Summary
Model omurgalı saç hücresi sisteminde motor komutlar sırasında afferent nöron aktiviteslerindeki değişiklikleri izlemek için bir protokol açıklıyoruz.
Abstract
Duyusal sistemler davranışları yönlendirmek için gerekli ipuçlarını toplar, ancak hayvanlar hangi bilgilerin biyolojik olarak ilgili olduğunu deşifre etmelidir. Locomotion, hayvanların çevredeki çevrenin ilgili duyusal ipuçlarından ayrılmaları gereken farklı ipuçları üretir. Örneğin, bir balık yüzdüğünde, vücut dalgalanmalarından oluşan akış, yanal çizgi sistemini oluşturan saç hücrelerinden oluşan mekanoresptif nöromstlar tarafından tespit edilir. Saç hücreleri daha sonra duyusal afferent nöronlar aracılığıyla sensörden beyne sıvı hareket bilgilerini iletir. Eş zamanlı olarak, sensörlü aşırı yüklemeyi önlemek için motor komutunun corollary deşarjı saç hücrelerine aktarılır. Bu nedenle, yanal hat sisteminin hassasiyetini değerlendirirken, locomotion sırasında tahmine dayalı motor sinyallerinin inhibitör etkisinin muhasebesi kritik öneme sahiptir. Zebra balığı larvalarında (döllenme sonrası 4-7 gün) posterior lateral çizgi afferent nöron ve ventral motor kök aktivitesini aynı anda izlemek için birkaç saat sürebilen in vivo elektrofizyolojik bir yaklaşım geliştirdik. Afferent nöronların hücre dışı kayıtları, tek veya birden fazla nörondan aktiviteyi algılayabilen gevşek yama kelepçe tekniği kullanılarak elde edilir. Motor nöron aktivitesini tespit etmek için cam elektrotlarla deriden ventral kök kayıtları yapılır. Deneysel protokolümüz, sağlam ve neşeli bir omurgalıda motor davranışlarda duyusal girişteki endojen veya çağrıştırılan değişiklikleri izleme potansiyeli sağlar.
Introduction
Mekanosensory sistemlerinin afferent nöronları işitme ve denge sırasında saç hücrelerinden beyne bilgi aktarır. Elektrofizyoloji, afferent nöronların hassasiyetini doğrudan kayıtlarla ortaya alabilir. Saç hücrelerinden tüm hücre yamalama zor olsa da, aşağı akış afferent nöronlardan kayıt yapmak daha kolaydır ve kontrollü stimülasyonlara yanıt olarak eylem potansiyellerinin değerlendirilmesine izin verir1,2,3. Saç hücrelerini uyarmak, mekanosensör yapıları değiştiren sapmalarına yol açar, böylece afferent nöronlarda eylem potansiyellerinde (sivri) bir artışı tetikler4,5,6. Dış uyaranların yokluğunda, afferent nöronlar da saç hücrelerinden7,8sonrası afferent post-sinaptik terminallere glutamat sızıntısı nedeniyle kendiliğinden yükselir ve duyarlılığın korunmasına katkıda bulunduğu gösterilmiştir9,10. Afferent aktivitenin yama kelepçesi kaydı, mikrofonikler 11 , 12 veya fonksiyonelkalsiyum görüntüleme13, 14,15 gibi daha düşük zamansal çözünürlüğe sahip teknikler kullanılarak mümkün olmayan saç hücresi hassasiyetinin ve sinyal dinamiklerinin gözlemlenmesine olanak tanır. Aşağıdaki protokol, saç hücresi duyarlılığındaki anlık değişiklikleri ortaya çıkarmak için motor komutlarla eşzamanlı afferent aktivitenin kaydedilmasına izin verecektir.
Zebra balığı (Danio rerio) vücutlarına göre su hareketini tespit etmek için yanal çizgi sistemini oluşturan nöromistiklerde bulunan saç hücrelerini kullanır, bu da navigasyon için gerekli sinir sinyallerine çevrilir16,17,18, avcı kaçınma, av yakalama19,20ve okul21. Su akışı ayrıca yüzme hareketleri ile kendi kendine üretilebilir22 , 23,24, solunum22,25,26ve besleme27. Bu davranışlar saç hücrelerini yorabilen ve algılamayı bozabilen tekrarlayan hareketlerden oluşur. Bu nedenle, yanal çizgi sisteminin dış (exafferent) ve kendi kendine oluşturulan (reafferent) akış uyaranları arasında ayrım yaptığı kritik öneme sahiptir. Bir corollary deşarjı, zebra balıklarında hareket sırasında kendi kendine oluşturulan akış sinyallerini hafifletir. Bu inhibitör tahmine dayalı motor sinyal, girişi değiştirmek veya reafferent geri bildirimin işlenmesini kesmek için azalan nöronlar aracılığıyla duyu reseptörlerine aktarılır28,29. Bu besleme sistemini erken anlamamıza katkıda bulunan ufuk açıcı çalışma, nöral devrenin bağlantı ve endojen aktivitesinin korunmadığı in vitro preparatlara dayanıyordu28, 30,31,32,33,34,35. Bu protokol, endojen geri bildirim dinamiklerinin korunduğu bozulmamış bir sinir devresini korumaya yönelik bir yaklaşımı açıklar, böylece corollary deşarj in vivo'nun daha iyi anlaşılmasını sağlar.
Burada özetlenen protokol, larva zebra balıklarında posterior lateral çizgi afferent nöron ve motor nöron aktivitesinin aynı anda nasıl izleneceğini açıklar. Motor komutlarından önce, sırasında ve sonrasında farklı sinyal dinamiklerini karakterize etmek, merkezi sinir sisteminden gelen ve hareket sırasında saç hücresi hassasiyetini modüle eden gerçek zamanlı, endojen geri bildirimler hakkında içgörüler sağlar. Bu protokol, deneylerden önce hangi malzemelerin hazırlanması gerektiğini özetler ve daha sonra zebra balığı larvalarının nasıl felç edileceğini ve hazırlanacağını açıklar. Protokol, afferent nöronların ve motor nöronların hücre dışı ventral kök (VR) kayıtlarının istikrarlı bir gevşek yama kaydının nasıl oluşturulacağını açıklayacaktır. Bu protokol kullanılarak elde edilebilen temsili veriler örnek bir bireyden sunulur ve deneysel protokolün birden fazla çoğaltması üzerinde analiz yapılır. Verilerin önceden işlenmesi MATLAB'da özel yazılı komut dosyaları kullanılarak gerçekleştirilir. Genel olarak, bu in vivo deneysel paradigma, model omurgalı saç hücresi sistemindeki hareket sırasında duyusal geri bildirimlerin daha iyi anlaşılmasını sağlamaya hazırdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan bakım ve deneyleri Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Elektrofizyolojik kayıtlar için malzemelerin hazırlanması
- Silikon elastomer tabanlı bir kayıt kabı yapın.
- Kendinden karıştırmalı silikon elastomer bileşenlerinin ince bir tabakasını (örneğin, Sylgard) sığ kuyunun kenarıyla düzleşene kadar bir kapak camı tabanlı doku kültürü kabına dağıtın. Yaklaşık 0,5 mL yeterlidir.
- Yemeği oda sıcaklığında en az 48 saat örtün ve iyileştirin.
- Diseksiyon iğneleri yapın.
- DC güç kaynağı kullanarak 100 mL'lik bir etchant (3M KOH) kabına negatif şarj (5 V) sağlayın ve pozitif yüklü çıkışa bir tungsten teli (0,002 inç; 50,8 μm çapında) takın.
DİkKAT: Potansiyel bir yangın tehlikesi oluşturabilecek kıvılcım üretme riskiyle karşı karşıya kalabileceğiniz için, negatif ve pozitif teller bu işlem sırasında birbirleriyle temas etmemelidir. - Ucu keskin bir noktaya darana kadar telin ucunu hızlı ve tekrar tekrar etchant banyosuna batırarak tungsten telini kazıyın. Stereomikroskop altında, düz kenarlı bir jiletle teli ucundan yaklaşık 1 mm kesin. Üç kez daha tekrarlayın ve ardından ince forseps kullanarak kürlenmiş kayıt kabına pimler yerleştirin.
- DC güç kaynağı kullanarak 100 mL'lik bir etchant (3M KOH) kabına negatif şarj (5 V) sağlayın ve pozitif yüklü çıkışa bir tungsten teli (0,002 inç; 50,8 μm çapında) takın.
- Kayıt elektrotlarını hazırlayın.
- Arka yan çizgiden afferent nöronları kaydetmek için kullanılacak hafif konik ( Şekil 1 Ai ) hafif konik ( Şekil 1 Ai) ile 30 μm çapında uçlu elektrotlara kutu filamentli yatay bir mikropipette çekme kullanarak bir borosilikat cam kılcal boru (iç çap: 0.86 mm, dış çap:1.50 mm) çekin.
- Ek bir borosilikat cam kılcal boru, daha küçük uç çaplarına (1-5 μm) sahip bir çift elektrot içine çekin. Her elde bir elektrot tutarak, uçları ~30° açıya kırmak için yavaşça birbirine doğru çalıştırın. Bir mikroforge kullanarak, eğimli ucu pürüzsüz olana kadar parlatın. Son uç çapı 30-50 μm arasında olmalıdır ve ventral kök (VR) kayıt elektrodu olarak kullanılacaktır (Şekil 1 Aii).
- Vr elektrodun ön kenarı ile yan tarafını, elektrodu başlığın pipet tutucusuna yerleştirirken uç diyaframının aşağı doğru yönlendirildiğinde yardımcı olmak için kalıcı mürekkeple işaretleyin (adım 3.2).
NOT: VR kayıt elektrodunun mekanik modifikasyonu kesin değildir ve 1.3.2. adım, parlatmadan önce uygun bir uç morfolojisi elde edilene kadar birden fazla deneme gerektirebilir. VR kayıt elektrotunun larvaların vücut eğrisine uyacak şekilde eğimli olması gerekir. Bir kez imal edildikten sonra, VR kayıt elektronu, uç deneyler arasında açık ve temiz kaldığı sürece tekrar tekrar kullanılabilir.
- Elektrofizyoloji kayıt programlarında protokolü oluşturun.
- Afferent nöron kayıtları için mikroelektrod akımının ve gerilim kelepçesi amplifikatörünün arkadaki Kanal 1 girişine sağ başlığın bağlı olduğundan ve sol başlığın VR kayıtları için Kanal 2 girişine bağlandığından emin olun.
NOT: Akım ve voltaj kelepçe amplifikatörü için bilgisayar özellikleri en az 1 Ghz veya daha iyi bir işlemci, Windows XP Pro veya Mac OS X 10.46.6, 512 MB RAM'li CD-ROM sürücüsü, 500 MB sabit disk alanı ve 2 USB bağlantı noktası gerektirir. - Bilgisayar kontrollü amplifikatör yazılımını açın.
- Her kanal için ŞA düğmesini tıklatarak Kanal 1 ve Kanal 2'yi geçerli kelepçe moduna ayarlayın.
- Aşağıdaki parametreleri hem I-Clamp 1 hem de I-Clamp 2 sekmeleri altına girin. Birincil Çıkış: 100x AC Membran Potansiyeli (100.000 mV/mV), Kazanç: 1.000, Bessel: 1 kHz , AC: 300 Hz , Kapsam: Bypass . İkincil Çıkış: 100x AC Membran Potansiyeli (100 mV/mV) , Kazanç: 1 , Lowpass Filtresi: 10 Hz.
- Kanal parametrelerini Ch1_Aff ve Ch2_VR olarak kaydedin.
- Yama kelepçe elektrofizyoloji yazılımını yükleyin ve açın.
- BNC koaksiyel kablo ile amplifikatörün ilgili Kanal 1 ve Kanal 2 Ölçekli Çıkışlarına bağlanan Sayısallaştırıcı Kanallara (örneğin, Analog IN #0 ve Analog IN #1) Ch1_Affve Ch2_Vr ekleyerek analog sinyalleri ayarlamak için Yapılandırma'yı tıklatın ve Laboratuvar Tezgahı'nı seçin. Tamam'a tıklayın.
NOT: Sayısallaştırıcı için en düşük bilgisayar gereksinimleri şunlardır: 1 Ghz veya daha iyi işlemci, Windows XP Pro veya Mac OS X 10.46.6, CD-ROM sürücüsü 512 MB RAM, 500 MB sabit sürücü alanı ve 2 USB bağlantı noktası. - Edin 'i tıklatın ve Yeni Protokol 'üseçin.
- Mod/Hız sekmesinde Boş Boşluk 'useçin; Alma Modualtında Deneme Süresini kullanılabilir disk alanını kullan (yani durdurulana kadar kayıt yap) veya istenen süreyi (ss:mm:ss)ayarlayın ve ardından çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için sinyal başına Örnekleme hızını (Hz) 20.000 olarak ayarlayın.
- Girişler sekmesinin altında, daha önce yapılandırılmış Analog IN Kanallarını seçin (adım 1.4.6'da) ve ilgili kanal için Ch1_Aff ve Ch2_VR seçin.
- Çıkışlar sekmesinin altında sırasıyla Kanal #0 ve Kanal #1 için Cmd 0 ve Cmd 1'i seçin.
- Amplifikatördeki Kanal 1 Komutunu BNC koaksiyel kablo ile sayısallaştırıcıdaki Analog Ouput 0'a bağlayın ve Kanal 2 Komutu için Analog Çıkış 1'e tekrarlayın.
- Kalan sekmeler varsayılan ayarlar altında kalabilir. Tamam'a tıklayın ve protokolü kaydedin.
- Afferent nöron kayıtları için mikroelektrod akımının ve gerilim kelepçesi amplifikatörünün arkadaki Kanal 1 girişine sağ başlığın bağlı olduğundan ve sol başlığın VR kayıtları için Kanal 2 girişine bağlandığından emin olun.
2. Çözüm hazırlığı
- Hank'in çözümünü hazırlayın: 137 mM NaCL, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na2HPO4, 0.44 mM KH2PO4, 1.3 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4, 4.2 mM NaHCO4; pH 7.3. Stoka uygun deiyonize su hacmini ekleyerek Hank'in çözeltisini% 10'a kadar seyreltin.
- Hücre dışı çözelti hazırlayın: 134 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 2.1 mM CaCl2, 10 mM glikoz, 10 mM HEPES tampon; pH 7.8 NaOH ile ayarlanır. Vakum filtresi hücre dışı çözeltiyi 0,22 μm gözenek boyutuna sahip filtreden geçirir.
- α hazırlayın -bungarotoxin: % 0.1 seyreltme üretmek için 10 mL hücre dışı çözeltide 1 mg lyophilized α-bungarotoxin çözün.
- Ötenazi çözeltisi hazırlayın: %10 Hank'in çözeltisinde %50 (mg/L) tamponlu farmasötik sınıf MS-222.
DİkKAT: α-bungarotoksin, kolinerjik reseptörleri bloke ederek kasları felç eden güçlü bir nörotoksindir. Eldiven gereklidir ve paralitik ile ilgilenirken göz koruması önerilir.
3. Elektrofizyolojik kayıtlar için larvaların hazırlanması
- Zebra balığı larvalarını hareketsiz hale getirdi.
- Laboratuvarda yetiştirilen zebra balığı popülasyonundan(Danio rerio; döllenmeden 4-7 gün sonra) larvaları kullanın ve 27 °C'de embriyo çözeltisinde (%10 Hank'in çözeltisi) barındırın.
- Larvaları büyük uçlu bir transfer pipeti kullanarak küçük bir Petri kabına (35 mm) aktarın ve çevredeki çözeltinin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın.
NOT: Embriyo çözeltisinin çıkarılması paralitikin seyreltilmesini önler ve etkinliğini arttırır. Bir görev mendilinin köşesi, kalan embriyo çözeltisini yok etmek için kullanılabilir ve larvalara temas etmemek veya larvaları havaya maruz bırakmamak önemlidir. - Larvaları yaklaşık 5 dakika boyunca% 0.1 α-bungarotoxin 10 μL'ye daldırın.
NOT: Larvaları hareketsiz hale getirmek için gerekli süre preparatlar arasında değişir. Sağlıklı bir hazırlık, sürekli hızlı kan akışının ve azalan motor tepkilerin yakından izlenmesine bağlıdır. Paralitik için kısa bir aşırı pozlama, kapsamlı bir yıkamadan sonra bile preparatın genel sağlığında yavaş bir düşüşe neden olabilir. Larva tamamen hareketsiz hale gelmeden önce, hala ince kas titreşimleri belirtileri gösterirken bir yıkama uygulamak en iyisidir. - Felçli larvaları hücre dışı çözelti ile yıkayın ve 10 dakika boyunca yıkayın.
NOT: Yıkama, larvaların ince kas titreşimlerinden felci tamamlamak için geçişini sağlar. Ayrıca, α-bungarotoxin, bu protokolün gözlemlediği endojen geri bildirim devresinin kritik bir bileşeni olan nikotinik asetilkolin reseptörü (nAChR) α9-subunit'in bir antagonistidir; bununla birlikte, bu etkinin Xenopus ve zebra balığı saç hücrelerinde 10 dakikalık bir yıkamadan sonra geri döndürülebilir olduğu gösterilmiştir36,29.
- Balıkları kayıt kabına sabitle.
NOT: Hayvan sağlığına müdahale ettiği için larva zebra balığı (4-7 dpf) hazırlanırken anestezi (örneğin MS-222, Tricaine) gerekli değildir. Aslında, larva zebra balıkları belirli omurgalı protokollerden muaftır.- Transfer pipetini kullanarak larvaları hücre dışı çözelti banyosundan silikon tabanlı kayıt kabına taşıyın. Yemeğin geri kalanını hücre dışı çözelti ile doldurun.
- Bir stereomikroskop altında, larvaları silikon paspasın merkezinin üzerinde ince uçlu ön uçlarla, yanal tarafı yukarı doğru, vücudun ön ve arka uçları sırasıyla soldan sağa doğru akarak hafifçe yerleştirin. Daha sonra ince uçlu önpsler kullanarak silikon paspastan kazınmış bir pim kavrayın ve pimi, doğrudan anüse dorsal dorsal olmayan larvaların dorsal notochord'u aracılığıyla silikona ortogonal olarak yerleştirin. İkinci pimi kuyruğun ucuna yakın notochord'dan yerleştirin ve üçüncü pimi gaz mesanesinin notochord dorsalına yerleştirin (Şekil 1B).
NOT: Pimler takarken, kan akışının engellenmesini veya çevredeki kas yapısına zarar vermesini önlemek için notochord genişliğinin merkezini hedeflemek önemlidir. Notochord arka lateral çizgi sinirine dorsaldır, bu nedenle uygun sabitleme ile yanal çizgi duyusal nöronlarında hasar beklenmez. Çevredeki dokuyu rahatsız etmemek için ilk temastan sonra yerleştirin. İdeal olarak, pimin çapı temiz yerleştirmeyi sağlamak için notochord'un genişliğinin yarısından daha azdır. Pimler bu genişliği aşarsa, istenen pim genişliği elde edilene kadar 1.2 adımını yineleyin. Sabitleme işleminden sonra kan akışı yavaşlarsa, 1.3. - Dördüncü pimi otik veziklikten geçirin ve pim kapsüle yerleştirilirken ön kısma doğru hafif bir dönüş sağlar (Şekil 1B). Hafif bir dönüş uygulandığında, afferent somata kümesini ortaya çıkarmak için klatrorum ve otik vezikül arasındaki dokuyu izleyin.
NOT: Dördüncü pimin açılı takılması, büyük otik veziklin tarafından engellenen arka yanal çizgi afferent ganglionun maruz kalmasını sağlamaktır.
4. Ventral kök kaydı
- Sabitlenmiş larvaları sabit bir aşama diferansiyel girişim kontrastı (DIC) dik mikroskop üzerine 10x su daldırma hedefinin altına yerleştirin ve sol baş sahne yaklaşım vektörüne paralel olarak kas bloklarının myseptal yarıklarını yönlendirin (Şekil 1B).
- Optik hava tablasında yüzen sabit kademeli DIC mikroskop, titreşimlerin kayıtlara müdahale etmesini önlemek için en iyi sonucu sağlar. Motorlu bir pozisyoner kullanarak, mikroskop daha sonra preparatın ve başlık başlıklarının monte edildiği sabit aşama etrafında serbestçe hareket edebilir (Şekil 1C).
- Zemin telini banyo çözeltisine yerleştirin ve sol sahne başlığına bağlı olduğundan emin olun.
- ESNEK jel yükleme pipet ucu kullanarak VR kayıt elektrodunu 30 μL hücre dışı çözelti ile doldurun ve sol baş kulis pipet tutucusuna yerleştirin.
- Bir pnömatik dönüştürücü tarafından üretilen pozitif basınç (1-2 mmHg) uygularken kayıt pipetini bir mikromanipülatör ile bulaşık çözeltisine küçümseyin. 10x büyütme altında, uç diyaframının yönünün aşağı doğru olduğunu onaylayın.
- Pnömatik dönüştürücü, pipet tutucu bağlantı noktasına silikon boru ile bağlanmalıdır.
- VR elektrotunun mioseptum üzerine yerleştirilmesi
- Mikromanipülatör'ü tekrar kullanarak, VR elektrot ucunu larva üzerinde pozisyon tutana kadar küçümseyin. Büyütmeyi 40x daldırma için artırın.
- Yarık VR elektrot ucu diyaframında ortalanana kadar elektrot ucunu iki miyomer ventral arasındaki bir mioseptum üzerinden yanal çizgiye getirin (Şekil 1D).
- Pipeti, uç diyaframın gecikme kenarı epitel ile hafifçe temas edene kadar küskünleyin. İlk temastan sonra, öndeki kenarın temas etmesini ve bir conta oluşturabilmesini sağlamak için pipeti çapraz olarak manevra yap.
- Pnömatik dönüştürücü ile negatif basınç (~100 mm Hg) uygulayın ve tutun.
NOT: VR pipetinin mioseptum ve sürekli negatif basınca göre doğru yönlendirilir, motor nöron aktivitesinin cilt boyunca yüksek sinyal-gürültü oranıyla algılanmasını optimize eder.
- Motor nöron aktivitesini tespit edin.
- Sol başlık amplifikatöre bağlanmalıdır, bu da güçlendirilmiş sinyali bitişik bir bilgisayarda izlenecek yama kelepçesi elektrofizyoloji yazılımına veren bir sayısallaştırıcıya aktarır (bkz. bölüm 1.4).
- Yama kelepçe yazılımında, VR sinyalini izlemek için araç çubuğundaki Oynat düğmesine tıklayın (Şekil 1E).
- İyi kalıplaşmış patlama sinyali dinamiklerine sahip motor nöron aktivitesi gözlendikten sonra VR kaydının sağlandığından emin olun29,37 (Şekil 1E).
NOT: Fiktif yüzme nöbetleri, hazırlığın felç olmasına rağmen iletmeye devam eden VR motor nöronlarının aktivite kalıplarıdır. Bu nedenle, fiktif yüzmeler, hayvanın davranışsal durumunu belirlemenin ve aynı zamanda hareketsiz bir hazırlık gerektiren afferent nöron kayıtlarını gerçekleştirirken lokomotor parametrelerini ölçmenin erişilebilir bir yoludur. Elimizde, bir VR kaydı elde edildikten sonra, sağlıklı bir hazırlık her birkaç saniyede bir gönüllü fiktif yüzme nöbetleri ortaya çıkarır. Unutmayın, sağlıklı bir hazırlık hızlı kan akışını sürdürüp sürdürebilir. Yeterli bir VR sinyali elde etmek birkaç dakika sürebilir ve ilk algılamadan sonra sinyal-gürültü oranı iyileşebilir. Zamanın yararına, bölüm 5'e geçmek kabul edilebilir. - Bölüm 5 tamamlandıktan sonra bir VR kaydı hala sağlanamazsa, negatif basıncı bırakın, elektrodu yükseltin ve larva sağlığı hala en uygunsa, farklı bir mioseptum üzerinde 4.4.2 adımından itibaren tekrarlayın.
5. Afferent nöron kaydı
- Farklı kayıt elektrotlarını 30 μL hücre dışı çözelti ile doldurun; sağ başpıt pipet tutucusuna(Şekil 1B,C)yerleştirin ve pnömatik dönüştürücü tarafından üretilen pozitif basınç (1-2 mm Hg) uygulanırken çanak çözeltisine küçümser.
- Arka yanal çizgi afferent ganglion'un yerini bulun ve gevşek bir şekilde takın.
- Bir mikromanipülatör kullanarak, afferent elektrot ucunu klatronun üzerinde pozisyon tutana kadar küçümseyin.
- Büyütmeyi 40x daldırma için artırın ve arka lateral çizgi siniri ve klatromunun kesişimini bulun. Cleithrum'dan liflerin arka lateral çizgi afferent ganglionu içselleştirdiklerine kadar olan yanal çizgi sinir ön kısmını takip edin, soma ayrı kümesi ile ayırt edilebilir (Şekil 1F).
- Elektrot ucunu afferent ganglionun üzerine getirin ve uç epitelle temas edene kadar pipetleri küçümseyin. Yavaşça, elektrot manevrası yaparak tüm uç çevresinin afferent ganglionla temas ettiğini belirtin.
- Pnömatik dönüştürücü ile negatif basınç (20-50 mm Hg) uygulayın ve tutun.
NOT: Afferent ganglion'a uygulanan negatif basınç, ventral kök kaydı sırasında uygulanan emişten daha yumuşaktır. Artan negatif basınç sinyalden gürültüye iyileştirebilir, ancak sürekli agresif emiş altında afferent nöron sağlığı azalır ve bu da başarılı bir kayıt olasılığını azaltır.
- Afferent nöron aktivitesini kaydedin.
- Sağ başlığın 4.5.1 adımında açıklandığı gibi benzer bir sırayla bağlandığından emin olun.
- pClamp10'da, afferent nöron ve VR sinyalini aynı anda izlemek için araç çubuğundaki Oynat düğmesine tıklayın.
- Ani artışlar kendiliğinden meydana geldiğinde, kabaca her 100-200ms1 ,29 (Şekil 1E)olduğunda tümhücrenin,afferent nöronların gevşek yama kaydının elde edildiğinden emin olun.
- Yavaş yavaş, afferent nöron kayıt elektrot basıncını atmosferik (0 mm Hg) geriye doğru artırın ve kaydın geri kalanı için tutun.
6. Veri toplama
- Eşzamanlı kayıt.
- Afferent nöron ve motor nöron aktivitesi tespit edildikten sonra, her iki kanalda da eşzamanlı boşluksuz kayıtları yakalamak için pClamp10'daki araç çubuğundaki Kaydet düğmesine tıklayın.
- İstediğiniz süre için kayıt (Şekil 1E).
NOT: Sağlıklı bir hazırlıkta bir kayıt saatler sürebilir ve dış uyaranlara yanıt vermeye devam edebilir. - Alma parametreleri gibi meta verileri korumak için kaydı desteklenen bir dosya türü (.abf, pClamp10) olarak kaydedin.
7. Ötenazi
- Pnömatik dönüştürücüler kullanarak hem afferent hem de VR kayıt elektrotlarına pozitif basınç (10 mm Hg) uygulayın ve elektrotları mikromanipülatörleri kullanarak kayıt çanaktan yükseltin.
- Kayıt çanağını sabit aşama DIC mikroskobundan diseksiyon stereomikroskopa aktarın.
- İnce uçlu forseps kullanarak, tungsten pimlerini notochord ve otik kapsülden çıkarın ve larvaları bir transfer pipeti kullanarak en az 5 dakika boyunca 5 mL ötanazi çözeltisi içeren bir Petri kabına (35 mm) aktarın.
8. Ön işleme ve veri analizi
NOT: Veri ön işleme ve analizi, komut satırı kodlamasının temel bir anlayışını gerektirecektir.
- Kayıt dosyasını ön işleme için dönüştürün.
- Matlab yazılımını yükleyin.
- Özel yazılı komut dosyası, abfload.m38'i indirin ve dosyayı ham kayıt dosyasını depolayan klasöre kaydedin.
- Matlab Düzenleyicisi penceresinde, abfload.m açın ve araç çubuğunda Çalıştır'a tıklayın. İstenirse Klasörü Değiştir'i seçin.
- Komutun penceresindeki işlevi, ham kayıt dosyası giriş olarak yürütün,
> [d,si,h] = abfload('[ham kayıt dosyası adı].abf')
ve çıktı çalışma alanını larva ataması, yaş ve [örnek numarası]_[dpf'deki yaş]_[ham kayıt dosyası adı (varsayılan olarak deneysel tarih içerir)] gibi deneysel tarih içeren bir dosya adıyla kaydedin.
NOT: Dönüştürülen dosya adı yalnızca alt çizgiyle belirtilen tamsayıları içermelidir.
- Veri ön işleme gerçekleştirin.
- Matlab komut dosyası AffVR_preprocess.m ve yazarlar tarafından özel olarak yazılmış ilişkili işlevleri indirin.
- Düzenleyici penceresinde AffVR_preprocess.m açın.
- Değişkenleraltında, sinyal-gürültü oranının kaydına bağlı olarak hem afferent hem de VR kayıtları(sırasıyla spk_detect_lb ve vr_detect_lb, satır 8 ve 14) için alt sınır çivi algılama eşiklerini ayarlayın.
NOT: Ani algılama, birden fazla farklı nörondan gelen sinyalleri genlik olarak sıralamak ve izole etmek için manuel eşiğe dayanır. Diğer birimlerin temel gürültüsü ve etkinliği, yalnızca maksimumun yüzde biri (örneğin, spk_detect_ub) içindeki ani genlikleri (örneğin, spk_detect_lb) içerecek şekilde eşikle filtrelenir. Eşikleme ayrıca motor aktivitesi ani artışlarının patlamalara ve kolektif fiktif yüzme sıçramalarına doğru bir şekilde binningsini sağlar. Genellikle, 0,5 eşik alt sınırı ile başlayın ve doğru algılama elde edilene kadar kademeli olarak azaltın. Örneğin, spk_detect_lb 0,5 ve spk_detect_ub 1,0 olarak ayarlamak, en fazla ani genlik sayısının %50'sine eşit veya daha büyük tüm ani artışları algılar ve gürültüyü veya daha düşük sivri genliklerdeki ek nöronları hariç tutar (Şekil 2A). Alternatif olarak, daha düşük başak genliklerinin nöronlarını izole etmek için daha yüksek spike genliklerinin nöronlarını dışlamak için spk_detect_ub 1.0'dan düşürebilme de olabilir. Ön işleme rakamı çıktıları (bkz. adım 7.2.6), ayarlamaların ve 7.2.2 adımından yinelemenin gerekli olup olmadığını bildirir. - Düzenleyici penceresinde, AffVR_preprocess.m yürütmek için Çalıştır'ı tıklatın.
- Önceden dönüştürülmüş .mat veri dosyasına gidin (bkz. adım 7.1.3); seçin ve otomatik ön işleme başlamak için Aç'ı tıklatın.
NOT: Özel komut dosyası çalışırken, "verileri filtreleme ...", "ventral kök etkinliğini algılama ..." ve "şekil oluşturma ..." gibi işleme adımları aracılığıyla ilerlemesini bildiren çıktılar Komut Penceresi'nde görünecektir. - AffVR_preprocess.m tarafından oluşturulan şekiller, farklı ani yükselişi ve VR algılamayı görselleştirecek ve herhangi bir analiz değişkenin ayarlanıp ayarlanmayacağını gösterecektir (Şekil 2).
- Önceden işlenmiş meta verileri preprocess_output klasörüne kaydetmek için klavyeye "Y" girin.
- Önceden işlenmiş veriler otomatik olarak data_out.xlsolarak çıktısını alacaktır.
- Önceden işlenmiş verileri istediğiniz gibi analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zebra balığı larvaları düzgün bir şekilde hareketsiz hale getirildikten ve arka lateral çizgi afferent ganglion ve VR kaydı elde edildikten sonra, hem afferent hem de motor nöronlardaki aktivite aynı anda ölçülebilir. Kayıt kanalları, kayıtsız ve VR etkinliğinin sürekli izlenmesi için boşluksuz kayıt protokolleri (adım 1.4) kullanılarak görüntülenir. Gerçek zamanlı olarak, spontan afferent ani artış oranındaki düşüşler, fiktif yüzme nöbetlerinin göstergesi olan VR aktivitesi ile eş zamanlı olarak gözlenebilir (Şekil 1E). En iyi sonuçların ve doğru ani yükselişin en az 0,5 sinyal-gürültü oranı elde eden kayıt ürünleri olduğunu gördük. Özel yazılı ön işleme komut dosyaları, farklı ve VR ani algılamanın görselleştirilmesine yardımcı olmak için çizimler oluşturur. Spontan afferent ani artışlar, eşik, minimum süre (0,01 ms) ve minimum ani artış aralığı (ISI; 1 ms) gibi ani parametrelerin birleşimi kullanılarak tanımlanır. Kaydı kurarken negatif basıncı artırmak genellikle aynı anda birden fazla farklı üniteden sinyal algılaması verir. Genlik ile filtreleme, bağımsız afferentlerin sinyal dinamiklerini ayırt etmeyi sağlar. Ön işleme komut dosyasındaki alt ve üst sınır algılama değişkenleri ayarlanarak sinyallerin izole edilmesi sağlanabilir (Şekil 2A). Çok üniteli kayıtlar elde etmek için agresif emiş, kararsız kayıtlara, mekanik gürültüye, kayıtsız sağlığın bozulmasına ve sonuçta sinyal kaybına neden olabilir. Bu nedenle, istenen sinyal elde edildikten sonra emmeyi atmosferik basınca yavaşça geri çevirmek önemlidir. Ventral kök başak algılaması, farklı ani algılamaya aynı parametreleri izler, ancak farklı fiktif yüzme sıçramalarını tanımlamak için ek girişler gerektirir. Bir motor komutu içindeki patlamalar, birbirlerinin 0,1 ms'si içinde en az iki ani artışla VR etkinliği ile tanımlanır ve en az 5 ms sürer. Tüm yüzme nöbetleri daha sonra <200 ms(Şekil 2B)aralıklarla en az üç patlama ile tanımlanmıştır.
Bir kayda bütünüyle bakıldığında afferent aktiviteyi yorumlamak zordur. Ön işleme komut dosyaları, sinyal dinamiklerindeki eğilimleri görselleştirmeye yardımcı olmak için iyi tanımlanmış bir ilgi süresine, bu durumda bir yüzme maçının (n = 33, Şekil 2C)başlangıcına dayanan farklı etkinliğin bölümlerini kaplar. Anlık afferent aktivite hareketli ortalama filtre ve 100 ms örnekleme penceresi kullanılarak hesaplanır. Ortalama spontan aktivite, motor aktivitenin başlangıcına yanıt olarak dramatik değişiklikler gösterir (Şekil 2C). Farklı aktiviteyi daha iyi incelemek ve analiz etmek için, yüzmeden önceki ve sonraki dönemler, ilgili yüzme maçının zaman aralığına uyacak şekilde ayarlanır. Ön işleme komut dosyasında ve temsili analiz edilen sonuçlarda bu dönemler "yüzme öncesi" ve "yüzme sonrası" olarak adilmektedir. Yüzme öncesi, yüzme ve yüzme sonrası ani artış oranları, süresi boyunca ilgili dönemdeki ani artış sayısı alınarak hesaplanmıştır. Her birey için tahminlerin hassasiyeti kısmen yüzme sayısının bir işlevidir, bu nedenle yüzme sayısının kareköke eşit olan bireysel ağırlıklarla, ağırlıklı regresyonlar kullanarak değişken ilişkileri analiz ettik.
Çeşitli ilgi dönemlerinde (yüzme öncesi, yüzme ve yüzme sonrası) farklı ani artış oranlarındaki farklılıklar, varyans (ANOVA) iki yönlü analizi ile test edilmiştir. Tukey'in geçici testi, yüzme ani artış oranları ile her ikisinin de yüzme öncesi ani artış oranları arasında ani artış oranlarında önemli farklılıklar tespit etti (8.94 ± 0.2 Hz, göreceli düşüş% 57) ve yüzme sonrası (5.34 ± 0.2 Hz, göreceli düşüş % 40) Dönem. Yüzme sonrası ani artış oranının yüzme öncesi ani artış oranından daha düşük olduğunu tespit ettiğimiz için ani artış oranı hemen taban çizgisine dönmedi (Gruplar arasında Tukey post-hoc testleri, p < 0.001; Şekil 3A). Doğrusal modeller, göreceli ani artış hızı ve fiktif yüzme parametreleri arasındaki ilişkileri tespit etmek için kullanılmıştır. Göreceli ani artış oranı, yüzme öncesi ani artış oranı üzerinden yüzme ani artış oranı alınarak hesaplanmıştır. Fictive yüzme parametreleri yüzme süresi, yüzme sıklığı (yani, yüzme maçı süresince bir yüzme maçı içindeki patlama sayısı) ve görev döngüsünü (yani, yüzmenin toplam süresi boyunca yüzme patlaması sürelerinin toplamı) içerir. Elimizde, göreceli ani artış hızının ortalaması ve varyansı ilişkiliydi, bu nedenle verilerin analiz için günlük dönüştürülmesi gerekiyordu. Afferent ani artış hızı yüzme süresi ile negatif olarak ilişkiliydi, yani yanal çizgi daha uzun süreli yüzmeler sırasında daha fazla inhibisyon yaşar (r2 = 0.186, F2,26 = 2.971, p = 0.045; Şekil 3B). Göreli ani artış hızı ile yüzme sıklığı veya görev döngüsü arasında korelasyon saptanmamıştır ((r2 = 0.099, F2.26 = 1.431, p = 0.231 ve r2 = 0.047, F2.26 = 0.645, p = 0.932 sırasıyla; Şekil 3C,D). Değişken ilişkilerin tüm analizleri kişi başına yüzme sayısına göre ağırlıklandırıldı ve tüm değişkenler daha sonra her birey tarafından ortalama alındı (n = 29).
Şekil 1: Posterior lateral çizgi afferent nöron ve ventral motor kök aktivitesinin eşzamanlı elektrofizyolojik kaydı. (A). Elektrotları kaydeden gevşek yama afferent (i) ve ventral motor kökü (ii) örneği. Ölçek çubukları 50 μm'yi temsil eder. (B) Larva zebra balıkları felç olur ve dört yerde (çapraz semboller) kayıt stabilitesi için bir Sylgard kabına sabitlenir. Kalın haçlar pimler için ekleme noktalarını temsil eder. (C) Elektrofizyoloji kulesi titreşim yalıtım tablasına monte edilir ve 40x büyütme yapabilen motorlu bir kontrol ünitesinde dik sabit kademeli mikroskopten oluşur. Çift akımlı kelepçe ve gerilim kelepçe kafası aşamaları mikromanipülatörlere monte edilir. (D) Vücut kaslarının miyomerleri, motor nöron arborizasyonları için kayıt işaretleri görevi yapan miyopota ile ayrılır. Ventral motor kök elektrodu ventral gövdeye (solda) yaklaşır ve bir mioseptumun (ok ucu) üzerine ortalanır ve alçaltılır. Ölçek çubuğu 50 μm'yi temsil eder. (E) Elektrofizyolojik kaydın gerçek zamanlı olarak ekran görüntüsü, spontan afferent aktivitenin (kanal 1) görselleştirilmesine ve fiktif yüzme maçının (kanal 2) göstergesi olan patlayan ventral kök aktivitesine izin verir. Kaydet ve Kullan düğmeleri kırmızı oklarla gösterilir. (F) Arka lateral çizgi afferent ganglion (kesik çizgi) cildin hemen altında uzanır ve sıkı bir afferent soma kümesi ile tanımlanabilir. Ganglion, klatron kemiğini (ok ucu) geçerek ganglion'a bağlandığı yanal çizgi sinirini takip ederek bulunabilir. Ölçek çubuğu 30 μm'yi temsil eder.
Şekil 2: Ön işleme şekil çıktıları doğru ani algılamayı görselleştirir. (A) Arka lateral çizgi afferent nöronların hücre dışı, gevşek yama kaydı. En az 1 ms'lik bir ani artış aralığı ile ayrık sivri uçlar (kırmızı noktalarla etiketlenmiş) algılanır. Diğer birimlerin temel gürültüsü ve etkinliği, maksimumun yalnızca %50'si içinde sivri genlikleri içerecek şekilde eşikleme ile filtrelenir. (B) Fiktif yüzme nöbetlerinin ventral motor kök kaydı (VR), kayıt süresi boyunca gönüllü motor komutları ortaya koymaktadır. VR ani artışları (kırmızı noktalar) benzer bir eşik filtresi kullanılarak algılanır ve daha sonra birbirinin 200 ms'si içinde bir etkinlik patlaması algılayarak tek bir yüzme maçına (yeşil) binned (bkz. ekleme; ölçek çubuğu 200 ms'yi temsil eder). Tanımlanan yüzme bout dışında algılanan ani artışlar stereotiplenmiş patlama aktivitesinin ani artış aralığında oluşmaz ve bu nedenle hariç tutulur. (C) Yüzmeden önce, yüzme sırasında ve sonrasındaki ani artış hızını gösteren her yüzme maçının başlangıcına (zaman = 0 s) ortalanmış spontan afferent spike hızı anlamına gelir. Hata çubukları SEM ± temsil eder.
Şekil 3: Fiktif yüzmeden önce, sırasında ve sonrasında afferent aktivitenin nicelleştirilmesi. (A) Yüzme sırasında afferent başak oranı önemli ölçüde azalır ve bu etki daha sonra bile devam eder. İstatistiksel olarak benzer gruplandırmalar a ve b ile gösterilir. (B) Daha uzun yüzme süresi, azalan afferent ani artış hızı ile ilişkilidir. (C-D) Yüzme sıklığı ve yüzme görev döngüsü, farklı ani artış oranıyla hiçbir korelasyon göstermez. Tüm değerler SEM ± ortalamayı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan deneysel protokol, sağlam ve neşeli bir omurgalıda motor davranışlar arasında duyusal girişteki endojen değişiklikleri izleme potansiyeli sağlar. Özellikle, larva zebra balıklarında yanal çizgi afferent nöronların ve ventral motor köklerinin eşzamanlı hücre dışı kayıtlarını gerçekleştirmeye yönelik in vivo bir yaklaşımı detaylandırıyor. Spontan afferent aktivite daha önce zebra balıklarında potansiyel eşzamanlı motoraktivitesi 1,2 ,39,40,41dikkate alınmadan karakterize edilmiştir. Ventral kök kayıtları ile motor aktivitenin varlığını izlemeden, spontan yüzme sırasında ve hatta sonrasında efferent inhibisyonun etkisi nedeniyle afferent aktivitenin deşifre edilmesi muhtemelen hafife alınacaktır.
In vivo elektrofizyolojik kayıtlar doğası gereği zorlayıcıdır. Deneyimlerimize göre, sağlıklı bir hazırlık sağlamak, farklı nöronlar ve ventral motor kökleri için başarılı, uzun ömürlü kayıtlar elde etmenin en büyük faktörüdür. Bunu yapmak için, sadece hızlı kan akışını tanımlamak ve izlemek değil, aynı zamanda cildin dokusunu ve alttaki kasları tanımak da önemlidir. Sağlıklı larvaların içsel kan akışına ve cilt durumuna aşina olmak için daha fazla işlemeden önce birkaç felçli larvayı mikroskop altında gözlemlemenizi öneririz. Cilt boyunca başarılı bir ventral kök kaydı, kayıt elektrodünün sıkı bir sızdırmazlık oluşturması için pürüzsüz ve sağlıklı bir cilt yüzeyi gerektirir. Bu yaklaşım, alttaki kasları açığa çıkarmak için epitelin parçalanması çağrısında bulunan invaziv ve zaman alıcı geleneksel protokoller37,42'yi atlatır. Cilt üzerinden kayıt yapmanın bir rahatsızlığı, sinyaller gerçekleşmeden önce zaman içinde potansiyel değişkenliktir. Uygulanan negatif basıncın büyüklüğünü ve süresini optimize etmek, sinyal oluşturmak ve sinyal-gürültü oranını potansiyel olarak iyileştirmek için gereken süreyi azaltacaktır. Sağlıklı, aktif bir preparattan elde edilen kayıtlar, birkaç saniyede bir meydana gelen fiktif yüzme nöbetleri ile 5-10 Hz arasında kendiliğinden afferent ani artış oranları vermelidir.
Motor aktivite durumunu ortaya çıkarmanın yanı sıra, ventral kök kayıtları, homolog saç hücresi sistemlerindeki aktivitenin yanı sıra (örneğin, işitsel ve vestibüler sistem35,43,44, 45)yanal hat aktivitesini zayıflamak için motor komutlarına paralel olarak boşalan efferent aktivitesini izlemek için bir proxy görevi görebilebilir. Efferent nöronlar arka beynin derinliklerinde yer alarak elektrofizyolojik kayıtlarını son derece zorlaştırır. Zebra balığı örnek bir genetik sistemdir ve elektrofizyoloji protokolümüz, corollary akıntı, saç hücresi duyarlılığı, ekssitoksiklik ve ötesi yönlerini güçlü bir şekilde araştırmak için transgenik çizgilerle tamamlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Ulusal Sağlık Enstitüsü (DC010809), Ulusal Bilim Vakfı (IOS1257150, 1856237) ve Whitney Deniz Biyobilimleri Laboratuvarı'ndan J.C.L.'ye desteklerini minnetle kabul ediyoruz. Liao Lab'ın geçmiş ve şimdiki üyelerine tartışmaları teşvik eden için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL beaker | PYREX | 1000 | resceptacle for etchant |
| 10x water immersion objective | Olympus | UMPLFLN10xW | low magnification for positioning larvae and recording electrode |
| 40x water immersion objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | higher magnification for position electrode tip and establishing patch-clamp |
| abfload.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for converting raw electrophysiology recordings to .mat files | |
| AffVR_preprocess.m | supplemental coding file | custom written MATLAB script for preprocessing recording data | |
| BNC coaxial cables | ThorLabs | 2249-C-12 | connecting amplifier and digitizer channels; require 4 |
| borosilicate glass capillaries w/ filament | Warner Instruments | G150F-3 | inner diameter: 0.86, outer diameter: 1.50; capillary glass used to form recording electrodes |
| burst_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| computer | N/A | N/A | any computer should work |
| DC Power Supply | Tenma | 72-420 | used for electrically etching dissection pins |
| electrophysiology digitizer | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | enables acquisition of patch-clamp data |
| filament | Sutter Instrument Company | FB255B | 2.5 mm box filament used in micropipette puller |
| fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | used to manipulate larvae and insert pins |
| fixed stage DIC microscope | Olympus | BX51WI | microscope used to visualize and establish patch-clamp recordings |
| flexible, tapered pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-169 | flexible tips enable insertion into recording electrode to dispense extracellular solution at the tip |
| FluoroDish | World Precision Instruments Inc. | FD3510-100 | cover glass bottomed dish recording dish |
| KimWipe | KimTech | 34155 | task wipe used for wicking away excess fluid from larvae |
| Kwik-Gard | World Precision Instruments Inc. | 710172 | self-mixing sylgard elastomer |
| MATLAB | MathWorks | R2020b | command line software for preprocessing data |
| microelectrode amplifier | Axon Instruments, Molecular Devices | MultiClamp 700B | patch clamp amplifier for dual channel recordings |
| microforge | Narishige | MF-830 microforge | to polish recording electrode |
| micromanipulator control unit | Siskiyou | MC1000-eR/T | 4-axis dial coordinator for controlling micromanipulator |
| micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | for pulling capillary glass into recording electrodes |
| microscope control unit | Siskiyou | MC1000e | positions the microscope around the fixed stage and preparation |
| motorized micromanipulator | Siskiyou | MX7600 | positions the headstage and attached recording electrode for patch-clamp recording |
| MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | downloadable from Axon MultiClamp 700B Commander download page |
| optical air table | Newport Corporation | VH3036W-OPT | breadboard isolation table to float microscope and minimize vibrations during recordings |
| pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | downloadable from Axon pCLAMP 10 Electrophysiology Data Acquisition & Analysis Software Download page |
| permanent ink marker | Sharpie | order from amazon.com | for marking the leading edge side of the VR electrode to ensure proper orientation when inserting into pipette holder |
| petri-dish | Falcon | 35-3001 | used to immerse larvae in paralytic |
| pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | hold recording electrode and connect to the headstage |
| pneumatic transducer | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | for controlling recording electrode internal pressure |
| potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473-25G | etchant for etching dissection pins |
| silicone tubing | Tygon | 14-169-1A | tubing to connect pneumatic transducer to pipette holder |
| spike_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | used to visualize pin tips and during preparation of larvae |
| straight edge razor blade | Canopus | order from amazon.com | cuts the tungsten wire while making dissection pins |
| swimbout_detect | supplemental coding file | custom written MATLAB function necessary to run AffVR_preprocess.m | |
| syringe | Becton Dickinson Compoany | 309602 | filled with extracellular solution to inject into recording electrodes |
| transfer pipette | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | single use, non-sterile pipette for transfering larvae |
| tricaine methanesulfonate | Syndel | 12854 | pharmaceutical aneasthetic used to euthanize larvae with high dosage. |
| tungsten wire | World Precision Instruments Inc. | 715500 | 0.002 inch, 50.8 μm diameter; used to make dissection pins |
| vacuum filtration unit | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | single use, sterile, vacuum filtration units used to sterilize extracellular solution used for electrophysiology electrode ringer |
| voltage-clamp current-clamp headstage | Molecular Devices | CV-7B | supplied with MultiClamp 700B amplifier used as left and right headstages |
| α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | for immobilizing the larvae prior to recording |
References
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
- Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C. Afferent and motorneuron activity in response to single neuromast stimulation in the posterior lateral line of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 112 (6), 1329-1339 (2014).
- Levi, R., Akanyeti, O., Ballo, A., Liao, J. C. Frequency response properties of primary afferent neurons in the posterior lateral line system of larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 113 (2), 657-668 (2015).
- Harris, G. G., Fishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
- Dow, E., Jacobo, A., Hossain, S., Siletti, K., Hudspeth, A. J. Connectomics of the zebrafish's lateral line neuromast reveals wiring and miswiring in a simple microcircuit. eLife. 7, 33988 (2018).
- Obholzer, N., et al. Vesicular glutamate transporter 3 is required for synaptic transmission in zebrafish hair cells. The Journal of Neuroscience. 28 (9), 2110-2118 (2008).
- Keen, E. C., Hudspeth, A. J. Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (14), 5537-5542 (2006).
- Li, G., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
- Manley, G. A., Robertson, D. Analysis of spontaneous activity of auditory neurons in the spiral ganglion of the guinea-pig cochlea. The Journal of Physiology. 258 (2), 323-336 (1976).
- Kiang, N. Y. S., Watanabe, T., Thomas, E., Clark, L. Discharge patterns of single fibers in the cat's auditory nerve. , MIT Press. Cambridge MA. (1965).
- Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Physiological recordings from zebrafish lateral-line hair cells and afferent neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
- Reinig, S., Driever, W., Arrenberg, A. B. The descending diencephalic dopamine system is tuned to sensory stimuli. Current Biology. 27 (3), 318-333 (2017).
- Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
- Pichler, P., Lagnado, L. Motor behavior selectively inhibits hair cells activated forward motion in the lateral line of zebrafish. Current Biology. 30 (1), 150-157 (2020).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish larvae exhibit rheotaxis and can escape a continuous suction source using their lateral line. PloS One. 7 (5), 36661 (2012).
- Suli, A., Watson, G. M., Rubel, E. W., Raible, D. W. Rheotaxis in larval zebrafish is mediated by lateral line mechanosensory hair cells. PLoS One. 7 (2), 29727 (2012).
- Oteiza, P., Odstcil, I., Lauder, G., Portugues, R., Engert, F. A novel mechanism for mechanosensory-based rheotaxis in larval zebrafish. Nature. 547 (7664), 445-448 (2017).
- McHenry, M. J., Feitl, K. E., Strother, J. A. Larval zebrafish rapidly sense the water flow of a predator's strike. Biology Letters. 5 (4), 477-479 (2009).
- Stewart, W. J., Cardenas, G. S., McHenry, M. J. Zebrafish larvae evade predators by sensing water flow. The Journal of Experimental Biology. 216, Pt 3 388-398 (2013).
- Mekdara, P. J., Schwalbe, M. A. B., Coughlin, L. L., Tytell, E. D. The effects of lateral line ablation and regeneration in schooling giant danios. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 8 175166 (2018).
- Palmer, L. M., Giuffrida, B. A., Mensinger, A. F. Neural recordings from the lateral line in free-swimming toadfish, Opsanus tau. The Biological Bulletin. 205 (2), 216-218 (2003).
- Ayali, A., Gelman, S., Tytell, E. D., Cohen, A. H. Lateral line activity during undulatory body motions suggests a feedback link in closed-loop control of sea lamprey swimming. Canadian Journal of Zoology. 87 (8), 671-683 (2009).
- Mensinger, A. F., Van Wert, J. C., Rogers, L. S. Lateral line sensitivity in free-swimming toad fish Opsanus tau. The Journal of Experimental Biology. 222, Pt 2 190587 (2019).
- Montgomery, J., Bodznick, D., Halstead, M. Hindbrain signal processing in the lateral line system of the dwarf scorpionfish Scopeana papillosus. The Journal of Experimental Biology. 199, Pt 4 893-899 (1996).
- Montgomery, J. C., Bodznick, D. An adaptive filter that cancels self-induced noise in the electrosensory and lateral line mechanosensory systems of fish. Neuroscience Letters. 174 (2), 145-148 (1994).
- Palmer, L. M., Deffenbaugh, M., Mensinger, A. F. Sensitivity of the anterior lateral line to natural stimuli in the oyster toadfish, Opsanus tau (Linnaeus). The Journal of Experimental Biology. 208, Pt 18 3441-3450 (2005).
- Russell, I. J., Roberts, B. L. Inhibition of spontaneous lateral-line activity of efferent nerve stimulation. The Journal of Experimental Biology. 57, 77-82 (1972).
- Lunsford, E. T., Skandalis, D. A., Liao, J. C. Efferent modulation of spontaneous lateral line activity during and after zebrafish motor commands. Journal of Neurophysiology. 122 (6), 2438-2448 (2019).
- Russell, I. J. The pharmacology of efferent synapses in the lateral-line system of Xenopus laevis. The Journal of Experimental Biology. 54 (3), 643-659 (1971).
- Roberts, B. L., Russell, I. J. The activity of lateral-line efferent neurons in stationary and swimming dogfish. The Journal of Experimental Biology. 57 (2), 435-448 (1972).
- Flock, A., Russell, I. J. The post-synaptic action of efferent fibres in the lateral line organ of the burbot Lota lota. The Journal of Physiology. 235 (3), 591-605 (1973).
- Montgomery, J. C. Noise cancellation in the electrosensory system of the thornback ray; common mode rejection of input produced by the animal's own ventilatory movement. Journal of Comparative Physiology. 155, 103-111 (1984).
- Tricas, T. C., Highstein, S. M. Action of the octavolateralis efferent system upon the lateral line of free-swimming toadfish, Opsanus tau. Journal of Comparative Physiology. 169 (1), 25-37 (1991).
- Weeg, M. S., Land, B. R., Bass, A. H. Vocal pathways modulate efferent neurons to the inner ear and lateral line. The Journal of Neuroscience. 25 (25), 5967-5974 (2005).
- Elgoyhen, A. B., Johnson, D. S., Boulter, J., Vetter, D. E., Heinemann, S. α9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell. 79 (4), 705-715 (1994).
- Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive swimming motor patterns in wild type and mutant larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3177-3188 (2005).
- Hentschke, H. abfload. 1.4.0.0. MATLAB Central File Exchange. , (2020).
- Harris, G. G., Milne, D. C. Input-output characteristics of the lateral-line sense organs of Xenopus laevis. The Journal of the Acoustical Society of America. 40 (1), 32-42 (1966).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Song, S., et al. Mathematical modeling and analyses of interspike-intervals of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral line. Nature Science Reports. 8, 14851 (2018).
- Liao, J. C., Fetcho, J. R. Shared versus specialized glycinergic spinal interneurons in axial motor circuits of larval zebrafish. The Journal of Neuroscience. 28 (48), 12982-12992 (2008).
- von Holst, E., Mittelstaedt, H. The principle of reafference: interactions between the central nervous system and the peripheral organs. Die Naturwissenschften. 37, 463 (1950).
- Crapse, T. B., Sommer, M. A. Corollary discharge across the animal kingdom. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (8), 587-600 (2008).
- Brichta, A. M., Goldberg, J. M. Responses to efferent activation and excitatory response-intensity relations of turtle posterior-crista afferents. Journal of Neurophysiology. 83 (3), 1224-1242 (2000).
