Hochdurchsatz-In-vitro-Assay mit patientenabgeleiteten Tumororganoiden

Menschliche Krebszelllinien sind weithin akzeptiert, um die Biologie von Krebs zu untersuchen und Krebsmittel zu bewerten. Diese Zelllinien bewahren jedoch nicht unbedingt die ursprünglichen Eigenschaften ihres Ausgangsgewebes, da sich ihre Morphologie, Genmutation und ihr Genexpressionsprofil während der Kultur über lange Zeiträume verändern können. Darüber hinaus werden die meisten dieser Zelllinien in einer Monoschicht kultiviert oder als murine Xenotransplantate verwendet, von denen keines physisch Tumorgewebe^{darstellt 1,2}. Daher ist die klinische Wirksamkeit von Krebsmedikamenten möglicherweise nicht die gleiche wie in Krebszelllinien. Daher wurden In-vitro-Systeme wie Ex-vivo-Assays mit patientenabgeleiteten Tumor-Xenotransplantaten oder patientenabgeleiteten Tumororganoiden (PDOs) und Tumorsphäroidmodellen entwickelt, die die Struktur und Funktion von Tumorgewebe genau reproduzieren. Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass diese Modelle die Reaktion der Patienten auf Krebsmedikamente vorhersagen, indem sie direkt mit dem entsprechenden Krebsgewebe vergleichbar sind. Diese In-vitro-Systeme wurden für verschiedene Tumorgewebetypen etabliert, und es wurden auch assoziierte Hochdurchsatz-Assay-Systeme (HTS) für das Arzneimittelscreening entwickelt^3,4,5,6,7. Heterogene Ex-vivo-Organoidkulturen von Primärtumoren, die aus Patienten oder von Patienten abgeleiteten Tumor-Xenotransplantaten gewonnen wurden, haben in den letzten Jahren aufgrund ihrer einfachen Kultur und ihrer Fähigkeit, die Komplexität von Zellen im Stromagewebe aufrechtzuerhalten, erheblich an Zugkraft gewonnen^8,9,10. Es wird erwartet, dass diese Modelle das Verständnis der Biologie von Krebs verbessern und die Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten in vitroerleichtern.

Eine Reihe neuartiger PDOs wurde kürzlich im Rahmen des Fukushima Translational Research Project aus verschiedenen Arten von Tumorgewebe, die als F-PDO bezeichnet werden, entwickelt. Die PDOs bilden große Zellcluster mit einer Morphologie ähnlich der des Quelltumors und können für mehr als sechs Monate kultiviert werden¹¹. Die vergleichende Histologie und umfassende Genexpressionsanalysen zeigten, dass die Merkmale der PDOs auch nach längerem Wachstum unter Kulturbedingungen nahe an denen ihres Ausgangstumorgewebes liegen. Darüber hinaus wurde für jeden Typ von g.U. in 96-Well- und 384-Well-Platten ein geeignetes HTS festgelegt. Diese Assays wurden verwendet, um mehrere molekulare Zielwirkstoffe und Antikörper zu bewerten. Hier wurden Standard-Chemotherapeutika (Paclitaxel und Carboplatin), die bei Endometriumkarzinom eingesetzt werden, mit F-PDOs bewertet, die von einem Patienten abgeleitet wurden, der nicht auf Paclitaxel und Carboplatin ansprach. Dementsprechend war die zellwachstumshemmende Aktivität von Paclitaxel und Carboplatin gegen diese pDO schwach (IC₅₀: >10 μM). Darüber hinaus haben frühere Forschungen berichtet, dass die Empfindlichkeit einiger F-PDOs gegenüber Chemotherapeutika und molekular zielgerichteten Wirkstoffen mit der klinischen Wirksamkeit^11,12,13übereinstimmt. Schließlich wurden Veränderungen in der übergeordneten Struktur der PDOs, die durch Krebsmedikamente verursacht wurden, mit einem dreidimensionalen Zellanalysesystem analysiert^12,13. Die Ergebnisse der Bewertung von Krebsmedikamenten mit einem pDO-basierten HTS sind vergleichbar mit den klinischen Ergebnissen, die für diese Wirkstoffe erzielt wurden. Hier wird ein Protokoll für ein einfacheres und genaueres HTS vorgestellt, mit dem die Wirksamkeit von Krebsmedikamenten und Immuntherapien anhand der PDO-Modelle bewertet werden kann.

Alle Experimente mit Materialien aus menschlichem Anbau wurden im Rahmen der Deklaration von Helsinki durchgeführt und vorab von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Fukushima genehmigt (Zulassungsnummern 1953 und 2192; Zulassungsdaten 18. März 2020 bzw. 26. Mai 2016). Von allen Patienten, die die in dieser Studie verwendeten klinischen Proben zur Verfügung stellten, wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

1. Kultur der PDOs

HINWEIS: F-PDOs bilden Zellcluster, die eine Vielzahl heterogener Morphologien aufweisen und in Suspensionskultur wachsen (Abbildung 1). Darüber hinaus können F-PDOs für mehr als 6 Monate kultiviert und für die zukünftige Verwendung kryokonserviert werden.

1. Auftauen von gespeicherten PDOs (Tag 0)
   1. PDOs (z. B. RLUN007, Lungenadenokarzinom) an Tag 0 auftauen und aussäen (Abbildung 1). Geben Sie zunächst 15 ml Medium für PDOs (siehe Materialtabelle),das 1% des B-27-Supplements und 30 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor enthält, in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
   2. Nachdem Sie die gefrorene Durchstechflasche aus dem Flüssigstickstofflager entnommen haben, rühren Sie die PDOs vorsichtig in einem 37 °C warmen Wasserbad für 2 min. Als nächstes entfernen Sie die Durchstechflasche aus dem Wasserbad, wischen Sie die Durchstechflasche mit 70% Ethanol ab und bewegen Sie die Durchstechflasche dann in eine biologische Sicherheitswerkbank.
   3. Der Inhalt der Durchstechflasche wird in das Röhrchen mit 15 ml Medium für PDOs überführt. Mischen Sie die PDOs und das Medium, indem Sie fünfmal vorsichtig mit einer 3 ml Transferpipette nach oben und unten pipettieren. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 x g für 3 min bei ~25 °C und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das DOP-Pellet in 5 ml frischem Medium und geben Sie es mit schonendem Pipettieren in einen^{25 cm 2-Kolben} (siehe Materialtabelle). Schließlich werden die PDOs in einem Inkubator bei 37 °C in 5%_{CO2 kultiviert.}
2. Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche (Tage 3-7). Zentrifugieren Sie die DOP-Suspension, um die Zellcluster auszufällen, und ersetzen Sie 4 ml des Mediums (80% Volumen). Resuspendieren Sie die Zellen im frischen Medium.
   HINWEIS: Die Mehrheit von RLUN007 erscheint als Zellcluster mit einem Durchmesser von 100-500 μm. Wenn sich die Farbe von Phenolrot im Medium wie in Abbildung 1Agezeigt in Gelb ändert, ersetzen Sie das Medium häufiger. Wenn das Medium am Tag nach dem Austausch gelb wird und jeder Zellhaufen zu größeren Clustern mit einem Durchmesser von >500 μm verschmilzt, passieren Sie ihn in einem Teilungsverhältnis von 1: 2.
3. Subkultur (Tage 8-28) von PDOs
   HINWEIS: Angesichts der Schwierigkeit, die Anzahl der einzelnen Zellen tatsächlich zu messen, wird der Zeitpunkt der Passage auf der Grundlage einer geeigneten Zellclusterdichte und der Größe des DOP-Pellets nach der Zentrifugation bestimmt (Abbildung 1B). Im Falle von RLUN007 erreicht das Volumen des DOP-Pellets etwa 2 Wochen nach dem Auftauen 30 μL (gesättigte Dichte in^{25 cm 2-Kolben).}
   1. Für den Transfer von einem 25 cm^2-Kolben auf zwei 25 cm^2-Flaschen (P1) wird die DOP-Suspension in ein Zentrifugenröhrchen überführt und 2 min bei ca. 25 °C mit 200 x g zentrifugiert. Schätzen Sie das Volumen des DOP-Pellets und verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das DOP-Pellet mit einer 5-ml-Pipette in 5 ml frischem Medium. Fünfmal bei niedriger Geschwindigkeit vorsichtig auf und ab pipettieren. Anschließend wird die Hälfte des Volumens der DOP-Suspension (2,5 ml) in zwei Kolben gegeben und jedem Kolben 2,5 ml frisches Medium zugegeben. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%_CO2.
   2. Für den Transfer von zwei 25-cm-2-Kolben auf einen 75-cm-2-Kolben (P2) wird die g.U.-Suspension von zwei Kolben in zwei^{Zentrifugenröhrchen} überführt und die gP bei 200 x g für 2 min bei etwa 25 °C zentrifugiert. Als nächstes schätzen Sie das Volumen des DOP-Pellets und resuspenieren Sie das Pellet in 2,5 ml frischem Medium (pro Röhrchen). Anschließend wird die g.U.-Suspension in einem Röhrchen mit der in dem anderen Kolben mit^{einem Kolben} mit 75 cm 2 kombiniert, der 10 ml frisches Medium enthält. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%_CO2. Die subkultivierten PDOs etwa 1 Woche nach der ersten Passage von zwei²⁵ cm^{2 Kolben} auf einen 75 cm 2 Kolben übertragen (Abbildung 1C).

2. Wachstumshemmung HTS

HINWEIS: Die wachstumshemmende Aktivität von Krebsmedikamenten gegen PDOs wird durch Messung des intrazellulären ATP-Gehalts bewertet, wie in Abbildung 2 dargestellt. Dieser Schritt wird mit einem kommerziell erhältlichen Zelllebensfähigkeits-Assay-Kit durchgeführt (siehe Materialtabelle).

1. Kulturieren Sie am Tag 0 die PDOs (z. B. RLUN007) in Kolben, bis eine ausreichende Anzahl von Zellclustern für den Assay verfügbar ist. Einen Tag vor der Aussaat die DOP-Suspension von einem 75 cm^2-Kolben in ein 15-ml-Röhrchen geben und bei 200 x g für 2 min zentrifugieren, um das GP-Pelletvolumen zu messen. Anschließend das DOP-Pellet in 15 ml frischem Medium resuspendieren und zurück in einen 75 cm^2-Kolben geben. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%_CO2.
   HINWEIS: Das erforderliche PDO-Pelletvolumen hängt von der Verdünnungsrate jeder g.U. und der Anzahl der für den Assay verwendeten 384-Well-Platten ab. Für RLUN007 ist ein Zellpelletvolumen von 200 μL für die Aussaat in zehn 384-Well-Platten erforderlich.
2. Am Tag 1 (24 h nach dem Wechsel des Mediums) zerkleinern Sie die PDOs unter Verwendung von Zellfragmentierungs- und Dispersionsgeräten (siehe Materialtabelle)mit einem Filterhalter, der einen 70 μm-Netzfilter enthält. Dann verdünnen Sie 15 ml der DOP-Suspension um das 10-fache. Säen Sie 40 μL der DOP-Suspension in 384-Well-Ultra-Low-Attachment-Sphäroid-Mikroplatten (runder Boden) (siehe Materialtabelle)mit einem Zellsuspensionsspender (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Für das Zerkleinern von Zellclustern wird empfohlen, die handelsübliche Zellfragmentierungs- und Dispersionsausrüstung zu verwenden (siehe Materialtabelle).
3. Nach 24 h nach der Aussaat (Tag 2) werden die PDOs mit 0,04 μL Prüfmittellösungen in Endkonzentrationsbereichen von 20 μM bis 1,0 nM (10 serielle Verdünnungen) mit einem flüssigen Handler behandelt (siehe Materialtabelle).
4. Geben Sie am Tag 8 (144 h nach der Behandlung mit der Prüfsubstanz) intrazelluläres ATP-Messreagenz zu den Prüftöpfen hinzu. Mischen Sie die Platten mit einem Mixer und inkubieren Sie für 10 min bei 25 °C. Messen Sie den intrazellulären ATP-Gehalt als Lumineszenz mit einem Plattenleser (siehe Materialtabelle).
5. Um die Lebensfähigkeit der Zelle zu berechnen, teilen Sie die Menge an ATP in den Testbohrungen durch die Menge in den Kontrollbohrungen, die das Fahrzeug enthalten, wobei der Hintergrund subtrahiert wird. Um die Wachstumsrate über 6 Tage zu berechnen, teilen Sie die Menge an ATP in den Fahrzeugkontrollbohrlöchern durch die in den Fahrzeugkontrollbohrungen 24 h nach der Aussaat.
6. Berechnen Sie die Werte für die 50%ige Hemmkonzentration (IC₅₀₎und die Fläche unter der Kurve (AUC) aus den Dosis-Wirkungs-Kurven mit biologischer Datenanalysesoftware (siehe Materialtabelle). Der Z-Faktor ist ein dimensionsloser Parameter, der von 1 (unendliche Trennung) bis <0 reicht, definiert als z = "1" - (3σc+ + 3σc-) >14sind.

3. HTS mit einem Cell-Picking- und Imaging-System zur Wachstumshemmung

HINWEIS: Wenn es eine große Abweichung (wenn der Variationskoeffizient [CV] beim Assay mehr als 20% in den Daten unter Verwendung von Protokoll 2 gibt, können PDOs einer ausgewählten Größe mit einem Zellpickel- und Bildgebungssystem in 96-Well- oder 384-Well-Platten gesät werden (Abbildung 2). Das Protokoll ist mit dem in den Schritten 2.1 und 2.2 im vorherigen Abschnitt beschriebenen Protokoll identisch. Dieser Schritt wird mit einem handelsüblichen Zellpflück- und Bildgebungssystem durchgeführt (siehe Materialtabelle).

1. Stellen Sie an Tag 1 eine 384-Well-Ultra-Low-Attachment-Sphäroid-Mikroplatte mit 40 μL Medium / Well sowie eine Zielplatte auf dem Zellpickel- und Bildgebungssystem ein.
2. Füllen Sie die Kommissionierkammer (siehe Materialtabelle)mit 6 mL Kulturmedium und zentrifugieren Sie bei 1.500 x g für 2 min, um Luftblasen zu entfernen. Die im Medium suspendierten PDOs (DOP-Pelletvolumen, 4 μL) in die Kommissionierkammer geben und auf die Anlage stellen.
3. Stellen Sie die Kammer für mindestens 1 Minute, gefolgt von der Dispersion, so dass sich die Zellhaufen am Boden der Kammer absetzen; Führen Sie dann ein Scannen der Kammer durch.
4. Stellen Sie die Kommissioniergröße auf 140-160 μm (Fläche 15.386-20.000 μm²⁾am System zur automatischen Auswahl von Zellclustern ein. Überprüfen Sie anschließend die Qualität der ausgewählten Zellcluster auf den gescannten Bildern und übertragen Sie zehn Zellcluster pro Vertiefung mitHilfe von Kommissionierspitzen (siehe Materialtabelle)in die Zielplatte.
5. Führen Sie die Protokollschritte ab Schritt 2.3 aus.

4. HTS für Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität

HINWEIS: Dieser Schritt wird mit einem handelsüblichen System (siehe Materialtabelle)durchgeführt, bei dem es sich um ein elektrisches Impedanzmessgerät handelt. Es wird verwendet, um die Zytolyse von PDOs durch Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) mit monoklonalen Antikörpern und natürlichen Killerzellen (NK) zu bewerten (Abbildung 3). NK-Zellen werden aus peripheren mononukleären Blutzellen unter Verwendung des NK-Zellproduktionskits (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt.

1. Messung der ADCC-Aktivität
   1. Beschichten Sie am Tag 0 eine 96-Well-Platte (siehe Materialtabelle)mit 50 μL 10 μg/ml Fibronektinlösung (0,5 μg/Well) bei 4 °C über Nacht.
   2. An Tag 1, nachdem die Fibronektinlösung entfernt wurde, fügen Sie 50 μL des Kulturmediums zu jeder Vertiefung hinzu, um die Hintergrundimpedanz zu messen.
   3. Vor der Aussaat 5 mL Zellkultur-Dissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle)zu den PDOs (RLUN007: 100 μL des DOP-Pellets in einem 75 cm^2-Kolben) geben und in einem CO2-Inkubator bei 37 °C für 20 min inkubieren, um die PDOs zu dispergieren. Um die Trypsinisierung zu stoppen, fügen Sie 5 ml Medium hinzu, zentrifugieren sie und entfernen Sie das Dissoziationsreagenz. Spülen Sie die PDOs mit frischem Medium ab und filtern Sie durch ein 40 μm Zellsieb (siehe Materialtabelle).
   4. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Zelllebensfähigkeitsanalysator (siehe Materialtabelle).
   5. Übertragen Sie die DOP-Suspension in einen Behälter und mischen Sie sie mit einem Mehrkanalpipettierer. Fügen Sie die DOP-Suspension in Vertiefungen mit 5 x 10⁴ Zellen /Vertiefung in einer 96-Well-Platte hinzu. Jede Vertiefung enthält ein Endvolumen von 100 μL. Anschließend stellen Sie die Platte für 30 min bei ca. 25 °C in eine biologische Sicherheitswerkbank.
   6. Die Platte wird in_{einem CO2-Inkubator} bei 37 °C auf das Gerät übertragen. Zeichnen Sie Änderungen der Impedanzsignale alle 15 Minuten als Zellindex auf.
   7. Tauen Sie die NK-Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad am selben Tag wie die DOP-Aussaat auf. Die Zellen aus der Durchstechflasche in ein 15-ml-Röhrchen mit 10 ml Medium für NK-Zellen (siehe Materialtabelle)überführen und bei 300 x g für 5 min bei ca. 25 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 10 ml frischem Medium. Nach der Zellzählung die Zelldichte auf 1 x 10⁶ Zellen/ml einstellen und in einen 75 cm^{2 Kolben} überführen. Kultivieren Sie die NK-Zellen in einem 5%_{CO2-Inkubator} bei 37 °C.
   8. Bereiten Sie am Tag 2 die Antikörperlösungen (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) in der 10-fachen Endkonzentration in sterilen V-Bottom-96-Well-Platten vor.
   9. Entfernen Sie 60 μL Medium aus jeder Vertiefung und geben Sie 10 μL Trastuzumab- oder Cetuximab-Lösung (10 μg/ml, 1 μg/ml und 0,1 μg/ml) zu den PDOs. Übertragen Sie die Platten in einem Inkubator zurück zum Instrument und zeichnen Sie den Zellindex für 1 h auf.
   10. Übertragen Sie die NK-Zellsuspension in ein 50-ml-Röhrchen und zählen Sie die Zellzahl. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min und stellen Sie die NK-Zelldichte auf 1 x 10⁶ Zellen/ml und 2 x 10⁶ Zellen/ml mit dem Medium für die PDOs ein.
   11. Den Effektorzellen (NK) werden 50 μL NK-Zellsuspension mit einem Zielzellverhältnis (RLUN007) von 1:1 oder 2:1 zugesetzt. Die Endkonzentrationen der Antikörper betragen 1 μg/ml, 0,1 μg/ml und 0,01 μg/ml. Halten Sie die Platte 15 Minuten lang bei ca. 25 °C und bringen Sie die Platten zum Instrument zurück.
2. Datenerhebung und -analyse
   1. Konvertieren Sie den Zellindex mit hilfe einer Analysesoftware in prozentuale Zytolysewerte (siehe Materialtabelle).
   2. Die prozentuale Zytolyse bezieht sich auf den Prozentsatz der Zielzellen, die von NK-Zellen im Vergleich zu Zielzellen (PDOs) allein als Kontrolle abgetötet werden. Subtrahieren Sie die Zellindizes der Vertiefungen, die nur NK-Zellen enthalten, vom Index der Probenbohrungen zu jedem Zeitpunkt. Normalisieren Sie jeden Wert auf den Zellindex unmittelbar vor der Zugabe von Antikörpern. Konvertieren Sie den normalisierten Zellindex in prozentuale Zytolyse mit der folgenden Gleichung: % Zytolyse = (1 - normalisierter Zellindex [Probentöpfe]) / normalisierter Zellindex (Ziel-Allein-Vertiefungen) x 100.

Ein hochgenaues HTS wurde unter Verwendung von PDOs und 384-Well-Mikroplatten zur Bewertung von Krebsmedikamenten entwickelt, und die Entwicklung eines HTS für jede PDO wurde zuvor berichtet10,11,12,13. Die Leistung des HTS wurde durch berechnung der Lebensläufe und des Z'-Faktors bewertet. Der Z'-Faktor ist eine weithin akzeptierte Methode zur Validierung der Assay-Qualität und -Leistung, und der Assay ist für HTS geeignet, wenn dieser Wert >0,514 beträgt. Die Kontrollbezugspunkte im 384-Well-Plattentest unter Verwendung von RLUN007 zeigten eine geringe Variabilität mit CV-Werten von 5,8% und berechneten Z'-Faktoren von 0,83, wie in Abbildung 4gezeigt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser Assay eine hohe Leistung für HTS aufweist. Um die Empfindlichkeit von PDOs gegenüber Krebsmedikamenten unter Verwendung von HTS zu untersuchen, wurde die Wachstumshemmung unter Verwendung von RLUN007 untersucht, das mit acht Krebsmedikamenten behandelt wurde, insbesondere epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) -Inhibitoren (Afatinib, Erlotinib, Gefitinib, Lapatinib, Osimertinib und Rociletinib) und Paclitaxel, die klinische Standardbehandlungen für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs sind, und Mitomycin C als Positivkontrolle. Die IC50- und AUC-Werte der Krebsmedikamente für jede g.U. sind in Abbildung 4 dargestellt. Die RLUN007 zeigte eine hohe Sensitivität (IC50 < 2 μM, AUC < 282) für alle EGFR-Inhibitoren und andere Krebsmittel. Sigmoidkurven, die für alle Daten berechnet wurden, zeigten, dass die wachstumshemmende Aktivität der Krebsmedikamente genau gemessen werden konnte.

Das Zellpicking- und Bildgebungssystem wird verwendet, wenn die Daten mit der oben genannten Methodik erheblich variieren. Das Zellpicking- und Bildgebungssystem, das Zellcluster genau auswählt, ohne sie zu beschädigen, ermöglicht genaue HTS-Assays, indem es die Zellclustergröße ausrichtet, um Zelltrümmer aus dem Assay-System auszuschließen. Wenn das System nicht verwendet wurde, betrug der CV-Wert 26,0% und der Z'-Faktor-Wert 0,23 (Daten nicht gezeigt). Die CV- und Z'-Faktor-Werte wurden jedoch mit dem System um 6,4% bzw. 0,81 verbessert.

Um die Zytolyse von PDOs mit ADCC-Aktivität mit dem elektrischen Impedanzmessgerät zu untersuchen, das die Anzahl, Morphologie und Anheftung von Zellen über einen längeren Zeitraum überwacht, wurden Veränderungen der Impedanzsignale mit RLUN007 bewertet, das mit den Antikörpern (Trastuzumab und Cetuximab) und NK-Zellen als Effektorzellen in einer 96-Well-Platte behandelt wurde. Verglichen mit der Kontrolle, die nur aus Zielzellen bestand, nahm die prozentuale Zytolyse mit der Zeit zu. Es erreichte 45% oder 75% nach 6 h bei einem E:T-Verhältnis von 1:1(Abbildung 5A,C)oder 2:1(Abbildung 5B,D)ohne die Antikörper. Die NK-Zell-vermittelte Zytolyse unter Verwendung von Trastuzumab betrug bei einem Verhältnis von 1:1(Abbildung 5A, 1μg/ml) bzw. 2:1(Abbildung 5B,1 μg/ml) etwa 60 % bzw. 90 % bei 6 h. Im Gegensatz dazu hatte Cetuximab einen dosisabhängigen Einfluss auf die NK-Zell-vermittelte Zytolyse (Abbildung 5C,D). Bei der höchsten Konzentration von Cetuximab wurden RLUN007 zu 90% bzw. 100% in einem Verhältnis von 1:1 bzw. 2:1 zerstört (Abbildung 5C,D). Die Wirkung von Trastuzumab war schwächer als die von Cetuximab, mit nur 60% Zytotoxizität. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das PDO-Assay-System die ADCC-Aktivität mit echtzeitbasierter impedanzbasierter Technologie bewerten kann.

Abbildung 1: Kritische Punkte für die g.U.-Kultur. (A) Farbänderung im Medium. (B) Messung der Menge an PDOs aus der Pelletgröße durch Auskleidung eines Zentrifugenröhrchens, das die PDOs enthält, mit Röhrchen, die in Konzentrationen für 50-200 μL gekennzeichnet sind. (C) DOP-Dichte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Zusammenfassung des Protokolls, das zur Erstellung eines Hochdurchsatz-Assay-Systems mit 384-Well-Mikrotiterplatten verwendet wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Zusammenfassung des Protokolls für den Hochdurchsatz-Assay der ADCC-Aktivität. ADCC, Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität; NK, natürlicher Killer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Hochdurchsatz-Assay-System zur Wachstumsinhibierung mit Krebsmedikamenten. Dosis-Wirkungs-Kurve von RLUN007 zu Krebsmedikamenten. Die gehackten PDOs wurden in 384-Well-Platten gesät. Diese wurden 6 Tage lang mit zehn verschiedenen Konzentrationen von Krebsmedikamenten (zwischen 10 μM und 1,5 nM) behandelt. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von dreifachen Experimenten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Hochdurchsatz-Assay für ADCC-Aktivität. (A,B) Trastuzumab. (C,D) Cetuximab. (A,C) Ein Verhältnis von RLUN007 zu Effektorzellen von 1:1. (B,D) Zytolyse mit einem Verhältnis von RLUN007: Effektorzellen von 1:2. Die Aktivität wurde 12 h nach Zugabe der Effektorzellen gemessen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung von drei Wiederholungsstichproben dargestellt. ADCC, Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Fujifilm Wako Bio Solutions Corporation ist eine Tochtergesellschaft von Fujifilm Wako Pure Chemicals, dem kommerziellen Eigentümer von F-PDO und F-PDO Medien durch Lizenzübertragung.