Summary
我々は、モデル脊椎動物の毛細胞系における運動コマンド中の、無毛ニューロン活動の変化をモニターするプロトコルを記述する。
Abstract
感覚システムは、行動を演出するために不可欠な手がかりを収集しますが、動物は生物学的に関連する情報を解読する必要があります。ロコモーションは、動物が周囲の環境の関連する感覚的手がかりから離れなければならないことの深い手がかりを生成します。例えば、魚が泳ぐと、体のうねりから発生した流れは、毛細胞を含むメカノ受容性ニューロマストによって検出され、横線系を構成する。その後、毛髪細胞は感覚的な感覚的なニューロンを介してセンサーから脳に流体運動情報を送信します。同時に、モータ指令のカロリー放電は、感覚過負荷を防ぐためにヘアセルに中継される。移動中の予測運動信号の抑制効果を考慮すると、横線系の感度を評価する際に重要である。我々は、数時間続くことができるゼブラフィッシュ幼虫(受精後4〜7日)における後側索神経および腹側運動根活性を同時に監視するin vivo電気生理学的アプローチを開発した。単一または複数のニューロンからの活性を検出することができる緩いパッチクランプ技術を使用して、細胞外のニューロンの記録が達成される。腹側根の記録は運動ニューロン活動を検出するためにガラス電極で皮膚を通して行われる。当社の実験プロトコルは、脊椎動物を無傷で動作させるモータ挙動全体の感覚入力の内因性または誘発変化を監視する可能性を提供します。
Introduction
メカノ感覚系の無透過ニューロンは、聴覚とバランスの間に毛細胞から脳に情報を伝達する。電気生理学は、直接録音を通じて、刺激性ニューロンの感受性を明らかにすることができる。毛髪細胞からの全細胞のパッチ適用は困難な場合がありますが、下流の不毛なニューロンからの記録は容易であり、制御された刺激1、2、3に応答して行動電位の評価を可能にする。毛細胞を刺激すると、そのたわみ、メカノ感覚構造を変更し、したがって、刺激性ニューロン4、5、6における作用電位(スパイク)の増加を引き起こす。外部刺激がない場合、無気泡性ニューロンはまた、毛細胞から無フェ性シナプス後末端7、8へのグルタミン酸漏れにより自発的にスパイクし、感度9,10の維持に寄与することが示されている。アフェレント活性のパッチクランプ記録は、マイクロフォニックス11、12、または機能的なカルシウムイメージング13、14、15など、より低い時間分解能を有する技術を用いて不可能なヘアセル感受性およびシグナルダイナミクスの観察を可能にする。次のプロトコルは、ヘアセル感度の瞬間的な変化を明らかにするために、モータコマンドと同時に、afferentアクティビティの記録を可能にします。
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、体に対する水の動きを検出するために横線系を構成する神経マストに含まれる毛髪細胞を使用し、ナビゲーション16、17、18、捕食者回避、獲物捕獲19、20、および学校教育21に不可欠な神経信号に翻訳される。水の流れは、水泳22、23、24、呼吸22、25、26、および給餌27の動きによっても自己発生することができる。これらの行動は、毛髪細胞を疲労させ、センシングを損なう繰り返しの動きを含む。したがって、横線系は、外部(エクサフェレント)と自己生成(reafferent)流動刺激を区別することが重要です。副分泌はゼブラフィッシュの移動中に自己生成流動信号を減衰させる。この抑制性予測運動信号は、センサ受容体に降下ニューロンを介して中継され、入力を変更するか、または再送フィードバック28,29の処理を中断する。このフィードフォワードシステムの早期理解に寄与する精細な研究は、神経回路の接続性および内因性活性が維持されなかったインビトロ調製に依存していた28、30、31、32、33、34、35。このプロトコルは、内因性フィードバックダイナミクスが維持され、生体内のカロリー放電をよりよく理解できる無傷の神経回路を維持するアプローチを記述する。
ここで概説するプロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュにおける後方線の受熱性ニューロンおよび運動ニューロン活性を同時に監視する方法を説明する。運動コマンドの前後にフェレントシグナルダイナミクスを特徴付けるので、移動中の毛細胞の感度を調節する中枢神経系からのリアルタイムの内因性フィードバックに関する洞察を得られます。このプロトコルは、実験の前にどのような材料を準備する必要があるかを概説し、ゼブラフィッシュの幼虫を麻痺させ、準備する方法を説明します。プロトコルは、運動ニューロンの不フェレントニューロンおよび細胞外腹側根(VR)記録の安定した緩いパッチ記録を確立する方法を説明する。このプロトコルを用いて得ることができる代表的なデータは、例示的な個体から提示され、実験プロトコルの複数の複製に対して分析を行った。データの前処理は、MATLABでカスタムのスクリプトを使用して実行されます。全体として、このin vivo実験パラダイムは、モデル脊椎動物の毛細胞系における移動中の感覚フィードバックをよりよく理解する準備ができている。
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Protocol
すべての動物のケアと実験は、フロリダ大学の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました.
1. 電気生理学的記録用材料の調製
- シリコンエラストマー底の録音皿を作ります。
- 自己混合シリコーンエラストマー成分(例えば、シルガード)の薄い層を、浅い縁が浅いリムとレベルアップするまで、カバーガラス底の組織培養皿に分配する。約0.5mLで十分です。
- 蓋をして、室温で最低48時間皿を治します。
- 解剖ピンを作る。
- DC電源を使用してエッチャント(3M KOH)の100 mLビーカーに負の電荷(5 V)を供給し、正に帯電した出力にタングステン線(0.002インチ、直径50.8μm)を取り付けます。
注意: 負のワイヤと正のワイヤは、火花を発生させる危険性があるため、この手順の間に相互に接触してはなりません。 - エッチタングステンワイヤーは、先端が鋭いポイントに狭くなるまで、ワイヤーの先端を素早く繰り返しエッチャントバスに浸します。実体顕微鏡下で、先端からワイヤーを直線エッジカミソリの刃で約1mm切ります。さらに3回繰り返し、細かい鉗子を使用して硬化した録音皿にピンを挿入します。
- DC電源を使用してエッチャント(3M KOH)の100 mLビーカーに負の電荷(5 V)を供給し、正に帯電した出力にタングステン線(0.002インチ、直径50.8μm)を取り付けます。
- 記録電極を準備します。
- ボロケイ酸ガラスキャピラリーチューブ(内径:0.86mm、外径:1.50mm)を、ボックスフィラメント付きの水平マイクロピペットプーラーを使用して、わずかなテーパー付きの直径30μmの先端(図1 Ai)を使用して後部横線から消火神経を記録するために使用される電極に引き出します。
- 追加のホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを、小さい先端径(1~5 μm)の電極に引き込みます。各手に1つの電極を持ち、互いにそっとチップを動かし、~30°の角度に割ります。マイクロフォージを使用して、ベベジチップを滑らかになるまで磨きます。最終的な先端の直径は30-50 μmの間で、腹側根(VR)記録電極として使用されるべきである(図1 Aii)。
- ヘッドステージのピペットホルダーに電極を挿入する際に先端の絞りを下方に向けるのを助けるために、VR電極の側を固定インクで固定インクでマークします(ステップ3.2)。
注:VR記録電極の機械的な変更は不正確であり、ステップ1.3.2は、適切な先端形態が研磨する前に達成されるまで、複数回の試みを必要とするかもしれません。VR記録電極は幼虫のボディカーブに適合するようにベベラーされる。一旦製造されると、VR記録電極は、実験の間に先端が明確で清潔なままである限り繰り返し使用することができる。
- 電気生理学記録プログラムでプロトコルを生成します。
- 右ヘッドステージが、アフェレントニューロン記録用のマイクロ電極電流および電圧クランプアンプの背面にある チャンネル1 入力に接続され、左ヘッドステージがVR記録用の チャンネル2 入力に接続されていることを確認します。
注:電流および電圧クランプアンプのコンピュータ仕様では、1 GHz以上のプロセッサ、Windows XP ProまたはMac OS X 10.46.6、512 MB RAM、500 MBのハードドライブ容量、2つのUSBポートを搭載したCD-ROMドライブが必要です。 - コンピュータ制御のアンプソフトウェアを開きます。
- チャンネル 1とチャンネル 2を現在のクランプ モードに設定するには、各チャンネルのICボタンをクリックします。
- I-Clamp 1 と I-Clamp 2 の両方のタブに次のパラメータを入力します。一次出力:100x AC膜電位(100,000 mV/mV)、ゲイン:1,000、ベッセル:1 kHz、AC:300 Hz、スコープ:バイパス。 二次出力:100x AC膜電位(100 mV /mV)、ゲイン:1、ローパスフィルタ:10 Hz。
- チャネル パラメータをCh1_Affとして保存し、Ch2_VR。
- パッチクランプの電気生理学ソフトウェアをインストールして開きます。
- 構成をクリックし、ラボベンチを選択して、Ch1_AffとCh2_Vrをデジタイザチャンネル(例えば、アナログIN#0とアナログIN#1)に追加して、BNC同軸ケーブルで、対応するチャンネル1とチャンネル2のアンプのスケーリング出力に接続してアナログ信号を設定します。[OK] をクリックします。
注: デジタイザの最小コンピュータ要件は、1 GHz 以上のプロセッサ、Windows XP Pro または Mac OS X 10.46.6、CD-ROM ドライブ 512 MB RAM、500 MB のハード ドライブ領域、および 2 つの USB ポートです。 - [ 取得 ] をクリックし、[ 新しいプロトコル] を選択します。
- [モード/レート] タブで、[ギャップなし] を選択します。[取得モード] で、[試用期間]を[使用可能なディスク領域を使用する (停止するまで記録する)] または目的の設定された長さ (hh:mm:ss)に設定し、解像度を最大にするために[信号あたりのサンプリング レート(Hz)]を20,000に設定します。
- [入力]タブで、以前に設定したアナログ IN チャネル(ステップ 1.4.6)を選択し、対応するチャンネルのCh1_AffとCh2_VRを選択します。
- [出力] タブで、[チャネル #0]と [チャンネル #1]に対して[Cmd 0]および[cmd 1]をそれぞれ選択します。
- アンプのチャンネル1コマンドをBNC同軸ケーブルを介してデジタイザーのアナログ・アウプット0に接続し、チャンネル2コマンドからアナログ出力1に対して繰り返します。
- 残りのタブは、既定の設定の下に残ることができます。 [OK] を クリックしてプロトコルを保存します。
- 右ヘッドステージが、アフェレントニューロン記録用のマイクロ電極電流および電圧クランプアンプの背面にある チャンネル1 入力に接続され、左ヘッドステージがVR記録用の チャンネル2 入力に接続されていることを確認します。
2. ソリューションの準備
- ハンクのソリューションを準備する: 137 mM NaCL, 5.4 mM Na2HPO4, 0.44 mM KH2PO4,1.3 mM CaCl2,1.0 mM MgSO4,4.2 mM NaHCO4;pH 7.3.適切な量の脱イオン水をストックに加えて、ハンクの溶液を10%希釈します。
- 細胞外溶液を準備する:134 mM NaCl、2.9 mM KCl、1.2 mM MgCl 2、2.1 mM CaCl2、10mMグルコース、10 mM HEPESバッファー;PH 7.8はNaOHで調整した。真空フィルターは、0.22 μmの細孔サイズのフィルターを介して細胞外溶液をフィルターします。
- α-bungarotoxinを準備する:10 mLの細胞外溶液に凍結乾燥したα-ブンガロトキシンの1mgを溶解し、0.1%希釈を生成する。
- 安楽死液を調製:10%ハンクの溶液中の50%(mg/L)緩衝型医薬品グレードMS-222。
注意:α-ブンガロトキシンは、コリン作動性受容体を遮断することによって筋肉を麻痺させる強力な神経毒である。麻痺を処理しながら手袋が必要とされ、目の保護をお勧めします。
3. 電気生理学的記録用幼虫の準備
- ゼブラフィッシュの幼虫を固定化します。
- ゼブラフィッシュの実験室育ちの集団(ダニオ・レリオ;受精後4~7日)の幼虫を使用し、27°Cで胚溶液(10%ハンク溶液)に収容する。
- 大きなチップを付けたトランスファーピペットを使用して、ハウジングから小さなペトリ皿(35mm)に幼虫を移し、周囲の溶液をできるだけ多く取り除きます。
注:胚溶液の除去は、麻痺の希釈を防止し、その有効性を増加させます。タスクワイプのコーナーは、残りの胚溶液を吸引するために使用することができ、幼虫に接触したり、幼虫を空気にさらさないことは重要です。 - 幼虫を0.1%の10μLのα-バンガロトキシンに約5分間浸漬します。
注:幼虫を固定するために必要な時間は、準備によって異なります。健康的な準備は、持続的な速い血流と減少した運動応答を注意深く監視に依存します。麻痺への短い過度の露出は、徹底的な洗浄後でも、準備の全体的な健康の低下につながることができます。幼虫が完全に固定化される前に洗浄を施すのが最善ですが、まだ微妙な筋肉の振動の兆候を示しています。 - 麻痺した幼虫を細胞外溶液で洗い、10分間入浴します。
注:洗い流しは幼虫が微妙な筋肉の振動から完全な麻痺に移行することを可能にする。また、α-ブンガロトキシンは、このプロトコルが観察する内因性フィードバック回路の重要な構成要素であるニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)α9-サブユニットのアンタゴニストである。しかし、この効果は、ゼノプスおよびゼブラフィッシュの毛細胞において、10分の洗浄36、29の後に可逆的であることが示されている。
- 録音皿に魚をピン。
注:麻酔(例えば、MS-222、トリケーヌ)は、動物の健康を妨げるので、幼虫ゼブラフィッシュ(4-7 dpf)を準備している間は必要ありません。実際、幼虫ゼブラフィッシュは特定の脊椎動物プロトコルから免除されています。- 移管ピペットを使用して、幼虫を細胞外溶液浴からシリコーン底の記録皿に移す。残りの皿を細胞外溶液で満たします。
- 実体顕微鏡の下で、幼虫をシリコーンマットの中央の上に細かくひっくり返した鉗子で、側面を上に、体の前部と後端がそれぞれ左から右に動くようにそっと置きます。次に、細かい先端の鉗子を使用してシリコーンマットからエッチングされたピンをつかみ、肛門に直接後振りする幼虫の脊索を通して、シリコーンに直交してピンを挿入します。尾の端近くの脊索に2番目のピンを挿入し、ガスブラダーの脊索後回を通して3番目のピンを挿入する(図1B)。
注:ピンを挿入する際には、血流を妨げたり、周囲の筋肉を損傷したりしないように、脊索幅の中心をターゲットにすることが重要です。脊索は後部横線神経に対して後振れであるため、適切なピン留めでは、横線感覚ニューロンへの損傷は期待されません。周囲の組織を乱さないように最初の接触後に挿入する。理想的には、ピンの直径は、クリーンな挿入を確実にするために、脊索の半分以下の幅です。ピンがこの幅を超える場合は、目的のピン幅が達成されるまでステップ 1.2 を繰り返します。ピン留め後に血流が遅くなった場合は、ステップ1.3から新しい標本を繰り返します。 - 4つ目のピンを大蓋小胞に挿入し、前に向かってわずかに回転しながら、ピンがカプセル化剤に挿入されます(図1B)。わずかな回転が適用されると、クリースラムとオティック小胞の間の組織を監視して、発泡性ソマタのクラスターを明らかにする。
注:第4のピンの斜めの挿入は、それ以外の場合は大きな大動脈小胞によって妨げられる後側線の露出を確実にする。
4. 腹側根記録
- 固定された幼虫を10倍の水浸漬目的の下に固定して固定された差動干渉コントラスト(DIC)直立顕微鏡に置き、左ヘッドステージアプローチベクトルに平行な筋肉ブロックの筋切裂を向ける(図1B)。
- 光学式エアテーブルに浮かぶ固定ステージDIC顕微鏡は、振動が録音に干渉するのを防ぐのに最適です。電動ポジショナーを使用して、顕微鏡は準備とヘッドステージが取り付けられている固定ステージの周りを自由に移動することができます(図1C)。
- 地上線を浴室の溶液に入れ、左のヘッドステージに接続していることを確認します。
- 柔軟なゲルローディングピペットチップを使用してVR記録電極に30μLの細胞外溶液を充填し、左ヘッドステージピペットホルダーに挿入します。
- 空気圧トランスデューサで作り出される陽圧(1-2 mmHg)を加えながら、マイクロマニピュレータで録音ピペットを皿溶液に下げます。10倍の拡大率の下で、先端絞りの向きが下向きであることを確認します。
- 空気圧トランスデューサは、シリコーンチューブを介してピペットホルダーポートに接続する必要があります。
- VR電極を筋隔膜に置く
- マイクロマニピュレーターを再度使用して、VR電極先端を幼虫の上の位置に保持するまで下げます。倍率を 40 倍の浸漬に増やします。
- 裂け目がVR電極先端開口部の中心となるまで、2つのミオメア腹側の間のミオセプタムの上に電極先端を横線に持って来なさい(図1D)。
- 先端開口の遅れエッジが上皮にそっと接触するまでピペットを下げます。最初の接触の後、ピペットを斜めに操縦して、先端が接触し、シールを生成できることを確認します。
- 空気圧トランスデューサで負圧(約100mmHg)を加え、ホールドします。
メモ:心切血と連続負圧に対するVRピペットの適切な向きは、皮膚を通して高い信号対雑音比を持つ運動ニューロンの活動を検出するのに適しています。
- 運動ニューロンの活動を検出します。
- 左のヘッドステージは増幅器に接続する必要があり、増幅された信号をデジタイザにリレーして、隣接するコンピュータで監視するパッチクランプ電気生理学ソフトウェアに信号を出力します(セクション1.4を参照)。
- パッチクランプソフトウェアで、ツールバーの再生ボタンをクリックしてVR信号を監視します(図1E)。
- ステレオタイプのバースト信号ダイナミクスを持つ運動ニューロンの活動が29、37観察されると、VR記録が達成されていることを確認してください(図1E)。
注:フィクティブスイムバウトは、準備が麻痺しているにもかかわらず伝達し続けるVR運動ニューロンの活動パターンです。したがって、架空の泳ぎは、動物の行動状態を決定し、同時に固定化された調製を必要とする無フェレントニューロン記録を行いながら、運動パラメータを測定するアクセス可能な手段である。私たちの手の中では、VRの記録が達成されると、健康的な準備は数秒ごとに自発的な架空の泳ぎの発作を引き出します。覚えておいてください, 健康的な準備は、速い血流を持続しています.十分なVR信号を得るのに数分かかる場合があり、初期検出後に信号対雑音比が改善される可能性があります。時間の利益のために、セクション5に進むことも可能です。 - セクション5を完了してもVR記録が達成されない場合は、負圧を放出し、電極を上げ、幼虫の健康状態が依然として最適な場合は、ステップ4.4.2以降を別のミオセプタムで繰り返します。
5. 不発泡ニューロン記録
- 30 μLの細胞外溶液でアフェレント記録電極を充填します。右ヘッドステージピペットホルダー(図1B,C)に挿入し、空気圧トランスデューサで生成される陽圧(1-2 mm Hg)を加えながら、皿溶液に下げます。
- 後部横線のアフェレントガングリオンを見つけてゆるやかに取り付けます。
- マイクロマニピュレーターを使用して、クリースラムの上の位置を保持するまで、アフェレント電極先端を下げます。
- 倍率を40倍の浸漬に増やし、後側線神経とクレイスラムの交点を見つけます。側索管門から後側側線を内側に通すところまで側線神経前部に従い、その後側索線を突出し、相馬の離散クラスターによって区別できる(図1F)。
- 電極先端をアフェレントガングリオンの上に持ち込み、先端が上皮に接触するまでピペットを下げます。先端全体が帯の神経節に接触するように電極を穏やかに操縦する。
- 空気圧トランスデューサで負圧(20~50mmHg)を加え、ホールドします。
注: 心房状神経節に適用される負圧は、腹側根の記録中に加えられる吸引よりも穏やかです。負圧を上げると信号対雑音が改善されますが、持続的な積極的な吸引の下で無断のニューロンの健康状態が低下し、記録に成功する確率が低下します。
- 生意気なニューロン活動を記録する。
- ステップ 4.5.1 で説明したように、右側のヘッドステージが同じ順序で接続されていることを確認します。
- pClamp10で、ツールバーの 再生 ボタンをクリックして、同時に、遊ぶニューロンとVR信号を監視します。
- スパイクが自発的に発生すると、細胞全体、帯状神経細胞の緩いパッチ記録が達成されることを確認し、およそ100〜200 ms1、29(図1E)。
- 徐々に、電極圧を大気(0mmHg)に戻して、残りの記録のために保持する、無フェレントニューロン記録電極圧を増加させる。
6. データ取得
- 同時録音。
- 一度、発泡ニューロンと運動ニューロンの活動が検出されたら、pClamp10のツールバーの 録音 ボタンをクリックして、両方のチャンネルで同時にギャップフリーの録音をキャプチャします。
- 目的の期間の記録(図 1E)。
注:健康的な準備での記録は、長時間持続し、外部刺激に応答し続けることができます。 - 取得パラメータなどのメタデータを保持するために、サポートされているファイルの種類(.abf、pClamp10)として記録を保存します。
7. 安楽死
- 空気圧トランスデューサを使用して、陽光とVRの両方の記録電極に正圧(10 mm Hg)を適用し、マイクロマニピュレータを使用して記録皿から電極を上げます。
- 固定段DIC顕微鏡から解剖実視顕微鏡に記録皿を移します。
- 細かい先端鉗子を使用して、脊索およびオティックカプセルからタングステンピンを取り除き、5 mLの安楽死液を含むペトリ皿(35mm)に移送ピペットを使用して幼虫を5分間以上移送する。
8. 前処理とデータ分析
注: データの事前処理と分析には、コマンド ライン コーディングの基本的な理解が必要です。
- 前処理のために記録ファイルを変換します。
- Matlab ソフトウェアをインストールします。
- カスタム書き込みスクリプト abfload.m38 をダウンロードし、未加工の記録ファイルを格納する同じフォルダーにファイルを保存します。
- [Matlab エディタ]ウィンドウで abfload を開き.mツールバーの[実行] をクリックします。メッセージが表示されたら、[フォルダの変更] を選択します。
- コマンド ウィンドウで、生の記録ファイルを入力として実行し、
> [d,si,h] = abfload('[未加工の記録ファイル名]))
また、幼虫の指定、年齢、実験日(例えば[標本番号]_[dpf]の経過時間)を含むファイル名を出力ワークスペースに保存します。
注: 変換されたファイル名には、アンダースコアで区切られた整数のみを含める必要があります。
- データの前処理を実行します。
- 著者によってカスタム作成された、matlabスクリプトAffVR_preprocess.mと関連する機能をダウンロードしてください。
- [エディター ] ウィンドウで、AffVR_preprocess.m開きます。
- [ 変数] で、信号対雑音比の記録に応じて、公束とVRの両方の録画(spk_detect_lb と vr_detect_lb、ライン8と14)の下限スパイク検出しきい値を調整します。
注: スパイク検出は、振幅によって複数の異性ニューロンからの信号を並べ替え、分離するために手動しきい値に依存します。ベースラインノイズおよび他のユニットからのアクティビティは、最大(例えば、spk_detect_ub)のパーセント(例えば、spk_detect_lb)内のスパイク振幅のみを含むようにしきい値によってフィルタリングされます。スレッショニングはまた、バーストと集団架空の泳ぎの吹き出物にモーター活動スパイクの正確なビニングを保証します。一般的に、しきい値の下限が 0.5 から始まり、正確な検出が達成されるまで徐々に減少します。たとえば、spk_detect_lbを 0.5 に設定し、spk_detect_ub を 1.0 に設定すると、スパイク振幅の最大値の 50% 以上のすべてのスパイクが検出され、ノイズまたはスパイク振幅が低い追加のニューロンは除外されます (図 2A)。あるいは、スパイク振幅の低いニューロンを分離するために、1.0からspk_detect_ubを下げて、より高いスパイク振幅のニューロンを除外することもできます。前処理の数値出力(ステップ7.2.6を参照)は、ステップ7.2.2からの調整と繰り返しが必要かどうかを通知します。 - [エディター ] ウィンドウで、[実行] をクリックしてAffVR_preprocess.mを実行します。
- 以前に変換した .mat データ ファイルに移動します (手順 7.1.3 を参照)。を選択して[ 開く ]をクリックして、自動前処理を開始します。
注: カスタム スクリプトの実行中に、出力が コマンド ウィンドウ に表示され、"データのフィルタリング"、"腹側ルートアクティビティの検出"、"数値の生成.." などの処理手順を実行して進行状況を通知します。 - AffVR_preprocess.mによって生成された数字は、急上昇とVR検出を可視化し、解析変数を調整すべきかどうかを示します(図2)。
- キーボードで「Y」と入力すると、事前処理されたメタデータがpreprocess_outputフォルダーに保存されます。
- 処理済みのデータは 、data_out.xlsとして自動的に出力されます。
- 必要に応じて、事前処理されたデータを分析します。
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Representative Results
ゼブラフィッシュの幼虫が適切に固定化され、後方線の斜線が気になるガングリオンとVR記録が達成された後、同時に、アフェレントと運動ニューロンの両方で活性を測定することができます。記録チャンネルは、ギャップのない記録プロトコル(ステップ1.4)を使用して表示され、afferentおよびVRアクティビティを継続的に監視します。リアルタイムでは、自発的な無フェレントスパイク率の低下は、架空の泳ぎの発作を示すVR活動と同時に観察することができる(図1E)。最良の結果と正確なスパイク検出は、少なくとも0.5の信号対雑音比を達成した記録の製品であることがわかりました。カスタムの作成前処理スクリプトは、afferent および VR スパイク検出の視覚化を支援するプロットを生成します。自発的なスパイクは、しきい値、最小時間(0.01 ms)、最小スパイク間隔(ISI; 1 ミリ秒)などのスパイク パラメータの組み合わせを使用して識別されます。記録を確立しながら負圧を増加させることは、多くの場合、一度に複数の異なるユニットからの信号検出をもたらす。振幅によるフィルタリングは、独立したアフェレントの信号ダイナミクスを区別することを可能にする。信号の分離は、前処理スクリプトの下限検出変数と上限検出変数を調整することによって達成できます(図2A)。マルチユニット録音を達成するための積極的な吸引は、不安定な記録、機械的なノイズ、消えのない健康の低下、そして最終的には信号の損失につながる可能性があります。したがって、所望の信号が達成されたら、ゆっくりと大気圧に吸引をダイヤルバックすることが重要です。腹側ルートスパイク検出は、フェレントスパイク検出と同一のパラメータに従いますが、異なるフィクティブスイムバウトを定義するには追加の入力が必要です。モーターコマンド内のバーストは、VR アクティビティによって定義され、互いに 0.1 ミリ秒以内に最低 2 つのスパイクが発生し、5 ミリ秒以上続きます。すべての水泳の試合は、<200 msのインターバースト間隔で最低3つのバーストによって表されます(図2B)。
録音全体を見ると、アナレントな活動を解釈することは困難です。事前処理スクリプトは、明確に定義された関心期間を中心とした、適切に定義された期間を中心とするafferentアクティビティのセクションをオーバーレイします(この場合、スイムバウトの開始(n = 33、 図2C)は、信号ダイナミクスの傾向を視覚化するのに役立ちます。瞬間的なアフェレントアクティビティは、移動平均フィルタと100 msサンプリングウィンドウを使用して計算されます。平均自発的活動は、運動活動の発症に対する劇的な変化を示す(図2C)。より良い解剖と分析の活動のために、水泳前後の期間は、対応するスイムバウトの時間間隔に一致するように設定されています。前処理スクリプトと代表的な分析結果では、これらの期間は「泳ぐ前」と「泳ぐ後」と呼ばれます。プリスイム、スイム、泳泳後のスパイク率は、その期間にわたってそれぞれの期間内のスパイクの数を取ることによって計算されました。各個体の推定値の精度は、泳泳回数の一部の関数であるため、加重回帰を使用して可変関係を分析し、個々の重みは泳ぎの数の平方根に等しい。
関心のあるさまざまな期間(泳ぐ前、泳ぐ、泳ぐ後)の異なるスパイク率の違いは、分散の双方向分析(ANOVA)によってテストされました。Tukeyのポストホックテストでは、水泳前の両方の水泳スパイク率とスパイクレートの間のスパイク率の有意な違いを検出しました(8.94±0.2 Hz、相対的な減少57%)泳ぐ後(5.34±0.2 Hz、相対的な減少40%)期間。スパイクレートはすぐにベースラインに戻らなかったので、泳ぎ後のスパイク率が泳ぐ前のスパイク率よりも低いことがわかりました(Tukeyのポストホックテストはグループ間で、p < 0.001; 図 3A)線形モデルは、相対的なスパイクレートと架空の泳ぎパラメータとの関係を検出するために使用されました。相対スパイク率は、泳ぐ前のスパイクレートに対する水泳スパイク率を取ることによって計算した。フィクティブスイムパラメータには、水泳時間、水泳頻度(水泳試合期間中の水泳試合内のバースト数)、デューティサイクル(水泳試合の合計期間にわたる水泳バースト期間の合計)が含まれていました。私たちの手では、相対的なスパイク率の平均と分散が相関していたので、データを分析のためにログ変換する必要がありました。消泡スパイク率は、泳ぐ期間と負の相関があり、横線がより長い期間の泳ぎの間に大きな阻害を経験することを意味する(r2 = 0.186、F2,26 = 2.971、p = 0.045; 図3B)。相対的なスパイク率と泳ぐ頻度とデューティサイクルの間には相関が検出されませんでした((r2 = 0.099、F2,26 = 1.431、p = 0.231、r2 = 0.047、F2,26 = 0.645、p = 0.932; 図3C,D)。変動関係のすべての解析は、個人ごとの泳ぎ回数によって重み付けされ、その後、すべての変数が各個体によって平均化された(n = 29)。
図1: 後側線の同時電気生理学的記録は、神経細胞と腹側運動根活動(A)の後側線の突出性神経細胞との同時記録を行う。緩いパッチの例は、アフェレント(i)と腹側モータルート(ii)記録電極。スケールバーは50 μmを表し(B)ラーバルゼブラフィッシュは、安定した記録のために4つの場所(クロスシンボル)に麻痺し、固定されています。太い十字はピンの挿入点を表します。(C)電気生理学用リグは、振動分離テーブルに取り付けられ、40倍の倍率を実現可能な電動コントローラ上の直立した固定ステージ顕微鏡で構成されています。デュアル電流クランプと電圧クランプヘッドステージは、マイクロマニピュレータに取り付けられています。(D) 筋筋の筋肉は、運動ニューロンの運動ニューロンの樹状化のランドマークとして機能するミオセプタによって分離される。腹側モーターの根電極は腹側体(左)に近づき、筋膜(矢頭)の上に中央に下げられる。スケールバーは50μm(E)リアルタイムでの電気生理学的記録のスクリーンキャプチャを表し、自然の不自然な活動(チャネル1)と破裂した腹側根活動の視覚化を可能にする架空の泳ぎの吹き出物(チャネル2)。。[レコード] ボタンと [再生] ボタンは赤い矢印で示されます。(F)後側面線のアフェレントガングリオン(破線)は皮膚のすぐ下にあり、気まぐれな相馬のきつい群れによって識別できる。神経節は、クリースラムの骨(矢印頭)を通り過ぎて神経節に接続する側線神経に従うことによって見つかります。スケールバーは30 μmを表します。
図2:前処理図出力は正確なスパイク検出を可視化する。(A)細胞外、後側面線の緩いパッチ記録は、発泡性ニューロンの後部線の記録を行う。不連続のスパイク(赤い点でラベル付け)は、最小のスパイク間間隔 1 ミリ秒で検出されます。ベースラインノイズと他のユニットからのアクティビティは、しきい値によってフィルタリングされ、最大の50%以内のスパイク振幅のみが含まれます。(B)架空の水泳の吹き出物の腹側モータールート記録(VR)は、記録の期間中、自発的なモータコマンドを明らかにする。VR スパイク(赤い点)は、同様のしきい値フィルタを使用して検出され、200 ミリ秒以内のアクティビティのバーストを検出して単一のスイムバウト(緑)にビン分割されます(挿入を参照してください。定義されたスイムバウトの外側で検出されたスパイクは、ステレオタイプ化されたバーストアクティビティのスパイク間間隔内では発生しないため、除外されます。(C)泳ぐ前、泳ぐ前、中、後のスパイク率を示す各水泳試合(時間=0s)の発症を中心とした自発的な発泡スパイク率を平均する。エラー バーは、± SEM を表します。
図3:フィクストスイミングの前、中、後のアファレント活動の定量化(A)は水泳中に有意に減少し、この効果はその後も持続する。統計的に類似したグループはaとb(B)より長い泳ぎ時間が減少したスパイク率に相関して示される。(C-D)水泳頻度と水泳義務サイクルは、発泡スパイク率との相関関係を示さない。すべての値は平均±SEMを表し、統計的重みが低いアウトポジションの個人は省略した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
説明された実験プロトコルは、脊椎動物を無傷で動作させる運動行動全体の感覚入力の内因性変化を監視する可能性を提供する。具体的には、幼虫ゼブラフィッシュにおける側線の無気泡性ニューロンと腹側運動根の同時細胞外記録を行うためのインビボアプローチを詳述する。自発的な発泡活動は、潜在的な同時運動活動1、2、39、40、41を考慮せずにゼブラフィッシュで以前に特徴付けられてきた。腹側ルート記録で運動活動の存在を監視することなく、自発的な水泳中、さらには後のエフェレント阻害の影響により、発泡活動を解読することは過小評価される可能性が高い。
生体内電気生理学的記録は本質的に困難です。私たちの経験では、健康的な準備を維持することは、発送性ニューロンと腹側運動根の成功した、長期的な録音を達成するための唯一の最大の要因です。これを行うには、速い血流を識別し、監視するだけでなく、皮膚の質感と下層の筋肉を認識することが重要です。さらに取り扱う前に、いくつかの麻痺した幼虫を顕微鏡で観察し、健康な幼虫の本質的な血流と皮膚状態に慣れ親しめるのがおすすめです。皮膚を通して成功した腹側根の記録は、記録電極が密封を生成するために滑らかで、健康な皮膚表面を必要とする。このアプローチは、侵襲的で時間のかかる伝統的なプロトコル37、42を回避し、下皮を解剖して根底にある筋肉を露出させる必要があります。皮膚を通して記録する不便さは、信号が実現される前の時間の潜在的な変動です。適用された負圧の大きさと持続時間を最適化すると、信号を確立するのに必要な時間が短縮され、信号対雑音比が向上する可能性があります。健康的でアクティブな準備からの録音は、数秒ごとに発生する架空の水泳の試合で5〜10 Hzの間の自発的な無熱スパイク率をもたらすはずです。
腹側根の記録は、運動活動状態を明らかにすることに加えて、横線活動を減衰させるモータコマンドに平行に放電する運動をモニタリングするためのプロキシとして機能し、横線活動を減衰させる30、31、32だけでなく、相同の毛細胞系における活動(例えば、聴覚および前庭システム35、43、44、45)。エフェレントニューロンは後脳の奥深くに存在し、それらの電気生理学的録音は非常に困難です。ゼブラフィッシュはモデルの遺伝的システムであり、当社の電気生理学プロトコルは、トランスジェニックラインによって補完され、カロリー放電、毛細胞感受性、興奮毒性などの側面を強力に調査することができます。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。
Acknowledgments
国立衛生研究所(DC010809)、国立科学財団(IOS1257150、1856237)、ホイットニー海洋生物科学研究所からJ.C.Lへの支援を心から受け入れました。遼研究室の過去・現在のメンバーに対し、議論を刺激して頂き、感謝申し上げたいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL beaker | PYREX | 1000 | resceptacle for etchant |
| 10x water immersion objective | Olympus | UMPLFLN10xW | low magnification for positioning larvae and recording electrode |
| 40x water immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp |
| abfload.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files | |
| AffVR_preprocess.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for preprocessing recording data | |
| BNC coaxial cables | ThorLabs | 2249-C-12 | connecting amplifier and digitizer channels; require 4 |
| borosilicate glass capillaries w/ filament | Warner Instruments | G150F-3 | inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes |
| burst_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| computer | N/A | N/A | any computer should work |
| DC Power Supply | Tenma | 72-420 | used for electrically etching dissection pins |
| electrophysiology digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | enables acquisition of patch-clamp data |
| filament | Sutter Instrument Company | FB255B | 2.5 mm box filament used in micropipette puller |
| fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | used to manipulate larvae and insert pins |
| fixed stage DIC microscope | Olympus | BX51WI | microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings |
| flexible, tapered pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-169 | flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip |
| FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | cover glass bottomed dish recording dish |
| KimWipe | KimTech | 34155 | task wipe used for wicking away excess fluid from larvae |
| Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | self-mixing sylgard elastomer |
| MATLAB | MathWorks | R2020b | command line software for preprocessing data |
| microelectrode amplifier | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplifier for dual channel recordings |
| microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish recording electrode |
| micromanipulator control unit | Siskiyou | MC1000-eR/T | 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator |
| micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | for pulling capillary glass into recording electrodes |
| microscope control unit | Siskiyou | MC1000e | positions the microscope around the fixed stage and preparation |
| motorized micromanipulator | Siskiyou | MX7600 | positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording |
| MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page |
| optical air table | Newport Corporation | VH3036W-OPT | breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings |
| pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page |
| permanent ink marker | Sharpie | order from amazon.com | for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder |
| petri-dish | Falcon | 35-3001 | used to immerse larvae in paralytic |
| pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | hold recording electrode and connect to the headstage |
| pneumatic transducer | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | for controlling recording electrode internal pressure |
| potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473-25G | etchant for etching dissection pins |
| silicone tubing | Tygon | 14-169-1A | tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder |
| spike_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | used to visualize pin tips and during preparation of larvae |
| straight edge razor blade | Canopus | order from amazon.com | cuts the tungsten wire while making dissection pins |
| swimbout_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| syringe | Becton Dickinson Compoany | 309602 | filled with extracellular solution to inject into recording electrodes |
| transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | single use, non-sterile pipette for transfering larvae |
| tricaine methanesulfonate | Syndel | 12854 | pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage. |
| tungsten wire | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins |
| vacuum filtration unit | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer |
| voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages |
| α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | for immobilizing the larvae prior to recording |
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