Summary
Aquí presentamos procedimientos quirúrgicos refinados para realizar con éxito el trasplante intraportal de islotes, un procedimiento quirúrgico clínicamente relevante pero técnicamente desafiante, en ratones.
Abstract
Aunque el hígado se acepta actualmente como el sitio de trasplante primario para islotes humanos en entornos clínicos, los islotes se trasplantan debajo de la cápsula renal en la mayoría de los estudios preclínicos de trasplante de islotes en roedores. Este modelo se usa comúnmente porque el trasplante de islotes intrahepáticos murinos es técnicamente desafiante, y un alto porcentaje de ratones podría morir por complicaciones quirúrgicas, especialmente sangrado del sitio de inyección después del trasplante. En este estudio, se demuestran dos procedimientos que pueden minimizar la incidencia de sangrado de la vena porta después de la infusión. El primer método aplica una esponja de gelatina hemostática absorbible al sitio de inyección, y el segundo método consiste en penetrar la aguja de inyección de islotes a través del tejido graso primero y luego en la vena porta mediante el uso del tejido graso como una barrera física para detener el sangrado. Ambos métodos podrían prevenir eficazmente la muerte del ratón inducida por sangrado. Se presentó toda la sección hepática que muestra la distribución de los islotes y la evidencia de trombosis de los islotes después del trasplante, una característica típica del trasplante intrahepático de los islotes. Estos protocolos mejorados refinan los procedimientos de trasplante intrahepático de islotes y pueden ayudar a los laboratorios a establecer el procedimiento para estudiar la supervivencia y la función de los islotes en entornos preclínicos.
Introduction
El trasplante intraportal de islotes (IIT) a través de la vena porta es el método más utilizado para el trasplante de islotes humanos en entornos clínicos. El modelo IIT de ratón ofrece una gran oportunidad para estudiar el trasplante de islotes y probar enfoques intervencionistas prometedores que pueden mejorar la eficacia del trasplante de islotes1. El IIT fue descrito por primera vez en la década de 1970 y utilizado por varios grupos1,2,3,4,5. Recuperó popularidad después del avance en el trasplante de islotes humanos en el año 20006,7. Sin embargo, la mayoría de los estudios de trasplante de islotes utilizaron la cápsula renal como un sitio preferido para el trasplante experimental de islotes debido a su fácil éxito. Por el contrario, el IIT es más desafiante técnicamente y se utiliza con menos frecuencia para los estudios de trasplante de islotes8,9. Sin embargo, a diferencia del IIT, los islotes trasplantados debajo de la cápsula renal no sufren la reacción inflamatoria inmediata mediada por la sangre caracterizada por trombosis, inflamación e isquemia del tejido hepático y, por lo tanto, tienen una mejor función que los islotes trasplantados al hígado. El modelo de cápsula renal, por lo tanto, puede no imitar completamente las tensiones encontradas por los islotes en el trasplante de islotes humanos10,11,12.
Una de las principales complicaciones de la IIT en ratones es el sangrado del lugar de inyección después del trasplante, lo que podría causar un 10-30% de mortalidad entre diferentes cepas de ratón12. En este documento, se han desarrollado dos enfoques refinados para detener el sangrado de manera más rápida y segura y para reducir la mortalidad del ratón después de un IIT. La demostración visual de estos detalles refinados ayudará a los investigadores a identificar los pasos clave de este procedimiento técnicamente desafiante. Además, la ubicación de los injertos de islotes en el hígado del receptor se determinó mediante el examen histológico del tejido hepático teñido de hematoxilina y eosina (H&E) (sección completa) que lleva islotes trasplantados.
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Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación de los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur y el Centro Médico Ralph H Johnson en Charleston.
1. Inducción de la diabetes usando estreptozotocina (STZ)
- Preparación de ratones receptores:
- Pesa todos los ratones individualmente.
- Verifique los niveles de glucosa en la sangre de una muestra de sangre de la vena de la cola usando un glucómetro.
- Determinación de la dosis de STZ para tres escenarios diferentes:
- Para los ratones con enfermedad del hígado graso, inyecte una dosis de STZ [40 mg/kg/día, inyección intraperitoneal (i.p.)] durante 5 días consecutivos.
- Para los ratones NOD-SCID inyectar 125 mg/kg de STZ, inyección única, i.p. después del ayuno nocturno.
- Para ratones C57BL/6 inyectar 225 mg/kg de STZ, inyección única, i.p.
- Cálculos para STZ (13,5 mg/ml):
NOTA: Este cálculo es para cinco ratones C57BL/6 con pesos corporales de 30 g:- Peso corporal total: 5 ratones x 30 g/ratón = 150g
- STZ necesario: 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33,75 mg
- Preparación STZ:
- Pesar la STZ después de la dosis precalculada.
- Transfiera el polvo STZ pesado a un vaso de precipitados de 10 ml sobre hielo.
- Agregue 3 ml de solución de citrato de sodio al vaso de precipitados para disolver el STZ.
- Mezcle bien, esterilice el filtro a través de un poro de 0,22 μm y use la solución STZ dentro de los 10 minutos posteriores a la preparación.
- Inyección STZ:
- Cargue la cantidad deseada de solución STZ (suficiente para un ratón) en una jeringa de 1 ml.
- Realice la inyección intraperitoneal en el cuadrante inferior derecho del abdomen del ratón.
- Observe a los ratones durante 5 minutos después de la inyección y verifique si hay signos de incomodidad durante este período de tiempo antes de volver a colocarlos en las jaulas.
- Controle el nivel de glucosa en sangre de una muestra de sangre de la vena de la cola usando un glucómetro diariamente después de la inyección de STZ.
NOTA: En este experimento, los ratones se consideran diabéticos cuando la glucosa en sangre no ayunada se > 350 mg / dL durante dos días consecutivos.
2. Preparación de islotes
NOTA: Los islotes humanos fueron cultivados en medios CMRL-1066 suplementados con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) a una densidad de 10.000 islotes equivalentes (IEQ) por plato de cultivo celular de 100 mm9. Los islotes de ratón se cultivaron en DMEM con 10% de FBS y 1% de P/S con la misma densidad13. Los ratones machos NOD-SCID y C57BL/7 entre 6-10 semanas de edad se obtuvieron de fuentes comerciales.
- Separe los islotes cultivados de la placa de cultivo celular mediante un rascado suave.
- Seleccione a mano el número deseado de islotes (por ejemplo, 300-350 islotes) utilizando una jeringa de 1 cc y colóquelos en tubos estériles de microcentrífuga de 1,5 ml en hielo.
- Gire el tubo durante 10 segundos con la microcentrífuga.
- Retira el sobrenadante, dejando un poco de líquido para evitar perder el pellet.
- Resuspend el pellet en 200 μL de HBSS con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5%.
- Aspire los islotes resuspendidos en una jeringa de insulina de 0,5 ml.
- Coloque la jeringa en posición vertical. Deje que los islotes se hundan durante 1 min.
- Empuje la jeringa para eliminar todas las burbujas, dejando alrededor de 100-150 μL de líquido que contiene islotes.
- Coloque la cabeza de la jeringa hacia abajo y golpee suavemente el costado de la jeringa para permitir que los islotes se distribuyan equitativamente por todo el líquido. Los islotes ya están listos para la inyección.
3. Trasplante de islotes
- Inducir y mantener al ratón bajo anestesia general con isoflurano al 2%. Compruebe la falta de reflejos del pedal para garantizar la anestesia adecuada del animal.
- Afeitarse y quitar el pelaje en el área del abdomen del ratón.
- Administrar una dosis única preoperatoria de buprenorfina (0,1 mg/kg p.i.).
- Desinfectar la zona quirúrgica con tres toallitas alternas de 2% de yodo y 75% de alcohol.
- Realizar una laparotomía con micro tijeras para generar una incisión de 1-1,5 cm.
- Abra la cavidad peritoneal con un retractor. Siga con el método A o el método B como se detalla a continuación.
4. Método A: (detener el sangrado con espuma de gel, Figura 1A)14,15,16
- Preparación del ratón
- Coloque una gasa estéril alrededor de la incisión.
- Extraiga suavemente el intestino con un fórceps y manténgalo en la gasa.
- Identificar la vena porta por su ubicación y exponerla bien.
- Cubra el intestino con una gasa tibia húmeda en solución salina durante toda la cirugía.
- Inserte la aguja de la jeringa de insulina precargada del islote a través de la vena porta cerca del duodeno (Figura 1B). Para hacerlo, sostenga la aguja con el orificio (bisel) hacia abajo y coloque el ángulo de la superficie de apertura paralela a la pared de la vena porta antes de penetrar a través de la pared.
- Tire del émbolo para extraer un poco de sangre (20-50 μL) en la jeringa para mezclar primero los islotes.
- Infundir los islotes en la vena porta lentamente mientras tira y empuja repetidamente la zambullida.
- Coloque un trozo de espuma de gel (aproximadamente 0,5 cm x 0,5 cm de tamaño) para cubrir el sitio de inyección.
- Presione la espuma de gel hacia abajo con una punta de algodón mientras extrae la aguja de la vena porta.
- Continúe presionando el gel durante aproximadamente 2 minutos para confirmar que no hay sangrado activo.
- Enrolle la punta de algodón sobre y lejos de la espuma de gel para asegurarse de que la espuma de gel cubra bien la vena porta.
5. Método B: (detener el sangrado con almohadilla de grasa, Figura 1C)17
- Exponga la vena porta a fondo.
- Use dos puntas de algodón para sostener la vena porta expuesta tanto del lado izquierdo como del derecho.
- Identifique la almohadilla de tejido graso entre el duodeno y la vena porta.
- Penetre a través de la almohadilla de grasa antes de insertar la aguja en la vena porta (Figura 1D).
- Infundir los islotes, siguiendo el procedimiento similar descrito anteriormente en las partes 4.2.1 y 4.2.2 del método A.
- Saque la aguja mientras presiona la grasa con una punta de algodón.
- Continúe presionando la almohadilla de grasa durante 1 minuto después de quitar la aguja.
- Después de confirmar que no hay sangrado de la vena porta, devuelva suavemente el intestino a la cavidad peritoneal en su posición original.
- Dejar 0,5 ml de solución salina tibia (36-37 °C) en la cavidad abdominal antes del cierre.
NOTA: La solución salina tibia facilita el movimiento y la recuperación del intestino después de la cirugía y previene la necrosis intestinal. - Cierre la capa muscular con una sutura 5-0.
- Cierre la capa de la piel con una sutura 4-0.
- Coloque el ratón en una jaula limpia en una almohadilla térmica hasta que se recupere completamente de la anestesia.
- Continúe proporcionando un analgésico (por ejemplo, buprenorfina 0,1 mg/kg i.p.) cada 12 h y calor suplementario durante 48 h después de la cirugía.
NOTA: El procedimiento de trasplante de islotes tarda aproximadamente 15-20 minutos en completarse.
6. Tinción de H&E y fotografía de toda la sección del hígado
- Perfusión hepática
- Ponga al ratón bajo anestesia como se describe anteriormente en la parte 3.1.
- Exponga cuidadosamente la vena porta y corte la vena cava inferior.
- Perfundir manualmente el hígado utilizando 20 ml de paraformaldehído al 10% a través de la vena porta durante aproximadamente 5 minutos, utilizando una jeringa de 20 ml con aguja 25G18.
NOTA: La perfusión hepática puede eliminar la sangre del tejido hepático y mejorar la fijación hepática sin alterar los injertos de los islotes. - Diseccionar el hígado entero perfundido de otros órganos.
- Fijar el tejido hepático perfundido en paraformaldehído al 10% durante 24 h.
- Incrustar el tejido en parafina.
- Corte secciones de tejido de 5 μm de espesor cada una y colóquelas en un portaobjetos de vidrio para mancharlas.
- Realizar tinción de H&E, insulina, fibrina y neutrófilos polimorfonucleares (PMN) utilizando métodos estándar15,16.
- Escanee toda la sección del hígado bajo un microscopio.
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Representative Results
Se realizaron trasplantes singénicos y xenogénicos de islotes a través de la vena porta. La función del injerto de islotes se observó de manera dependiente de la dosis en ambos modelos de trasplante de islotes. En el modelo de trasplante de islotes singénicos utilizando ratones C57BL/6, el trasplante de 250 islotes condujo a normoglucemia transitoria antes de que los ratones volvieran a la hiperglucemia. Los ratones que recibieron 500 islotes alcanzaron y mantuvieron la normoglucemia más allá de los 30 días posteriores al trasplante (Figura 2A). Los ratones en ambos grupos mostraron un aumento del peso corporal (Figura 2B).
Del mismo modo, en los islotes humanos con el modelo de trasplante de islotes de ratón diabético NOD-SCID, la función del injerto de islote se comparó cuando se trasplantaron 45, 85 o 140 IEQs/kg de peso corporal. La normoglucemia no se pudo lograr cuando se trasplantaron 45 islotes humanos IEQ/g (~225-275 islotes/ratón). Cuando el número de islotes aumentó a 85 IEQ/g (~ 400-450 islotes/ratón), el 35,7% (10/28) de los receptores alcanzaron normoglucemia (p = 0,02 vs. 45 IEQ/g grupo) en el día 60 después del trasplante. Además, el 83,3% (5/6) de los receptores que recibieron 140 IEQ/g (~ 600-650 islotes/ratón) de islotes humanos alcanzaron normoglucemia (Figura 2C). Además, la mayoría de los ratones que tenían sangrado murieron después de la cirugía, mientras que los ratones sin sangrado sobrevivieron (Figura 2D).
Una vez que se injertan suficientes islotes humanos a los receptores de NOD-SCID, sus niveles de glucosa en sangre pueden controlarse bien en la etapa temprana posterior al trasplante y mantenerse bien hasta el final del estudio. Los islotes injertados se pueden identificar fácilmente por H&E y tinción de insulina. A los 28 días después del trasplante, los islotes humanos trasplantados se distribuyeron uniformemente por todo el hígado, principalmente alrededor / cerca de un vaso sanguíneo (Figura 3).
El modelo intrahepático se utilizó para demostrar la reacción inflamatoria instantánea mediada por la sangre como se observa en el trasplante de islotes humanos. En nuestra sección de tejidos, observamos expresión de insulina, y presencia de fibrina e infiltración de leucocitos polimorfonucleares en islotes trasplantados (Figura 4A-D).
Figura 1: Ilustración de procedimientos de trasplante intrahepático de islotes. (A, C). Esquemas de los pasos clave utilizados en el Método A y el Método B. (B, D). Los islotes se inyectaron directamente a través de la vena porta (C) o indirectamente a través de la palmadita de grasa (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados representativos del trasplante intraportal de islotes. (A, B). Trasplante intraportal de islotes de ratón singénicos. Los islotes pancreáticos (250 o 500) de ratones C57BL/6 fueron trasplantados a ratones machos C57BL/6 que se volvieron diabéticos por STZ. (A) Se midieron los niveles de glucosa en sangre en serie. La normoglucemia se definió como niveles de glucosa <200 mg/dL durante >2 días consecutivos. (B) Se observó un aumento en el peso corporal de los receptores después del trasplante de islotes. (C) Porcentaje de ratones diabéticos NOD-SCID que alcanzaron normoglucemia en ratones que recibieron un número diferente de islotes humanos a 45 IEQ/g (n=7), 85 IEQ/g (n=28) y 140 IEQ/g (n=6). (D) Porcentaje de supervivencia después del IIT en ratones sangrantes y no sangrantes (n=14 cada uno). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Tinción H&E de secciones hepáticas de hígado NOD-SCID con injerto de islote humano a los 28 días después del trasplante. Los islotes están marcados por círculos negros. El diámetro de cada círculo se corresponde positivamente con el tamaño de cada islote. Barra de escala = 1.000 μm en toda la sección hepática y 100 μm en el recuadro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cuadros histológicos representativos de islotes de ratón trasplantados intraportales en hígado 6 h después del trasplante intraportal. (A) H&E, (B) insulina (rojo) (C) fibrina y (D) tinciones de PMN. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, se han demostrado dos procedimientos mejorados que pueden prevenir el sangrado y pueden reducir la mortalidad del ratón durante el IIT del ratón. Este estudio permite a los investigadores visualizar el modelo de trasplante de islotes que es único en el estudio de la respuesta inflamatoria instantánea mediada por la sangre después del trasplante. El modelo IIT es un modelo distintivo para estudiar la supervivencia de las células de los islotes y las lesiones isquémicas hepáticas en respuesta al trasplante de islotes19. Aquí, refinamos el procedimiento basándonos en estudios previos y redujimos la mortalidad temprana en ratones inducida por complicaciones. Tanto el método A14,15,16 como el método B8,9 se utilizaron en múltiples estudios. Demostramos que los islotes distribuidos entre todo el hígado, y la infiltración de neutrófilos y la trombosis típicamente asociadas con IIT fueron prominentes en el injerto inmediatamente después del trasplante.
Hay varios pasos clave en el trasplante de islotes hepáticos de ratón. Debido a que tanto los islotes humanos como los de ratón pueden ser tan grandes como 200 μm de tamaño, se debe usar un tamaño de aguja de al menos 27G para el trasplante para garantizar el flujo suave de los productos de los islotes. Sin embargo, esto generaría un gran orificio en la vena porta que puede causar sangrado después de la extracción de la aguja. Al inyectar islotes a través del ángulo correcto y usar una esponja dental para bloquear el sitio de inyección o la inyección a través del tejido graso, la posibilidad de sangrado se puede minimizar y los ratones tienen tasas de supervivencia más altas después del trasplante. Estos pasos también pueden ayudar a evitar lesiones de isquemia-reperfusión calientes en el hígado causadas por la obstrucción del flujo sanguíneo de la vena porta al realizar este procedimiento19. También pueden reducir los daños al hígado y los intestinos que pueden contribuir a la mortalidad del ratón después de la cirugía.
También hay varias limitaciones del modelo de trasplante de islotes intrahepáticos de ratón en comparación con el entorno de trasplantes de islotes humanos. En primer lugar, no podemos controlar la presión de la vena porta del ratón durante la infusión de los islotes como lo hacemos en entornos clínicos. En segundo lugar, el volumen que se puede trasplantar a los ratones puede no reflejar la alta cantidad de producto de islotes trasplantado a un ser humano. Por lo tanto, la extensión de la trombosis puede ser diferente. En tercer lugar, los injertos de islotes de ratón después del trasplante se expondrán temporalmente a un ambiente hiperglucémico ya que no se administrará insulina a los ratones, mientras que en los humanos20, se administrará insulina durante el período peritrasplante para reducir el estrés de los islotes trasplantados20. Sin embargo, el modelo de islotes intrahepáticos ofrece un modelo preclínico único que se puede utilizar para estudiar el trasplante de islotes humanos.
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Disclosures
Todos los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Departamento de Asuntos de Veteranos (VA-ORD BLR & D Merit I01BX004536), y el Instituto Nacional de Salud otorga subvenciones # 1R01DK105183, DK120394, DK118529, a HW. Nos gustaría darles las gracias al Sr. Michael Lee y a la Sra. Lindsay Swaby por la edición del idioma
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| 1 mL Syringe with needle | AHS | AH01T | |
| 20 mL Syringe | BD | 301031 | |
| 25G x 5/8" hypodermic needles | BD | 305122 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| CMRL-1066 | Corning | 15110CV | |
| DMEM | Corning | 10013CV | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35011CV | |
| FreeStyle Glucose meter | Abbott | Lite | |
| FreeStyle Blood Glucose test strips | Abbott | Lite | |
| Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP) | Pharmacia & Upjohn Company | 34201 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 27-gauge needle | BD | 879588 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | HyClone | SV30010 | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Streptozocin (STZ) | Sigma | S0130 | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
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