Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Hirnorganoiden und deren Verwendung bei der Modellierung mitochondrialer Erkrankungen.
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Methodenartikel
Generierung menschlicher Gehirnorganoide für die mitochondriale Krankheitsmodellierung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mitochondriale Erkrankungen stellen die größte Klasse angeborener Stoffwechselstörungen dar und sind derzeit unheilbar. Diese Erkrankungen verursachen neurologische Entwicklungsdefekte, deren zugrunde liegende Mechanismen noch aufgeklärt werden müssen. Ein Haupthindernis ist der Mangel an effektiven Modellen, die die früh einsetzende neuronale Beeinträchtigung der Patienten rekapitulieren. Fortschritte in der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) ermöglichen die Erzeugung von dreidimensionalen (3D) Hirnorganoiden, mit denen die Auswirkungen von Krankheiten auf die Entwicklung und Organisation des Nervensystems untersucht werden können. Forscher, einschließlich dieser Autoren, haben kürzlich menschliche Gehirnorganoide eingeführt, um mitochondriale Störungen zu modellieren. Dieser Artikel berichtet über ein detailliertes Protokoll für die robuste Erzeugung von humanen iPSC-abgeleiteten Gehirnorganoiden und deren Verwendung in mitochondrialen bioenergetischen Profiling- und Bildgebungsanalysen. Diese Experimente werden die Verwendung von Gehirnorganoiden zur Untersuchung von Stoffwechsel- und Entwicklungsstörungen ermöglichen und können entscheidende Informationen liefern, um die neuronale Pathologie mitochondrialer Erkrankungen zu sezieren.
Einleitung
Mitochondriale Erkrankungen stellen die größte Klasse angeborener Stoffwechselstörungen dar1. Sie werden durch genetische Mutationen verursacht, die verschiedene mitochondriale Prozesse stören, einschließlich oxidativer Phosphorylierung (OXPHOS)2, Assemblierung der Atmungskette, mitochondrialer Dynamik und mitochondrialer DNA-Transkription oder -Replikation3. Gewebe mit Energiebedarf sind besonders von mitochondrialer Dysfunktion betroffen4. Dementsprechend entwickeln Patienten mit mitochondrialen Erkrankungen typischerweise früh einsetzende neurologische Manifestationen.
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Protokoll
HINWEIS: Die Verwendung menschlicher iPS-Zellen kann eine ethische Genehmigung erfordern. Die in dieser Studie verwendeten iPS-Zellen wurden von gesunden Kontrollpersonen nach lokaler ethischer Zulassung abgeleitet (#2019-681). Alle Zellkulturverfahren müssen unter einer sterilen Zellkulturhaube durchgeführt werden, wobei alle Reagenzien und Verbrauchsmaterialien sorgfältig desinfiziert werden müssen, bevor sie unter die Haube überführt werden. Menschliche iPS-Zellen, die zur Differenzierung verwendet werden, sollten eine Passagenzahl unter 50 haben, um mögliche genomische Aberrationen zu vermeiden, die bei extensiver Kultur auftreten können. Der pluripotente Zustand ....
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Ergebnisse
Das hier beschriebene Protokoll erleichtert die robuste Erzeugung von runden Organoiden (Abbildung 1A).< Die erzeugten Organoide enthalten reife Neuronen, die mit Hilfe von axonspezifischen Proteinmarkern (SMI312) und Dendriten (Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2)) sichtbar gemacht werden können (Abbildung 1B). Reife Organoide enthalten nicht nur neuronale Zellen (MAP2-positiv), sondern auch Gliazellen .......
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Diskussion
Dieser Artikel beschreibt die reproduzierbare Erzeugung von humanen iPSC-abgeleiteten Gehirnorganoiden und deren Verwendung für die mitochondriale Krankheitsmodellierung. Das hier beschriebene Protokoll wurde auf der Grundlage einer zuvor veröffentlichten Arbeit modifiziert20. Ein großer Vorteil des vorliegenden Protokolls besteht darin, dass es nicht die manuelle Einbettung jedes Organoids in eine Gerüstmatrix erfordert. Tatsächlich wird die Matrixlösung einfach in das Zellkulturmedium gelöst. Da.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen oder nicht-finanziellen Interessen.
Danksagungen
Wir danken Miriam Bünning für die technische Unterstützung. Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 an A.P.), Spark und dem Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds an A.P.), der United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant an A.P.), dem Universitätsklinikum Düsseldorf (Forschungskommission UKD an A.P.) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) (d: Bio Young Investigator Grant AZ 031L0211 an A.P.). Die Arbeiten im Labor von C.R.R. wurden von der DFG gefördert (FOR 2795 "Synapsen unter Stress", Ro 2327/13-1).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | Layout-Software; Vektorgrafik-Editor | |
| Alexa Fluor 488 Esel Anti-Meerschweinchen | Sigma Aldrich | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | 1:300 |
| Antimycin A | Sigma Aldrich | 1397-94-0 | |
| Anti-Β-Tubulin III (TUJ-1) | Sigma Aldrich | T8578 | 1:2000 |
| Argon-Laser | Melles Griot | Jeder andere Laser, z.B. Diodenlaser, die 488 emittieren, ist auch in Ordnung | |
| Ascorbinsäure | Sigma | A92902 | |
| B-27 mit Vitamin A | Gibco | 17504044 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 3% in PBS, Lösung bei -20 ° lagern; C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star Zellkultur 6-Well-Platte | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemisch definiertes Lipidkonzentrat | Gibco | 11905031 | |
| Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop C1 | Nikon Microscope Solutions | Modulares konfokales Mikroskop System | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basalmembran-Matrix, Phenolrot-frei, LDEV-frei | Corning | 356231 | Matrix-Komponente |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Esel Anti-Ziege Cy3 | Merck Millipore | AP180C | 1:300 |
| Esel Anti-Maus Cy3 | Merck Millipore | AP192C | 1:300 |
| Esel Anti-Kaninchen Cy3 | Merck Millipore | AP182C | 1:300 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| DS-Q1Mc Kamera | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse 90i aufrechtes Weitfeldmikroskop | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse E 600FN aufrechtes Mikroskop | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 Inverses Mikroskop | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Bildgebungssoftware für konfokales Mikroskop | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| Fötales Rinderserum | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| Glaspasteur-Pipette | Marke | 747715 | Invertiert |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Helium-Neon-Laser | Melles Griot | Jeder andere Laser, z. B. Diodenlaser, die 594 emittieren, ist in Ordnung, auch | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 Inkubator | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Bild J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | Bildverarbeitungssoftware | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| Knockout Serum Ersatz | Gibco | 10828010 | |
| Laser (407 nm) | Coherent | Jeder andere Laser, z.B. Diodenlaser, der 407 emittiert, ist auch in Ordnung | |
| Map2 | Synaptic Systems | Nr. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Zentrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Ergänzung | Gibco | 17502-048 | |
| Nadel zum einmaligen Gebrauch (23G x 1" TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | Imaging software | |
| Oligomycin A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| PAP Pen | Sigma | Z377821-1EA | Zum Zeichnen von hydrophoben Barrieren auf Objektträgern. |
| Papain-Dissoziationssystem-Kit | Worthington | LK003150 | |
| Paraformaldehyd | Merck | 818715 | 4% in PBS, Lösung bei -20 & Grad lagern; C |
| Pasteurpipette 7mL | VWR | 612-1681 | Graduiert bis zu 3 mL |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | Trockenmikroskop | |
| Objektiv Plan Apo VC 60x / 1.40 Öl DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | Öl-Tauchmikroskop Objektiv | |
| Petrischale aus Polystyrol (100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit Zellsiebkappe (5 mL) | Falcon | 352235 | |
| Kaliumchlorid | Roth | 6781.1 | |
| ProLong Glas Antifade Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| Qualitatives Filterpapier | VWR | 516-0813 | |
| Gesteinshemmer | Merck | SCM075 | |
| Rotenon | Sigma | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | 13031 | |
| Skalpellklingen | Heinz Herenz Hamburq | 1110918 | |
| SMI312 | Biolegend | 837904 | 1:500 |
| Natriumbicarbonat | Merck/Sigma | 31437-1kg-M | |
| Natriumchlorid | Roth | 3957 | |
| Natrium Dihydrogenphosphat | Applichem | 131965 | |
| Natriumpyruvat | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase Zelldissoziationsreagenz | Gibco/StemPro | A1110501 | Reagenz A |
| Sekundenkleber Gel | UHU | 63261 | Klebegel |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| Spritze zum Einmalgebrauch (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Gewebekulturhaube | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Production beendet, jedes andere einstellbare Mikrotom ist auch in Ordnung. | |
| Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade | Wilkinson Schwert | 70517470 | |
| Whatman Benchkote | Merck/Sigma | 28418852 | |
| Wnt Antagonist I | EMD Millipore Corp | 3378738 | |
| XF 96 extrazellulärer Flussanalysator | Seahorse Bioscience | 100737-101 | |
| XF Assay DMEM Medium | Seepferdchen Bioscience | 103680-100 | |
| XF Kalibrant Lösung | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96-Well-Mikroplatte) | Seahorse Bioscience | 102416-100 |
Referenzen
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080(2016).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K.
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Nachdrucke und Genehmigungen
