Summary
Qui presentiamo procedure chirurgiche raffinate sull'esecuzione con successo del trapianto intraportale di isole, una procedura chirurgica clinicamente rilevante ma tecnicamente impegnativa, nei topi.
Abstract
Sebbene il fegato sia attualmente accettato come sito di trapianto primario per le isole umane in contesti clinici, le isole vengono trapiantate sotto la capsula renale nella maggior parte degli studi di trapianto di isole precliniche di roditori. Questo modello è comunemente usato perché il trapianto di isole intraepatiche murine è tecnicamente impegnativo e un'alta percentuale di topi potrebbe morire per complicazioni chirurgiche, in particolare sanguinamento dal sito di iniezione post-trapianto. In questo studio, vengono dimostrate due procedure che possono ridurre al minimo l'incidenza di sanguinamento della vena porta post-infusione. Il primo metodo applica una spugna di gelatina emostatica assorbibile al sito di iniezione, e il secondo metodo prevede la penetrazione dell'ago per iniezione dell'isolotto attraverso il tessuto adiposo prima e poi nella vena porta utilizzando il tessuto adiposo come barriera fisica per fermare il sanguinamento. Entrambi i metodi potrebbero prevenire efficacemente la morte del topo indotta dal sanguinamento. Sono state presentate l'intera sezione epatica che mostra la distribuzione delle isole e l'evidenza di trombosi delle isole post-trapianto, una caratteristica tipica per il trapianto di isole intraepatiche. Questi protocolli migliorati perfezionano le procedure di trapianto intraepatico di isole e possono aiutare i laboratori a impostare la procedura per studiare la sopravvivenza e la funzione delle isole in contesti pre-clinici.
Introduction
Il trapianto intraportale di isole (IIT) attraverso la vena porta è il metodo più comunemente usato per il trapianto di isole umane in contesti clinici. Il modello IIT murino offre una grande opportunità per studiare il trapianto di isole e testare approcci interventistici promettenti che possono migliorare l'efficacia del trapianto di isole1. IIT è stato descritto per la prima volta nel 1970 e utilizzato da diversi gruppi1,2,3,4,5. Ha riacquistato popolarità dopo la svolta nel trapianto di isole umane nell'anno 20006,7. Tuttavia, la maggior parte degli studi sul trapianto di isole ha utilizzato la capsula renale come sito preferito per il trapianto sperimentale di isole grazie al suo facile successo. Al contrario, l'IIT è più tecnicamente impegnativo e meno frequentemente utilizzato per gli studi sui trapianti di isole8,9. A differenza dell'IIT, tuttavia, le isole trapiantate sotto la capsula renale non soffrono della reazione infiammatoria immediata mediata dal sangue caratterizzata da trombosi, infiammazione e ischemia del tessuto epatico, e quindi hanno una funzione migliore rispetto alle isole trapiantate nel fegato. Il modello di capsula renale, quindi, potrebbe non imitare completamente gli stress incontrati dalle isole nel trapianto di isole umane10,11,12.
Una delle principali complicanze dell'IIT nei topi è il sanguinamento dal sito di iniezione dopo il trapianto, che potrebbe causare il 10-30% della mortalità tra diversi ceppi di topo12. In questo articolo, sono stati sviluppati due approcci raffinati per fermare il sanguinamento in modo più rapido e sicuro e per ridurre la mortalità dei topi dopo un IIT. La dimostrazione visiva di questi dettagli raffinati aiuterà i ricercatori a identificare i passaggi chiave di questa procedura tecnicamente impegnativa. Inoltre, la posizione degli innesti di isole nel fegato del ricevente è stata determinata dall'esame istologico del tessuto epatico colorato di ematossilina ed eosina (H & E) (intera sezione) recante isole trapiantate.
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Protocol
Tutte le procedure sono state condotte con l'approvazione dei comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali presso la Medical University of South Carolina e il Ralph H Johnson Medical Center di Charleston.
1. Induzione del diabete con streptozotocina (STZ)
- Preparazione dei topi riceventi:
- Pesare tutti i topi individualmente.
- Controllare i livelli di glucosio nel sangue da un campione di sangue della vena della coda utilizzando un glucometro.
- Determinazione della dose STZ per tre diversi scenari:
- Per i topi con steatosi epatica iniettare una dose di STZ [40 mg/kg/die, iniezione intraperitoneale (i.p.)] per 5 giorni consecutivi.
- Per i topi NOD-SCID iniettare 125 mg/kg di STZ, iniezione singola, cioè dopo digiuno notturno.
- Per i topi C57BL/6 iniettare 225 mg/kg di STZ, iniezione singola, i.p.
- Calcoli per STZ (13,5 mg/mL):
NOTA: Questo calcolo è per cinque topi C57BL/6 con pesi corporei di 30 g:- Pesi corporei totali: 5 topi x 30 g/mouse = 150g
- STZ necessario: 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33,75 mg
- Preparazione STZ:
- Pesare l'STZ seguendo la dose precalcolata.
- Trasferire la polvere STZ pesata in un becher da 10 ml su ghiaccio.
- Aggiungere 3 mL di soluzione di citrato di sodio al becher per sciogliere l'STZ.
- Mescolare bene, filtrare sterilizzare attraverso un poro di 0,22 μm e utilizzare la soluzione STZ entro 10 minuti dalla preparazione.
- Iniezione STZ:
- Caricare la quantità desiderata di soluzione STZ (sufficiente per un mouse) in una siringa da 1 mL.
- Eseguire l'iniezione intraperitoneale nel quadrante inferiore destro dell'addome del topo.
- Osservare i topi per 5 minuti dopo l'iniezione e verificare eventuali segni di disagio durante questo periodo di tempo prima di rimetterli nelle gabbie.
- Monitorare il livello di glucosio nel sangue da un campione di sangue della vena della coda utilizzando un glucometro ogni giorno dopo l'iniezione di STZ.
NOTA: In questo esperimento, i topi sono considerati diabetici quando la glicemia non a digiuno è > 350 mg / dL per due giorni consecutivi.
2. Preparazione dell'isolotto
NOTA: le isole umane sono state coltivate in mezzi CMRL-1066 integrati con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (P/S) ad una densità di 10.000 isole equivalenti (IEQ) per piatto di coltura cellulare da 100 mm9. Le isole di topo sono state coltivate in DMEM con il 10% di FBS e l'1% di P/S con la stessa densità13. I topi maschi NOD-SCID e C57BL/7 tra le 6-10 settimane di età sono stati ottenuti da fonti commerciali.
- Staccare gli isolotti coltivati dal piatto di coltura cellulare con un leggero graffio.
- Selezionare a mano il numero desiderato di isole (ad esempio, 300-350 isole) utilizzando una siringa da 1 cc e metterle in tubi microcentrifuga sterili da 1,5 ml sul ghiaccio.
- Ruotare il tubo per 10 secondi usando la microcentrifuga.
- Rimuovere il surnatante, lasciando un po' di liquido per evitare di perdere il pellet.
- Sospendere il pellet in 200 μL di HBSS con lo 0,5% di albumina sierica bovina (BSA).
- Aspirare le isole risospese in una siringa da insulina da 0,5 ml.
- Posizionare la siringa in posizione verticale. Lascia che gli isolotti affondino per 1 minuto.
- Spingere la siringa per rimuovere tutte le bolle, lasciando circa 100-150 μL di liquido contenente isole.
- Posizionare la siringa a testa in giù e picchiettare delicatamente il lato della siringa per consentire alle isole di distribuirsi equamente in tutto il liquido. Le isole sono ora pronte per l'iniezione.
3. Trapianto di isole
- Indurre e mantenere il topo in anestesia generale con il 2% di isoflurano. Controllare la mancanza di riflessi del pedale per garantire una corretta anestesia dell'animale.
- Rasare e rimuovere la pelliccia nella zona dell'addome del mouse.
- Somministrare una singola dose pre-operatoria di Buprenorfina (0,1 mg/kg p.p.).
- Disinfettare l'area chirurgica con tre salviette alternate di iodio al 2% e alcol al 75%.
- Eseguire una laparotomia con micro forbici per generare un'incisione di 1-1,5 cm.
- Aprire la cavità peritoneale con un riavvolgitore. Seguire con il metodo A o il metodo B come descritto di seguito.
4. Metodo A: (smettere di sanguinare con schiuma gel, Figura 1A)14,15,16
- Preparazione del mouse
- Posizionare una garza sterile intorno all'incisione.
- Estrarre delicatamente l'intestino usando una pinza e tenerlo sulla garza.
- Identificare la vena porta dalla sua posizione ed esporla bene.
- Coprire l'intestino con una garza calda umido salino durante l'intero intervento chirurgico.
- Inserire l'ago della siringa per insulina precaricato sull'isolotto attraverso la vena porta vicino al duodeno (Figura 1B). Per fare ciò, tenere l'ago con il foro (smussatura) rivolto verso il basso e posizionare l'angolo della superficie di apertura parallelo alla parete della vena porta prima di penetrare attraverso la parete.
- Tirare lo stantuffo per prelevare un po ' di sangue (20-50 μL) nella siringa per mescolare prima le isole.
- Infondere lentamente gli isolotti nella vena porta mentre si tira e si spinge ripetutamente il tuffo.
- Posizionare un pezzo di schiuma gel (circa 0,5 cm x 0,5 cm di dimensione) per coprire il sito di iniezione.
- Premere la schiuma di gel verso il basso con una punta di cotone mentre si estrae l'ago dalla vena porta.
- Continuare a premere sul gel per circa 2 minuti per confermare che non vi è alcun sanguinamento attivo.
- Capovolgere la punta di cotone sopra e lontano dalla schiuma di gel per assicurarsi che la schiuma di gel copra bene la vena porta.
5. Metodo B: (smettere di sanguinare con cuscinetto di grasso, Figura 1C)17
- Esporre accuratamente la vena porta.
- Utilizzare due punte di cotone per tenere la vena porta esposta sia dal lato sinistro che da quello destro.
- Identificare il cuscinetto di tessuto adiposo tra il duodeno e la vena porta.
- Penetrare attraverso il cuscinetto di grasso prima di inserire l'ago nella vena porta (Figura 1D).
- Infondere gli isolotti, seguendo la procedura simile sopra descritta nelle parti 4.2.1 e 4.2.2 del metodo A.
- Estrarre l'ago mentre si preme sul grasso con una punta di cotone.
- Continuare a premere sul cuscinetto grasso per 1 minuto dopo aver rimosso l'ago.
- Dopo aver confermato che non vi è alcun sanguinamento dalla vena porta, riportare delicatamente l'intestino nella cavità peritoneale nella sua posizione originale.
- Lasciare 0,5 ml di soluzione salina calda (36-37 °C) nella cavità addominale prima della chiusura.
NOTA: La soluzione salina calda facilita il movimento e il recupero dell'intestino post-operatorio e previene la necrosi intestinale. - Chiudere lo strato muscolare con una sutura 5-0.
- Chiudere lo strato di pelle con una sutura 4-0.
- Posizionare il mouse in una gabbia pulita su una piastra riscaldante fino a completo recupero dall'anestesia.
- Continuare a fornire un analgesico (ad esempio, buprenorfina 0,1 mg / kg i.p.) ogni 12 ore e calore supplementare per 48 ore dopo l'intervento chirurgico.
NOTA: La procedura di trapianto di isole richiede circa 15-20 minuti per essere completata.
6. Colorazione H & E e fotografia dell'intera sezione epatica
- Perfusione epatica
- Mettere il mouse in anestesia come descritto sopra nella parte 3.1.
- Esporre con attenzione la vena porta e tagliare la vena cava inferiore.
- Perfondere manualmente il fegato utilizzando 20 ml di paraformaldeide al 10% attraverso la vena porta per circa 5 minuti, utilizzando una siringa da 20 ml con ago da 25 G18.
NOTA: La perfusione epatica può rimuovere il sangue dal tessuto epatico e migliorare la fissazione del fegato senza disturbare gli innesti di isole. - Sezionare l'intero fegato perfuso da altri organi.
- Fissare il tessuto epatico perfuso in paraformaldeide al 10% per 24 ore.
- Incorporare il tessuto nella paraffina.
- Tagliare sezioni di tessuto di 5 μm di spessore ciascuna e metterle su un vetrino per la colorazione.
- Eseguire la colorazione di H&E, insulina, fibrina e neutrofili polimorfonucleati (PMN) utilizzando metodi standard15,16.
- Scansiona l'intera sezione epatica al microscopio.
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Representative Results
Abbiamo eseguito trapianti di isole singeniche e xenogeniche attraverso la vena porta. La funzione dell'innesto di isole è stata osservata in modo dose-dipendente in entrambi i modelli di trapianto di isole. Nel modello di trapianto di isole singeniche utilizzando topi C57BL/6, il trapianto di 250 isole ha portato a normoglicemia transitoria prima che i topi tornassero all'iperglicemia. I topi che ricevevano 500 isole hanno raggiunto e mantenuto la normoglicemia oltre i 30 giorni dopo il trapianto (Figura 2A). I topi di entrambi i gruppi hanno mostrato un aumento del peso corporeo (Figura 2B).
Allo stesso modo, nel modello di trapianto di isole di topo NOD-SCID per diabetici, la funzione dell'innesto di isole è stata confrontata quando sono stati trapiantati 45, 85 o 140 QI / kg di peso corporeo. La normoglicemia non è stata raggiunta quando sono state trapiantate 45 isole umane IEQ/ g (~ 225-275 isole / topo). Quando il numero di isole è aumentato a 85 IEQ/g (~ 400-450 isole/topo), il 35,7% (10/28) dei riceventi ha raggiunto normoglicemia (gruppo p =0,02 vs. 45 IEQ/g) al giorno 60 post-trapianto. Inoltre, l'83,3% (5/6) dei riceventi che hanno ricevuto 140 IEQ/g (~ 600-650 isole/topo) di isole umane ha raggiunto la normoglicemia (Figura 2C). Inoltre, la maggior parte dei topi che avevano sanguinamento sono morti dopo l'intervento chirurgico mentre i topi senza sanguinamento sono sopravvissuti (Figura 2D).
Una volta che un numero sufficiente di isole umane viene innestato per i riceventi di NOD-SCID, i loro livelli di glucosio nel sangue possono essere ben controllati nella fase iniziale post-trapianto e ben mantenuti fino alla fine dello studio. Le isole innestate possono essere facilmente identificate da H & E e colorazione dell'insulina. A 28 giorni dopo il trapianto, le isole umane trapiantate sono state distribuite uniformemente in tutto il fegato, per lo più intorno / vicino a un vaso sanguigno (Figura 3).
Il modello intraepatico è stato utilizzato per dimostrare la reazione infiammatoria istantanea mediata dal sangue come osservato nel trapianto di isole umane. Nella nostra sezione tissutale, abbiamo osservato l'espressione di insulina e la presenza di fibrina e leucociti polimorfonucleati infiltrazioni nelle isole trapiantate (Figura 4A-D).
Figura 1: Illustrazione delle procedure di trapianto intraepatico di isole. (A, C). Schemi dei passaggi chiave utilizzati nel Metodo A e nel Metodo B. (B, D). Le isole sono state iniettate direttamente attraverso la vena porta (C) o indirettamente tramite grasso pat (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati rappresentativi del trapianto intraportale di isole. (A, B). Trapianto intraportale di isole di topo singeniche. Le isole pancreatiche (250 o 500) di topi C57BL/6 sono state trapiantate in topi maschi C57BL/6 resi diabetici da STZ. (A) Sono stati misurati i livelli seriali di glucosio nel sangue. La normoglicemia è stata definita come livelli di glucosio <200 mg / dL per >2 giorni consecutivi. (B) L'aumento del peso corporeo dei riceventi è stato osservato dopo il trapianto di isole. (C) Percentuale di topi diabetici NOD-SCID che raggiungono la normoglicemia nei topi che ricevono un numero diverso di isole umane a 45 IEQ / g (n = 7), 85 IEQ / g (n = 28) e 140 IEQ / g (n = 6). (D) Percentuale di sopravvivenza dopo IIT in topi sanguinanti e non sanguinanti (n=14 ciascuno). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Colorazione H&E di sezioni epatiche di innesto di isole umane con fegato NOD-SCID a 28 giorni dopo il trapianto. Gli isolotti sono contrassegnati da cerchi neri. Il diametro di ogni cerchio corrisponde positivamente alla dimensione di ciascun isolotto. Barra della scala = 1.000 μm nell'intero comparto epatico e 100 μm nell'inserto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini istologiche rappresentative di isole di topo trapiantate intraportali nel fegato 6 ore dopo trapianto intraportale. (A) H&E, (B) insulina (rossa) (C) Fibrina e (D) macchie di PMN. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, sono state dimostrate due procedure migliorate che possono prevenire il sanguinamento e possono ridurre la mortalità del topo durante l'IIT del topo. Questo studio consente ai ricercatori di visualizzare il modello di trapianto di isole che è unico nello studio della risposta infiammatoria istantanea mediata dal sangue dopo il trapianto. Il modello IIT è un modello distintivo per lo studio della sopravvivenza delle cellule insulari e delle lesioni ischemiche epatiche in risposta al trapianto di isole19. Qui, abbiamo perfezionato la procedura sulla base di studi precedenti e ridotto la mortalità precoce del topo indotta da complicanze. Sia il metodo A14,15,16 che il metodo B8,9 sono stati utilizzati in più studi. Abbiamo dimostrato che le isole distribuite tra tutto il fegato e l'infiltrazione dei neutrofili e la trombosi tipicamente associate all'IIT erano prominenti nell'innesto immediatamente dopo il trapianto.
Ci sono diversi passaggi chiave nel trapianto di isole epatiche di topo. Poiché sia le isole umane che quelle di topo possono avere una dimensione di 200 μm, è necessario utilizzare una dimensione dell'ago di almeno 27 G per il trapianto per garantire il flusso regolare dei prodotti insulari. Tuttavia, questo genererebbe un grande foro nella vena porta che può causare sanguinamento dopo la rimozione dell'ago. Iniettando isole attraverso l'angolo corretto e utilizzando una spugna dentale per bloccare il sito di iniezione o l'iniezione attraverso il tessuto adiposo, la possibilità di sanguinamento può essere ridotta al minimo e i topi hanno tassi di sopravvivenza più elevati dopo il trapianto. Questi passaggi possono anche aiutare a evitare lesioni da ischemia-riperfusione calda del fegato causate dal blocco del flusso sanguigno della vena porta durante l'esecuzione di questa procedura19. Possono anche ridurre i danni al fegato e all'intestino che possono contribuire alla mortalità dei topi dopo l'intervento chirurgico.
Ci sono anche diverse limitazioni del modello di trapianto di isole intraepatiche di topo rispetto all'impostazione dei trapianti di isole umane. In primo luogo, non possiamo monitorare la pressione della vena porta del topo durante l'infusione delle isole come facciamo in ambito clinico. In secondo luogo, il volume che può essere trapiantato nei topi potrebbe non riflettere l'elevata quantità di prodotto insulare trapiantato in un essere umano. Pertanto, l'estensione della trombosi può essere diversa. In terzo luogo, gli innesti di isole di topo dopo il trapianto saranno temporaneamente esposti a un ambiente iperglicemico poiché nessuna insulina sarà somministrata ai topi, mentre nell'uomo20, l'insulina verrebbe somministrata durante il periodo di peritrapianto per ridurre lo stress delle isole trapiantate20. Tuttavia, il modello di isole intraepatiche offre un modello pre-clinico unico che può essere utilizzato per studiare il trapianto di isole umane.
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Disclosures
Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dal Department of Veterans Affairs (VA-ORD BLR& D Merit I01BX004536) e dal National Institute of Health concede # 1R01DK105183, DK120394, DK118529, a HW. Vorremmo ringraziarvi mr. Michael Lee e Ms. Lindsay Swaby per l'editing linguistico
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| 1 mL Syringe with needle | AHS | AH01T | |
| 20 mL Syringe | BD | 301031 | |
| 25G x 5/8" hypodermic needles | BD | 305122 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| CMRL-1066 | Corning | 15110CV | |
| DMEM | Corning | 10013CV | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35011CV | |
| FreeStyle Glucose meter | Abbott | Lite | |
| FreeStyle Blood Glucose test strips | Abbott | Lite | |
| Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP) | Pharmacia & Upjohn Company | 34201 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 27-gauge needle | BD | 879588 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | HyClone | SV30010 | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Streptozocin (STZ) | Sigma | S0130 | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
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