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Neuroscience

जेब्राफिश में तैराकी के दौरान पीछे की पार्श्व रेखा Afferent न्यूरॉन्स की गतिविधि

Published: February 10, 2021 doi: 10.3791/62233
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Florida, The Whitney Laboratory for Marine Bioscience

Summary

हम एक मॉडल कशेरुकी बाल सेल प्रणाली में मोटर कमांड के दौरान afferent न्यूरॉन गतिविधि में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन।

Abstract

संवेदी प्रणाली व्यवहार निर्देशन के लिए आवश्यक संकेत इकट्ठा, लेकिन जानवरों को समझना चाहिए कि क्या जानकारी जैविक रूप से प्रासंगिक है । लोकोमोशन रफ़ू संकेत उत्पन्न करता है कि जानवरों को आसपास के वातावरण के प्रासंगिक संवेदी संकेतों से अलग होना चाहिए। उदाहरण के लिए, जब कोई मछली तैरती है, तो शरीर के लहरों से उत्पन्न प्रवाह का पता मेकेनोरेसेप्टिव न्यूरोमाट्स द्वारा लगाया जाता है, जिसमें बाल कोशिकाएं शामिल होती हैं, जो पार्श्व रेखा प्रणाली की रचना करती हैं। बाल कोशिकाओं तो संवेदी afferent न्यूरॉन्स के माध्यम से मस्तिष्क को सेंसर से तरल पदार्थ गति जानकारी संचारित । समवर्ती, मोटर कमांड के परिणामी निर्वहन संवेदी अधिभार को रोकने के लिए बाल कोशिकाओं को रिले किया जाता है। लोकोमोशन के दौरान भविष्य कहनेवाला मोटर संकेतों के निरोधात्मक प्रभाव के लिए लेखांकन, इसलिए, पार्श्व लाइन प्रणाली की संवेदनशीलता का मूल्यांकन करते समय महत्वपूर्ण है। हमने वीवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण विकसित किया है ताकि एक साथ जेब्राफिश लार्वा (4-7 दिन बाद निषेचन) में पीछे की पार्श्व रेखा afferent न्यूरॉन और वेंट्रल मोटर रूट गतिविधि की निगरानी की जा सके जो कई घंटों तक चलेगा। ढीले पैच क्लैंप तकनीक का उपयोग करके अफरेंट न्यूरॉन्स की बाह्य एकल रिकॉर्डिंग प्राप्त की जाती है, जो एकल या कई न्यूरॉन्स से गतिविधि का पता लगा सकती है। मोटर न्यूरॉन गतिविधि का पता लगाने के लिए ग्लास इलेक्ट्रोड के साथ त्वचा के माध्यम से वेंट्रल रूट रिकॉर्डिंग की जाती है। हमारा प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल एक अक्षुण्ण, व्यवहार कशेरुकी में मोटर व्यवहार में संवेदी इनपुट में अंतर्जात या पैदा परिवर्तन की निगरानी करने की क्षमता प्रदान करता है।

Introduction

मशीनोसेंसरी सिस्टम के एफेरेंट न्यूरॉन्स श्रवण और संतुलन के दौरान बालों की कोशिकाओं से मस्तिष्क को जानकारी प्रसारित करते हैं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डायरेक्ट रिकॉर्डिंग के जरिए एफेरेंट न्यूरॉन्स की संवेदनशीलता को उजागर कर सकती है। जबकि बालों की कोशिकाओं से पूरी कोशिका पैचिंग चुनौतीपूर्ण हो सकती है, डाउनस्ट्रीम अफ़रेंट न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग करना आसान है और नियंत्रित उत्तेजनाओं के जवाब में कार्रवाई क्षमताओं के आकलन की अनुमति देता है1,2,3। उत्तेजक बाल कोशिकाओं को उनके विक्षेप की ओर ले जाते हैं, जो मशीनी संरचनाओं को संशोधित करता है, इस प्रकार अफ़ोड़क न्यूरॉन्स4,5,6में एक्शन क्षमता (स्पाइक्स) में वृद्धि को ट्रिगर करता है। बाहरी उत्तेजनाओं के अभाव में, अफरेंट न्यूरॉन्स भी अनायास बाल कोशिकाओं से ग्लूटामेट रिसावके कारण7, 8के बाद के अफरेंट पोस्ट-सिनैप्टिक टर्मिनलों पर स्पाइक करते हैं, और संवेदनशीलता9,10को बनाए रखने की दिशा में योगदान करने के लिए दिखाए गए हैं। अफ़रीद गतिविधि की पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग बाल कोशिका संवेदनशीलता और सिग्नल गतिशीलता का अवलोकन करने में सक्षम बनाती है जो कम लौकिक संकल्प के साथ तकनीकों का उपयोग करना संभव नहीं है, जैसे माइक्रोफोनिक्स11,12 या कार्यात्मक कैल्शियम इमेजिंग13,14,15में। निम्नलिखित प्रोटोकॉल बाल कोशिका संवेदनशीलता में तात्कालिक परिवर्तन प्रकट करने के लिए मोटर आदेशों के साथ विषम गतिविधि समवर्ती की रिकॉर्डिंग की अनुमति देगा।

जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)न्यूरोमाट्स में निहित बाल कोशिकाओं का उपयोग करते हैं जो उनके शरीर के सापेक्ष पानी के आंदोलन का पता लगाने के लिए पार्श्व रेखा प्रणाली की रचना करते हैं, जिसका अनुवाद नौवहन16,17, 18,शिकारी परिहार, शिकार कैप्चर19,20और स्कूली शिक्षा21के लिए आवश्यक तंत्रिका संकेतों में किया जाता है। 22 , 23 , 24 ,श्वसन 22,25,26और भोजन27की गति से भी जल प्रवाह स्वयं उत्पन्न हो सकता है । इन व्यवहारों में दोहराव वाले आंदोलन शामिल हैं जो बालों की कोशिकाओं को थकान और संवेदन को ख़राब कर सकते हैं। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि पार्श्व रेखा प्रणाली बाहरी (बाहरी) और स्व-उत्पन्न (रीपरेंट) प्रवाह उत्तेजनाओं के बीच अंतर करती है। एक कोरोलरी डिस्चार्ज जेब्राफिश में लोकोमोशन के दौरान स्व-जनित प्रवाह संकेतों को क्षीण करता है। इस निरोधात्मक भविष्य कहनेवाला मोटर सिग्नल को इनपुट को संशोधित करने या रीपरेंट फीडबैक28 , 29के प्रसंस्करण में बाधा डालने के लिए संवेदी रिसेप्टर्स के लिए उतरते न्यूरॉन्स के माध्यम से रिले कियाजाताहै । इस फीडफॉरवर्ड सिस्टम को हमारी शुरुआती समझ में योगदान देने वाले मौलिक कार्य ने विट्रो की तैयारियों पर भरोसा किया जहां तंत्रिका सर्किट की कनेक्टिविटी और अंतर्जात गतिविधि को28, 30,32,32,34,34,35नहींरखा गया था । यह प्रोटोकॉल एक अक्षुण्ण तंत्रिका सर्किट को संरक्षित करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है जहां अंतर्जात प्रतिक्रिया गतिशीलता को बनाए रखा जाता है जिससे वीवो में कोरोलरी डिस्चार्ज की बेहतर समझ हो जाती है।

यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल में लार्वा जेब्राफिश में एक साथ पीछे की पार्श्व रेखा अफरेंट न्यूरॉन और मोटर न्यूरॉन गतिविधि की निगरानी कैसे की जाए, इसका वर्णन किया गया है। मोटर कमांड से पहले, दौरान और बाद में अफ़ोड़क संकेत गतिशीलता की विशेषता, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से वास्तविक समय, अंतर्जात प्रतिक्रिया में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो लोकोमोशन के दौरान बाल कोशिका संवेदनशीलता को संशोधित करता है। यह प्रोटोकॉल यह रेखांकित करता है कि प्रयोगों से पहले किन सामग्रियों को तैयार करने की आवश्यकता होगी और फिर यह बताता है कि ज़ेब्राफ़िश लार्वा को लकवा कैसे दिया जाए और तैयार किया जाए। प्रोटोकॉल का वर्णन करेगा कि मोटर न्यूरॉन्स की अफरेंट न्यूरॉन्स और एक्सेसेलुलर वेंट्रल रूट (वीआर) रिकॉर्डिंग की एक स्थिर ढीली पैच रिकॉर्डिंग कैसे स्थापित की जाए। प्रतिनिधि डेटा है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है एक आदर्श व्यक्ति से प्रस्तुत कर रहे है और विश्लेषण प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के कई प्रतिकृति पर किया गया था । डेटा की प्री-प्रोसेसिंग मैटलैब में कस्टम लिखित लिपियों का उपयोग करके की जाती है। कुल मिलाकर, वीवो प्रयोगात्मक प्रतिमान में यह एक मॉडल कशेरुकी बाल सेल प्रणाली में लोकोमोशन के दौरान संवेदी प्रतिक्रिया की बेहतर समझ प्रदान करने के लिए तैयार है।

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Protocol

सभी पशु देखभाल और प्रयोगों फ्लोरिडा के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया ।

1. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए सामग्री की तैयारी

  1. एक सिलिकॉन इलास्टोमर-तली रिकॉर्डिंग डिश बनाएं।
    1. एक कवर ग्लास तली ऊतक संस्कृति पकवान में स्वयं मिश्रण सिलिकॉन इलास्टोमर घटकों (जैसे, सिलगार्ड) की एक पतली परत बांटना जब तक यह उथले अच्छी तरह से रिम के साथ स्तर । लगभग 0.5 एमएल पर्याप्त है।
    2. कमरे के तापमान पर न्यूनतम 48 घंटे के लिए डिश को कवर और ठीक करें।
  2. विच्छेदन पिन बनाएं।
    1. डीसी बिजली आपूर्ति का उपयोग करके व्हांट (3एम कोह) के 100 एमएल बीकर को नकारात्मक चार्ज (5 वी) प्रदान करें और सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए आउटपुट के लिए टंगस्टन तार (0.002 इंच; 50.8 माइक्रोन व्यास) संलग्न करें।
      सावधानी: नकारात्मक और सकारात्मक तारों को इस प्रक्रिया के दौरान एक दूसरे से संपर्क नहीं करना चाहिए क्योंकि आप स्पार्क्स के उत्पादन का जोखिम चला सकते हैं, जो संभावित आग का खतरा पैदा कर सकता है।
    2. एचीएच टंगस्टन तार जल्दी से और बार-बार तार की नोक को नक़्क़ाशी स्नान में डुबोएं जब तक कि टिप एक तेज बिंदु तक संकरी न हो जाए। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, तार को सीधे किनारे रेजर ब्लेड के साथ टिप से लगभग 1 मिमी काटें। तीन बार और दोहराएं और फिर ठीक संदंश का उपयोग कर ठीक रिकॉर्डिंग डिश में पिन डालें।
  3. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड तैयार करें।
    1. एक बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका ट्यूब (आंतरिक व्यास: 0.86 मिमी, बाहरी व्यास: 1.50 मिमी) को एक क्षैतिज माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके इलेक्ट्रोड में बॉक्स फिलामेंट का उपयोग करके मामूली टेपर(चित्रा 1 एआई)के साथ इलेक्ट्रोड में 30 माइक्रोन व्यास टिप के साथ, जिसका उपयोग पीछे की पार्श्व रेखा से एकफरेंट न्यूरॉन्स को रिकॉर्ड करने के लिए किया जाएगा।
    2. छोटे टिप व्यास (1-5 माइक्रोन) के साथ इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी में एक अतिरिक्त बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका ट्यूब खींचें। प्रत्येक हाथ में एक इलेक्ट्रोड पकड़े हुए, धीरे से एक दूसरे भर में सुझावों को चलाने के लिए उंहें एक ~30 ° कोण को तोड़ने के लिए । माइक्रोफॉर्ज का उपयोग करके, चिकनी होने तक बेवल टिप पॉलिश करें। अंतिम टिप व्यास 30-50 माइक्रोन के बीच होना चाहिए और इसका उपयोग वेंट्रल रूट (वीआर) रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड(चित्रा 1 एआईआई)के रूप में किया जाएगा।
    3. हेडस्टेज (चरण 3.2) के पिपेट धारक में इलेक्ट्रोड डालने पर टिप अपर्चर को नीचे की ओर उन्मुख करने में सहायता करने के लिए स्थायी स्याही के साथ अग्रणी किनारे के साथ वीआर इलेक्ट्रोड के किनारे को चिह्नित करें।
      नोट: वीआर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का यांत्रिक संशोधन गलत है और चरण 1.3.2 को चमकाने से पहले उपयुक्त टिप आकृति विज्ञान प्राप्त होने तक कई प्रयासों की आवश्यकता हो सकती है। वीआर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड लार्वा के शरीर वक्र के अनुरूप होता है। एक बार गढ़े जाने के बाद वीआर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का इस्तेमाल तब तक बार-बार किया जा सकता है जब तक कि टिप प्रयोगों के बीच स्पष्ट और साफ रहती है ।
  4. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग कार्यक्रमों में प्रोटोकॉल उत्पन्न करें।
    1. सुनिश्चित करें कि दाएं हेडस्टेज को एफेरेंट न्यूरॉन रिकॉर्डिंग के लिए माइक्रोइलेक्ट्रोड करंट और वोल्टेज क्लैम्प एम्पलीफायर के पीछे चैनल 1 इनपुट से जुड़ा हुआ है और लेफ्ट हेडस्टेज वीआर रिकॉर्डिंग के लिए चैनल 2 इनपुट से जुड़ा हुआ है ।
      नोट: वर्तमान और वोल्टेज क्लैम्प एम्पलीफायर के लिए कंप्यूटर स्पेसिफिकेशन के लिए न्यूनतम रूप से 1 Ghz या एक बेहतर प्रोसेसर, विंडोज एक्सपी प्रो या मैक ओएस एक्स 10.46.6, सीडी-रोम ड्राइव के साथ 512 एमबी रैम, 500 एमबी हार्ड ड्राइव स्पेस और 2 यूएसबी पोर्ट की आवश्यकता होती है।
    2. कंप्यूटर नियंत्रित एम्पलीफायर सॉफ्टवेयर खोलें।
    3. प्रत्येक चैनल के लिए आईसी बटन पर क्लिक करके चैनल 1 और चैनल 2 को वर्तमान क्लैंप मोड में सेट करें।
    4. आई-क्लैंप 1 और आई-क्लैंप 2 टैब दोनों के तहत निम्नलिखित मापदंडों को इनपुट करें। प्राथमिक उत्पादन: 100x एसी झिल्ली क्षमता (100,000 mV/mV), लाभ:1,000, Bessel:1 kHz, एसी:300 हर्ट्ज, स्कोप:बाईपास । माध्यमिक उत्पादन: 100x एसी झिल्ली क्षमता (100 mV/mV), लाभ:1, लोपास फिल्टर: 10 हर्ट्ज।
    5. Ch1_Aff और Ch2_VR के रूप में चैनल मापदंडों कोबचाओ ।
    6. पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर स्थापित करें और खोलें।
    7. कॉन्फ़िगर पर क्लिक करें और Ch1_Aff और Ch2_Vr को डिजिटाइज़र चैनलों (जैसे, एनालॉग इन #0 और एनालॉग इन #1) मेंजोड़कर एनालॉग सिग्नल स्थापित करने के लिए लैब बेंच का चयन करें, जो बीएनसी कोक्सियल केबल द्वारा इसी चैनल 1 और चैनल 2 स्केल्ड आउटपुट एम्पलीफायर से जुड़े हुए हैं। ठीक हैपर क्लिक करें ।
      नोट: डिजिटाइज़र के लिए न्यूनतम कंप्यूटर आवश्यकताएं हैं: एक 1 Ghz या बेहतर प्रोसेसर, विंडोज एक्सपी प्रो या मैक ओएस एक्स 10.46.6, सीडी-रोम ड्राइव 512 एमबी रैम, 500 एमबी हार्ड ड्राइव स्पेस, और 2 यूएसबी पोर्ट।
    8. अधिग्रहण पर क्लिक करें और नए प्रोटोकॉलका चयन करें ।
    9. मोड/रेट टैब में, गैप फ्रीचुनें; अधिग्रहण मोडके तहत, या तो उपलब्ध डिस्क स्पेस (यानी, रिकॉर्ड जब तक बंद हो जाए) या एक वांछित सेट अवधि (एचएच: मिमी: एसएस)का उपयोग करने के लिए परीक्षण लंबाई निर्धारित करें, और फिर संकल्प को अधिकतम करने के लिए प्रति सिग्नल (हर्ट्ज) को 20,000 तक नमूना दर निर्धारित करें।
    10. इनपुट्स टैब के तहत, एनालॉग इन चैनलों का चयन करें जिन्हें पहले कॉन्फ़िगर किया गया था (चरण 1.4.6 में) और इसी चैनल के लिए Ch1_Aff और Ch2_VR का चयन करें।
    11. आउटपुट टैब के तहत, क्रमशः चैनल #0 और चैनल #1 के लिए सीएमडी 0 और सीएमडी 1 काचयन करें।
      1. चैनल 1 कमांड को एम्पलीफायर पर एनालॉग Ouput 0 से बीएनएससी कोक्सियल केबल के माध्यम से डिजिटाइजर पर कनेक्ट करें और चैनल 2 कमांड के लिए एनालॉग आउटपुट 1 के लिए दोहराएं।
    12. शेष टैब डिफ़ॉल्ट सेटिंग के तहत रह सकते हैं। ठीक है पर क्लिक करें और प्रोटोकॉल को बचाने के लिए।

2. समाधान तैयारी

  1. हैंक का समाधान तैयार करें: 137 mM NaCL, 5.4 m M KCL, 0.25 mMNa 2HPO4,0.44 mM KH2PO4,1.3 m M CaCl2,1.0 m M M MgSO4,4.2 mM NaHCO4; पीएच 7.3. स्टॉक में डिएकाइज्ड पानी की उचित मात्रा जोड़कर 10% हैंक के समाधान को पतला करें।
  2. एक्सट्रासेलुलर सॉल्यूशन तैयार करें: 134 एमएम एनएसीएल, 2.9 एमएम केसीएल, 1.2 एमएम एमजीसीएल2,2.1 एमएम सीसीएल2,10 एमएम ग्लूकोज, 10 एमएम एचईपीई बफर; पीएच 7.8 नाओएच के साथ समायोजित। 0.22 माइक्रोन पोर आकार के साथ फिल्टर के माध्यम से वैक्यूम फ़िल्टर एक्सट्रासेलुलर समाधान।
  3. α तैयार करें - बंगारोटॉक्सिन: 0.1% कमजोर पड़ने का उत्पादन करने के लिए 10 एमएल एक्स्ट्रासेलुलर समाधान में 1 मिलीग्राम लियोफिलाइज्ड α-बंगारोटॉक्सिन को भंग करें।
  4. इच्छामृत्यु समाधान तैयार करें: 10% हैंक के समाधान में 50% (मिलीग्राम/एल) बफर फार्मास्यूटिकल-ग्रेड एमएस-222।
    सावधानी: α-बुंगारोटॉक्सिन एक शक्तिशाली न्यूरोटॉक्सिन है जो कोलिनेर्गिक रिसेप्टर्स को अवरुद्ध करके मांसपेशियों को लकवा देता है। दस्ताने की आवश्यकता होती है और लकवा ग्रस्त लोगों को संभालते समय आंखों की सुरक्षा की सिफारिश की जाती है।

3. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए लार्वा की तैयारी

  1. जेब्राफिश लार्वा को स्थिर करें।
    1. जेब्राफिश की प्रयोगशाला नस्ल की आबादी से लार्वा का उपयोग करें(दानियो रेरियो;निषेचन के बाद 4-7 दिन) और भ्रूण समाधान में घर (10% हैंक का समाधान) 27 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. बड़े-इत्तला वाले स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके आवास से लार्वा को एक छोटे पेट्री डिश (35 मिमी) में स्थानांतरित करें और जितना संभव हो उतना आसपास के समाधान को हटा दें।
      नोट: भ्रूण के समाधान को हटाने से लकवाग्रस्त होने से रोका जा सकता है और इसकी प्रभावकारिता बढ़ जाती है। एक कार्य पोंछ के कोने का उपयोग शेष भ्रूण समाधान को दूर करने के लिए किया जा सकता है, और लार्वा से संपर्क नहीं करना या लार्वा को हवा के संपर्क में छोड़ना महत्वपूर्ण है।
    3. लगभग 5 मिनट के लिए 0.1% α-बुंगारोटॉक्सिन के 10 माइक्रोल में लार्वा विसर्जित करें।
      नोट: लार्वा को स्थिर करने के लिए आवश्यक समय तैयारी के बीच भिन्न होता है। एक स्वस्थ तैयारी निरंतर तेजी से रक्त प्रवाह और मोटर प्रतिक्रियाओं में कमी की बारीकी से निगरानी पर निर्भर करता है। लकवाग्रस्त लोगों को संक्षिप्त ओवरएक्सपोजर पूरी तरह से धोने के बाद भी तैयारी के समग्र स्वास्थ्य में धीमी गिरावट का कारण बन सकता है। लार्वा को पूरी तरह से स्थिर करने से पहले धोने को लागू करना सबसे अच्छा है, जबकि यह अभी भी सूक्ष्म मांसपेशियों के कंपन के लक्षण दिखाता है।
    4. झोले के साथ लार्वा को एक्सपेरिमेंटल सॉल्यूशन से धोएं और 10 मिनट तक नहाएं।
      नोट: वॉशआउट लार्वा को सूक्ष्म मांसपेशियों के कंपन से पक्षाघात को पूरा करने के लिए संक्रमण करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, α-बंगारोटॉक्सिन निकोटीन एसीटाइलकोलिन रिसेप्टर (एनएएचआर) α9-सबयूनिट का विरोधी है, जो इस प्रोटोकॉल का अवलोकन करने वाले अंतर्जात प्रतिक्रिया सर्किट का एक महत्वपूर्ण घटक है; हालांकि , 10 मिनट वॉशआउट36,29के बाद ज़ेनोपस और जेब्राफिश हेयर सेल्स में यह प्रभाव प्रतिवर्ती दिखाया गया है ।
  2. रिकॉर्डिंग डिश में पिन मछली।
    नोट: लार्वा ज़ेब्राफिश (4-7 डीपीएफ) तैयार करते समय एनेस्थीसिया (जैसे, एमएस-222, ट्राइकेन) की आवश्यकता नहीं होती है क्योंकि यह पशु स्वास्थ्य में हस्तक्षेप करता है। वास्तव में, लार्वा जेब्राफिश कुछ कशेरुकी प्रोटोकॉल से मुक्त हैं।
    1. स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके, लार्वा को एक्सपेरिलिएलर सॉल्यूशन बाथ से सिलिकॉन-तली रिकॉर्डिंग डिश में ले जाएं। एक्सट्रासेलुलर सॉल्यूशन के साथ डिश के शेष को भरें।
    2. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, धीरे-धीरे लार्वा को सिलिकॉन चटाई के केंद्र के ऊपर ठीक-इत्तला देने वाले संदंश के साथ स्थिति, पार्श्व की ओर, शरीर के पूर्वकाल और पीछे के सिरों के साथ क्रमशः बाएं से दाएं चल रहे हैं। फिर ठीक-इत्तला दी संदंश का उपयोग करके सिलिकॉन चटाई से एक नक़्क़ाशी पिन को समझें और लार्वा के पृष्ठीय नोटोकॉर्ड के माध्यम से सीधे गुदा के पृष्ठीय नोटोकॉर्ड के माध्यम से सिलिकॉन में पिन, ऑर्थोगोनली डालें। पूंछ के अंत के पास नोटोकॉर्ड के माध्यम से दूसरा पिन डालें और तीसरे पिन को गैस मूत्राशय(चित्रा 1B)के नोटोओकॉर्ड पृष्ठीय के माध्यम से डालें।
      नोट: पिन डालते समय, रक्त प्रवाह को रोकने या आसपास की मांसपेशी को नुकसान पहुंचाने से रोकने के लिए नोटोकॉर्ड चौड़ाई के केंद्र को लक्षित करना महत्वपूर्ण है। नोटोकॉर्ड पीछे की पार्श्व रेखा तंत्रिका के लिए पृष्ठीय है, इसलिए उचित पिनिंग के साथ, पार्श्व रेखा संवेदी न्यूरॉन्स को कोई नुकसान होने की उम्मीद नहीं है। आसपास के ऊतकों को परेशान न करने के लिए पहले संपर्क के बाद डालें। आदर्श रूप से, पिन का व्यास साफ प्रविष्टि सुनिश्चित करने के लिए नोटोकॉर्ड की चौड़ाई से आधे से भी कम है। यदि पिन इस चौड़ाई से अधिक है, तो वांछित पिन चौड़ाई प्राप्त होने तक चरण 1.2 दोहराएं। यदि पिनिंग के बाद रक्त प्रवाह धीमा हो जाता है, तो एक नए नमूने के साथ चरण 1.3 से दोहराएं।
    3. पूर्वकाल की ओर थोड़ा सा रोटेशन प्रदान करते हुए चौथा पिन डालें क्योंकि पिन एनकैप्सुलेंट(चित्रा 1B) में सम्मिलित होता है। जैसा कि थोड़ा सा रोटेशन लागू किया जाता है, क्लीथ्रम और ओटिक वेसिकल के बीच ऊतक के लिए देखने के लिए afferent सोमाता के क्लस्टर प्रकट करते हैं ।
      नोट: चौथे पिन का कोण सम्मिलन पीछे पार्श्व रेखा के जोखिम को सुनिश्चित करना है, जो अन्यथा बड़ेोटिक वेसिकल द्वारा बाधित है।

4. वेंट्रल रूट रिकॉर्डिंग

  1. एक निश्चित चरण अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) ईमानदार माइक्रोस्कोप पर 10x पानी विसर्जन उद्देश्य के तहत टिकी लार्वा रखें और बाएं हेडस्टेज दृष्टिकोण वेक्टर(चित्रा 1 बी)के समानांतर मांसपेशियों के ब्लॉकों के माईसेप्टल क्लीफ को उन्मुख करें।
    1. ऑप्टिकल एयर टेबल पर जारी एक निश्चित चरण डीआईसी माइक्रोस्कोप रिकॉर्डिंग के साथ हस्तक्षेप करने से कंपन को रोकने के लिए सबसे अच्छा काम करता है। एक मोटराइज्ड पोजिशनर का उपयोग करके, माइक्रोस्कोप तब निश्चित चरण के चारों ओर स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित हो सकता है जिसमें तैयारी और हेडस्टेज(चित्रा 1C)लगाए जाते हैं।
    2. जमीन के तार को स्नान समाधान में रखें और सुनिश्चित करें कि यह बाएं हेडस्टेज से जुड़ा हुआ है।
  2. एक लचीला जेल-लोडिंग पिपेट टिप का उपयोग करके 30 माइक्रोन एक्सट्रासेलुलर समाधान के साथ वीआर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड भरें और बाएं हेडस्टेज पिपेट धारक में डालें।
  3. न्यूमेटिक ट्रांसड्यूसर द्वारा उत्पादित सकारात्मक दबाव (1-2 एमएमएचजी) लागू करते समय एक माइक्रोमैनीपुलेटर के साथ रिकॉर्डिंग पिपेट को कम करें। 10x आवर्धन के तहत, टिप अपर्चर के अभिविन्यास की पुष्टि नीचे की ओर है।
    1. वायवीय ट्रांसड्यूसर सिलिकॉन ट्यूबिंग के माध्यम से पिपेट धारक बंदरगाह से जुड़ा होना चाहिए।
  4. वीआर इलेक्ट्रोड को मायोसेप्टम पर रखें
    1. माइक्रोमैनीपुलेटर का फिर से उपयोग करना, वीआर इलेक्ट्रोड टिप को तब तक कम करें जब तक कि यह लार्वा के ऊपर स्थिति नहीं पकड़ रहा हो। 40x विसर्जन करने के लिए आवर्धन बढ़ाएं।
    2. दो मायोमेरेस वेंट्रल के बीच एक मायोसेप्टम पर इलेक्ट्रोड टिप को पार्श्व रेखा पर लाएं जब तक कि फांक वीआर इलेक्ट्रोड टिप अपर्चर(चित्रा 1D)में केंद्रित न हो जाए।
    3. टिप अपर्चर के पिछड़ते किनारे धीरे एपिथेलियम से संपर्क करने तक पिपेट को कम करें। प्रारंभिक संपर्क के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए पिपेट को तिरछे पैंतरेबाज़ी करें कि अग्रणी किनारा संपर्क करता है और एक सील उत्पन्न कर सकता है।
    4. वायवीय ट्रांसड्यूसर और होल्ड के साथ नकारात्मक दबाव (~ 100 मिमी एचजी) लागू करें।
      नोट: मायोसेप्टम और निरंतर नकारात्मक दबाव के सापेक्ष वीआर पिपेट का उचित अभिविन्यास त्वचा के माध्यम से उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ मोटर न्यूरॉन गतिविधि का पता लगाने का अनुकूलन करता है।
  5. मोटर न्यूरॉन गतिविधि का पता लगाएं।
    1. बाएं हेडस्टेज को एम्पलीफायर से जोड़ा जाना चाहिए, जो एक डिजिटाइजर में प्रवर्धित संकेत को रिले करता है जो एक आसन्न कंप्यूटर पर निगरानी करने के लिए पैच क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर में उक्त सिग्नल को आउटपुट करता है (सेक्शन 1.4 देखें)।
    2. पैच क्लैंप सॉफ्टवेयर में वीआर सिग्नल(चित्रा 1E)की निगरानी के लिए टूल बार पर प्ले बटन पर क्लिक करें ।
    3. सुनिश्चित करें कि वीआर रिकॉर्डिंग एक बार मोटर न्यूरॉन गतिविधि को अच्छी तरह से टकसाली फट सिग्नल गतिशीलता के साथ प्राप्त किया जा रहा है29,37 (चित्रा 1E)मनाया जाता है।
      नोट: Fictive तैरना मुकाबलों VR मोटर न्यूरॉन्स की गतिविधि पैटर्न है कि तैयारी के बावजूद संचारित करने के लिए जारी है झोले के मारे हुए हैं । इसलिए, काल्पनिक तैरते जानवर की व्यवहार स्थिति का निर्धारण करने और लोकोमोटर मापदंडों को मापने का एक सुलभ साधन हैं, जबकि साथ ही एक स्थिर न्यूरॉन रिकॉर्डिंग का प्रदर्शन करते हैं जिसके लिए एक स्थिर तैयारी की आवश्यकता होती है। हमारे हाथों में, एक बार एक VR रिकॉर्डिंग हासिल की है, एक स्वस्थ तैयारी स्वैच्छिक काल्पनिक तैरना हर कुछ सेकंड प्रकाश में लाना होगा । याद रखें, एक स्वस्थ तैयारी तेजी से रक्त प्रवाह निरंतर है। सलाह दी जाए, पर्याप्त वीआर सिग्नल प्राप्त करने में कई मिनट लग सकते हैं और प्रारंभिक पता लगाने के बाद सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार हो सकता है। समय के हित में धारा 5 पर आगे बढ़ना स्वीकार्य है।
    4. यदि धारा 5 को पूरा करने के बाद वीआर रिकॉर्डिंग अभी भी प्राप्त नहीं की जाती है, तो नकारात्मक दबाव जारी करें, इलेक्ट्रोड बढ़ाएं, और एक अलग मायसेप्टम पर आगे 4.4.2 कदम से दोहराएं यदि लार्वा स्वास्थ्य अभी भी इष्टतम है।

5. Afferent न्यूरॉन रिकॉर्डिंग

  1. एक्सट्रासेलुलर समाधान के 30 माइक्रोन के साथ एफेरेंट रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड भरें; वायवीय ट्रांसड्यूसर द्वारा उत्पादित सकारात्मक दबाव (1-2 मिमी एचजी) लागू करते समय सही हेडस्टेज पिपेट धारक(चित्रा1बी, सी)में डालें और डिश समाधान में कम करें।
  2. पीछे पार्श्व रेखा के पीछे की रेखा से पता लगाएं और शिथिल रूप से संलग्न करें।
    1. माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करके, एफरेंट इलेक्ट्रोड टिप को तब तक कम करें जब तक कि यह क्लीथ्रम के ऊपर स्थिति नहीं पकड़ रहा हो।
    2. 40x विसर्जन करने के लिए आवर्धन बढ़ाएं और पीछे पार्श्व रेखा तंत्रिका और क्लीथ्रम के चौराहे का पता लगाएं। क्लीथ्रम से पार्श्व रेखा तंत्रिका पूर्वकाल का पालन करें जहां फाइबर पीछे की पार्श्व रेखा के अफ़्रीक गैंगलियन को आंतरिक रूप देते हैं, जो सोमा(चित्रा 1F)के असतत क्लस्टर द्वारा अलग किया जा सकता है।
    3. एपेरेंट गैंगलियन पर इलेक्ट्रोड टिप लाएं और पिपेट को तब तक कम करें जब तक कि टिप एपिथेलियम से संपर्क न करे। धीरे-धीरे, इलेक्ट्रोड को पैंतरेबाज़ी करें ताकि पूरी टिप परिधि अफरेंट गैंगलियन से संपर्क करे।
    4. वायवीय ट्रांसड्यूसर और होल्ड के साथ नकारात्मक दबाव (20-50 मिमी एचजी) लागू करें।
      नोट: अफ़रीद गैंगलियन पर लागू नकारात्मक दबाव वेंट्रल रूट रिकॉर्डिंग के दौरान लागू सक्शन की तुलना में जेंटलर है। नकारात्मक दबाव बढ़ाने से सिग्नल-टू-शोर में सुधार हो सकता है, लेकिन निरंतर आक्रामक सक्शन के तहत अफरेंट न्यूरॉन स्वास्थ्य में गिरावट आती है, जो एक सफल रिकॉर्डिंग की संभावना को कम करता है।
  3. रिकॉर्ड अफ़र्सेंट न्यूरॉन गतिविधि।
    1. सुनिश्चित करें कि सही हेडस्टेज एक समान अनुक्रम में जुड़ा हुआ है जैसा कि चरण 4.5.1 में वर्णित है।
    2. pClamp10 में, एक साथ afferent न्यूरॉन और वीआर सिग्नल की निगरानी करने के लिए टूल बार पर प्ले बटन पर क्लिक करें।
    3. सुनिश्चित करें कि पूरे सेल, afferent न्यूरॉन्स के ढीले पैच रिकॉर्डिंग हासिल की है एक बार स्पाइक्स अनायास होते हैं, मोटे तौर पर हर 100-200 एमएस1,29 (चित्रा 1E)।
    4. धीरे-धीरे, एफ़रेंट न्यूरॉन रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड दबाव को वायुमंडलीय (0 मिमी एचजी) में वापस बढ़ाएं और शेष रिकॉर्डिंग के लिए पकड़ें।

6. डेटा अधिग्रहण

  1. एक साथ रिकॉर्डिंग।
    1. एक बार afferent न्यूरॉन और मोटर न्यूरॉन गतिविधि दोनों का पता चला रहे हैं, pClamp10 में टूल बार पर रिकॉर्ड बटन पर क्लिक करें दोनों चैनलों में एक साथ अंतर मुक्त रिकॉर्डिंग पर कब्जा करने के लिए ।
    2. वांछित अवधि के लिए रिकॉर्ड(चित्रा 1E)।
      नोट: एक स्वस्थ तैयारी में एक रिकॉर्डिंग कई घंटों तक चल सकती है और बाहरी उत्तेजनाओं के प्रति उत्तरदायी रह सकती है।
    3. अधिग्रहण मापदंडों जैसे मेटाडेटा को संरक्षित करने के लिए एक समर्थित फ़ाइल प्रकार (.abf, pClamp10) के रूप में रिकॉर्डिंग को सहेजें।

7. इच्छामृत्यु

  1. वायवीय ट्रांसड्यूसर का उपयोग करके अफरेंट और वीआर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड दोनों पर सकारात्मक दबाव (10 मिमी एचजी) लागू करें और माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करके रिकॉर्डिंग डिश से इलेक्ट्रोड उठाएं।
  2. रिकॉर्डिंग डिश को फिक्स्ड स्टेज डीआईसी माइक्रोस्कोप से विच्छेदन स्टीरियोमाइक्रोस्कोप में स्थानांतरित करें।
  3. ठीक टिप संदंश का उपयोग करके, नोटोकॉर्ड औरोटिक कैप्सूल से टंगस्टन पिन हटा दें, और लार्वा को एक पेट्री डिश (35 मिमी) में स्थानांतरित करें जिसमें कम से कम 5 मिनट के लिए इच्छामृत्यु समाधान का 5 एमएल होता है।

8. प्री-प्रोसेसिंग और डेटा-विश्लेषण

नोट: डेटा प्री-प्रोसेसिंग और विश्लेषण के लिए कमांड लाइन कोडिंग की बुनियादी समझ की आवश्यकता होगी।

  1. प्री-प्रोसेसिंग के लिए रिकॉर्डिंग फाइल को कन्वर्ट करें।
    1. मटलैब सॉफ्टवेयर इंस्टॉल करें।
    2. कस्टम लिखित स्क्रिप्ट, abfload.m38 डाउनलोड करें और फ़ाइल को उसी फ़ोल्डर में सहेजें जो कच्ची रिकॉर्डिंग फ़ाइल को संग्रहीत करता है।
    3. मतलैब एडिटर विंडो में, एबीएफलोड खोलें.m और टूल बार पर रन पर क्लिक करें। यदि प्रेरित किया जाए तो परिवर्तन फ़ोल्डरचुनें.
    4. इनपुट के रूप में कच्चे रिकॉर्डिंग फ़ाइल के साथ कमांड विंडो में फ़ंक्शन निष्पादित करें,
      > [d,si,h] = abfload('[कच्ची रिकॉर्डिंग फ़ाइल नाम].abf')
      और एक फ़ाइल नाम के साथ आउटपुट कार्यक्षेत्र को सहेजें जिसमें लार्वा पदनाम, आयु और प्रयोगात्मक तिथि जैसे [नमूना संख्या]_[डीपीएफ में आयु] _[कच्ची रिकॉर्डिंग फ़ाइल नाम (डिफ़ॉल्ट रूप से प्रयोगात्मक तिथि शामिल है)] ।
      नोट: परिवर्तित फ़ाइल नाम में केवल रेखांकित करने वाले पूर्णांक शामिल होने चाहिए।
  2. डेटा प्री-प्रोसेसिंग करें।
    1. मतलैब स्क्रिप्ट AffVR_preprocess.m और संबंधित कार्यों, लेखकों द्वारा लिखित कस्टम डाउनलोड करें।
    2. संपादक खिड़की में, AffVR_preprocess.m खोलें।
    3. वेरिएबल्सके तहत, सिग्नल-टू-शोर अनुपात की रिकॉर्डिंग के आधार पर क्रमशः spk_detect_lb औरvr_detect_lb, लाइन8 और 14 दोनों के लिए लोअर बाउंड स्पाइक डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड को समायोजित करें।
      नोट: स्पाइक डिटेक्शन आयाम द्वारा एक से अधिक अफरंती न्यूरॉन से संकेतों को सॉर्ट और अलग करने के लिए मैनुअल थ्रेसहोल्डिंग पर निर्भर करता है। अन्य इकाइयों से बेसलाइन शोर और गतिविधि को केवल एक प्रतिशत (जैसे, spk_detect_ub) के प्रतिशत (जैसे, spk_detect_lb) के भीतर स्पाइक आयाम शामिल करने के लिए थ्रेसहोल्ड द्वारा फ़िल्टर किया जाता है। थ्रेसहोल्डिंग फटने और सामूहिक काल्पनिक तैरना मुकाबलों में मोटर गतिविधि स्पाइक्स के सटीक बिनिंग को भी सुनिश्चित करता है। आम तौर पर, 0.5 की एक सीमा कम बाध्य के साथ शुरू करें, और सटीक पता लगाने तक धीरे-धीरे कम हो जाते हैं। उदाहरण के लिए, 0.5 के रूप में spk_detect_lb और 1.0 के रूप में spk_detect_ub की स्थापना स्पाइक आयाम अधिकतम के 50% के बराबर या अधिक से अधिक सभी स्पाइक्स का पता लगाने और शोर या कम स्पाइक आयाम(चित्रा 2A)के अतिरिक्त न्यूरॉन्स को बाहर कर देगा। वैकल्पिक रूप से, कम स्पाइक आयामों के न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए उच्च स्पाइक आयामों के न्यूरॉन्स को बाहर करने के लिए spk_detect_ub को 1.0 से कम कर सकता है। प्री-प्रोसेसिंग फिगर आउटपुट (चरण 7.2.6 देखें) यह सूचित करेगा कि चरण 7.2.2 से समायोजन और दोहराना आवश्यक है या नहीं।
    4. संपादक विंडो में, AffVR_preprocess.m को निष्पादित करने के लिए रन पर क्लिक करें।
    5. पहले से परिवर्तित .mat डेटा फ़ाइल पर नेविगेट करें (चरण 7.1.3 देखें); स्वचालित प्रीप्रोसेसिंग शुरू करने के लिए ओपन पर चयन करें और क्लिक करें।
      नोट: जबकि कस्टम स्क्रिप्ट चल रही है, आउटपुट कमांड विंडो में "फ़िल्टरिंग डेटा ..." जैसे प्रसंस्करण चरणों के माध्यम से अपनी प्रगति को सूचित करते हुए दिखाई देंगे, "वेंट्रल रूट गतिविधि का पता लगाना..." और "आंकड़े पैदा करना..."
    6. AffVR_preprocess.m द्वारा उत्पन्न आंकड़े अफरेंट स्पाइक और वीआर डिटेक्शन की कल्पना करेंगे और यह इंगित करेंगे कि क्या किसी भी विश्लेषण चर को समायोजित किया जाना चाहिए(चित्रा 2)।
    7. एक preprocess_output फ़ोल्डर में पूर्व प्रसंस्कृत मेटाडेटा को बचाने के लिए कीबोर्ड पर "वाई" दर्ज करें।
    8. प्री-प्रोसेस्ड डेटा स्वचालित रूप से data_out.xlsके रूप में आउटपुट करेगा।
  3. वांछित के रूप में पूर्व-प्रसंस्कृत डेटा का विश्लेषण करें।

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Representative Results

जेब्राफिश लार्वा को ठीक से स्थिर करने के बाद और पीछे की पार्श्व रेखा अफ़रीद गैंगलियन और वीआर रिकॉर्डिंग हासिल की जाती है, इसलिए एक साथ दोनों अफ़ीरंत और मोटर न्यूरॉन्स में गतिविधि को मापा जा सकता है। रिकॉर्डिंग चैनलों को अफरेंट और वीआर गतिविधि की निरंतर निगरानी के लिए गैप-फ्री रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल (चरण 1.4) का उपयोग करके प्रदर्शित किया जाता है। वास्तविक समय में, सहज अफरेंट स्पाइक दर में कमी को वीआर गतिविधि के साथ समवर्ती देखा जा सकता है जो फिक्टिव तैरना मुकाबलों(चित्रा 1E)का संकेत देता है। हमने पाया कि सबसे अच्छा परिणाम और सटीक स्पाइक का पता लगाने रिकॉर्डिंग के उत्पादों कि कम से ०.५ के एक संकेत से शोर अनुपात हासिल किया गया । कस्टम लिखित प्री-प्रोसेसिंग स्क्रिप्ट अफरेंट और वीआर स्पाइक डिटेक्शन के विज़ुअलाइज़ेशन में सहायता करने के लिए भूखंड उत्पन्न करती हैं। सीमा, न्यूनतम अवधि (0.01 एमएस), और न्यूनतम अंतर-स्पाइक अंतराल (आईएसआई; 1 एमएस) जैसे स्पाइक मापदंडों के संयोजन का उपयोग करके सहज अफ़ीम स्पाइक्स की पहचान की जाती है। रिकॉर्डिंग की स्थापना के दौरान नकारात्मक दबाव बढ़ाना अक्सर एक बार में कई अफ़ीरमान इकाइयों से सिग्नल डिटेक्शन की पैदावार करता है। आयाम द्वारा फ़िल्टर करना स्वतंत्र अफ़रेंट्स की सिग्नल गतिशीलता के बीच भेद करने की अनुमति देता है। प्री-प्रोसेसिंग स्क्रिप्ट(चित्रा 2 ए)में निचले-बाउंड और ऊपरी-बाउंड डिटेक्शन वेरिएबल्स को एडजस्ट करके सिग्नल्स को अलग-थलग किया जा सकता है । बहु-इकाई रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए आक्रामक सक्शन अस्थिर रिकॉर्डिंग, यांत्रिक शोर, अफररेंट स्वास्थ्य के क्षरण और अंततः संकेत की हानि का कारण बन सकता है। इसलिए, वांछित संकेत प्राप्त होने के बाद वायुमंडलीय दबाव में धीरे-धीरे सक्शन को डायल करना महत्वपूर्ण है। वेंट्रल रूट स्पाइक डिटेक्शन एफेरेंट स्पाइक डिटेक्शन के समान मापदंडों का पालन करता है लेकिन अलग-अलग काल्पनिक तैरना मुकाबलों को परिभाषित करने के लिए अतिरिक्त इनपुट की आवश्यकता होती है। एक मोटर कमांड के भीतर फटने को वीआर गतिविधि द्वारा परिभाषित किया जाता है जिसमें एक दूसरे के 0.1 एमएस के भीतर न्यूनतम दो स्पाइक्स होते हैं और न्यूनतम 5 एमएस तक रहते हैं। सभी तैरना मुकाबलों तो <२०० एमएस(चित्रा 2B)के अंतर फट अंतराल के साथ तीन फटने की एक ंयूनतम द्वारा चित्रित कर रहे हैं ।

अपनी संपूर्णता में एक रिकॉर्डिंग को देखते समय अफ़रींट गतिविधि की व्याख्या करना मुश्किल है। पूर्व प्रसंस्करण स्क्रिप्ट ब्याज की एक अच्छी तरह से परिभाषित अवधि पर केंद्रित afferent गतिविधि के वर्गों ओवरले होगा, इस मामले में, एक तैरना मुक्केबाज़ी की शुरुआत (एन = ३३, चित्रा 2C)संकेत गतिशीलता में रुझानों की कल्पना में सहायता करने के लिए । तात्कालिक afferent गतिविधि एक चलती औसत फिल्टर और एक 100 एमएस नमूना खिड़की का उपयोग कर गणना की है। मतलब सहज गतिविधि मोटर गतिविधि(चित्रा 2C)की शुरुआत के जवाब में नाटकीय परिवर्तन दिखाता है। बेहतर विच्छेदन और afferent गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए, तैरने से पहले और बाद में अवधि इसी तैरना मुक्केबाज़ी के समय अंतराल मैच के लिए सेट कर रहे हैं । प्री-प्रोसेसिंग स्क्रिप्ट और प्रतिनिधि विश्लेषण परिणामों में इन अवधियों को "प्री-तैरना" और "तैरने के बाद" कहा जाता है। पूर्व तैरना, तैरना, और बाद तैरना स्पाइक दरों अपनी अवधि में संबंधित अवधि के भीतर स्पाइक्स की संख्या लेने के द्वारा गणना की गई । प्रत्येक व्यक्ति के लिए अनुमानों की सटीकता आंशिक रूप से तैरने की संख्या का एक समारोह है, इसलिए हमने भारित प्रतिगमन का उपयोग करके परिवर्तनीय संबंधों का विश्लेषण किया, जिसमें व्यक्तिगत वजन तैरने की संख्या के वर्ग जड़ के बराबर है।

ब्याज की विभिन्न अवधियों (पूर्व तैरना, तैरना, और तैरने के बाद) में अफरेंट स्पाइक दरों में अंतर विचरण (ANOVA) के दो तरह के विश्लेषण द्वारा परीक्षण किया गया । है Tukey के बाद तदर्थ परीक्षण तैराकी स्पाइक दरों और दोनों पूर्व तैरना (८.९४ ± ०.२ हर्ट्ज, सापेक्ष कमी ५७%) और तैरने के बाद (5.34 ± 0.2 हर्ट्ज, सापेक्ष कमी 40%) समय। स्पाइक दर तुरंत बेसलाइन पर वापस नहीं दिया हमने यह भी पाया कि बाद तैरना स्पाइक दर पूर्व तैरना स्पाइक दर से कम था (Tukey के बाद समूहों में तदर्थ परीक्षण, पी < ०.००१; चित्रा 3A)। रैखिक मॉडल का उपयोग सापेक्ष स्पाइक दर और काल्पनिक तैरने के मापदंडों के बीच संबंधों का पता लगाने के लिए किया जाता था। सापेक्ष स्पाइक दर पूर्व तैरना स्पाइक दर पर तैरना स्पाइक दर लेने के द्वारा गणना की गई थी । फिक्टिव तैरना मापदंडों में तैरने की अवधि, तैरने की आवृत्ति (यानी, तैरने वाले मुक्केबाज़ी की अवधि में तैरने वाले मुक्केबाज़ी के भीतर फटने की संख्या), और कर्तव्य चक्र (यानी, तैरने वाले मुक्केबाज़ी की कुल अवधि में तैरने की अवधि) शामिल थे। हमारे हाथों में, सापेक्ष स्पाइक दर का मतलब और विचरण सहसंबद्ध था, इसलिए डेटा को विश्लेषण के लिए लॉग इन करना आवश्यक था। Afferent स्पाइक दर नकारात्मक तैरना अवधि के साथ सहसंबद्ध था जिसका अर्थ है कि पार्श्व रेखा लंबी अवधि के तैरने केदौरान अधिक अवरोध का अनुभव (आर 2 = 0.186, एफ2,26 = 2.971, पी = 0.045; चित्रा 3B)। सापेक्ष स्पाइक दर के बीच कोई संबंध नहीं पाया गया था और न तो आवृत्ति तैरना और न ही शुल्क चक्र ((आर2 = 0.099, एफ2,26 = 1.431, पी = 0.231, और आर2 = 0.047, एफ2,26 = 0.645, पी = 0.932, क्रमशः; चित्रा 3C,डी) । चर संबंधों के सभी विश्लेषण प्रति व्यक्ति तैरने की संख्या से भारित थे और सभी चर तब प्रत्येक व्यक्ति (एन = 29) द्वारा औसत थे।

Figure 1
चित्रा 1:पीछे की पार्श्व रेखा के एकसाथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग न्यूरॉन और वेंट्रल मोटर रूट गतिविधि। (ए)। एक ढीले-पैच एफिरेंट(i)और वेंट्रल मोटर रूट(ii)रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड का उदाहरण। स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं।(ख)लार्वा जेब्राफिश को स्थिरता रिकॉर्ड करने के लिए सिल्गार्ड डिश में चार स्थानों (क्रॉस सिंबल) में लकवा मार दिया जाता है और पिन किया जाता है। बोल्ड क्रॉस पिन के लिए सम्मिलन बिंदुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। (ग)इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग एक कंपन-अलगाव तालिका पर घुड़सवार है और 40x आवर्धन में सक्षम मोटराइज्ड नियंत्रक पर एक ईमानदार निश्चित चरण माइक्रोस्कोप के होते हैं । दोहरी वर्तमान क्लैंप और वोल्टेज क्लैंप हेड चरण माइक्रोमैनीपुलेटर पर लगाए जाते हैं। (घ)शरीर की मांसपेशी के मायोमेरेज़ को मायोसेप्टा द्वारा अलग किया जाता है जो मोटर न्यूरॉन आर्बोराइजेशन के लिए रिकॉर्डिंग लैंडमार्क के रूप में काम करते हैं। वेंट्रल मोटर रूट इलेक्ट्रोड वेंट्रल बॉडी (बाएं) तक पहुंचता है और एक मायोसेप्टम (एरोहेड) के शीर्ष पर केंद्रित और कम होता है। स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है।(ई)वास्तविक समय में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग का स्क्रीन कैप्चर सहज अफरेंट गतिविधि (चैनल 1) के दृश्य की अनुमति देता है और वेंट्रल रूट गतिविधि को फिक्टिव स्विम बाउट (चैनल 2) का संकेत देता है। रिकॉर्ड और प्ले बटन लाल तीर के साथ चिह्नित कर रहे हैं। (च)पीछे पार्श्व रेखा अफ़रीद गैंगलियन (धराशायी रेखा) त्वचा के ठीक नीचे स्थित है और इसे अफरेंट सोमा के एक तंग क्लस्टर द्वारा पहचाना जा सकता है। गैंगलियन क्लीथ्रम हड्डी (एरोहेड) के पिछले पार्श्व रेखा तंत्रिका का पालन करके स्थित किया जा सकता है जहां यह गैंगलियन से जोड़ता है। स्केल बार 30 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:प्री-प्रोसेसिंग फिगर आउटपुट सटीक स्पाइक डिटेक्शन की कल्पना करते हैं। (ए)पीछे की पार्श्व रेखा के अफ़रीद न्यूरॉन्स की एक्स्ट्रासेलुलर, लूज-पैच रिकॉर्डिंग। असतत स्पाइक्स (लाल डॉट्स के साथ लेबल) 1 एमएस के न्यूनतम अंतर-स्पाइक अंतराल के साथ पाए जाते हैं। अन्य इकाइयों से बेसलाइन शोर और गतिविधि को केवल अधिकतम के 50% के भीतर स्पाइक आयाम शामिल करने के लिए थ्रेसहोल्ड करके फ़िल्टर किया जाता है। (ख)वेंट्रल मोटर रूट रिकॉर्डिंग (वीआर) फिक्टिव स्विम मुकाबलों की रिकॉर्डिंग की अवधि के दौरान स्वैच्छिक मोटर कमांड प्रकट करते हैं । वीआर स्पाइक्स (लाल डॉट्स) एक समान सीमा फिल्टर का उपयोग करके पता लगाया जाता है और फिर एक दूसरे के २०० एमएस के भीतर गतिविधि के फट का पता लगाकर एक तैरना मुक्केबाज़ी (हरे रंग) में binned (डालने देखें; स्केल बार २०० एमएस का प्रतिनिधित्व करता है) । परिभाषित तैरना मुक्केबाज़ी के बाहर का पता चला स्पाइक्स टकसाली फट गतिविधि के अंतर स्पाइक अंतराल के भीतर नहीं होते हैं और इसलिए बाहर रखा गया है । (ग)मतलब सहज afferent स्पाइक दर प्रत्येक तैरना मुक्केबाज़ी की शुरुआत पर केंद्रित (समय = 0 एस) से पहले स्पाइक दर चित्रण, के दौरान, और तैराकी के बाद । त्रुटि सलाखों ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:पहले, दौरान और फेक्टिव तैराकी के बाद, अफ़ोषक गतिविधि का मात्राकरण। (ए)तैराकी के दौरान अफरेंट स्पाइक दर काफी कम हो जाती है और यह प्रभाव बाद में भी बना रहता है। सांख्यिकीय रूप से इसी तरह के समूहों को ए और बी(बी)द्वारा चिह्नित किया जाता है, लंबी तैरने की अवधि कम अफरेंट स्पाइक दर से सहसंबद्ध होती है। (C-D) तैरना आवृत्ति और तैरना शुल्क चक्र afferent स्पाइक दर के लिए कोई संबंध नहीं दिखा। सभी मूल्यों का प्रतिनिधित्व मतलब है ± SEM. कम सांख्यिकीय वजन के साथ बाहर रहने वाले व्यक्तियों को छोड़ दिया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

वर्णित प्रायोगिक प्रोटोकॉल एक अक्षुण्ण, व्यवहार कशेरुकी में मोटर व्यवहार भर में संवेदी इनपुट में अंतर्जात परिवर्तन की निगरानी करने की क्षमता प्रदान करता है । विशेष रूप से, यह लार्वा ज़ेब्राफ़िश में पार्श्व लाइन एफेरेंट न्यूरॉन्स और वेंट्रल मोटर रूट्स की एक साथ बाह्यकालीन रिकॉर्डिंग करने के लिए वीवो दृष्टिकोण का विवरण देता है। जेब्राफिश में संभावित समवर्ती मोटर गतिविधि 1,2 ,39, 40,41पर विचार किए बिना सहज अफ़रक गतिविधि की विशेषता रही है . वेंट्रल रूट रिकॉर्डिंग के साथ मोटर गतिविधि की उपस्थिति की निगरानी के बिना, अफरेंट गतिविधि को समझने की संभावना के दौरान, और उसके बाद भी सहज तैराकी के प्रभाव के कारण कम करके आंका जाएगा।

वीवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग में स्वाभाविक रूप से चुनौतीपूर्ण हैं। हमारे अनुभव में, एक स्वस्थ तैयारी को बनाए रखना एक सबसे बड़ा कारक है जो अग्रेंट न्यूरॉन्स और वेंट्रल मोटर जड़ों के लिए सफल, लंबे समय तक चलने वाली रिकॉर्डिंग को प्राप्त करने के लिए है। ऐसा करने के लिए, न केवल तेजी से रक्त प्रवाह की पहचान और निगरानी करना महत्वपूर्ण है, बल्कि त्वचा की बनावट और अंतर्निहित मांसपेशी को भी पहचानें। हम आंतरिक रक्त प्रवाह और स्वस्थ लार्वा की त्वचा की स्थिति से परिचित होने के लिए आगे की हैंडलिंग से पहले माइक्रोस्कोप के नीचे कई झोले के लार्वा को देखने की सलाह देते हैं। त्वचा के माध्यम से एक सफल वेंट्रल रूट रिकॉर्डिंग को एक तंग सील उत्पन्न करने के लिए रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लिए एक चिकनी, स्वस्थ त्वचा की सतह की आवश्यकता होती है। यह दृष्टिकोण पारंपरिक प्रोटोकॉल37,42 को दरकिनार करता है जो आक्रामक और समय लेने वाली हैं, जो अंतर्निहित मांसपेशी को बेनकाब करने के लिए एपिथेलियम को दूर करने का आह्वान करते हैं। त्वचा के माध्यम से रिकॉर्डिंग की असुविधा संकेतों के एहसास होने से पहले समय में संभावित परिवर्तनशीलता है। लागू नकारात्मक दबाव की परिमाण और अवधि का अनुकूलन एक संकेत स्थापित करने के लिए आवश्यक समय कम हो जाएगा और संभावित संकेत से शोर अनुपात में सुधार होगा । एक स्वस्थ, सक्रिय तैयारी से रिकॉर्डिंग हर कुछ सेकंड होने वाली काल्पनिक तैरना मुकाबलों के साथ 5-10 हर्ट्ज के बीच सहज afferent स्पाइक दरों उपज चाहिए ।

मोटर गतिविधि राज्य का खुलासा करने के अलावा, वेंट्रल रूट रिकॉर्डिंग एफेरेंट गतिविधि की निगरानी के लिए प्रॉक्सी के रूप में काम कर सकती है जो पार्श्व लाइन गतिविधि30, 31, 32 के साथ-साथ समरूप हेयर सेल सिस्टम (जैसे, श्रवण और वेस्टिबुलर सिस्टम35, 43,44,45)को कम करने के लिए मोटर कमांड के समानांतर निर्वहन करती है। एफेरेंट न्यूरॉन्स हिंडब्रेन में गहरे रहते हैं, जिससे उनमें से इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग बेहद चुनौतीपूर्ण होती है। ज़ेब्राफ़िश एक मॉडल जेनेटिक सिस्टम है, और हमारे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रोटोकॉल को ट्रांसजेनिक लाइनों द्वारा पूरित किया जा सकता है ताकि कोरोलरी डिस्चार्ज, हेयर सेल संवेदनशीलता, एक्सटोटॉक्सिकिटी और उससे आगे के पहलुओं की शक्तिशाली जांच की जा सके।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

हम कृतज्ञता से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (DC010809), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (IOS1257150, 1856237), और समुद्री जैव विज्ञान के लिए व्हिटनी प्रयोगशाला J.C.L. से समर्थन स्वीकार करते हैं । हम चर्चा उत्तेजक के लिए लियाओ लैब के अतीत और वर्तमान सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL beaker PYREX 1000 resceptacle for etchant
10x water immersion objective Olympus UMPLFLN10xW low magnification for positioning larvae and recording electrode
40x water immersion objective Olympus LUMPLFLN40XW higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp
abfload.m supplemental coding file custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files
AffVR_preprocess.m supplemental coding file custom written MATLAB script for preprocessing recording data
BNC coaxial cables ThorLabs 2249-C-12 connecting amplifier and digitizer channels; require 4
borosilicate glass capillaries w/ filament Warner Instruments G150F-3 inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes
burst_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
computer N/A N/A any computer should work
DC Power Supply Tenma 72-420 used for electrically etching dissection pins
electrophysiology digitizer Axon Instruments, Molecular Devices Axon DigiData 1440A enables acquisition of patch-clamp data
filament Sutter Instrument Company FB255B 2.5 mm box filament used in micropipette puller
fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 used to manipulate larvae and insert pins
fixed stage DIC microscope Olympus BX51WI microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings
flexible, tapered pipette tip Fisher Scientific 02-707-169 flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip
FluoroDish World Precision Instruments Inc. FD3510-100 cover glass bottomed dish recording dish
KimWipe KimTech 34155 task wipe used for wicking away excess fluid from larvae
Kwik-Gard World Precision Instruments Inc. 710172 self-mixing sylgard elastomer
MATLAB MathWorks R2020b command line software for preprocessing data
microelectrode amplifier Axon Instruments, Molecular Devices MultiClamp 700B patch clamp amplifier for dual channel recordings
microforge Narishige MF-830 microforge to polish recording electrode
micromanipulator control unit Siskiyou MC1000-eR/T 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator
micropipette puller Sutter Instrument Company Flaming/Brown P-97 for pulling capillary glass into recording electrodes
microscope control unit Siskiyou MC1000e positions the microscope around the fixed stage and preparation
motorized micromanipulator Siskiyou MX7600 positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording
MultiClamp Commander Molecular Devices 2.2.2 downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page
optical air table Newport Corporation VH3036W-OPT breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings
pCLAMP Molecular Devices 10.7.0 downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page
permanent ink marker Sharpie order from amazon.com for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder
petri-dish Falcon 35-3001 used to immerse larvae in paralytic
pipette holder Molecular Devices 1-HL-U hold recording electrode and connect to the headstage
pneumatic transducer Fluke Biomedical Instruments DPM1B for controlling recording electrode internal pressure
potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473-25G etchant for etching dissection pins
silicone tubing Tygon 14-169-1A tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder
spike_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000-C used to visualize pin tips and during preparation of larvae
straight edge razor blade Canopus order from amazon.com cuts the tungsten wire while making dissection pins
swimbout_detect supplemental coding file custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m
syringe Becton Dickinson Compoany 309602 filled with extracellular solution to inject into recording electrodes
transfer pipette Sigma-Aldrich Z135003-500EA single use, non-sterile pipette for transfering larvae
tricaine methanesulfonate Syndel 12854 pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage.
tungsten wire World Precision Instruments Inc. 715500 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins
vacuum filtration unit Sigma-Aldrich SCGVU11RE single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer
voltage-clamp current-clamp headstage Molecular Devices CV-7B supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages
α-bungarotoxin ThermoFisher B1601 for immobilizing the larvae prior to recording

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References

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Lunsford, E. T., Liao, J. C. Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish. J. Vis. Exp. (168), e62233, doi:10.3791/62233 (2021).

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