Method Article

Verfeinerte CLARITY-basierte Gewebereinigung für die dreidimensionale Fibroblastenorganisation in gesunden und verletzten Mäuseherzen

DOI:

10.3791/62023

⸱

May 16th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Confocal Imaging Core, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine verfeinerte Methode der Gewebereinigung wurde entwickelt und auf das erwachsene Mausherz angewendet. Diese Methode wurde entwickelt, um dichtes, autofluoreszierendes Herzgewebe zu beseitigen und gleichzeitig die markierte Fibroblastenfluoreszenz aufrechtzuerhalten, die einer genetischen Reporterstrategie zugeschrieben wird.

Abstract

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Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache und sind oft durch erhöhte Herzfibrose gekennzeichnet, die zu einer erhöhten ventrikulären Steifigkeit mit veränderter Herzfunktion führen kann. Dieser Anstieg der herzventrikulären Fibrose ist auf die Aktivierung von ansässigen Fibroblasten zurückzuführen, obwohl nicht gut verstanden ist, wie diese Zellen innerhalb des 3-dimensionalen (3-D) Herzens, zu Beginn oder nach der Aktivierung funktionieren. Um zu untersuchen, wie Fibroblasten zu Herzerkrankungen und ihrer Dynamik im 3D-Herzen beitragen, wurde eine verfeinerte CLARITY-basierte Gewebereinigungs- und Bildgebungsmethode entwickelt, die fluoreszierend markierte Herzfibroblasten im gesamten Mausherz zeigt. Geweberesidente Fibroblasten wurden genetisch mit Rosa26-loxP-eGFP floreszierenden Reportermäusen markiert, die mit der kardialen Fibroblasten-exprimierenden Tcf21-MerCreMer-Knock-in-Linie gekreuzt wurden. Diese Technik wurde verwendet, um die Fibroblastenlokalisierungsdynamik im gesamten linken Ventrikel des Erwachsenen bei gesunden Mäusen und in fibrotischen Mausmodellen für Herzerkrankungen zu beobachten. Interessanterweise wurden in einem Verletzungsmodell einzigartige Muster von Herzfibroblasten im verletzten Mausherz beobachtet, die Bändern von umwickelten Fasern in kontraktiler Richtung folgten. In ischämischen Verletzungsmodellen trat der Fibroblastentod auf, gefolgt von einer Wiederbesiedlung aus der Infarktgrenzzone. Zusammen ermöglicht diese verfeinerte Kardgewebeklärtechnik und das digitalisierte Bildgebungssystem eine 3D-Visualisierung von Herzfibroblasten im Herzen ohne die Einschränkungen von Antikörperpenetrationsversagen oder früheren Problemen im Zusammenhang mit verlorener Fluoreszenz aufgrund von Gewebeverarbeitung.

Introduction

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Obwohl Kardiomyozyten die größte Volumenfraktion im Herzen ausmachen, sind Herzfibroblasten reichlich vorhanden und entscheidend an der Regulierung der strukturellen und reparativen Grundmerkmale dieses Organs beteiligt. Herzfibroblasten sind sehr mobil, mechanisch ansprechend und phänotypisch abhängig vom Ausmaß ihrer Aktivierung. Herzfibroblasten sind notwendig, um normale Spiegel der extrazellulären Matrix (ECM) aufrechtzuerhalten, und zu wenig oder zu viel ECM-Produktion durch diese Zellen kann zu Krankheiten führen1,2,3. Angesichts ihrer Bedeutung bei Krankheiten sind Herzfibroblasten zu einem immer wichtigeren Untersuchungsthema geworden, um neue Behandlungsstrategien zu identifizieren, insbesondere bei dem Versuch, übermäßige Fibrose zu begrenzen4,5,6,7. Nach einer Verletzung aktivieren und differenzieren sich Fibroblasten in einen synthetischeren Zelltyp, der als Myofibroblast bekannt ist, der proliferativ sein und reichlich ECM absondern kann, sowie eine kontraktile Aktivität aufwies, die hilft, die Ventrikel umzugestalten.

Während herzfibroblasten in 2-D-Kulturen 6,8 ,9,10umfassend auf ihre Eigenschaften und Dynamiken im3D-lebendenHerzen untersucht wurden, wird viel weniger über ihre Eigenschaften und Dynamik im 3D-lebenden Herzen verstanden, entweder zu Beginn oder bei Krankheitsstimulation. Hier wurde eine verfeinerte Methode beschrieben, um das erwachsene Mausherz zu klären und gleichzeitig die Fluoreszenz von Fibroblasten aufrechtzuerhalten, die mit einem Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer-Genreportersystem markiert sind. Innerhalb des Herzens ist Tcf21 ein relativ spezifischer Marker für ruhendierende Fibroblasten4. Nachdem Tamoxifen verabreicht wurde, um das induzierbare MerCreMer-Protein zu aktivieren, exprimieren im Wesentlichen alle ruhend ruhenden Fibroblasten dauerhaft ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) aus dem Rosa26-Locus, was ihre Verfolgung in vivo ermöglicht.

Es gibt zahlreiche gut etablierte Gewebereinigungsprotokolle, von denen einige auf das Herz11 , 12,13,14,15,16,17angewendet wurden . Es wurde jedoch festgestellt, dass viele der Reagenzien, die in verschiedenen Gewebereinigungsprotokollen verwendet werden, endogene Fluoreszenzsignale abschrecken18. Darüber hinaus ist das erwachsene Herz aufgrund der reichlich vorhandenen Hämgruppen-haltigen Proteine, die Autofluoreszenz erzeugen, schwer zu klären19. Daher war das Ziel dieses Protokolls, die Fibroblastenmarkerfluoreszenz mit der gleichzeitigen Hemmung der Häm-Autofluoreszenz im verletzten erwachsenen Herzen für eine optimale 3D-Visualisierung in vivo12,13,14,16,17,20zu erhalten.

Frühere Studien, die versuchten, den kardialen Fibroblasten in vivo zu untersuchen, verwendeten perfundierte Antikörper, um diese Zellen zu kennzeichnen, obwohl solche Studien durch Antikörperpenetration und kardiale Gefäßstruktur begrenzt waren14,16,17,20. Obwohl Salamon et al. eine Gewebereinigung mit Aufrechterhaltung der topischen neuronalen Fluoreszenz im neonatalen Herzen gezeigt haben und Nehrhoff et al. gezeigt haben, dass die Fluoreszenzmarkierung myeloischer Zellen erhalten bleibt, wurde die Aufrechterhaltung der endogenen Fluoreszenz durch die gesamte ventrikuläre Wand noch nicht nachgewiesen, einschließlich der Visualisierung von adulten Herzfibroblasten zu Beginn oder nach Verletzung13,20. Dieses Gewebereinigungsprotokoll verfeinert eine Mischung früherer Protokolle, die auf der CLARITY-Methode (klares lipidgetauschtes Acrylamid-hybridisiertes starres Imaging/Immunostaining/In-situ-Hybridisierungs-kompatibles Gewebehydrogel) und PEGASOS (Polyethylenglykol (PEG)-assoziiertes Lösungsmittelsystem) basieren. Dieses verfeinerte Protokoll ermöglichte eine robustere Untersuchung von Herzfibroblasten im Mausherz zu Studienbeginn und wie sie auf verschiedene Arten von Verletzungen reagieren. Das Protokoll ist einfach und reproduzierbar und wird dazu beitragen, das Verhalten von Herzfibroblasten in vivo zu charakterisieren.

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Protocol

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Alle Experimente mit Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Cincinnati Children's Hospital Medical Center genehmigt. Die Institution ist auch AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care) zertifiziert. Mäuse wurden durch zervikale Dislokation eingeschläfert, und Mäuse, die sich einer Überlebenschirurgie unterzogen, erhielten Schmerzlinderung (siehe unten). Alle Methoden zur Schmerzbehandlung und Euthanasie basieren auf Empfehlungen des Gremiums für Euthanasie der American Veterinary Medical Association. Alle Mäuse wurden in Maiskolben-Einstreueinheiten untergebracht, in denen jederzeit Wasser und Nahrung zur Verfügung standen. Mäuse wurden 4 in einem Käfig mit dem gleichen Geschlecht untergebracht. Für operationen oder unverletzte Gewebereinigungen wurden gleich viele 6-8 Wochen alte männliche und weibliche Mäuse verwendet.

HINWEIS: Sterile chirurgische Bedingungen wurden in allen Operationen aufrechterhalten. Der Chirurg wechselte in saubere Peelings und ein steriles Kleid und zog dann Schuhüberzüge und ein Haarnetz an. Der Chirurg schrubbte dann ihre Hände mit Chlorhexidin und zog sterile CHIRURGISCHE Handschuhe an. Der Chirurg wurde von einem Techniker unterstützt, der die Schnittstelle jeweils 3 Mal sedierte, rasierte und schrubbte, abwechselnd zwischen 2% Chlorohexidingluconat und 70% Isopropanol. Die Mäuse wurden dann zum Chirurgen gebracht und operiert. Zwischen den Tieren wurden die Instrumente in einem Perlensterilisator sterilisiert.

1. Cre-Rekombination

  1. Kreuz Rosa26-loxP-eGFP Mäuse (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) mit Tcf21-MerCreMer Mäusen (Abbildung 1A)6,21.
  2. Wenn die Nachkommen dieser Kreuzung 6 Wochen alt sind, verabreichen Sie eine intraperitoneale Injektion von 75 mg / kg Tamoxifen, gelöst in Maisöl. 22 Dieses Tamoxifen zweimal im Abstand von 48 h verabreichen (Abbildung 1B).
  3. Nach Tamoxifen-Injektionen setzen Sie die Mäuse eine Woche lang auf eine Diät mit Tamoxifen-Nahrung (~ 0,4 g / kg Tamoxifencitrat). Nach einer Woche Tamoxifen-Chow bringen Sie die Mäuse eine Woche lang zu einer normalen autoklavierten Chow-Diät zurück, bevor Sie eine Operation durchführen(Abbildung 1B). Legen Sie eine angemessene Anzahl von Mäusen (3 pro chirurgischem Zustand) als unverletzte Kontrollen vor. Opfern Sie diese Mäuse und fahren Sie mit dem unten beschriebenen Clearing-Prozess nach der einwöchigen normalen Chow-Diät fort.
  4. Führen Sie nach dem Tamoxifen-Regime und der Rekombination eine Operation durch.

2. Chirurgische Modelle

  1. Ischämie/Reperfusion (I/R)23,24
    1. Anästhesie von Mäusen mit 1,5% Isoflurangas in der Raumluft in einer belüfteten Box; Rasieren Sie ihre Brust und Hälse mit elektrischen Klippern und schrubben Sie dann die rasierten Bereiche mit einem 2% Chlorhexidingluconat-getränkten Tupfer.
    2. Verwenden Sie künstliche Tränensalbe, um Trockenheit während der Operation zu verhindern, indem Sie Salbe auf die Augen der sedierten Mäuse legen.
    3. Führen Sie einen Mittelhalsschnitt mit einer chirurgischen Schere durch, um die Visualisierung der Luftröhre zu ermöglichen. Mit einem 20 G Katheter intubieren, indem Sie den Intubationstubus in die Luftröhre legen und den Trachealkatheter durch den Mittelhalsschnitt visualisieren. Legen Sie die Mäuse auf ein Beatmungsgerät, während sie mit Isoflurangas (1,5%) in der Raumluft.
    4. Machen Sie einen Schnitt unter der linken vorderen Extremität mit einer chirurgischen Schere und schneiden Sie die Interkostalmuskeln zwischen den Rippen 3 und 4. Verteilen Sie die Aufreißrippen mit einem Retraktor.
    5. Legen Sie einen kleinen, in Kochsalzlösung getränkten Schwamm zwischen die Lunge und das Herz, um eine Schädigung der Lunge zu verhindern.
    6. Mit einer Angelhakennadel (6,5 mm, 3/8 c) die linke Koronararterie mit einem lösbaren Rutschknoten mit 8-0 binden Prolene.
    7. Entfernen Sie den Schwamm mit einer Zette.
    8. Nähen Sie die Interkostalmuskeln mit 4-0 geflochtener Seide und einer kontinuierlichen Naht geschlossen, während Sie auch das Ende des 8-0 exteriorisieren Prolene-Rutschknoten.
    9. Schließen Sie die Hautschnitte mit topischem Gewebekleber mit dem Ende des verdeckten Schlupfknotens hervorstehend.
    10. Ziehen Sie nach einer Stunde Verschluss das äußere Ende des Schlupfknotens, um den Koronararterienverschluss innerlich zu lösen, die Ischämie zu lindern und eine Reperfusion zu verursachen.
    11. Verabreichen Sie 0,02 ml buprenorphin mit verlängerter Freisetzung über subdermale Injektion (72 h Freisetzung) als Schmerzmittel und legen Sie die Mäuse in eine sauerstoffreiche Inkubationskammer bei 37 °C, getrennt von anderen Tieren. Überwachen Sie die Mäuse mindestens alle 15 Minuten, bis sie sich von der Anästhesie erholt haben und in der Lage sind, eine sternale oder sitzende Position beizubehalten. Bringen Sie die Mäuse in ihre normale Unterbringung zurück.
    12. Beurteilen Sie die Tiere nach der Operation 48 Stunden lang auf Schmerzen und Leiden und überwachen Sie die Schnittstelle täglich, bis sie vollständig geheilt ist.
    13. Beobachten Sie die Mäuse nach der Operation bis zum Opfer auf Hydratation, Ernährung und allgemeines Wohlbefinden.
  2. Myokardinfarkt (MI)25,26,27
    1. Führen Sie die Schritte 2.1.1–2.1.7 aus.
    2. Verwenden Sie eine kontinuierliche Naht, um die Interkostalmuskulatur mit 4-0 geflochtener Seide zu schließen.
    3. Schließen Sie den Hautschnitt mit topischem Gewebekleber.
    4. Führen Sie die Schritte 2.1.11–2.1.13 aus.
  3. Angiotensin II/Phenylephrin mikroosmotische Pumpeninfusion
    1. Vorbereiten Eine 10 μg/μL Arbeitslösung von Angiotensin II und 500 μg/μL Arbeitslösung von Phenylephrin unter sterilen Bedingungen (d. h. in einer Laminar-Flow-Haube) durch Zugabe von 1 mg Angiotensin II zu 100 μL steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 250 mg Phenylephrinhydrochlorid in 500 μL PBS vorbereiten.
    2. Berechnen Sie die Verdünnung jeder Arbeitslösung und des Endvolumens, das an die mikroosmotische Pumpe abgegeben werden soll, basierend auf dem Mausgewicht.
      HINWEIS: Zum Beispiel benötigt eine 20 g Maus 20 g x 14 Tage x 1,5 μg/Tag = 420 μg Angiotensin oder 42 μL Arbeitslösung sowie 20 g x 14 Tage x 50 μg/Tag = 14000 μg Phenylephrinhydrochlorid oder 28 μL Arbeitslösung.
    3. Für das Gewicht jeder Maus verdünnen Sie den Arbeitsstoff des Arzneimittels in sterilem PBS und füllen Sie die mikroosmotischen Pumpen (0,25 μL/h, 14 Tage, ca. 100 μL) mit einer 27 G Nadel und einer 1 ml Spritze.
      HINWEIS: Dies erzeugt eine Durchflussrate von 1,5 μg∙g-1∙Tag-1 Angiotensin II und 50 μg∙g-1∙Tag-1 Phenylephrinhydrochlorid, sobald es in die Mäuse gelegt wurde.
    4. Betäuben Sie die Mäuse mit 1,5% Isofluran-Inhalation (wirkungsvoll) in einer belüfteten Kammer mit Raumluft.
    5. Legen Sie die betäubten Mäuse auf einen sterilen Operationstisch in der Opinposition und halten Sie die Anästhesie mit Isoflurangasinhalation (1,5%) durch einen Nasenkegel.
    6. Verwenden Sie künstliche Tränensalbe auf den Augen des Tieres, um Trockenheit während der Operation zu verhindern.
    7. Rasieren Sie das Fell über dem Implantationsbereich mit elektrischen Haarschneidemaschinen und sterilisieren Sie den zu schneidenden Bereich mit Ethanol und einem sterilen Tupfer. Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 1 cm) mit einer chirurgischen Schere in der epidermalen Schicht der Maushaut auf der rechten seitenseitigen Seite des Rückens, unterhalb des Schulterblattes. Verwenden Sie die stumpfen Seiten einer chirurgischen Schere, um die Haut sanft in und um den Bereich der Implantation zu strecken, um die Minipumpe einzuführen.
    8. Legen Sie die mikroosmotische Pumpe in den Schnitt und manövrieren Sie sie physisch links von der dorsalen Mittellinie der Maus, indem Sie die Pumpe manuell unter die Haut massieren.
    9. Schließen Sie den Schnitt durch kontinuierliche Naht mit 4-0 Seide mit einer Kegelpunktnadel.
    10. Nach der Pumpimplantation Buprenorphin mit langsamer Freisetzung in einer Dosis von 0,1 mg/kg Körpergewicht mittels subdermaler Injektion zur Analgesie (72-h langsame Freisetzung) verabreichen. Legen Sie die Mäuse in eine sauerstoffreiche Inkubationskammer bei 37 °C, getrennt von anderen Tieren. Überwachen Sie die Mäuse mindestens alle 15 Minuten, bis sie sich von der Anästhesie erholen und eine sternale oder sitzende Position beibehalten können.
    11. Nach der Erholung von der Anästhesie in der 37 °C Erwärmungskammer setzen Sie die Mäuse wieder in ihre Standard-Wohneinheiten.
    12. Überwachen Sie die Mäuse nach der Operation 48 Stunden lang auf Schmerzen und Leiden und überwachen Sie die Schnittstelle täglich, bis sie vollständig verheilt ist.
    13. Beobachten Sie die Mäuse nach der Operation bis zum Opfer auf Hydratation, Ernährung und allgemeines Wohlbefinden.

3. Löschen von erwachsenen Mausherzen mit einem modifizierten aktiven CLARITY-Protokoll

  1. Bereiten Sie einen sauberen Operationsbereich vor, indem Sie die Operationsoberfläche und alle chirurgischen Werkzeuge mit 70% Ethanol sterilisieren. Bereiten Sie eine Lösung aus kaltem 1x PBS und 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS (jeweils 100 ml) vor. Tragen Sie Handschuhe, Laborkittel, Gesichtsmaske und Augenschutz.
  2. Bereiten Sie Den Heparinpuffer vor, indem Sie 10 Einheiten Heparin in 0,9% w / v Natriumchloridlösung verdünnen. Injizieren Sie jede Maus intraperitoneal mit 60 μL Heparin-NaCl mit einer 1-ml-Spritze und einer 27-G-Nadel.
  3. Fünf Minuten nach der Injektion von Heparin-NaCl-Lösung betäuben Sie die Mäuse mit 1,5% iger Isofluran-Inhalation (wirkungsvoll) in einer belüfteten Kammer mit Raumluft.
  4. Euthanisieren Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation, wobei der Hinterkopf mit dem flachen, geschlossenen Ende der Zögere gehalten wird, während die Wirbelsäule durch Ziehen des Schwanzes ausgerenkt wird.
  5. Reinigen Sie die ventrale Oberfläche der Maus mit 70% Ethanol auf einem Wattestäbchen. Machen Sie einen 3 cm Querschnitt etwa 3 cm unterhalb des Xiphoid-Prozesses mit einer chirurgischen Schere.
  6. Trennen Sie die Haut vom darunter liegenden Bauchwandgewebe, indem Sie den Bauch bis zum Xiphoid-Prozess entglovingen (halten Sie die Haut am nächsten zum Schwanz und ziehen Sie die Haut, die dem Kopf am nächsten ist, in Richtung Brustkorb). Machen Sie einen 2 cm queren Schnitt im subkutanen Bauchwandgewebe 3 cm unterhalb des Xiphoid-Prozesses mit einer chirurgischen Schere. Machen Sie einen vertikalen Schnitt von diesem Querschnitt, die Mittellinie hinauf und durch den Brustkorb. Stecken Sie den Brustkorb zurück und entblößen Sie das Herz.
  7. Verwenden Sie eine 27-G-Nadel und eine 10-ml-Spritze, um kaltes PBS in die obere Hohlvene und Aorta zu injizieren (jede Positionsmanipulation des Herzens sollte sorgfältig mit stumpfer Zünzette durchgeführt werden, um eine Punktion zu vermeiden), um Blut aus dem Herzen zu entfernen.
    HINWEIS: Eine ausreichende Durchblutung kann durch Schwanzzucken und Verfärbung der Lunge festgestellt werden.
  8. Verwenden Sie eine 27 G Nadel und eine 10 ml Spritze, um kalte 4% PFA in die obere Hohlvene und Aorta zu injizieren, um den Fixierungsprozess zu beginnen.
  9. Beschneide die Herzen. Die Vorhöfe, der rechte Ventrikel und das Septum sowie der linke Ventrikel sollten mit einem geraden Klingenskalpell getrennt werden. Legen Sie dieses Gewebe in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, das mit kaltem 4% PFA gefüllt ist, und legen Sie es über Nacht bei 4 °C auf einen Nutator.
  10. Waschen Sie das Herz 3 mal für jeweils 1 h mit kaltem 1x PBS, um überschüssiges PFA zu entfernen.
  11. Bereiten Sie das Hydrogel (A4P0 für relative Acrylamid/Polyacrylamid-Zusammensetzung bezeichnet) vor, indem Sie die folgenden Chemikalien in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen mischen: 10% 40% Acrylamid, 10% 1x PBS, 80% destilliertes Wasser.
  12. Die 0,25% ige Lösung des Photoinitiators (2,2-Azobis[2-(2-imidazolin-2yl)propan)dihydrochlorid) wird der Hydrogellösung kurz vor dem Eintauchen des Herzens in das Hydrogel hinzugefügt.
  13. Legen Sie das Herz in ein konisches Röhrchen, das das Hydrogel enthält. Das konische Rohr in Folie einwickeln und über Nacht bei 4 °C ohne körperliche Störung inkubieren.
  14. Nach ca. 14 h bei 4 °C das konische Röhrchen mit dem Herzen in ein 37 °C großes Perlenbad bringen.
  15. Nach 2,5 h im Perlenbad das Herz vorsichtig mit einer Zette aus dem Hydrogel entfernen.
  16. Waschen Sie die Herzen 3 mal für je 1 h in einem 15 mL konischen Röhrchen mit 1x PBS bei 37 °C auf einem Nutator.
  17. Legen Sie die Herzen mit einer Zette in den Korb der aktiven Elektrophoresemaschine und legen Sie den Deckel auf den Korb. Stellen Sie sicher, dass der Deckel sicher sitzt.
  18. Füllen Sie das aktive Elektrophoresekammerreservoir mit elektrophoretischer Räumlösung, indem Sie die Lösung in die Kammer gießen.
  19. Sobald die Kammer mit elektrophoretischer Clearinglösung gefüllt ist, kann der Korb mit dem Herzen untergetaucht werden. Setzen Sie die Kappe sicher auf die Elektrophoresemaschine.
  20. Führen Sie die Elektrophoresemaschine bei 1,5 A, 37 °C für 1,5 h aus.
  21. Überprüfen Sie nach 1,5 h Elektrophorese die Herzen visuell, um sicherzustellen, dass kein undurchsichtiges Gewebe zurückbleicht. Wenn Regionen des Gewebes noch undurchsichtig sind, tauchen Sie das Herz erneut in Elektrophoreselösung in die elektrophoretische Kammer und setzen Sie die Elektrophorese für 0,5 h gleichzeitig fort.
    HINWEIS: Die Elektrophorese sollte bei ersten Anzeichen einer Gewebeschädigung (z. B. Gewebefransen) abgebrochen werden.
  22. Waschen Sie die Herzen in einem 15 mL konischen Röhrchen mit 1x PBS für 1 h, jeweils 3 mal, bei 37 °C auf einem Nutator.
  23. Tauchen Sie die Herzen in ein 15 mL konisches Röhrchen, das N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylendiamin enthält – ein Entfärbungsmittel, das die Häm-Autofluoreszenz reduziert.
    HINWEIS: Diese Lösung sollte alle 24 Stunden gewechselt werden, bis die Herzen vollständig klar sind (ca. 2 Tage).
  24. Waschen Sie die Herzen in einem 15 mL konischen Röhrchen mit 1x PBS 3 mal für jeweils 1 h, um überschüssiges Entfärbungsmittel zu entfernen.
  25. Brechungsindex-Matching-Lösung (RIMS) durch Kombination von 30 ml 0,02 M Phosphatpuffer, 40 g 5-(N-2, 3-Dihydroxypropylacetamido) -2 , 4 , 6-Tri-Jod-N,N'-Bis (2 , 3 Dihydroxypropyl) Isophthalamid unter Rühren (muss vollständig gelöst werden - dies kann bis zu einer Stunde dauern), 5 mg Natriumazid, 50 μL Tween20 und 1 g 1,4-Diazabicyclo[2,2.2]-Oktan und stellen Sie den pH-Wert auf 7,5 ein.
  26. Gleichen Sie die Herzen in RIMS für 48 Stunden vor der Bildgebung aus.

4. Bildgebung von gereinigten Herzen mit einem aufrechten konfokalen Einzelphotonenmikroskop

HINWEIS: Die Bildgebungsvorrichtung besteht aus der unteren Hälfte einer 10 cm Glas-Petrischale, einem 3D-gedruckten Bodenbehälter, einem runden Glasdeckel und einem 3D-gedruckten oberen Reservoir(Abbildung 1C–E). 3D-gedruckte Materialien wurden intern von der Abteilung für klinische Technik des Cincinnati Children's Hospital hergestellt.

  1. Verwenden Sie Vakuumfett, um den 3D-gedruckten Bodenbehälter in eine Glas-Petrischale zu versiegeln, indem Sie eine dünne Schicht Vakuumfett auf den Boden des 3D-gedruckten Stücks auftragen (Abbildung 1C).
    HINWEIS: Das Reservoir sollte die gleiche Höhe wie die abgebildete Probe haben (d.h. die Probe sollte nicht durch den darauf platzierten Glasdeckel komprimiert werden, und die Probe sollte auch nicht in der Lage sein, innerhalb des Reservoirs zu schweben und sich zu bewegen).
  2. Füllen Sie das Reservoir mit RIMS und entfernen Sie alle Blasen mit einer Pipettspitze. Legen Sie das Herz vorsichtig mit der linksventrikulären Wand nach oben in die RIMS, um sicherzustellen, dass keine Blasen in die Lösung eingeführt werden.
  3. Befestigen Sie einen Glasdeckel auf die Unterseite des 3D-gedruckten oberen Reservoirstücks (Ergänzende Abbildung 1A) mit Vakuumfett (wiederum indem Sie eine dünne Schicht Vakuumfett auf das 3D-gedruckte Stück legen und auf den Deckzettel legen) (Abbildung 1D).
  4. Legen Sie den Glasdeckel und den oberen Behälter mit der Seite nach unten auf den unteren Behälter (Ergänzende Abbildung 1B), ohne dass Blasen einschleppen. Die Haftung zwischen RIMS und Abdeckschlupf bietet eine Abdichtung zwischen den oberen und unteren Reservoirstücken (Abbildung 1E).
  5. Füllen Sie das obere Reservoir mit Glycerin zur Verwendung mit einem 10-fachen Glycerin-Immersionsobjektiv.
  6. Verwenden Sie ein Einzelphotonenmikroskop, das mit einem konfokalen Multiphotonen-Scankopf ausgestattet ist, um die gereinigten Herzen abbilden zu können.
  7. Senken Sie das Stadium des Einzelphotonenmikroskops und platzieren Sie die Petrischale mit der Probe in der Mitte der Stufe. Heben Sie die Stufe an und senken Sie das 10-fache Glycerin-Immersionsobjektiv in das Glycerin im oberen Reservoir des Probenapparates. Stellen Sie sicher, dass die Probe im Fokus ist, indem Sie mit den Okularen auf den Rand der Probe schauen.
  8. Wechseln Sie von der Okularansicht zur Kameraansicht am Computer, indem Sie auf die Live-Taste klicken.
    1. Stellen Sie die Parameter X und Y ein, indem Sie zuerst den breitesten Teil der Gewebeprobe lokalisieren, der sich am Boden der Petrischale befinden sollte.
    2. Klicken Sie auf ND-Erfassung und benutzerdefinierten Multipoint. Erstellen Sie Multipoints, indem Sie zuerst die Mitte der Gewebeprobe finden, indem Sie den Joystick verwenden, um von links nach rechts und von oben nach unten zu streichen.
    3. Bestimmen Sie dann basierend auf der Größe des Gewebes die erforderliche Kachelgröße (typischerweise 6 x 5 für ein 6-8 Wochen altes Mausherz). Führen Sie dazu eine Testbildgebung durch, indem Sie nur X- und Y-Parameter erfassen (deaktivieren Sie z auf der Registerkarte ND-Erfassung),um zu überprüfen, ob die gesamte Länge und Breite des Gewebes erfasst wurde.
  9. Um z-Parameter festzulegen, öffnen Sie die XYZ-Navigationund klicken Sie auf die Symbole nach oben und unten, bis Sie den oberen und unteren Rand des Beispiels finden.
    1. Öffnen Sie das Z-Intensitätskorrekturfeld und stellen Sie die Fluoreszenz oben, in der Mitte und unten im Gewebe ein, um die Gewebedichte zu korrigieren, indem Sie die Laserleistung an jedem Z-Punkt erhöhen oder verringern. Legen Sie diese fest, indem Sie auf den Set-Pfeil rechts im Bedienfeld "Z-Intensitätskorrektur" klicken.
    2. Stellen Sie die Z-Schrittgröße im ND-Erfassungsfenster auf 5 μm ein.
  10. Nachdem die X-, Y- und Z-Parameter des Herzens abgegrenzt und die Z-Intensitätskorrektur eingestellt wurde, verwenden Sie das automatisierte aufrechte Mikroskop mit einem 10-fachen Glycerin-Immersionsobjektiv mit einem Resonanzscanner und Galliumarsenidphosphid-Photomultiplier-Röhrchen (GaAsP PMTs), um die gereinigten Herzen abbilden. Stellen Sie sicher, dass die Registerkarten XY und Z unter ND-Erfassungaktiviert sind, und drücken Sie Z-Korrektur ausführen.
  11. Stitchen, entmischen und entrauschen Sie die resultierenden Bilder, indem Sie das Mehrpunktbild in der Verarbeitungssoftware öffnen und auf den Stitch-Button klicken. Klicken Sie unter Bildauf Blind Unmixing, 2 Kanal, und suchen Siedann . und klicken Sie unter Bildauf denoise.ai, dann auf den fluoreszierenden Kanal Ihrer Wahl (z. B. GFP).
    HINWEIS: Dieser Prozess führt zu einem 3D-Bild von GFP-positiven Fibroblasten im gesamten linken Ventrikel.
  12. Verwenden Sie Sekundäranalysesoftware, um Muster und Trends bei der Ausbreitung von Herzfibroblasten weiter zu identifizieren. Verwenden Sie die Spots-Funktion, indem Sie das Spots-Assistentenprogramm ausführen.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herzfibroblasten sind sowohl für die Ausgangsfunktion des Herzens als auch für die Reaktion auf Herzverletzungen unerlässlich. Frühere Versuche, die Anordnung und Morphologie dieser Zellen zu verstehen, wurden größtenteils in 2D-Umgebungen durchgeführt. Es wurde jedoch eine verfeinerte Herzgewebereinigung (Abbildung 2) und 3D-Bildgebungstechnik veröffentlicht, die eine fortgeschrittene, detailliertere Visualisierung von Herzfibroblasten ermöglicht. Bei dieser bildgebenden Technik wurde festg...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel stellt eine verfeinerte Methode zur Gewebereinigung vor, die die Visualisierung von Herzfibroblasten in vivo sowohl zu Studienbeginn als auch nach Verletzungen ermöglicht, um Fibroblasten im Mausherz zu charakterisieren und besser zu verstehen. Dieses erweiterte Protokoll adressiert Einschränkungen in bestehenden Gewebereinigungsprotokollen, die versucht haben, bestimmte Zelltypen im erwachsenen oder neonatalen Herzen zu identifizieren12,13,

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Angaben zum Inhalt dieses Manuskripts.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken dem CCHMC Confocal Imaging Core für ihre Unterstützung und Anleitung bei der Entwicklung dieses Modells sowie Matt Batie von Clinical Engineering für das Design aller 3D-gedruckten Teile. Demetria Fischesser wurde durch ein Trainingsstipendium der National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) und Jeffery D. Molkentin durch das Howard Hughes Medical Institute unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-0 geflochtene SeideEthiconK871H
8-0 ProlenEthicon8730H
40% Acrylamid LösungBio-Rad1610140
Angiotensin IISigmaA9525-50G
Künstliche TränensalbeCovetrus048272
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2. 2]octan)Millipore SigmaD27802-25G
GLUture topischer GewebekleberWorld Precision Instruments503763
HeparinSigmaH0777
Imaris Start AnalysesoftwareOxford InstrumentsN/A
Mikroosmotische PumpenAlzetModell 1002
Nikon Elements AnalysesoftwareNikonN/A
Nikon A1R HD aufrechtes MikroskopNikonN/A
Normales autoklaviertes MikroskopLabdiet5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-Dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iod-N,
N'-bis (2, 3 Dihydroxypropyl) isophthalamid		CosmoBioAXS-1002424
ParaformaldehydElektronenmikroskopie Sciences15710
PhenylephrinhydrochloridSigmaP6126-10G
PhotoinitiatorWako ChemicalsVA-044
Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]Jackson LaboratoriesJax Best.-Nr.: 012429
NatriumazidSigma AldrichS2002-5G
NatriumchloridlösungHospira, Inc.NDC 0409-4888-10
TamoxifenSigma AldrichT5648
Tamoxifen foodEnvigoTD.130860
Tween-20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylendiamin, EntfärbungsmittelMillipore Sigma122262-1L
X-Clarity elektrophoretische ReinigungskammerLogos BiosystemsC30001
X-Clarity elektrophoretische ReinigungslösungLogos BiosystemsC13001
X-Clarity Elektrophorese-GewebekorbLogos BiosystemsC12001
X-Clarity Elektrophorese-GewebekorbhalterLogos BiosystemsC12002

References

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