verschiedene andere Stoffwechselfunktionen3,13,14.

Um die nachteiligen Auswirkungen exogener Substanzen zu beurteilen, verlassen sich Toxikologen seit Jahrzehnten auf Tierversuche, aber heutzutage ist dies nicht der bevorzugte Ansatz. Neben der begrenzten Vorhersagefähigkeit für die Toxizität beim Menschen beinhalten Tiermodelle zahlreiche ethische Fragen. Das Verbot von Tierversuchen in der Kosmetikindustrie und die Empfehlung, in der Forschung dem 3R-Prinzip (d.h. Replacement, Reduction und Refinement) zu folgen, haben zur Entwicklung alternativer Testmethoden auf der Grundlage von In-vitro-Ansätzen geführt15. Die ersten In-vitro-Hautzellmodelle wurden bereits in den 90er Jahren beschrieben, und eine beeindruckende Entwicklung von einfachen menschlichen Keratinozyten-Monokulturen zu vollständig differenzierten Epidermis- und Volldickenmodellen wurde erreicht16. Heutzutage hat das Skin Tissue Engineering sowohl im pharmazeutischen als auch im dermatokosmetischen Bereich an Bedeutung gewonnen. In den letzten zwei Jahrzehnten haben mehrere Unternehmen dreidimensionale (3D) rekonstruierte menschliche Epidermis (RhE) kommerzialisiert, die standardisierte und reproduzierbare Werkzeuge für hautbezogene Studien darstellen. Mehrere kommerzielle RhE-Modelle sind für die In-vitro-Hautprüfung von Chemikalien nach oecD-Richtlinien zur Prüfung von Hautreizungen17,18 (d.h. Testrichtlinie 43919) und Hautkorrosion20 (d.h. Testrichtlinie 43121)zugelassen. Der In-vitro-Test zur Hautsensibilisierung22 (d.h. SENS-IS-Assay) befindet sich derzeit in der Zulassungsspur und wird von Experten begutachtet23. Es gibt auch zahlreiche andere Assays, die kommerzielle RhE-Modelle verwenden, um die Phototoxizität24zu bewerten, Arzneimittelformulierungen25,kosmetische Formulierungen und Wirkstoffe26zu testen, die Hautbarrierefunktion27 zu untersuchen und die biologische Reaktion auf Umweltstressoren zu testen28,29,30,31.

Neben handelsüblichen 3D-Hautmodellen haben mehrere Forschungsgruppen eigene RhEs32 , 33,34,35,36,37entwickelt. Eigene RhEs bieten den Vorteil, die Kulturbedingungen entsprechend dem Zweck der Studie zu steuern. Insbesondere können Forscher den Typ und die Quelle der Keratinozyten auswählen, die für die Rekonstitution ihres 3D-Epidermismodells verwendet werden sollen (d. H. Primär vs. Immortalisiert, Neugeborene vs. Alter, Einzelne vs. Gepoolte Zufallsspender, Geschlecht, ethnische Zugehörigkeit, individuelle Lebensgewohnheiten wie Rauchen usw.). Sie haben die Möglichkeit, die Zusammensetzung des Kulturmediums zu variieren und Wachstumsfaktoren, Vitamine oder andere Verbindungen zu integrieren, die die Expression von Zielproteinen oder Lipiden modulieren können. Mit dem hauseigenen RhEs können Forscher auch biologische Reaktionen und biomechanische Eigenschaften in Abhängigkeit vom Differenzierungszustand des 3D-Modells untersuchen. Zusätzlich zu diesen intuitiven Parametern gibt es kontinuierliche Bemühungen, die Komplexität von 3D-Hautmodellen zu erhöhen und sie physiologisch relevanter zu machen, zum Beispiel durch Hinzufügen anderer epidermaler Zelltypen (z. B. Melanozyten und Immunzellen)38,39, durch Kultivierung der Keratinozyten auf einer fibroblastenbevölkerten Kollagenmatrix40,41,42und durch Einbeziehung von Komponenten des vaskulären Netzwerks43,44,45.

Obwohl es möglich ist, die Kulturbedingungen auf spezifische Bedürfnisse abzustimmen, gibt es Parameter, die eingehalten werden müssen, um sowohl die Qualität als auch die Relevanz einer RhE zu gewährleisten. Zur Kultivierung von RhE-Geweben werden normale humane epidermale Keratinozyten (NHEKs) in spezifische durchlässige Kultureinsätze eingesät, deren poröse synthetische Membran die Vertiefungen in zwei Kompartimente trennt, d.h. das apikale und das basolaterale Kompartiment. Die Porosität der Membran (d.h. eine Porengröße von 0,4 μm) ist so, dass sie die Bildung einer Zellmonoschicht im apikalen Kompartiment ohne Migration von Zellen zur Basaleinsatzseite und die Fütterung der Keratinozyten mit essentiellen Nährstoffen aus dem im basolateralen Kompartiment enthaltenen Kulturmedium ermöglicht. Zu Beginn des Rekonstitutionsprozesses werden NHEKs für einige Tage unter eingetauchten Bedingungen kultiviert, um ihre Haftung auf der Membran zu ermöglichen. Der Kalziumspiegel in beiden Kompartimenten ist im Vergleich zu der Kalziumkonzentration, die für die 2D-Kultur von NHEKs verwendet wird, erhöht, um die Proliferation von Zellen zu verlangsamen und stattdessen ihre Differenzierung zu fördern46. Ein epidermaler Calciumgradient ist essentiell, um die Barrierebildung und Homöostase zu regulieren47,48. Hohe Calciumgehalte (d.h. bis zu 1,5 mM) fördern die Bildung interzellulärer Verbindungen und modulieren die Bildung der verhornten Hülle während der terminalen Differenzierung49. Sobald Keratinozyten eine kontinuierliche und fest haftende Monoschicht auf der Stützmembran bilden, wird das Medium aus dem apikalen Kompartiment entfernt und der Kulturprozess an der Luft-Flüssig-Grenzfläche (ALI) fortgesetzt, um die Schichtung zu stimulieren und eine epidermale Barriere zu etablieren50,51. Spezifische Kulturbedingungen sind entscheidend, um ein vollständig geschichtetes Epithel zu erhalten36. Während des Rekonstitutionsprozesses bei ALI wird das Medium im basolateralen Kompartiment mit Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF), Insulin, Kalzium und Ascorbinsäure ergänzt. Ascorbinsäure spielt eine wichtige Rolle bei der Bildung einer geeigneten SC-Lipidbarriere, die der der einheimischen menschlichen Haut sehr ähnlichist 52. Keratinozyten, die in ascorbinsäureergänzungsmittelmittel gezüchtet werden, zeigen einen differenzierten Phänotyp mit einer erhöhten Anzahl von Keratohyalingranula sowie organisierte interzelluläre Lipidlamellen in den Zwischentischen der Korneozyten52. Eine solche Supplementierung ist unerlässlich, um die epidermale Barrierefunktion zu verbessern, indem der Gehalt an verhornten Hüllen erhöht und eine Erschöpfung der hydrophilen Antioxidantienspeicher vermieden wird53,54. KGF, ein wichtiger parakriner Mediator der epidermalen Proliferation und Differenzierung, wird verwendet, um die NHEKs55zu stimulieren.

Zu den Hauptnachteilen der internen RhEs gehören der Verlust der Standardisierung zwischen forschungseinrichtungen und eine erhöhte Arbeitsintensität und ein erhöhter Zeitaufwand (bis zu 3 Wochen im Vergleich zu den gebrauchsfertigen kommerziellen Modellen). Ziel des vorliegenden Papiers ist es, diese Nachteile anzugehen und die Grundlage für eine Produktion in größerem Maßstab zu legen. Zusätzlich zu den oben genannten Vorteilen von hauseigenen RhEs zielt das aktuelle Protokoll darauf ab, die Intra- und Intervariabilität zwischen Geweben zu reduzieren, Kontaminationsrisiken zu reduzieren und den Kultivierungsprozess zu rationalisieren.

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und robuste Methode zur Kultivierung von RhEs mit neonatalen NHEKs. Darüber hinaus zeigt es repräsentative Ergebnisse der Charakterisierung der RhEs-Morphologie, Barriereintegrität und Expression von Proteinen, die spezifisch für die epidermale Differenzierung sind. Die morphologische Struktur von RhEs wurde mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbe- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht. Zur Bewertung der Barriereintegrität wurden der transepidermale elektrische Widerstand (TEER) und die Expositionszeit gegenüber Triton X-100 gemessen, um 50% der Gewebelebensfähigkeit (ET50)zu reduzieren. Die Bildung von desmosomale Verbindungen (d.h. Desmoglein 1) wurde mittels Immunfluoreszenz (IF) analysiert, um die Keratinozytenadhäsion zu bewerten. Die Bildung von epidermalen Strukturproteinen (d.h. Involucrin, Loricrin und Filaggrin) wurde mit IF evaluiert und nachgewiesen. Diese Proteine sind an der Bildung der hochvernetzten Proteinhülle beteiligt, die SC-Korneozyten umgibt und sind daher wichtige Marker für die epidermale Differenzierung im Spätstadium56,57. Darüber hinaus wurde IF verwendet, um Keratin 10 zu analysieren, ein Protein, das in differenzierten Zellen im Frühstadium im SS58 induziert und in allen differenzierten Schichten gefunden wurde. Schließlich wurde die Reaktion der RhE auf proinflammatorische Reize (d.h. Lipopolysaccharid und Tumornekrosefaktor alpha) untersucht. Die Spiegel von Interleukin 1 alpha (IL-1α) und Interleukin 8 (IL-8) wurden in den Zellkulturmedien mit Enzym-Linked Immunosorbent Assays (ELISA) gemessen.

Protokoll

Überprüfen und befolgen Sie nationale und internationale ethische Überlegungen und Bedingungen im Zusammenhang mit der Verwendung menschlicher Gewebe oder Zellen, bevor Sie Forschungsaktivitäten im Zusammenhang mit diesem Protokoll planen und durchführen.
HINWEIS: Alle Schritte dieses Protokolls müssen unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden. Biosicherheits-Level-2-Praktiken sind die Mindestanforderung für den Anbau von RhEs. Beim Umgang mit den in diesem Protokoll beschriebenen Chemikalien/Reagenzien sind alle erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen zu treffen.

1. Herstellung von Zellkulturmedien

HINWEIS: Es gibt drei verschiedene Arten von serumfreien Nährmedien, die für die Kultivierung von RhEs verwendet werden (Tabelle 1): (i) das Basalmedium mit niedrigem Kalziumspiegel (60 μM Ca2+),das für die 2D-Kultur von NHEKs verwendet wird; ii) das untergetauchte Medium mit hohem Kalziumgehalt (1,5 mMCa2+),das für die Aussaat von NHEKs in das Zellkultureinsatzsystem verwendet wird; und (iii) das Luft-Flüssig-Grenzflächenmedium (ALI) mit hohem Kalziumspiegel (1,5 mMCa2+),Ascorbinsäure und Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF).

MittelMittlere InformationenBenötigte Menge
Basales MediumKeratinozyten-Wachstumsmedium36 ml/24 Bohrungen
+ 1 % [v/v] HKGS
+ 1 % [v/v] 100x Antibiotikum-Antimykotikum
Untergetauchtes MediumKeratinozyten-Wachstumsmedium36 ml/24 Bohrungen
+ 1 % [v/v] HKGS
+ 1 % [v/v] 100x Antibiotikum-Antimykotikum
+ 1,5 mM Ca2+
Luft-Flüssig-GrenzflächenmediumKeratinozyten-Wachstumsmedium216 ml/24 Bohrungen
+ 1 % [v/v] HKGS
+ 1 % [v/v] 100x Antibiotikum-Antimykotikum
+ 1,5 mM Ca2+
+ 50 μg/ml Ascorbinsäure
+ 10 ng/ml Keratinozyten-Wachstumsfaktor

Tabelle 1. Übersichtstabelle der verschiedenen Kulturmedien, die zur Kultivierung von RhEs verwendet werden. Liste verschiedener Kulturmedien mit Beilagen.

  1. Bereiten Sie das Basalmedium vor.
    1. Ergänzen Sie die Flasche mit 500 ml Keratinozytenwachstumsmedium(Table of Materials)mit 5 ml humanen Keratinozytenwachstumspräparaten (HKGS), um Endkonzentrationen von 0,2% [v/v] Rinder-Hypophysenextrakt (BPE), 0,2 ng/ml humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 0,18 μg/ml Hydrocortison, 5 μg/ml Rindertransferrin und 0,01 μg/ml rekombinantem humaninsulinähnlichem Wachstumsfaktor-I (IGF-I) zu erreichen.
    2. Fügen Sie 5 ml 100x antibiotisch-antimykotische Lösung hinzu, die 10.000 Einheiten / ml Penicillin, 10.000 μg / ml Streptomycin und 25 μg / ml Amphotericin B enthält.
  2. Bereiten Sie das untergetauchte Medium vor.
    1. Ergänzen Sie die Flasche mit 500 ml Keratinozytenwachstumsmedium (Materialtabelle) mit 5 ml HKGS, um Endkonzentrationen von 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/ml humanem rekombinantem EGF, 0,18 μg/ml Hydrocortison, 5 μg/ml Rindertransferrin und 0,01 μg/ml humanem rekombinantem IGF-I zu erreichen.
    2. Fügen Sie 5 ml 100x antibiotische antimykotische Lösung hinzu.
    3. 5 ml einer 0,144 MCaCl2 (Calciumchlorid) Stammlösung werden zu einer Endkonzentration von 1,5 mMCa2+ hinzugefügt.
      HINWEIS: Die Kalziumkonzentration ist bereits während der Unterwasserphase erhöht, um die Differenzierung der Keratinozyten zu stimulieren und den Schichtungsprozess einzuleiten49.
  3. Bereiten Sie das ALI-Medium (Air-Liquid Interface) vor.
    1. Ergänzen Sie eine Flasche mit 500 ml Keratinozytenwachstumsmedium(Materialtabelle)mit 5 ml HKGS, um Endkonzentrationen von 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/ml humanem rekombinantem EGF, 0,18 μg/ml Hydrocortison, 5 μg/ml Rindertransferrin und 0,01 μg/ml humanem rekombinantem IGF-I zu erreichen.
    2. Fügen Sie 5 ml 100x antibiotische antimykotische Lösung hinzu.
    3. 5 ml einer 0,144 M CaCl2-Stammlösung werdenhinzugefügt, um eine Endkonzentration von 1,5 mMCa2+zu erreichen.
    4. Fügen Sie 1 ml einer 25 mg/ml Ascorbinsäure-Stammlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 50 μg/ml Ascorbinsäure zu erreichen.
    5. 50 μL eines 100 μg/ml KGF in 1% [w/v] Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) werden hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 10 ng/ml KGF zu erreichen.
      HINWEIS: Da Ascorbinsäure oxidationsempfindlich ist, wird empfohlen, ein stabiles Ascorbinsäurederivat wie Magnesium-L-Ascorbyl-2-phosphat59 oder L-Ascorbinsäure 2-Phosphat Sesquimagnesium60zu verwenden. Wenn Ascorbinsäure verwendet wird, wird empfohlen, das ALI-Medium vor jeder Auffrischung frisch mit Ascorbinsäure zu ergänzen.

2. Kultur der NHEKs

HINWEIS: Da primäre humane Keratinozyten an ihrer vierten oder fünften Passage61proliferativ bleiben, werden NHEKs in ihrer dritten Passage für die Kultivierung von RhEs verwendet. Primäre Keratinozyten sollten aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit sehr vorsichtig behandelt werden. Sorgfältiges und langsames Pipettieren von Zellsuspensionen zu jeder Zeit ist sehr wichtig, um den Zustand der Zellen nicht zu stören.

  1. Auftauen einer Durchstechflasche mit 1 x10 6 kryokonservierten NHEKs in einem Wasserbad bei 37 °C, indem Sie einen Teil der Durchstechflasche in das Wasser tauchen. Inkubieren Sie die Durchstechflasche für 1-2 Minuten im Wasserbad, bis nur noch ein kleiner Streifen Eis sichtbar ist.
    ACHTUNG: Tauchen Sie nicht die gesamte Durchstechflasche in das Wasserbad, um Verunreinigungen zu vermeiden. Tauen Sie die Zellen nicht länger als 2 Minuten auf; Dies kann die Lebensfähigkeit der Zelle verringern. Wischen Sie die Durchstechflasche mit einer 70% igen Ethanollösung ab, bevor Sie das Röhrchen in die laminare Haube geben.
  2. Resuspendieren Sie die Zellen sehr vorsichtig, indem Sie 2-3 mal auf und ab pipettieren. Die Zellsuspension wird in zwei T75-Kolben mit insgesamt 15 ml vorgewärmtes Auftaumedium überführen, was zu einer Aussaatdichte von 6,7 x 104 Zellen/cm2führt.
    HINWEIS: Für die ersten beiden Passagen und das Auftauen von kryokonservierten NHEKs wird gemäß den Empfehlungen des Lieferanten Zellkulturmedium verwendet.
  3. Legen Sie die Kolben in den Zellkulturinkubator (37 °C, 5% CO2und 95% relative Luftfeuchtigkeit (RH)).
  4. Ersetzen Sie nach etwa 24 Stunden das Auftaumedium durch das Basalmedium, um Dimethylsulfoxid (DMSO) aus der Keratinozyten-Gefrierlösung zu entfernen.
  5. Erfrischen Sie das Basalmedium alle zwei Tage.
  6. Nach 4-6 Tagen Kultivierung sollten die Zellen zu etwa 80% konfluent und bereit für die Aussaat in Einsätzen für die Kultivierung von RhEs sein.
    HINWEIS: Keratinozyten sollten auf maximal 80% Konfluenz gezüchtet werden, um ihre Proliferativkapazität zu erhalten62. Die Anzahl der aufzutauenden Zellen muss mehrere Parameter berücksichtigen, wie die Zelldurchgangszahl, die Zelllebensfähigkeit beim Auftauen, die Aussaateffizienz sowie die Verdopplungszeit.

3. Aussaat von NHEKs

HINWEIS: Dieses Protokoll ist für die Verwendung in einem 24-Well-Trägerplattenformat konzipiert. Werden andere Plattenformate benötigt (z.B. 12-Well- oder 6-Well-Format), sollten Optimierungen in der Aussaatdichte und im mittleren Volumen in Betracht gezogen werden. Abbildung 1 fasst einen vorgeschlagenen Zeitplan für den RhE-Anbau zusammen und zeigt die Anbaubedingungen.

Prozessdiagramm der Keratinozytendifferenzierung, Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenmethode, Wachstum der menschlichen Epidermis.
Abbildung 1: Schematischer Zeitplan des Rekonstitutionsprotokolls. Darstellung der RhE-Modellvorbereitung, des Kultivierungsprozesses und der Anwendung (Exposition gegenüber chemischer Substanz). Das Schema enthält die entsprechenden Zellkulturmedientypen für jeden Schritt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. 24-Well-Platten mit 1,5 ml Tauchmedium vorfüllen, idealerweise mit einer Dispenserpipette.
  2. Entfernen Sie das Basalmedium aus den T75-Kolben, die für die Kultur der NHEKs verwendet werden.
  3. Spülen Sie die Zellen aus, indem Sie 5 ml vorgewärmtes PBS in jeden T75-Kolben geben.
  4. Entfernen Sie PBS aus den Kolben.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, da das Medium Proteine und Kalzium enthält, die die Trypsinaktivität hemmen.
  5. Jedem T75-Kolben werden 2-3 ml vorgewärmte 0,05% [v/v]-Trypsin/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugefügigt. Stellen Sie sicher, dass die Trypsinlösung gleichmäßig auf dem Zellkulturbereich des Kolbens verteilt ist.
    ACHTUNG: Das Volumen von 2 ml basiert auf dem oben genannten 80%igen Zusammenfluss. Verwenden Sie 3 ml für Flaschen mit einem höheren Zusammenfluss.
  6. Die Kolben für 4 Minuten in den Zellkulturinkubator stellen (37 °C, 5% CO2und 95% RH). Überprüfen Sie, ob sich die Zellen mit dem Mikroskop bei einer 10-fachen Vergrößerung lösen. Rappen Sie den Kolben gegen die Handfläche, um den Zellen zu helfen, sich von der Oberfläche des Kolbens zu lösen. Abgelöste Zellen können als abgerundete Zellen beobachtet werden, die in der Trypsinlösung schwimmen.
    ACHTUNG: Inkubieren Sie die Zellen in Trypsin nicht länger als 6 Minuten. Eine überte trypsinisierung kann die Zellen schädigen und ihre Adhärenz verringern63.
  7. Sobald alle Zellen abgelöst sind, fügen Sie jedem T75-Kolben ein gleiches Volumen (d. H. 2-3 ml) vorgewärmter Trypsin-Inhibitor hinzu.
  8. Die Zellsuspension aus den Kolben in ein Zentrifugenrohr überführen.
  9. Spülen Sie die Kolben mit 5 ml vorgewärmtes PBS ab und geben Sie es in das Zentrifugenröhrchen, das die Zellsuspension enthält.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die meisten Zellen gesammelt werden, indem Sie die Anzahl der Restzellen in den Kolben unter dem Mikroskop überprüfen. Die Oberfläche des Kolbens sollte zu 95% leer sein. Ist dies nicht der Fall, ist es möglich, den Trypsinisierungsschritt (3.3-3.9) zu wiederholen. Beachten Sie jedoch, dass eine erneute Trypsinisierung vermieden werden sollte.
  10. Zentrifugieren Sie die geernteten Zellen bei 400 x g für 5 min.
  11. Entsorgen Sie vorsichtig den größten Teil des Überstands und lassen Sie etwa 100-200 μL in der Röhrchen.
    ACHTUNG: Saugen Sie das Pellet während dieses Verfahrens nichtan. 
  12. Kehren Sie das Pellet der Zellen in einem geringen Volumen des untergetauchten Mediums vorsichtig wieder auf und ab, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu gewährleisten. Beginnen Sie mit einem geringen Volumen (d. h. 500 μL), um die Bildung von Zellaggregaten zu vermeiden, und addieren Sie insgesamt bis zu 1 ml untergetauchtes Medium pro T75-Ausgangskolben.
    HINWEIS: Streichen Sie die Röhre vorsichtig mit den Fingern, um einen Teil des Zellpellets vorsichtig im Überstand aufzulösen.
  13. Zählen Sie die Zellen in der Suspension mit der Trypanblau-Ausschlussmethode.
    1. Verdünnen Sie 0,4% [v/v] trypanblauen Fleck und die Zellsuspension im Verhältnis 1:1, indem Sie 10 μL von 0,4% [v/v] trypanblauen Fleck zu 10 μL Zellsuspension hinzufügen. 10 μL der Lösung zu einem Zählschieber geben. Messen Sie die Zellzahl unmittelbar nach dem Mischen der Zellsuspension mit Trypanblau, da Trypanblau nach einer Exposition von mehr als 1 minute65die Zelllebensfähigkeit verringert.
      ACHTUNG: Trypanblau erwies sich als potentiell mutagen, karzinogen und Teratogen64. Behandeln Sie den Farbstoff mit Sorgfalt und entsorgen Sie den Abfall sicher gemäß den örtlichen Laborvorschriften.
      HINWEIS: Ein alternativer Ansatz zur Verwendung von Trypanblau ist der ungefährliche Farbstoff Erythrosin B66.
  14. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit zusätzlichem eingetauchtem Medium, um eine Konzentration von 3,525 x 105 Zellen/ml in untergetauchtem Medium zu erreichen, indem Sie das VolumenV2 wie in Gleichung 1 gezeigt hinzufügen:
    Gleichung zur Veranschaulichung des statischen Gleichgewichts, V2=C1*(V1/C2)-V1, Schlüssel zur Schaltungsanalyse.
    C1 = gezählte Zellkonzentration in der Zellsuspension erhalten in 3,12 (Zellen/ml)
    V1 = Volumen zur Resuspendierung des Zellpellets in 3,12 (ml)
    C2 = gezielte Zellkonzentration in der Suspension (d.h. 3,525 x 105 Zellen/ml)
    V2 = Volumen, das hinzugefügt werden muss, um die angestrebte Zellkonzentration (ml) zu erreichen
    HINWEIS: Die Oberfläche des empfohlenen Kultureinsatzes beträgt 0,47 cm2; daher beträgt die entsprechende Aussaatdichte 3,75 x 105 Zellen/cm2.
  15. Eine zweite Zellzahl(C3)der in Schritt 3.14 erhaltenen verdünnten Lösung wird durchgeführt. Verwenden Sie Gleichung 2, um das Zellsuspensionsvolumen(V4)zu berechnen, das in den Kultureinsatz eingesät werden soll:
    Spannungsumwandlungsgleichung, V4=C3*(V3/C4), Formel für elektrische Schaltungen.
    C3 = gezielte Zellkonzentration in der Suspension (d.h. 3,525 x 105 Zellen/ml)
    V3 = Zielvolumen der Zellsuspension, die im Kultureinsatz ausgesät werden soll (d.h. 0,5 mL)
    C4 = gezählte Zellkonzentration in der verdünnten Suspension, erhalten in 3,14 (Zellen/ml)
    V4 = tatsächliches Volumen der zellsuspension zu säenden Zellsuspension (ml)
  16. Hängen Sie die 24 Zellkultureinsätze in die höchste Position der empfohlenen Trägerplatte und übertragen Sie die Trägerplatte auf die mit Tauchmedium vorgefüllte 24-Well-Platte (vgl. 3.1).
    ACHTUNG: Achten Sie beim Übertragen der Trägerplatte auf die Multi-Well-Platte darauf, dass keine Luftblasen zwischen der Insertmembran und dem untergetauchten Medium aus dem Basalkompartiment eingeschlossen werden, da dies die Fütterung der Zellen beeinträchtigt und letztendlich die RhE-Lebensfähigkeit und -Morphologie beeinträchtigt.
  17. Fügen Sie das ermittelte Volumen V4 (aus Gleichung 2) der Zellsuspension zu jedem Einsatz hinzu.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die umgekehrte Pipettiertechnik zu verwenden, um die Zellsuspension genau auf die Kultureinsätze zu verteilen.
    ACHTUNG: Achten Sie darauf, die Membran nicht zu beschädigen, wenn Sie die Zellsuspension in den Kultureinsatz geben. Eine Vorsichtsmaßnahme besteht darin, die Zellsuspension entlang der Wand des Einlegesystems zu dosieren, ohne die Oberfläche der Membran zu berühren.
  18. Nach der Aussaat die 24-Well-Platten für 10-15 min bei Raumtemperatur inkubieren, um einen Kanteneffekt (d.h. ungleichmäßige Temperaturverteilung zwischen allen Vertiefungen67)zu überwinden. Bewegen Sie die Platten während dieser Zeit nicht.
  19. Die Platten werden in den Zellkulturinkubator (37 °C, 5% CO2und 95% RH) überführen. Die Zellen werden drei Tage lang untergetauchten Bedingungen gehalten.
    HINWEIS: Um Gewebevariabilität zu vermeiden, stapeln Sie die Platten nach der Aussaat nicht im Inkubator, um sicherzustellen, dass jeder Einsatz die gleiche Wärmemenge erhält. Nach drei Tagen (d.h. während der ALI-Kultivierung) ist das Stapeln von Platten möglich.

4. Kultivierung an der Luft-Flüssig-Grenzfläche

  1. Nach einer dreitägigen Inkubation im Zellkulturinkubator (37 °C, 5% CO2und 95% RH) setzen Sie die Zellen, die an der Membranoberfläche hafteten, dem ALI aus, indem Sie das untergetauchte Medium aus dem apikalen Kompartiment entfernen, vorzugsweise mit einem Aspirationssystem und einer Pasteur-Pipette aus Glas.
    HINWEIS: Alternativ kann das eingetauchte Medium aus dem apikalen Fach mit einer manuellen Mikropipette entfernt werden.
  2. Füllen Sie neue 24-Well-Platten mit 1,5 mL frischem vorgewärmten ALI-Medium und übertragen Sie die Trägerplatten mit den Kultureinsätzen auf die neuen Multi-Well-Platten.
  3. Die Multi-Well-Platten werden zurück in den Zellkulturinkubator (37 °C, 5 % CO2und 95 % relative Luftfeuchtigkeit) übertragen.
  4. Aktualisieren Sie das ALI Medium alle 2-3 Tage für 14 Tage.
  5. Führen Sie die Auffrischung in zwei Schritten durch: 1) Bereiten Sie eine neue Platte mit 1,5 ml / Well frischem vorgewärmtem ALI-Medium vor und 2) übertragen Sie die Trägerplatte auf die neue Platte.
    ACHTUNG: Während des gesamten Rekonstitutionsverfahrens ist es am besten, den Deckel, der die Trägerplatte bedeckt, nicht zu entfernen, um die RhEs vor möglichen Verunreinigungen zu schützen.
    HINWEIS: Der ALI-Schritt ist entscheidend für die Entwicklung eines geschichteten epidermalen Modells, da er eine terminale Differenzierung der Keratinozyten ermöglicht68. Nach dem Gang zu ALI ist eine visuelle Kontrolle der Einsätze erforderlich, um zu überprüfen, ob es "undichte Gewebe" gibt: mittlere Tröpfchen auf der Gewebeoberfläche, die aus dem basolateralen Kompartiment kommen. Wenn die Leckage an ALI Tag 3 auftritt, entfernen Sie das Medium vorsichtig aus dem Kultureinsatz, ohne die Oberfläche des Gewebes zu berühren. Bleibt die Leckage bestehen, empfiehlt es sich, austretendes Gewebe zu entsorgen, da dies ein Hinweis darauf ist, dass im RhE-Modell keine korrekte Barrierebildung vorliegt.
  6. Am Ende des Rekonstitutionsprozesses können die Gewebe verschiedenen Stressoren ausgesetzt werden, um beispielsweise oxidativen Stress oder Entzündungen auszulösen. Parallel dazu können sie mit chemischen Verbindungen oder kosmetischen Inhaltsstoffen behandelt werden. HINWEIS: Während der Exposition/Behandlung werden Gewebe in der Regel ab ALI D14 in untergetauchtem Medium gehalten. Wenn erwartet wird, dass Gewebe über einen längeren Zeitraum (d. h. 48-72 Stunden) exponiert/behandelt werden, wird empfohlen, (i) die Exposition/Behandlung früher im ALI-Kultivierungsprozess zu beginnen, z. B. D7-D9, um die Ausdünnung der lebensfähigen Schichten und die Verdickung des SC zu vermeiden, und (ii) die Gewebe in ALI-Medium zu inkubieren, um die Zellproliferation weiter zu stimulieren.
  7. Für die RhE-Ernte sammeln Sie das Gewebe und das Zellkulturmedium zum Zeitpunkt des Interesses für histologische Analysen, Lebensfähigkeitstests, Protein/RNA-Extraktion und enzymgebundene Immunsorbent-Assays (ELISAs).

Ergebnisse

In 2D kultivierte NHEKs zeigen eine traditionelle Morphologie mit einer konsistenten polygonalen Form (Abbildung 2A). Wie oben beschrieben, werden NHEKs nach Erreichen einer Konfluenz von etwa 80% in Kultureinsätze eingesät. Die Morphologie der RhEs wurde mittels H&E-Färbung und TEM analysiert. Nach 15 Tagen bei ALI erhält man ein vollständig geschichtetes Gewebe, wie es durch seine vier epidermalen Hauptschichten angezeigt wird: sb, SS, SG und SC (Abbildung 2B). In der SB-Schicht haben die Zellen eine spaltenförmige Form. Von der zweiten Schicht bis zu den oberen Schichten der RhE differenzieren sich NHEKs wie durch die Veränderungen in der Zellmorphologie beobachtet (von einer säulenförmigen Form in der SB-Schicht hin zu einer stacheligen Form in der SS-Schicht). In der SG-Schicht haben die Zellen eine abgeflachtere Form und zeigen Keratohyalin-Granula (KG), die als violette Punkte im Zytoplasma dargestellt werden. Ihre charakteristische runde und stellare Form wird durch weiße Pfeile auf dem H&E-Bild hervorgehoben (Abbildung 2C). Die Zellen im SC sind endständig differenziert und vollständig abgeflacht und haben keinen Zellkern. Die geschichteten RhEs haben eine Gesamtdicke von 84,3 ± 2,4 μm und ihr SC hat eine Dicke von 19,6 ± 3,2 μm (Abbildung 2D). Diese Werte sind vergleichbar mit denen, die für einheimische menschliche Haut angegeben wurden, d.h. 60-120 μm und 10-20 μm bzw.69. Die Anzahl der lebensfähigen Schichten beträgt 6-7, was im Vergleich zu der einheimischen menschlichen Haut niedriger ist und etwa 7-1470 beträgt. Die ultrastrukturelle Analyse von RhEs zu verschiedenen Zeitpunkten im Rekonstitutionsprotokoll (d.h. 7, 10, 13 und 15 Tage) zeigt den Verhornungsprozess der RhEs mit einer erhöhten Anzahl von Korneozytenschichten im Laufe der Zeit (Abbildung 2E). Nach 15 Tagen am ALI besteht der SC des RhE-Gewebes aus etwa 15-25 Schichten, was mit dem für die native menschliche Haut (d.h. 15-20 Schichten) berichteten Wert vergleichbar ist69.

Histologie der Hautschichten und des Zellwachstums; Enthält Mikroskopiebilder und ein Balkendiagramm für die Dickenanalyse.
Abbildung 2: Primäre Keratinozyten und rekonstruierte menschliche Epidermis. (A) Phasenkontrastmikroskopische Aufnahme von primären Keratinozyten vor der Aussaat auf Inserts. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. (B-C) H & E-Hellfeldmikroskopiebild von RhE. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm (B) und 25 μm (C). (D) Quantifizierung der Dicke von RhE und SC (mittlere ± SEM, n=3). (E) Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von RhE-Querschnitten nach 7, 10, 13 und 15 Tagen bei ALI. Der Maßstabsbalken beträgt 4 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Entsprechend ihrer Differenzierungsstufe zeigen NHEKs, die in 3D wachsen, je nach Differenzierungsstadium unterschiedliche Proteinexpressionsprofile. Die Expression von Proteinen, die für die Keratinozytendifferenzierung im Frühstadium (d. h. Keratin 10), die Keratinozytendifferenzierung im Spätstadium (d. h. Involucrin, Loricrin und Filaggrin) und die Keratinozytenadhäsion (d. h. Desmoglein 1) in RhEs spezifisch sind, wurde mittels IF-Färbung bestimmt. Die Involucrinexpression erscheint stärker in der SG-Schicht, da ihre Expression früher während des Differenzierungsprozesses eingeleitet wird (Abbildung 3D), während Filaggrin und Loricrin in den oberen Schichten exprimiert werden (Abbildung 3B-C). Keratin 10-Expression wurde in allen lebensfähigen Schichten gefunden, mit Ausnahme der SB-Schicht (Abbildung 3E). RhEs zeigen funktionelle desmosomale Verbindungen, wie durch die Expression von Desmoglein 1 im Interzellularraum der lebensfähigen epidermalen Schichten angezeigt (Abbildung 3F). Abschließend werden alle fünf Marker exprimiert und in den entsprechenden epidermalen Schichten lokalisiert und in einen gesunden epidermalen Differenzierungsprozess übersetzt.

Histologie und Immunfluoreszenzmikroskopie epidermaler Hautschichten; H&E und Proteinmarker.
Abbildung 3: Epidermale Differenzierung, Gewebeadhäsion und Gewebeintegrität der rekonstruierten menschlichen Epidermis. (A) H&E-Hellfeldmikroskopiebild von RhE. Konfokale Fluoreszenzmikroskopieaufnahmen von (B) Filaggrin (FLG), (C) Loricrin (LOR), (D) Involucrin (INV), (E) Keratin 10 (K10) und (F) Desmoglein 1 (DSG-1) dargestellt in Magenta. Die Kernfärbung (DAPI) ist blau dargestellt. Der Maßstabsbalken beträgt 25 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Barriereeigenschaften des RhE-Modells wurden untersucht, indem sowohl die Lebensfähigkeit als auch die Integrität des Gewebes bewertet wurden. Die Gewebeintegrität wurde nach 15 Tagen durch Messung des TEER mit einem Voltohmmeter bestimmt. Die für die RhEs erfassten Werte von 2567 ± 415 Ω,cm2 übersetzen die Bildung einer kontinuierlichen Barriere (Abbildung 4A). Diese Werte liegen im Bereich der RhE-Modelle71,72,73,74. Zusätzlich wurde die erforderliche Expositionszeit für eine zytotoxische Referenzchemikalie (d. h. Triton X-100) zur Verringerung der Gewebelebensfähigkeit um 50% (ET50)mit einem Thiazolylblautetrazoliumbromid (MTT) -Assay bestimmt. Der für die RhE gemessene ET50-Wert betrug 2,1 Stunden. Dieser Wert liegt im Akzeptanzbereich anderer epidermaler 3D-Modelle, die für eine zuverlässige Vorhersage der Reizklassifizierung qualifiziert sind (OECD-Leitlinie 439)19.

Boxplot und Liniendiagramm, die die Beständigkeit und Lebensfähigkeit des Gewebes im Vergleich zur Expositionszeit zeigen; ET50=2,1h.
Abbildung 4: Barriereeigenschaften der rekonstruierten menschlichen Epidermis. (A) Gewebeintegrität gemessen mit transepithelialem elektrischem Widerstand (mittlere ± SEM, n=6). (B) ET50 bestimmt durch Messung der Lebensfähigkeit des Gewebes (d. h. MTT-Assay) bei topischer Exposition bei 78,3 μL von 1% Triton X-100 (mittlere ± REM, n=3).

Die Reaktionsfähigkeit von RhEs wurde auf bekannte proinflammatorische Reize untersucht. RhEs wurden systemisch behandelt, d.h. Die Zugabe von Reizen im Medium des basolateralen Kompartiments wurde mit 100 μg/ml Escherichia coli Lipopolysaccharid (LPS) und 40 ng/ml Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) behandelt. Nach 24 Stunden Reize wurde das Zellkulturmedium gesammelt. Die Zytotoxizität wurde mit einem Laktatdehydrogenase (LDH)-Assay gemessen und mit Werten eines bekannten Membrandisruptors, dem Triton X-100-Reinigungsmittel, verglichen(Abbildung 5). Ein signifikanter Anstieg (p < 0,05, Einweg-ANOVA, Dunnetts Mehrfachvergleichstest) wurde bei der LDH-Aktivität in RhEs gezeigt, die mit Triton X-100 behandelt wurden. LPS- und TNF-α-Behandlungen zeigten beide nicht zytotoxisch.

Balkendiagramm der LDH-Aktivität; TX-100, LPS, TNF-α Vergleich; Ergebnisse von Enzymassays; statistische Analyse.
Abbildung 5: Die zytotoxizität gemessen mittels Lactate Dehydrogenase (LDH) Assay. Die Daten werden als relative Werte für die Kontrolle unbehandelter Gewebe dargestellt (STRG); Mittelwert ± SEM, n=9 (Triton X-100), n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). Die Signifikanz wurde mit Einweg-ANOVA, Dunnetts Mehrfachvergleichstest, getestet. Sternchen kennzeichnet statistisch signifikanten Unterschied zu STRG, ****p < 0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Freisetzung von Interleukin 1 alpha (IL-1α) und Interleukin 8 (IL-8) im RhE-Medium wurde mit ELISAs quantifiziert. Abbildung 6 zeigt sowohl die quantifizierte als auch die relative IL-1α- und IL-8-Freisetzung durch die RhEs bei Herausforderung mit LPS und TNF-α. Die LPS-Behandlung führte zu einer statistisch signifikanten (p < 0,05, ungepaarter Student's T-Test) induzierten Freisetzung von IL-8 (9,6 ± 1,0-facher Anstieg) und IL-1α (2,7 ± 1,3-facher Anstieg). TNF-α induzierte keine signifikante IL-8-Freisetzung, obwohl eine Tendenz zu erhöhten IL-8-Spiegeln beobachtet wurde (2,3 ± 0,8-facher Anstieg). TNF-α löste jedoch signifikant (p < 0,05, ungepaarter Student's T-Test) die IL-1α-Freisetzung aus (1,8 ± 0,5-facher Anstieg).

Vergleich des Balkendiagramms der IL-8- und IL-1α-Expressionsniveaus; LPS, TNF-α Wirkungen; statistische Analyse.
Abbildung 6: Proinflammatorische Reaktionen in der rekonstruierten menschlichen Epidermis. Konzentrationen von IL-8-Freisetzung durch die RhE bei einer 24-Stunden-Herausforderung mit LPS (A) und TNF-α (B). Die Daten werden als Mittelwert dargestellt ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (C) Die Daten werden als Mittelwert des relativen Wertes im Vergleich zu Kontrollgeweben, unbehandelten Geweben (STRG) ± REM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α) dargestellt. Die Konzentration der IL-1α-Freisetzung der RhE bei einer 24-Stunden-Herausforderung mit LPS (D) und TNF-α (E). Die Daten werden als Mittelwert dargestellt ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (F) Die Daten werden als Mittelwert des relativen Wertes im Vergleich zu STRG ± SEM, n=4 (LPS), n=3 (TNF-α) dargestellt. Die Signifikanz wurde durch einen ungepaarten T-Test eines Schülers getestet. Sternchen kennzeichnet statistisch signifikante Unterschiede zu STRG, *p < 0,05, ****p < 0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

RhEs sind weit verbreitet als Screening-Werkzeuge in den pharmazeutischen und dermato-kosmetischen Bereichen36,75,76,77,78. Obwohl mehrere Unternehmen solche RhEs kommerziell verfügbar gemacht haben, bleiben sie kostspielig und schränken die Möglichkeit ein, Anbauparameter nach Bedarf zu variieren, um neue Forschungsfragen zu beantworten. Dieses Papier beschreibt den Herstellungsprozess von hauseigenen RhEs auf robuste und zuverlässige Weise und bietet eine detaillierte Charakterisierung der erhaltenen Gewebe, um die Relevanz des Modells als alternativen Ansatz für Tierversuche zu bestätigen.

Einige der Schritte im Protokoll sind entscheidend, um eine ordnungsgemäße Keratinozytendifferenzierung und RhE-Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Dies kann durch die Verwendung der optimalen Zellen, Mediumstypen und Kultivierungsbedingungen durchgeführt werden. Im vorgeschlagenen RhE-Modell wurden neonatale NHEKs aufgrund ihrer fehlenden antigenen Exposition im Vergleich zu erwachsenen NHEKs ausgewählt. Darüber hinaus waren Keratinozyten auf die kaukasische Ethnizität beschränkt, um Variabilität zwischen den Arten zu vermeiden. Primäre Keratinozyten werden typischerweise wegen ihrer Fähigkeit zur Differenzierung und Stratifizierung verwendet79. Sie können kommerziell oder durch interne Isolierung von der Haut eines Erwachsenen gewonnen werden80. Die Kultivierung einer Zelllinie (d.h. HaCaT) auf einer Polycarbonatmembran hat gezeigt, dass die Differenzierung fehlschlägt und eine beeinträchtigte Fähigkeit zur Synthese von Lipiden gezeigt wurde, die für die Barrierebildung notwendig sind.81. Die Einbeziehung verschiedener Kulturmatrizen wie Hydrogele, Kollagen-, Fibrin- und Sphärogusskulturen führte jedoch zur erfolgreichen Entwicklung von 3D-Hautmodellen.78,82,83,84,85,86. Die immortalisierten Zelllinien, N/TERT, haben sich als geeignet für die Entwicklung von RhEs erwiesen35. Primäre Keratinozyten bleiben bei ihrer vierten oder fünften Passage proliferativ61Daher beinhaltet das aktuelle Protokoll die Verwendung von Keratinozyten in ihrer dritten Passage. De Vuyst et al. haben gezeigt, dass die Zellaussaatdichte von Bedeutung ist und ausreichend sein muss (d.h. ≥ 2,5x105 Zellen/cm2), um sicherzustellen, dass das Medium aus dem basolateralen Kompartiment nicht in das apikale Kompartiment diffundiert. Eine unzureichende Aussaatdichte (z. B. < 2.5x105 Zellen/cm2) kann zu einer Unfähigkeit führen, eine geeignete Barriere zu bilden, was durch die Diffusion des Mediums vom basolateralen zum apikalen Kompartiment angezeigt wird, was zu untergetauchten anstelle von ALI-Kulturbedingungen führt.62. Serumfreies Keratinozyten-Wachstumsmedium (siehe Materialtabelle) wurde aus Gründen der Reproduzierbarkeit bevorzugt, da es den Vorteil bietet, mit einem chemisch definierten Medium zu arbeiten und das Risiko einer Kontamination zu verringern. Dieses Medium hat eine geringere Kalziumkonzentration (d.h. 60 μM) und stimuliert daher die Proliferation von Keratinozyten87. Die Erhöhung der Kalziumkonzentration (d.h. 1,5 mM) ab dem ersten Schritt der RhE-Kultivierung begünstigt die Keratinozytendifferenzierung und die Bildung von Hautbarrieren und die Homöostase49. Darüber hinaus wird das ALI-Medium mit Ascorbinsäure ergänzt, die sich als entscheidend für die Bildung von SC-Lipiden und zur Förderung der Differenzierung erwiesen hat.52,53,54. Das ALI-Medium enthält auch KGF, einen Wachstumsfaktor, der von Fibroblasten abgesondert wird, der an Keratinozyten-Transmembranrezeptoren binden kann und bei Aktivierung eine doppelte Rolle bei der Differenzierung und Wundreparatur spielt55,88. Es ist wichtig, das ALI-Medium in bestimmten Zeitintervallen aufzufrischen, um die RhEs konstant mit frischen Nährstoffen zu versorgen. Der Einsatz eines Trägerplattensystems ist entscheidend für den RhE-Anbau in größerem Maßstab (d.h. 24 Einsätze/Platte). Es bietet den Vorteil, Zeit zu sparen, das Risiko einer Kontamination zu reduzieren und weniger Raum für die Einführung menschlicher Fehler zu lassen. Es bietet auch die Möglichkeit, RhEs in einem hohen Medienvolumen (d. H. 1,5 ml) zu kulturieren, was die erforderliche Anzahl von ALI-Medium-Refreshes reduziert. Darüber hinaus bietet es die Möglichkeit, eine volle Platte von Einsätzen auf eine Platte mit frischem Medium zu übertragen, den Kontakt mit den Einsätzen einzeln zu vermeiden oder den Plattendeckel freizulegen.

Es gibt mehrere Einschränkungen des RhE-Modells, die beachtet werden sollten. In der nativen menschlichen Haut besteht ein Gleichgewicht zwischen der Proliferation von Keratinozyten in der Basalschicht und der Ablösung von Korneozyten im SC (d.h. Abschuppung).89. In vitro findet jedoch keine Abschämierung statt. Daher bleiben die Korneozyten an der RhE gebunden und bilden ein dickes SC, das physiologisch weniger relevant ist. Daher gibt es eine begrenzte Anbauzeitspanne von RhEs. Darüber hinaus ist dieses RhE-Modell einfach und unkompliziert, da es aus einem einzigen Zelltyp besteht, nämlich dem Keratinozyten, dem am häufigsten vorkommenden Zelltyp der Epidermis. Es gibt jedoch andere Zelltypen, die in der Epidermis ansässig sind, wie Melanozyten, dendritische Zellen (dh Langerhans-Zellen), T-Zellen (z. B. CD8).+ B. Zellen) und Merkelzellen13. Um die physiologische Relevanz des Hautmodells zu erhöhen, haben Forscher Hautmodelle durch Zugabe von Melanozyten komplexer gemacht38 , Immunzellen39oder vom Patienten abgeleitete Zellen90. Man sollte bedenken, dass die Barriereeigenschaften menschlicher Hautmodelle im Vergleich zur nativen menschlichen Haut unterschiedlich sind, insbesondere aufgrund einer anderen SC-Lipidzusammensetzung und einer höheren Barrierepermeabilität. 91,92,93,94,95. Mehrere Studien haben jedoch über Veränderungen der Barriereeigenschaften menschlicher Hautmodelle durch die Kultivierung unter Hypoxie berichtet.96 oder verminderte relative Luftfeuchtigkeit97, die Modulation der dermalen Matrix mit Chitosan98und Veränderung der freien Fettsäuren im Kulturmedium99. Darüber hinaus können sowohl in einfachen als auch in komplexeren RhEs die Kulturbedingungen und die Medienzusammensetzung moduliert werden, um pathologische Merkmale nachzuahmen. Durch die Herausforderung des Modells mit Zytokinen wird eine abnormale Morphologie100 und Es können Veränderungen der Gen- und Proteinexpressionsniveaus festgestellt werden, die typischerweise bei häufigen Hauterkrankungen wie atopischer Dermatitis und Psoriasis beobachtet werden35,101,102,103,104,105. Das Stummschalten spezifischer Gene in Keratinozyten vor beginnt der Rekonstitution des 3D-Modells ist ein weiterer Ansatz, um Merkmale von Hauterkrankungen nachzuahmen und neue therapeutische Lösungen zu untersuchen106,107. Neben der Modellierung nur einer epidermalen Schicht kann ein hautliches Kompartiment in das Modell einbezogen werden (d. h. benannte menschliche Hautäquivalente oder Modelle mit voller Dicke), indem Fibroblasten vor der RhE-Rekonstitution in eine Kollagenmatrix eingebettet werden, wodurch es physiologisch relevanter und für Alterungs- und Wundheilungsstudien geeignet ist108,109,110. Darüber hinaus wurden Tumorsphäroide zu menschlichen Hautäquivalenten hinzugefügt, um die Progression des Melanoms zu untersuchen111,112. Die neuesten Fortschritte auf dem Gebiet der Hautmodelle sind Bio-Printing und Skin-on-a-Chip. Mehreren Forschungsgruppen ist es in jüngster Zeit gelungen, (perfusierbare) biobedruckte Hautäquivalente zu entwickeln.45,113,114. Das vorgeschlagene Protokoll nutzt ein 24-Well-Format und eine Trägerplatte, wodurch eine individuelle Handhabung der Einsätze vermieden wird. Der Studienumfang ist jedoch noch recht begrenzt und es fehlt an Automatisierung. Durch die Implementierung von Bio-Printing oder Skin-on-a-Chip können kleinere Hautmodelle mit automatisierteren Prozessen und in größerem Maßstab verwendet werden.

Die in diesem Protokoll beschriebene RhE weist mehrere Ähnlichkeiten mit den bereits entwickelten und gut charakterisierten kommerziellen epidermalen Modellen auf. Die morphologische Analyse hat gezeigt, dass die Anzahl der lebensfähigen Schichten im vorgeschlagenen RhE-Modell zwar im Vergleich zu der einheimischer menschlicher Haut geringer ist (d. h. 6-7 im Vergleich zu 7-14), aber vergleichbar mit der des EpiDerm RhE-Modells (d. h. 8-12)70. Ähnlich wie die Modelle EpiDerm, EpiSkin und SkinEthic zeigt die obere RhE-Schicht ein Korbgewebemuster aus dicht gepackten Korneozytenschichten28. Darüber hinaus ergab die TEM-Analyse, dass die Anzahl der SC-Schichten im vorgeschlagenen RhE-Modell (d. h. 15-25) mit der von EpiDerm (d. h. 16-25)70vergleichbar ist. Insgesamt weist das vorgeschlagene RhE-Modell eine ähnliche Struktur wie andere kommerzialisierte epidermale Modelle auf und ahmt die native menschliche Epidermis nach. Die mit TEER gemessene Gewebeintegrität liegt im Bereich kommerzieller RhE-Modelle (d.h. zwischen 3000-5600 Ω,cm2)71,72,73 und anderen hauseigenen RhEs (d.h. ca. 5000 Ω,cm2)74,115. Das vorgeschlagene RhE-Modell erweist sich als gut differenziert, wie das Vorhandensein und die korrekte Lokalisierung von Differenzierungs- und Gewebeadhäsionsmarkern zeigt. Darüber hinaus zeigt das vorgeschlagene RhE-Modell, dass es auf proinflammatorische Reize (d.h. LPS und TNF-α) anspricht.

Abschließend zeigt das aktuelle Protokoll, wie RhEs zuverlässig und in relativ großem Maßstab hergestellt werden können, um die Bedürfnisse von Forschern sowohl in akademischen als auch in privaten Institutionen zu erfüllen. Das vorgeschlagene RhE-Modell zeigt eine ähnliche Morphologie, epidermale Differenzierung und biologische Reaktionsfähigkeit wie andere bestehende kommerzielle Modelle. Es bietet ein alternatives Werkzeug sowohl für den pharmazeutischen als auch für den dermatokosmetischen Bereich, wenn der Zugang zu einem relevanten Hautmodell erforderlich ist.

Offenlegungen

Marc Eeman und Benedetta Petracca sind Mitarbeiter von Dow Silicones Belgien. Alle anderen Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen des Marie-Skłodowska-Curie-Stipendiums mit der Finanzhilfevereinbarung Nr. 765602 diese Arbeit finanziert. Alle Autoren erkennen die Unterstützung der Adolphe Merkle Foundation und der Universität Ferrara an und danken Dow Silicones Belgium. Dr. Miguel Spuch-Calvar ist für die Erstellung der grafischen Bilder des RhE-Kultivierungsprozesses anerkannt. Die Autoren danken Dr. Barbara Drasler, Dr. Franco Cervellati und Dr. Agnès Tessier für ihre technische Unterstützung und Diskussionen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EssigsäureSigma AldrichA6283Eosin-Lösung mit 1 mL Essigsäure pro 100 mL ansäuern.
Antibiotikum-Antimykotikum (100x)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15240062
Wässrige Eosin Y-LösungSigma AldrichHT110280Eosin-Lösung mit 1 mL Essigsäure pro 100 mL ansäuern.
Calciumchlorid (CaCl2)Sigma Aldrich oder MerckC8106 oder 1.02378.0500Stammlösung von 0,144 M herstellen, filtrieren, sterilisieren und Aliquote bei -20 °C lagern. Es wird empfohlen, alle 6 Monate neue Aliquots zu erstellen.
DAPIRoche10236276001Bereiten Sie einen Vorrat zu 100 μ g/mL und lagern Sie die Aliquoten bei -20 °C. Der Arbeitszustand beträgt 1 μμ; g/ml.
Entellan EindeckmittelMerck1.07960.0500Eindeckmittel für H& E Färbung.
EpiLife-Medium (als Keratinozyten-Wachstumsmedium bezeichnet)Thermo Fisher Scientific (Gibco)MEPI500CAEnthält 0,06 mM Ca2+.
Ethanol absolutJeder LieferantN/A
Formalin 10%Leica Biosystems3800770
Humane Keratinozyten Wachstumsergänzung (HKGS) (100x)Thermo Fisher Scientific (Gibco)S0015Um Endkonzentrationen von 0,2 % [v/v] BPE, 0,2 ng/ml humaner rekombinanter EGF, 0,18 μ g/mL Hydrocortison,5 μ g/ml Rindertransferrin und 0,01 &μ; g/ml humaner rekombinanter insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I.
IsopropanolBiosolve B.V.0016264102BS
Kaiser's Glyceringelatine, phenolfreiMerck1.08635.0100Eindeckmedium für ZF-Färbungen.
Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF)R& D Systems251-KG-050Rekonstituiert KGF-Protein bei 100 μμ; g/mL in sterilen 0,1 % [w/v] BSA in PBS. Aliquots zubereiten und bei -20°C lagern.
Lactatdehydrogenase (LDH) Assay-KitRoche4744926001
L-Ascorbinsäure-2-phosphat-SesquimagnesiumsalzhydratSigma-AldrichA8960Bereiten Sie eine Stammlösung von 25 mg/ml vor, filtrieren Sie sie, sterilisieren Sie sie und lagern Sie die Aliquots bei -20 °C. Es wird empfohlen, alle 6 Monate neue Aliquots zu erstellen. Im Dunkeln lagern.
Lipopolysaccharid (LPS), E.coli Stamm O55:B5Sigma-AldrichL4524Bereiten Sie einen Vorrat von 1 mg/ml in sterilem PBS vor und lagern Sie die Aliquote bei -20 μC. Die Arbeitskonzentration beträgt 100 μm; g/ml. 
Mayer' s HämatoxylinSigma-AldrichMHS80
Normale humane epidermale Keratinozyten (NHEKs)Lonza00192906Humane primäre Keratinozyten, die aus der Vorhaut von Neugeborenen isoliert und von mindestens drei Spendern gepoolt wurden.
Phosphatgepufferte KochsalzlösungThermo Fisher Scientific (Gibco)10010056 oder 10010-015Referenznummern können von Land zu Land variieren.
Rekombinanter Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α)ImmunoTools11344483Bereiten Sie einen Vorrat von 100 μm vor. g/mL in sterilem Reinstwasser. Die Arbeitskonzentration beträgt 40 ng/ml
Steriles ReinstwasserJeder LieferantN/A
Thiazolylblau, Tetrazoliumbromid (MTT)Sigma-AldrichM5655Bereiten Sie einen Vorrat von 5 mg/ml MTT in sterilem PBS vor. Die Arbeitskonzentration beträgt 1 mg/ml.
Triton X-100Sigma-Aldrich93426
Trypanblau (0,4 % [v/v])Alle LieferantenN/A
Trypsin-InhibitorThermo Fisher Scientific (Gibco)R007100
Trypsin/EDTA (0,05 % [v/v])Thermo Fisher Scientific (Gibco)25300054
Tween 20Sigma-AldrichP1379
XylolSigma-Aldrich214736
Ziege Anti-Maus IgG H& L (Alexa Fluor 488)AbcamAb150113
Trinatriumcitrat-DihydratMerck1.06448.0500Für Antigen-Retrieval-Puffer für die ZF-Färbung.
Ziege Anti-Kaninchen IgG H& L (Dylight 488)AgriseraAS09 633
Filaggrin Maus AntikörperBioTechne (Novus Biologicals)NBP2-53243
Involucrin Kaninchen AntikörperBioTechne (Novus Biologicals)NBP2-33742
Keratin 10 Maus AntikörperBioTechne (Novus Biologicals)NBP2-32962
Desmoglein-1 Maus Antikörper BioTechne (Novus Biologicals)MAB944
Loricrin Kaninchen AntikörperBioTechne (Novus Biologicals)NBP1-33610
Eine

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