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Methodenartikel

In-Nucleus Hi-C in Drosophila-Zellen

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DOI:

10.3791/62106

⸱

15. September 2021

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Genom ist im Kernraum in verschiedene Strukturen organisiert, die durch Chromosomenkonformationserfassungstechnologien aufgedeckt werden können. Die In-Nucleus-Hi-C-Methode liefert eine genomweite Sammlung von Chromatin-Interaktionen in Drosophila-Zelllinien, die Kontaktkarten generiert, die mit Megabasenauflösung auf Restriktionsfragmentebene untersucht werden können.

Zusammenfassung

Das Genom ist in topologisch assoziierenden Domänen (TADs) organisiert, die durch Grenzen begrenzt sind, die Interaktionen zwischen Domänen isolieren. Bei Drosophila werden die Mechanismen, die der TAD-Bildung und den Grenzen zugrunde liegen, noch untersucht. Die anwendung der hier beschriebenen In-Nucleus Hi-C-Methode trug dazu bei, die Funktion von architektonischen Protein-Bindenden (AP)-Stellen an TAD-Grenzen zu analysieren, die das Notch-Gen isolieren. Genetische Veränderungen von Domänengrenzen, die zum Verlust von APs führen, führen zu TAD-Fusion, Transkriptionsfehlern und langfristigen topologischen Veränderungen. Diese Ergebnisse lieferten Beweise für den Beitrag genetischer Elemente zur Bildung von Domänengrenzen und zur Kontrolle der Genexpression bei Drosophila. Hier wurde die in-nucleus Hi-C-Methode ausführlich beschrieben, die wichtige Checkpoints liefert, um die Qualität des Experiments zusammen mit dem Protokoll zu beurteilen. Gezeigt werden auch die erforderliche Anzahl von Sequenzierungslesungen und validen Hi-C-Paaren zur Analyse genomischer Interaktionen auf verschiedenen genomischen Skalen. CrispR/Cas9-vermittelte genetische Editierung regulatorischer Elemente und hochauflösendes Profiling genomischer Interaktionen mit diesem In-Nucleus-Hi-C-Protokoll könnte eine leistungsstarke Kombination für die Untersuchung der strukturellen Funktion genetischer Elemente sein.

Einleitung

Bei Eukaryoten ist das Genom in Chromosomen unterteilt, die während der Interphase1bestimmte Territorien im Kernraum einnehmen. Das Chromatin, das die Chromosomen bildet, kann in zwei Hauptzustände unterteilt werden: einen von zugänglichem Chromatin, das transkriptionell freizügig ist, und den anderen von kompaktem Chromatin, das transkriptionell repressiv ist. Diese Chromatinzustände trennen sich und vermischen sich selten im Kernraum und bilden zwei verschiedene Kompartimente im Kern2. Auf der Sub-Megabase-Skala trennen Grenzen Domänen von hochfrequenten Chromatin-Wechselwirkungen, sogenannte TADs, die die Chromosomenorganisation3,4,5markieren. Bei Säugetieren werden TAD-Grenzen durch Cohesin und CCCTC-Bindungsfaktor (CTCF)6,7,8besetzt. Der Cohesin-Komplex extrudiert Chromatin und stoppt an CTCF-Bindungsstellen, die in konvergenter Orientierung in der genomischen Sequenz angeordnet sind, um stabile Chromatinschleifen9,10,13,14zu bilden. Genetische Störung der CTCF-DNA-Bindungsstelle an den Grenzen oder Verringerung der CTCF- und Cohesinproteinhäufigkeit führt zu abnormalen Wechselwirkungen zwischen regulatorischen Elementen, Verlust der TAD-Bildung und Deregulierung der Genexpression9,10,11,13,14.

Bei Drosophila werden die Grenzen zwischen TADs von mehreren APs besetzt, darunter der Grenzelement-assoziierte Faktor 32 kDa (BEAF-32), das Motif 1-Bindungsprotein (M1BP), das zentromale Protein 190 (CP190), der Suppressor des Haarflügels (SuHW) und CTCF, und sind mit aktiven Histonmodifikationen und Polymerase II16,17,18angereichert. Es wurde vermutet, dass bei Drosophila TADs als Folge der Transkription13 , 17,19auftreten, und die genaue Rolle unabhängiger APs bei der Grenzbildung und den Isolationseigenschaften wird noch untersucht. Ob Domänen in Drosophila eine alleinige Folge der Aggregation von Regionen ähnlicher Transkriptionszustände sind oder ob APs, einschließlich CTCF, zur Grenzbildung beitragen, muss daher noch vollständig charakterisiert werden. Die Erforschung genomischer Kontakte mit hoher Auflösung wurde durch die Entwicklung von Chromosomenkonformationserfassungstechnologien in Verbindung mit sequenzierung der nächsten Generation ermöglicht. Das Hi-C-Protokoll wurde erstmals mit dem Ligationsschritt "in Lösung"2 beschrieben, um falsche Ligationsprodukte zwischen Chromatinfragmenten zu vermeiden. Mehrere Studien wiesen jedoch auf die Erkenntnis hin, dass das nützliche Signal in den Daten von Ligationsprodukten stammte, die an teilweise lysierten Kernen gebildet wurden, die nicht in Lösung20,21waren .

Das Protokoll wurde dann modifiziert, um die Ligatur im Kern als Teil des Einzelzell-Hi-C-Experiments22durchzuführen. Das In-Nucleus-Hi-C-Protokoll wurde anschließend in die Zellpopulation Hi-C integriert, um eine konsistentere Abdeckung über den gesamten Bereich genomischer Entfernungen zu erzielen und Daten mit weniger technischem Rauschen zu erzeugen23,24. Das hier ausführlich beschriebene Protokoll basiert auf dem Population in-nucleus Hi-C Protokoll23,24 und wurde verwendet, um die Folgen der genetischen Entfernung von DNA-bindenden Motiven für CTCF und M1BP von einer Domänengrenze am Notch-Genlocus in Drosophila25zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Veränderung der DNA-bindungsnden Motive für APs an der Grenze drastische Folgen für die Bildung der Notch-Domäne, größere topologische Defekte in den Regionen rund um den Notch-Locus und die Deregulierung der Genexpression hat. Dies deutet darauf hin, dass genetische Elemente an Domänengrenzen für die Aufrechterhaltung der Genomtopologie und Genexpression in Drosophila25wichtig sind.

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Protokoll

1. Fixierung

  1. Beginnen Sie mit 10 Millionen Schneider's Line 2 plus (S2R+) Zellen, um 17,5 ml einer Zellsuspension in Schneider-Medium herzustellen, das 10% fetales Rinderserum (FBS) bei Raumtemperatur (RT) enthält.
  2. Fügen Sie methanolfreies Formaldehyd hinzu, um eine Endkonzentration von 2% zu erhalten. Mischen und inkubieren Sie für 10 Minuten bei RT, wobei Sie darauf achten, jede Minute zu mischen.
    HINWEIS: Formaldehyd ist eine gefährliche Chemikalie. Befolgen Sie die entsprechenden Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften und arbeiten Sie im Abzug.
  3. Löschen Sie die Reaktion durch Zugabe von Glycin, um eine Endkonzentration von 0,125 M zu erreichen, und mischen Sie. Inkubieren Sie für 5 Minuten bei RT, gefolgt von 15 Minuten auf Eis.
  4. Zentrifuge für 400 × g bei RT für 5 min und dann für 10 min bei 4 °C; Verwerfen Sie den Überstand. Das Pellet vorsichtig in 25 ml kalter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung wieder auffüllen.
  5. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei 4 °C, dann den Überstand entsorgen.
    HINWEIS: Wenn Sie mit dem Protokoll fortfahren, fahren Sie mit Schritt 2.1 für die Lyse fort. Andernfalls wird das Pellet in flüssigkeitsN2 eingefroren und bei -80 °C gelagert.

2. Lyse

  1. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml eiskaltem Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% nichtionisches Tensid (siehe Materialtabelle);10 mM NaCl; 1x Proteaseinhibitoren) und stellen Sie das Volumen mit eiskaltem Lysepuffer auf 10 ml ein. Stellen Sie das Volumen ein, um eine Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml zu erhalten. 30 Minuten auf Eis inkubieren und alle 2 Minuten durch Umkehren der Röhrchen mischen.
  2. Zentrifugieren Sie die Kerne bei 300 × g für 5 min bei 4 °C und entsorgen Sie dann vorsichtig den Überstand. Waschen Sie das Pellet 1x mit 1 ml Kaltlysepuffer und geben Sie es in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie das Pellet 1x mit 1 ml kaltem 1,25-fachem Restriktionspuffer und resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 360 μL 1,25x Restriktionspuffer.
  3. Fügen Sie 11 μL 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) pro Röhrchen (0,3% Endkonzentration) hinzu, mischen Sie sorgfältig durch Pipettieren und inkubieren Sie bei 37 °C für 45 min, schütteln Sie bei 700-950 U / min. Pipetieren Sie auf und ab, um Klumpen während der Inkubation einige Male zu stören.
  4. Löschen Sie das SDS durch Zugabe von 75 μL nichtionischem Tensid (10% ige Lösung, siehe Materialtabelle)pro Röhrchen (1,6% Endkonzentration) und inkubieren Sie bei 37 °C für 45 min, schütteln Sie es bei 950 U / min. Pipeten Sie ein paar Mal auf und ab, um Klumpen während der Inkubation zu stören.
    HINWEIS: Wenn Klumpen groß und schwer zu stören sind, verringern Sie die Drehzahl während SDS- und Tensidbehandlungen auf 400 U / min. Wenn die Klumpen durch Pipettieren schwer zu disaggregieren sind, teilen Sie die Probe in zwei Teile; Passen Sie die Volumina von Restriktionspuffer, SDS und Tensid an; und fahren Sie mit der Permeabilisierung fort. Als nächstes drehen Sie die Kerne mit minimaler Geschwindigkeit (200 × g),entsorgen Sie vorsichtig den Überstand, bündeln Sie die Proben in einem 1X-Restriktionspuffer und fahren Sie mit dem Aufschluss fort. Nehmen Sie ein Aliquot von 10 μL als unverdaute Probe (UD).

3. Enzymatische Verdauung

  1. Verdauen Sie das Chromatin durch Zugabe von 200 Einheiten (U) Mbo I pro Röhrchen und inkubieren Sie bei 37 °C für einen Zeitraum von 4 h bis über Nacht während des Drehens (950 U / min).
  2. Fügen Sie am nächsten Tag zusätzliche 50 U Mbo I pro Rohr hinzu und inkubieren Sie bei 37 ° C für 2 h, während Sie drehen (950 U / min).
  3. Inaktivieren Sie das Enzym, indem Sie die Röhrchen bei 60 °C für 20 min inkubieren. Legen Sie die Schläuche auf Eis.
    HINWEIS: Nehmen Sie ein Aliquot von 10 μL als verdaute Probe (D).

4. Biotinylierung von DNA-Enden

  1. Um die Restriktionsfragmentüberhänge zu füllen und die DNA-Enden mit Biotin zu kennzeichnen, fügen Sie jeweils 1,5 μL von 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL von 0,4 mM Biotin dATP, 17,5 μL Tris Low-EDTA (TLE) Puffer [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0] und 10 μL von 5 U / μL Klenow (DNA Polymerase I großes Fragment) zu allen Röhrchen hinzu. Vorsichtig mischen und 75 min bei 37 °C inkubieren. Schütteln Sie bei 700 U / min alle 10 s für 30 s. Legen Sie alle Schläuche auf Eis, während Sie die Ligationsmischung vorbereiten.

5. Ligatur

  1. Jede verdaute Chromatinmischung wird in ein separates 1-ml-Röhrchen mit Ligationsmischung (100 μL 10x Ligationspuffer, 10 μL 10 mg/ml Rinderserumalbumin, 15 HE T4-DNA-Ligase und 425 μL doppelt destilliertes Wasser [ddH2O]) übertragen. Durch sanftes Pipettieren gründlich mischen und über Nacht bei 16 °C inkubieren.

6. Vernetzungsumkehr und DNA-Reinigung

  1. Bauen Sie Proteine durch Zugabe von 50 μL 10 mg/ml Proteinase K pro Röhrchen ab und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 2 h. Umgekehrte Vernetzung durch Erhöhung der Temperatur auf 65 °C und Inkubation über Nacht.
  2. RNA durch Zugabe von 20 μL 10 mg/ml RNase A abbauen und 1 h lang bei 37 °C inkubieren.
  3. Führen Sie eine Phenol:Chloroform-Extraktion durch, gefolgt von einer Ethanolfällung.
    1. Fügen Sie 1 Volumen Phenol-Chloroform hinzu und mischen Sie gründlich durch Inversion, um eine homogene Weißphase zu erhalten.
      HINWEIS: Phenol ist eine gefährliche Chemikalie. Befolgen Sie die entsprechenden Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften. Arbeiten Sie im Abzug.
    2. Zentrifuge bei 15.000 × g für 15 min. Die wässrige Phase in ein frisches 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Führen Sie eine Rückextraktion der unteren Schicht mit 100 μL TLE-Puffer durch und übertragen Sie die wässrige Phase in dasselbe 2-ml-Röhrchen.
    3. Ausfällung der DNA durch Zugabe von 2 Volumina 100% Ethylalkohol (EtOH), 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 μL 20 mg/ml Glykogen. Bei -20 °C für einen Zeitraum von 2 h bis über Nacht inkubieren.
    4. Bei 15.000 × g 30 min bei 4 °C schleudern und die Pellets 2x mit eiskaltem 70% EtOH waschen. Trocknen Sie die Pellets bei RT und bürsten Sie sie in 100 μL TLE-Puffer wieder auf. Quantifizieren Sie die DNA mit einem fluorogenen Farbstoff, der selektiv an DNA bindet, und einem Fluorometer gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialtabelle).
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Lagern Sie Ligationsprodukte kurzfristig bei 4 °C oder langfristig bei -20 °C. Verwenden Sie ein Aliquot (100 ng) des Materials als ligierte Probe (L) zur Qualitätskontrolle.

7. Bewerten Sie die Qualität der Hi-C-Vorlage

  1. Qualitative Kontrollen von Verdauung und Ligation
    1. Reinigen Sie DNA von den UD- und D-Aliquoten, indem Sie die Vernetzungen umkehren, und führen Sie die Phenol:Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung wie oben beschrieben durch.
    2. Laden Sie 100 ng UD-, D- und L-Proben in ein 1,5% iges Agarosegel. Suchen Sie nach einem Abstrich um 500 bp in der D-Probe im Vergleich zu einem hochmolekularen Band für die L-Probe (siehe repräsentative Ergebnisse).
  2. Aufschlusseffizienz quantitative Kontrolle
    HINWEIS: Um die Aufschlusseffizienz genauer zu beurteilen, verwenden Sie die UD- und D-Proben als Vorlagen, um quantitative Polymerase-Kettenreaktionen (qPCR) mit Primern durchzuführen, die wie folgt entwickelt wurden.
    1. Entwerfen Sie ein Primerpaar, das ein DNA-Fragment amplifiziert, das die DNA-Restriktionsstelle für das für die Verdauung verwendete Enzym (Mbo I im vorliegenden Protokoll) enthält, das in der Formel in Schritt 7.2.3 R genannt wird.
    2. Entwerfen Sie ein Primerpaar, das ein Kontroll-DNA-Fragment amplifiziert, das nicht die Restriktionsstelle für das für die Verdauung verwendete Enzym (Mbo I für das vorliegende Protokoll) enthält, das in der Formel in Schritt 7.2.3 als C bezeichnet wird.
    3. Verwenden Sie die Zyklusschwellenwerte (Ct-Werte) der Verstärkung, um die Restriktionseffizienz gemäß der unten gezeigten Formel zu berechnen:
      % Restriktion = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
      Dabei bezieht sich CtR auf den Ct-Wert von Fragment R und CtC auf den Ct-Wert des Fragments C für Probe D und Probe UD.
      HINWEIS: Der Restriktionsprozentsatz spiegelt die Effizienz des Restriktionsenzyms wider, das das eingeschränkte (R) DNA-Fragment spaltet, verglichen mit einem Kontroll-DNA-Fragment (C), das die Restriktions-DNA-Stelle nicht enthält. Ein Restriktionswirkungsgrad von ≥ 80% wird empfohlen.
  3. Erkennung bekannter Wechselwirkungen
    1. Führen Sie eine PCR durch, um eine interne Ligationskontrolle zu verstärken, um Wechselwirkungen mit kurzer und/oder mittlerer oder langer Reichweite zu untersuchen (siehe repräsentative Ergebnisse).
    2. Alternativ können Primer zur Verstärkung eines Ligationsprodukts, bei dem sich die Primer in Vorwärts-Vorwärts- oder Rückwärts-Rückwärts-Ausrichtung in benachbarten Restriktionsfragmenten befinden, entwerfen.
  4. Fill-in- und Biotin-Markierungskontrolle
    1. Überprüfung der Hi-C-Markierung und Ligationseffizienz durch Amplifikation und Verdauung einer bekannten Wechselwirkung oder eines Ligationsprodukts zwischen benachbarten Restriktionsfragmenten im Genom, wie oben beschrieben.
      HINWEIS: Erfolgreiches Fill-in und Ligation der Mbo I-Stelle (GATC) erzeugt eine neue Stelle für das Restriktionsenzym Cla I (ATCGAT) an der Ligationsstelle und regeneriert die Mbo-I-Stelle.
    2. Verdauen Sie das PCR-Produkt mit Mbo I, Cla I oder beidem. Nachdem Sie die Proben mit einem 1,5-2% igen Gel ausgeführt haben, schätzen Sie die relative Anzahl der 3C- und Hi-C-Ligationsverbindungen, indem Sie die Intensität der geschnittenen und ungeschnittenen Bänder quantifizieren26.
      HINWEIS: Ein Wirkungsgrad von > 70% ist erwünscht (siehe repräsentative Ergebnisse).

8. Beschallung

  1. Beschallen Sie die Proben, um 200-500 bp DNA-Fragmente zu erhalten. Für das in diesem Protokoll verwendete Instrument (siehe Materialtabelle) verdünnenSie die Probe (von 5 bis 10 μg) in 130 μL ddH2O pro Röhrchen und stellen Sie das Instrument auf 400 bp ein: Füllstand: 10; Zollfaktor: 10%; Spitzenleistung (w): 140; Zyklen pro Burst: 200; Zeit(en): 80.

9. Biotinentfernung/Endreparatur

HINWEIS: Die unten gezeigten Schritte sind für 5 μg Hi-C-DNA angepasst.

  1. Um die Biotinentfernung durchzuführen, wird die Probe (130 μL) in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Fügen Sie 16 μL 10x Ligationspuffer, 2 μL 10 mM dATP, 5 μL T4 DNA Polymerase (15U) und 7 μL ddH2O (160 μL Gesamtvolumen) hinzu. Bei 20 °C 30 min inkubieren.
  2. Fügen Sie 5 μL von 10 mM dNTPs, 4 μL 10x Ligationspuffer, 5 μL T4-Polynukleotidkinase (10 U/μL), 1 μL Klenow und 25 μL ddH2O (200 μL Des Gesamtvolumens) hinzu. Bei 20 °C 30 min inkubieren.

10. Größenauswahl

  1. Um Fragmente auszuwählen, die hauptsächlich im Größenbereich von 250-550 bp liegen, führen Sie zuerst eine sequenzielle SPRI-Größenauswahl (Solid Phase Reversible Immobilization) mit 0,6x durch, gefolgt von 0,90x gemäß den Anweisungen des Herstellers und eluieren Sie die DNA mit 100 μL TLE.

11. Biotin Pulldown / A-Tailing / Adapter-Ligation

HINWEIS: Führen Sie die Waschungen durch, indem Sie die magnetischen Perlen durch Wirbeln wieder aufwenden, drehen Sie die Proben für 3 Minuten auf einem rotierenden Rad und drehen Sie dann die Probe kurz herunter und legen Sie sie auf den magnetischen Ständer. Lassen Sie die Perlen am Magneten haften, verwerfen Sie den Überstand und fahren Sie mit dem folgenden Waschschritt fort. Führen Sie die Waschungen bei 55 °C auf einem Thermoblock mit Rotation anstelle des rotierenden Rades durch.

  1. Machen Sie das Endvolumen auf 300 μL pro Probe mit TLE für Pull-Down. Bereiten Sie die Perlenwaschpuffer vor: 1x Tween Buffer (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween), 0,5x TB, 1x No-Tween Puffer (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
  2. Verwenden Sie 150 μL Streptavidin-gebundene magnetische Perlen (siehe Materialtabelle)pro Bibliothek. Waschen Sie die Perlen 2x mit 400 μL 1x TB. Dann Perlen in 300 μL 2x NTB resuspendieren.
  3. Mischen Sie die Perlen mit dem 300 μL Hi-C-Material und inkubieren Sie bei RT für 30 Minuten auf einem rotierenden Rad, damit Biotin an Streptavidin-Perlen gebunden werden kann.
  4. Die Perlen mit 400 μL 0,5x TB waschen und bei 55 °C für 3 min inkubieren und mit 750 U/min drehen. Waschen Sie die Perlen in 200 μL 1x Restriktionspuffer.
  5. Die Perlen werden in 100 μL dATP-Tailing-Mischung (5 μL 10 mM dATP, 10 μL 10x Restriktionspuffer, 5 μL Klenow exo- und 80 μL ddH2 O)resuspendiert. Bei 37 °C 30 min inkubieren.
  6. Den Überstand entfernen, die Perlen 2x mit 400 μL 0,5x TB waschen, bei 55 °C für 3 min inkubieren und bei 750 U/min drehen.
  7. Waschen Sie die Perlen mit 400 μL 1x NTB und dann mit 100 μL 1x Ligationspuffer.
  8. Die Perlen in 50 μL 1x Ligationspuffer resuspendieren und die Suspension in ein neues Röhrchen überführen. Fügen Sie 4 μL vorgeglühte PE-Adapter (15 μM Vorrat) und 2 μL T4-Ligase (400 U / μL, dh 800 U / Röhrchen) hinzu; inkubieren Sie bei RT für 2 h.
    HINWEIS: Glühen Sie die Adapter vor, indem Sie gleiche Mengen von PE 1.0- und PE 2.0-Adaptern (30 μM-Bestand) hinzufügen und 10 Minuten bei RT inkubieren (siehe Materialtabelle).
  9. Fangen Sie die Perlen wieder ein, indem Sie den Überstand entfernen und die Perlen 2x mit 400 μL TB waschen. Waschen Sie die Perlen mit 200 μL 1x NTB, dann mit 100 μL 1x Restriktionspuffer und resuspendieren Sie die Perlen in 40 μL 1x Restriktionspuffer.

12. PCR-Amplifikation

  1. Richten Sie PCRs mit 25 μL Volumen mit 5, 6, 7 und 8 Zyklen ein. Verwenden Sie für jede PCR:
    Reaktionsrezept
    Hi-C Perlen2,5 μL
    10 μM PE PCR Primer 1 (Materialtabelle)0,75 μL
    10 μM PE PCR Primer 2 (Materialtabelle)0,75 μL
    10 mM dNTP0,6 μL
    5x Reaktionspuffer5 μL
    DNA-Polymerase0,3 μL
    ddH2O14,65 μL
    Gesamt25 μL
    ZyklenTemperaturZeit
    198 °C30 s
    n Zyklen98 °C10 s
    65 °C30 s
    72 °C30 s
    172 °C7 Min.

13. Endgültige PCR-Amplifikation

  1. Führen Sie die endgültige PCR-Amplifikation unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben und der Anzahl der ausgewählten Zyklen durch. Teilen Sie die Probe mit 5 μL Hi-C-Perlen als Vorlage in 50 μL-Reaktionen.
  2. Sammeln Sie alle PCR-Reaktionen und übertragen Sie sie in ein frisches Röhrchen. Verwenden Sie den Magneten, um die Streptavidin-Perlen zu entfernen und den Überstand (PCR-Produkte) wiederherzustellen. Die Perlen in ein frisches Röhrchen geben, die Perlen wie in Schritt 11.2.9 angegeben waschen und als Backup in 1x Restriktionspuffer bei 4 °C lagern.
  3. Reinigen Sie die PCR-Produkte mit dem 0,85-fachen Volumen der SPRI-Perlen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Elute mit 30 μL TLE-Puffer.
  4. Quantifizieren Sie die Hi-C-Bibliothek mit einem fluorometrischen Instrument und bestätigen Sie die Qualität der Bibliothek durch chipbasierte Kapillarelektrophorese.
  5. Verwenden Sie als letzten Qualitätskontrollpunkt 1 μL der Hi-C-Bibliothek als Vorlage, um eine PCR-Reaktion mit 10 Zyklen unter den gleichen Bedingungen durchzuführen, die in Schritt 12.1 beschrieben wurden. Teilen Sie das PCR-Produkt in zwei Mikrozentrifugenröhrchen auf: Verdauen Sie eine mit Cla I und lassen Sie die andere unverdaut als Kontrolle. Führen Sie die Produkte in einem 1,5-2% igen Agarosegel aus (siehe repräsentative Ergebnisse).
  6. Fahren Sie mit der 50 bp oder 75 bp Paired-End-Sequenzierung auf einer geeigneten Sequenzierungsplattform fort.

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Ergebnisse

Im Folgenden werden die Ergebnisse eines erfolgreichen Hi-C-Protokolls beschrieben (siehe eine Zusammenfassung des Hi-C-Protokollworkflows in Abbildung 1A). Während des Hi-C-Experiments im Kern gibt es mehrere Kontrollpunkte für die Qualitätskontrolle. Probenal aliquots wurden vor (UD) und nach (D) dem Chromatinrestriktionsschritt sowie nach der Ligatur (L) gesammelt. Die Vernetzung wurde umgekehrt und die DNA wurde gereinigt und auf einem Agarosegel ausgeführt. Ein Abstrich von 200-1000 bp ...

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Diskussion

Die hier vorgestellte In-Nucleus-Hi-C-Methode hat eine detaillierte Untersuchung der Drosophila-Genomtopologie mit hoher Auflösung ermöglicht und einen Überblick über genomische Interaktionen auf verschiedenen genomischen Skalen ermöglicht, von Chromatinschleifen zwischen regulatorischen Elementen wie Promotoren und Enhancern bis hin zu TADs und der Identifizierung großer Kompartimente25. Die gleiche Technologie wurde auch effizient auf Säugetiergewebe mit einigen Modifikationen angewendet

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die ZUSCHUSSNUMMER IN207319 des UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) und die Fördernummer 303068 des Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) unterstützt. == ist ein Masterstudent, der vom Science and Technology National Council (CONACyT) CVU Nummer 968128 unterstützt wird.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
16 % (vol/vol) Paraformaldehyd-LösungAgar ScientificR1026
Biotin-14-dATPInvitrogenCA1524-016
ClaI-EnzymNEBR0197S
COVARIS UltraschallgerätCovarisLE220-M220
Cut SmartNEBB72002S
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1xLife Technologies41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1Invitrogen65002
Fötales Rinderserum (FBS) steril filtriertSigmaF9665
Klenow Dna PolI großes FragmentNEBM0210L
Klenow exo(-)NEBM0210S
LigationspufferNEBB020S
MboI-EnzymNEBR0147M
NP40-IgepalSIGMACA-420Nichtionisches Tensid zur Zugabe in Lysepuffer
PE-Adapter 1.0Illumina5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'PE
Adapter 2.0Illumina5'-ACACTCTCTCCCTACACGACCT
CTTCCGATCT-3'PE
PCR Grundierung 1.0Illumina5'-AATGATACGGCGACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCT-3'PE
PCR Primer 2.0Illumina5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA
ACCGCTCTTCCGATCT-3'Phenol
: Chloroform:Isoamylalkohol 25:24:1SIGMAP2069
Primer 1 (bekannte Wechselwirkung, Abbildung 2A)Sigma5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Primer
2 (bekannte Wechselwirkungen, Abbildung 2A)Sigma5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'Proteaseinhibitor-Cocktailtablette
Roche4693132001
Proteinase KRoche3115879001
QubitThermoFisherQ33327
RNAseRoche10109142001 SPRI-Perlen
BeckmanB23318
T4-DNA-LigaseInvitrogen15224-025
T4-DNA-PolymeraseNEBM0203S
T4-Polynukleotidkinase (PNK)NEBM0201L
TaqPhusionNEBM0530SDNA-Polymerase
Triton X-100Nichtionisches Tensid zum Abschrecken von SDS

Referenzen

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
  4. Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
  5. Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
  6. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
  7. Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
  8. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  9. Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
  10. Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
  11. Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
  12. Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
  13. Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
  14. Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
  15. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
  16. Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82(2014).
  17. Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189(2018).
  18. Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
  19. Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
  20. Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403(2013).
  21. Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
  22. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  23. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  24. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175(2015).
  25. Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894(2020).
  26. Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).
  27. Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259(2015).
  28. Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093(2016).
  29. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310(2015).
  30. Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
  31. Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198(2015).
  32. Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189(2018).
  33. Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
  34. Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
  35. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137(2008).
  36. Ong, C. -T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
  37. Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
  38. Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
  39. Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
  40. Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
  41. Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
  42. Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
  43. Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).

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