Dieses Protokoll beschreibt Anwendungen der Probenimmobilisierung mit Fibrin-Gerinnseln, die Begrenzung des Driftens und das Hinzufügen und Auswaschen von Reagenzien während der Live-Bildgebung. Die Proben werden auf einen Tropfen Fibrinogen übertragen, der das Kulturmedium auf der Oberfläche eines Deckslips enthält, nach dem die Polymerisation durch Zugabe von Thrombin induziert wird.
Drosophila ist ein wichtiges Modellsystem, um eine Breite von biologischen Fragen zu studieren. Verschiedene Organe und Gewebe aus verschiedenen Entwicklungsstadien der Fliege wie imaginäre Scheiben, das Larvenhirn oder Eikammern von erwachsenen Weibchen oder der adulte Darm können extrahiert und in Kultur zur Bildgebung mit Zeitraffermikroskopie gehalten werden, was wertvolle Einblicke in die Zell- und Entwicklungsbiologie bietet. Hier beschreiben wir detailliert unser aktuelles Protokoll zur Zerlegung von Drosophila Larvenhirnen und stellen dann unseren aktuellen Ansatz zur Immobilisierung und Orientierung von Larvenhirnen und anderen Geweben auf einem Glasdeckel mit Fibrin-Gerinnseln vor. Diese Immobilisierungsmethode erfordert nur die Zugabe von Fibrinogen und Thrombin zum Kulturmedium. Es eignet sich für hochauflösende Zeitraffer-Bildgebung an invertierten Mikroskopen mehrerer Proben in derselben Kulturschale, minimiert das seitliche Driften, das häufig durch Bewegungen der Mikroskopstufe in der Multipoint-Besuchsmikroskopie verursacht wird, und ermöglicht das Hinzufügen und Entfernen von Reagenzien während der Bildgebung. Wir präsentieren auch maßgeschneiderte Makros, die wir routinemäßig verwenden, um sie beim Driften zu korrigieren und spezifische quantitative Informationen aus der Zeitrafferanalyse zu extrahieren und zu verarbeiten.
Drosophila ist nach wie vor ein wichtiges Modellsystem, um eine Vielzahl biologischer Fragen zu untersuchen und hat sich seit Jahrzehnten in der Weiterentwicklung von Wissen in vielen Disziplinen hervorgetan. Ein Merkmal, das es besonders auszeichnet, ist, dass es besonders gut für Live-Bildgebung geeignet ist. Die Fähigkeit, subzelluläre Prozesse oder das Verhalten von Zellen und Geweben in Echtzeit zu überwachen, trägt weiterhin zur Generierung von Schlüsselkonzepten bei, die für die Zell- und Entwicklungsbiologie relevant sind. Viele erfolgreiche Protokolle wurden von verschiedenen Gruppen entwickelt, um solche Drosophila-Proben lebendig und gesund zu halten, um das Verhalten der Probe und der fluoreszierenden Moleküle zu studieren. Organe und Gewebe aus der Fliege wie imaginäre Scheiben1,2, das Larvenhirn3,4,5,6, oder Eikammern von erwachsenen Weibchen7,8,9, oder der adulte Darm10 zum Beispiel kann extrahiert und in Kultur für die Bildgebung mit Zeitraffermikroskopie gehalten werden. Eine zentrale Herausforderung für die Live-Bildgebung besteht darin, sicherzustellen, dass die Probe für eine optimale Auflösung und unbeweglich in der Nähe der Bildfläche gehalten wird, ohne die Probenintegrität zu beeinträchtigen, die empfindlich auf mechanische Stöße reagieren kann. Um neuronale Stammzellen, sogenannte Neuroblasten oder Neuronen im Drosophila Larvenhirn, zu untersuchen, kann beispielsweise die Aufbewahrung von Proben in der Nähe der bildgebenden Oberfläche erreicht werden, indem man sie mit Kulturmedien in versiegelten Bildkammern11,12,13bedeckt. Dieser Ansatz lässt den Medienaustausch jedoch nicht so einfach zu und schränkt so den versuchsfreudigen Handlungsspielraum ein. Alternativ können Proben vorbereitet und auf Abdeckungen platziert werden, die behandelt werden, um die Haftung von Zellen zu erhöhen und Multi-Point-Besuchsmikroskopie und erweiterte Live-Zell-Bildgebung in offenen Kulturgerichten zu ermöglichen, die potenziell einen Medienaustausch ermöglichen, aber keine einfachen Mittel bieten, um Probendrift oder Verlust während des Medienaustauschs zu verhindern14,15.
Die Fibrin-Gerinnselmethode, die ursprünglich entwickelt wurde, um Meiose in lebenden Kranich-Fliegen-Spermatozyten16 zu untersuchen, ist speziell geeignet, um diese Probleme zu überwinden. Fibrinogen wird in einem relevanten Kulturmedium gelöst, die Proben, die in einem Tropfen dieser Lösung auf einer geeigneten Glas-Oberflächen-Bildkammer platziert und ausgerichtet sind, bevor Thrombin hinzugefügt wird, was zur schnellen Bildung eines unlöslichen Fibrin-Gerinnsels führt, eines klebrigen faserigen Netzes, das an der Glasoberfläche und den Proben haftet und gleichzeitig den Zugang der Probe zum Kulturmedium gewährleistet. Das Medium kann dann ausgetauscht werden, ohne die Gerinnsel- oder Probenposition zu stören. Der Austausch von Kulturmedien während der Bildgebung ist beispielsweise wünschenswert, wenn Inhibitoren wie bei der ursprünglichen Methode oder zum Auswaschen oder Pulsjagdexperimenten zugesetzt werden sollen oder wenn fluoreszierende Farbstoffe während der Livezellbildgebung zugesetzt werden sollen, während Zellen und Gewebe an Ort und Stelle gehalten werden. Fibrin-Gerinnsel eignen sich zur Abbildung von Drosophila-Geweben sowie einzelnen Zellen13,17. Fibrin-Gerinnsel können weiter verwendet werden, um Proben zu orientieren, die aufgrund ihrer Form oder anderer Eigenschaften normalerweise nicht in der gewünschten Weise durch Modulation der Probenposition innerhalb des Fibrin-Gerinnsels und der Form des Gerinnsels selbst ausgerichtet würden.
Hier stellen wir ein Update zu unseren aktuellen Fibrin Gerinnsel-basierten Bildgebungsmethoden zur Verfügung und stellen Werkzeuge für die segmentierungsbasierte Bildanalyse zur Verfügung und konzentrieren uns auf den Einsatz dieser Methode zur Untersuchung von Neuroblastenteilungen im sich entwickelnden Fliegenhirn. Wir verwenden routinemäßig die Fibrin Gerinnsel-Methode, um mehrere Proben in verschiedenen Gerinnseln in der gleichen Kulturschale zu folgen. Dies ermöglicht i) Die Bildgebung subzellulärer Ereignisse wie Zentromomverhalten oder mRNA-Lokalisierung live18,19, ii) Überwachung des Verhaltens von Proben bei der pharmakologischen Behandlung verschiedener Genotypen unter den gleichen bildgebenden Einstellungen mit Multipunkt-Besuchsmikroskopie20, iii) Untersuchung der Auswirkungen der akuten Hemmung der Enzyme21 und iv) Minimierung von Driften zur Untersuchung von Veränderungen in der Ausrichtung der Zellteilung von Zellen in ihrer physiologischen Umgebung auf gezielte Laser-Abl2. Während unerwünschte Wirkungen von Thrombin und Fibrinogen und dem Fibrin-Gerinnsel empirisch für jede Probe getestet werden müssen, Diese Methode ist grundsätzlich geeignet, jede Art von Probe zu immobilisieren, die durch Live-Zell-Bildgebung analysiert werden soll und in Drosophila wurde erfolgreich verwendet, um mehrere Aspekte der Neuroblasten Biologie5,19,20, sondern auch die Dynamik der zytosensorischen Projektionen der weiblichen Keimbahn Stammzellen23 und Veränderungen der Polarität bei akuter aPKC Hemmung der Follikelzellen von Drosophila weiblichen Eikammern21zu studieren.
Zeitrafferfluoreszenz-Bildgebung führt zur Generierung komplexer zeitaufgelöster 3D-Datensätze, die Methoden zum Extrahieren dieser quantitativen Informationen erfordern. Hier beschreiben wir unsere Weiterentwicklung von ImageJ-basierten24 Makros, die verwendet werden können, um das Driften in Hyperstacks und maßgeschneiderten ImageJ-Makros zu korrigieren, die eine halbautomatische Quantifizierung der Mehrkanalfluoreszenz am Zellkortex ermöglichen, die zur Quantifizierung kortikaler Proteine in Neuroblasten von Drosophila-Larval-Gehirnen oder von individuellen Strahlneuronen in der primären Zellkultur entwickelt wurde.
Live-Bildgebung der gesamten Mount D. melanogaster Larvengehirne bietet die Möglichkeit, asymmetrische neuronale Stammzellteilungen in Bedingungen in der Nähe eines physiologischen Kontextes zu beobachten. Der erste Teil unseres Protokolls stellt unseren Ansatz zur Zerlegung von Larvenhirnen vor. Wie bereits erwähnt13, ist ein kritischer Aspekt der Vorbereitung zu vermeiden, das Gehirn zu beschädigen. Die schwierigste Aspekt dieser ist es, das Gehirn von den benachbarten imaginären Scheiben zu trennen, ohne übermäßig auf das Gehirn zu ziehen. Unser Ansatz zum “Schneiden ohne Ziehen” besteht darin, entweder eine Schleifbewegung mit den Spitzen eines Zangenpaares durchzuführen oder eine Zangenspitzen entlang zweier anderer Zangenspitzen zu schieben, die die Verbindung zwischen Geweben halten (Abbildung 1A), während Lerit et al. sägeartige Bewegungen mit einem Trennstift beschreiben. Wir raten dem Experimentator, alle Ansätze auszuprobieren und die am besten geeigneten für sich zu übernehmen. Wir empfehlen auch, BSA- oder FCS-beschichtete Pipettenspitzen anstelle von Sezierwerkzeugen zu verwenden, um isolierte Gehirne zu übertragen. Die Beschichtung verhindert, dass Gewebe am Kunststoff kleben und ermöglicht den sicheren Transfer von Geweben, während sie immer vollständig eingetaucht werden, ohne sie einer möglichen vorübergehenden Verformung zu unterwerfen, da sie während des Transfers am Sezierwerkzeug kleben. Beschichtete Spitzen haben andere Vorteile, um die Übertragung mehrerer Gehirne auf einmal zu ermöglichen, was besonders nützlich ist, wenn es wichtig ist, die Aufenthaltszeit der Proben innerhalb eines bestimmten Mediums zu kontrollieren; sie eignen sich für den Transfer anderer Gewebe, auch zerbrechlicher Gewebe wie z. B. Fettkörper; Sie können eine breite Palette von verschiedenen Probengrößen aufnehmen, indem sie größere Spitzen verwenden oder die Extremität der Spitze schneiden.
Als nächstes beschreibt dieses Protokoll die Verwendung von Fibrinogen-Gerinnung, um Larvengehirne auf dem Deckblatt einer Kulturschale zu immobilisieren. Ein Gehirn ist innerhalb eines Tropfens von Kulturmedium + Fibrinogen ausgerichtet, nach dem die Gerinnung durch die Zugabe von Thrombin induziert wird. Die Fibrin-Bildung erfolgt schrittweise und bietet ein Zeitfenster, in dem die Ausrichtung der Probe gegebenenfalls verfeinert werden kann(Abbildung 2C). Wenn eine leichte Kompression der Probe erforderlich ist – wovon wir bei Larvenhirnen raten -, kann sie auch fein eingestellt werden, indem das Gerinnsel in den Schritten 3.4.4 und 3.5.2 mehr oder weniger nahe an der Probe gedrückt wird. Der Hauptvorteil dieser Fibrinogen-Gerinnung gegenüber dem in Lerit et al. beschriebenen Protokoll, in dem Gehirne zwischen einer gasdurchlässigen Membran und einem Abdeckrutsch montiert sind, ist die Fähigkeit, das Kulturmedium während der Live-Bildgebung zu ersetzen. Ein möglicher Vorteil der Verwendung einer gasdurchlässigen Membran gegenüber unserem Protokoll könnte sein, dass sie eine optimale Sauerstoffversorgung der Proben bietet, die mit unserem Ansatz eingeschränkter sein könnte, da Gehirne durch das Gerinnsel und ein Medium von der Luft getrennt werden. Aus diesem Grund, obwohl wir nicht die Wirkung der Menge der Kulturmedium innerhalb der Kultur Gericht bewertet, schlagen wir vor, die Menge der Kultur Medium auf den Gerinnseln zu begrenzen, während die Gerinnsel vollständig eingetaucht.
Da die Manipulation der Gerinnsel experimentell schwierig und zeitaufwändig sein kann, empfehlen wir dem Experimentator, zunächst Gerinnsel ohne Proben zu manipulieren. Die Modulation des Volumens des Tropfens kulturmittel + Fibrinogen auf dem Deckel, die Konzentration von Fibrinogen oder das Volumen und die Konzentration von Thrombin könnte dazu beitragen, die Vorbereitung zu erleichtern und könnte wichtig sein, wenn das Protokoll an andere Arten von Geweben angepasst werden. Mit genügend Erfahrung bei der Manipulation der Gerinnsel können bei Bedarf mehrere Gehirne in einem Gerinnsel immobilisiert werden, obwohl dies die Feinabstimmung der Ausrichtung erschwert. Auf dem Deckblatt können mehrere Gerinnsel gebildet werden, so dass z.B. Proben verschiedener Genotypen abbilden können. Es ist auch möglich, verschiedene Gerinnsel auf dem gleichen Coverslip verschiedenen Kulturmedien auszusetzen, obwohl darauf geachtet werden muss, niemals die Tropfen des Kulturmediums zu mischen, das die verschiedenen Gerinnsel bedeckt. Sobald Larvengehirne immobilisiert sind und bereit für Live-Bildgebung, empfehlen wir, die Empfehlungen von Lerit et al.13 zu folgen, um übermäßige Photoschäden zu vermeiden. Wir fügen diesen Empfehlungen nur hinzu, um das Gehirn nicht nur bei 25 °C während der Live-Bildgebung mit einem Bühneninkubator zu halten, sondern auch, um dieses Stadium mindestens 30 min vor Beginn der Bildgebung vorzuheizen. Wenn wir dies nicht systematisch tun, führt dies zu einer starken Fokusdrift.
Es kann in einigen Kontexten vorteilhaft sein, korrelierte Mikroskopie durchzuführen und eine Probe nach Live-Bildgebung zu fixieren und zu immunstainieren. Eine Einschränkung der Verwendung von Fibrin-Gerinnseln ist jedoch, dass es fast unmöglich ist, ein Gehirn mechanisch von einem Gerinnsel zu isolieren, ohne es zu beschädigen. Ein möglicher Weg, diese Einschränkung zu überwinden, könnte darin bestehen, Methoden zu entwickeln, um Fibrin-Gerinnsel mit Plasmin zu abbauen oder die Gerinnseldemontage durch Zugabe eines Peptids zu induzieren, das die Knöpfe imitiert, was die Fibrin-Polymerisationermöglicht 28. Wir verwenden in der Regel Fibrin-Gerinnsel auf Proben von Einzelzellen bis zu 200 M langen Geweben, aber wir könnten auch erfolgreich in Gerinnseln und Bildgehirnen von erwachsenen Hummeln über 3 mm Breit immobilisieren. Die Obergrenze des Stichprobenumfangs, der in Gerinnsel immobilisiert werden kann, muss noch ermittelt werden. In ähnlicher Weise, obwohl wir in der Regel immobilisierte Proben für 4 bis 5 h abbilden, haben wir neuroblasten in der Primärkultur für bis zu 3 Tage erfolgreich ababgebildet, was darauf hindeutet, dass das Gerinnsel zumindest die längerfristige Lebensfähigkeit nicht beeinträchtigt. Im Gegenteil, Gerinnsel können den regelmäßigen Austausch des Mediums erleichtern, eine Voraussetzung für eine längerfristige Bildgebung, ohne dass geräte wie peristaltische Pumpen für diesen Zweck benötigt werden. Während wir die Permeabilitätsparameter von Fibringer nicht gemessen haben, scheint die faserige gelartige Natur der Gerinnsel durch zelldurchlässige Moleküle durchdrungen zu sein. Wir fanden heraus, dass Latrunculin A, Colcemid oder 1-NAPP1, HALO-Tag Liganden und andere Standardfarbstoffe, die in der Zellbiologie verwendet werden, die Zellen im Fibringer problemlos erreichen und bisher keine Moleküle gefunden haben, die durch das Gerinnsel zurückgehalten würden, was jedoch eine Möglichkeit ist, die empirisch getestet werden muss.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verwendung von Fibrin-Gerinnseln eine zuverlässige und relativ einfache Implementierung einer Möglichkeit bietet, lebende Gewebe für die Live-Bildgebung zu immobilisieren. Über seine Nützlichkeit bei der Begrenzung des seitlichen Driftens hinaus hat sich die Fähigkeit, das Kulturmedium während der Live-Bildgebung zu verändern, als von unschätzbarem Wert für unseren ansatzbereiten Ansatz der chemischen Genetik erwiesen, die asymmetrische Zellteilung von D. melanogaster Neuroblasten zu untersuchen21. Wir gehen davon aus, dass diese Technik für Studien in einer Vielzahl unterschiedlicher Gewebe von Vorteil sein wird, insbesondere wenn sie chemische Genetik oder beispielsweise die Protein-Selbstkennzeichnung29beinhalten.
Unser MultiHyperStackReg-Makro basiert auf dem TurboReg ImageJ-Plugin, das aufeinander folgende Frames oder Slices eines Stacks ausrichtet, und dem MultiStackReg ImageJ-Plugin, das es ermöglicht, die Transformationen auf andere Stacks anzuwenden. MultiHyperStackReg ermöglicht es einfach, diese Transformationen auf Hyperstacks anzuwenden (Stapel mit mindestens vier Dimensionen). Da die Verwendung von MultiHyperStackReg, wie wir es beschreiben, viele Aktionen erfordert und ziemlich zeitaufwändig werden kann, haben wir auch das AutoHyperStackReg-Makro geschrieben, das automatisch alle in den Schritten 6.2 und 6.3 beschriebenen Schritte ausführt. Im Gegensatz zu MultiHyperStackReg fehlt AutoHyperStackReg derzeit jedoch die Möglichkeit, die Ausrichtung eines Stacks basierend auf einer Subregion dieses Stacks zu berechnen, eine Option, die wir gefunden haben, ist manchmal entscheidend für eine befriedigende Ausrichtung. Eine weitere Einschränkung von AutoHyperStackReg besteht darin, dass seine Verwendung auf Übersetzungen beschränkt ist und nicht auf die anderen Transformationen, die von TurboReg und MultiStackReg vorgeschlagen werden, während MultiHyperStackReg auf einen Hyperstack jeden Transformationstyp anwenden kann, wenn der Benutzer ihn benötigt. Zukünftige Versionen werden diese Funktionen implementieren und auf GitHub30verfügbar sein. Schließlich bietet unser rotierendes Linecan-Makro eine einfache Möglichkeit, kortikale Signale im Zeitraffer schnell zu messen, auch wenn der Kortex seine Position oder Ausrichtung im Laufe der Zeit ändert. Ob der Tracking-Modus oder der Nicht-Tracking-Modus für die Analyse am besten geeignet ist, hängt von der Qualität und Konsistenz des kortikalen Signals ab. Der Tracking-Modus ist einfacher zu verwenden, da der Benutzer nicht berücksichtigen muss, wo sich der Kortex für jeden Zeitpunkt befindet und große Positions- und Orientierungsänderungen im Laufe der Zeit aufnehmen kann. Es ist jedoch nur dann geeignet, wenn das kortikale Signal während des gesamten Films stark genug bleibt, um es zu detektieren: Ein Versäumnis, etwas anderes als den Kortex zu erkennen (z. B. ein helles zytoplasmatisches Fach in der Nähe des Kortex), kann die Detektion für jeden folgenden Zeitpunkt beeinträchtigen (z. B. bewegt sich das zytoplasmatische Fach vom Kortex weg und die kortikalen Linien können ihm für den Rest des Zeitraffers folgen). Der Nicht-Tracking-Modus hat diese Falle nicht, da die Erkennung auf die ursprünglich vom Benutzer gezeichnete Linie beschränkt ist (z. B. kann ein helles zytoplasmatisches Fach dazu führen, dass die Erkennung für einige Zeitpunkte fehlschlägt, aber da sich das zytoplasmatische Fach von der Detektionszone entfernt, wird die korrekte Erkennung des Kortex fortgesetzt), verhält sich aber nicht gut, wenn sich die Kortexposition oder -ausrichtung im Laufe der Zeit stark ändert. Das nächste Feature (das auf GitHub30verfügbar sein wird), das für den Tracking-Modus entwickelt werden soll, ist die Option, nur bestimmte Zeitpunkte zu analysieren und einen Referenzzeitpunkt (anstelle des ersten Zeitpunkts) zu definieren, vor dem und nach dem die Erkennung durchgeführt wird, wodurch der Benutzer zumindest problematische Zeitpunkte vermeiden kann.
The authors have nothing to disclose.
Die Arbeit im Januschke-Labor wird von Wellcome Trust Grants 100031/Z/12/A und 1000032/Z/12/A unterstützt. Die Gewebebildgebungseinrichtung wird durch das Stipendium WT101468 von Wellcome unterstützt.
Albumin bovine serum, BSA | Merck | 5470 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture | Sigma | F7524 | |
Fibrinogen from human plasma | Sigma | F3879 | |
FluoroDish Cell Culture Dish – 35mm, 23 mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | |
PP1 Analog (1NA-PP1) | Merck Millipore | 529579 | |
Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | |
Schneider's Insect Medium | Sigma | S0146 | |
Thrombin from bovine plasma | Merck | T4648 |