Methodenartikel

Längsschnittliche intravitale Bildgebung durch klare Silikonfenster

DOI:

10.3791/62757

⸱

5. Januar 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird ein Ansatz für die intravitale Langzeitbildgebung mit optisch klaren Silikonfenstern vorgestellt, die direkt auf das interessierende Gewebe/Organ und die Haut geklebt werden können. Diese Fenster sind billiger und vielseitiger als andere, die derzeit im Feld verwendet werden, und das chirurgische Einführen verursacht begrenzte Entzündungen und Leiden bei den Tieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die intravitale Mikroskopie (IVM) ermöglicht die Visualisierung von Zellbewegung, -teilung und -tod bei Einzelzellauflösung. IVM durch chirurgisch eingesetzte Bildgebungsfenster ist besonders leistungsfähig, da es die Längsmessung desselben Gewebes über Tage bis Wochen ermöglicht. Typische Bildfenster bestehen aus einem Glasdeckglas in einem biokompatiblen Metallrahmen, der an der Haut der Maus vernäht ist. Diese Fenster können die freie Bewegung der Mäuse beeinträchtigen, eine starke Entzündungsreaktion hervorrufen und aufgrund von Glasscherben oder zerrissenen Nähten versagen, von denen jede Euthanasie erfordern kann. Um diese Probleme anzugehen, wurden Fenster für die langfristige Bildgebung von Bauchorganen und Brustdrüsen aus einem dünnen Film aus Polydimethylsiloxan (PDMS) entwickelt, einem optisch klaren Silikonpolymer, das zuvor für kraniale Bildgebungsfenster verwendet wurde. Diese Fenster können direkt auf das Gewebe geklebt werden, wodurch die Zeit für das Einführen reduziert wird. PDMS ist flexibel und trägt im Laufe der Zeit zu seiner Haltbarkeit bei Mäusen bei – es wurden bis zu 35 Tage getestet. Längsschnittbildgebung ist die Bildgebung derselben Geweberegion während separater Sitzungen. Ein Edelstahlgitter wurde in die Fenster eingebettet, um die gleiche Region zu lokalisieren, was die Visualisierung dynamischer Prozesse (wie die Involution der Brustdrüse) an den gleichen Stellen im Abstand von Tagen ermöglicht. Dieses Silikonfenster ermöglichte auch die Überwachung einzelner disseminierter Krebszellen, die sich im Laufe der Zeit zu Mikrometastasen entwickelten. Die in dieser Studie verwendeten Silikonfenster sind einfacher einzusetzen als metallgerahmte Glasfenster und verursachen eine begrenzte Entzündung des abgebildeten Gewebes. Darüber hinaus ermöglichen eingebettete Gitter eine einfache Verfolgung derselben Geweberegion in wiederholten Bildgebungssitzungen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die intravitale Mikroskopie (IVM), die Bildgebung von Geweben bei betäubten Tieren, bietet Einblicke in die Dynamik physiologischer und pathologischer Ereignisse bei zellulärer Auflösung in intaktem Gewebe. Die Anwendungen dieser Technik sind sehr unterschiedlich, aber IVM war im Bereich der Krebsbiologie von entscheidender Bedeutung, um aufzuklären, wie Krebszellen in Gewebe eindringen und metastasieren, mit der umgebenden Mikroumgebung interagieren und auf Medikamente reagieren 1,2,3. Darüber hinaus war IVM der Schlüssel zum besseren Verständnis der komplexen Mechanismen, die Immunantworten steuern, indem es Erkenntnisse lieferte, die Ex-vivo-Profiling-Ansätze (z. B. Durchflusszytometrie) ergänzten. Zum Beispiel haben intravitale Bildgebungsexperimente Details über Immunfunktionen in Bezug auf Zellmigration und Zell-Zell-Kontakt enthüllt und eine Plattform zur Quantifizierung der raumzeitlichen Dynamik als Reaktion auf Verletzungen oder Infektionengeboten 4,5,6,7. Viele dieser Prozesse können auch durch histologische Färbung untersucht werden, aber nur IVM ermöglicht die Verfolgung dynamischer Veränderungen. Während ein histologischer Abschnitt eine Momentaufnahme des Gewebes zu einem bestimmten Zeitpunkt bietet, kann die intravitale Bildgebung interzelluläre und subzelluläre Ereignisse innerhalb desselben Gewebes im Laufe der Zeit verfolgen. Insbesondere Fortschritte bei der Fluoreszenzmarkierung und die Entwicklung molekularer Reporter haben es ermöglicht, molekulare Ereignisse mit zellulärem Verhalten wie Proliferation, Tod, Motilität und Interaktion mit anderen Zellen oder der extrazellulären Matrix zu korrelieren. Die meisten IVM-Techniken basieren auf der Fluoreszenzmikroskopie, die aufgrund der Lichtstreuung die Abbildung tieferer Gewebe schwierig macht. Das interessierende Gewebe muss daher oft mit einem oft invasiven und terminalen Verfahren operativ exponiert werden. So kann das Gewebe je nach Organstelle kontinuierlich für einen Zeitraum von wenigen bis 40 h8 abgebildet werden. Alternativ ermöglicht das chirurgische Einsetzen eines permanenten Bildgebungsfensters die sequentielle Abbildung desselben Gewebes über einen Zeitraum von Tagen bis Wochen 7,9.

Die Entwicklung neuer Bildgebungsfenster wurde als technologischer Bedarf zur weiteren Verbesserung intravitaler Bildgebungsansätzehervorgehoben 10. Das prototypische intravitale Bildgebungsfenster ist ein Metallring, der einen Glasdeckel enthält, der mit Nähten11 auf der Haut befestigt ist. Störungen der Bewegungsfreiheit, die Ansammlung von Exsudat und Schäden am Glasdeckglas sind häufige Probleme bei der Verwendung solcher Fenster. Darüber hinaus erfordert das prototypische Fenster eine spezielle Produktion, und der chirurgische Eingriff kann eine umfangreiche Schulung erfordern. Um diese Probleme anzugehen, wurde Polydimethylsiloxan (PDMS), ein Silikonpolymer, das zuvor in Schädelfenstern für die Langzeitbildgebung im Gehirn verwendet wurde12, für den Einsatz in der Bildgebung von Bauchorganen und Brustdrüsen angepasst. Hier wird eine detaillierte Methode zur Erzeugung von PDMS-basierten Silikonfenstern vorgestellt, einschließlich der Frage, wie das Fenster um ein Edelstahlgitter gegossen wird, um Landmarken für die wiederholte Abbildung derselben Geweberegionen bereitzustellen. Weiterhin wird ein einfacher, stichfreier Operationsablauf zum Einführen des Fensters über Bauchorgane oder die Brustdrüse beschrieben. Dieser neue Ansatz überwindet einige der häufigsten Probleme mit derzeit verwendeten Bildgebungsfenstern und erhöht die Zugänglichkeit der intravitalen Längsbildgebung.

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Protokoll

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Alle beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den chirurgischen Richtlinien des Cold Spring Harbor Laboratory durchgeführt und waren vom Institutional Animal Care and Use Committee des Cold Spring Harbor Laboratory genehmigt worden.

1. Gießen des Silikonfensters

  1. Bereiten Sie das Silikonpolymer (PDMS) vor, indem Sie das Basiselastomer und den Härter im Verhältnis 10:1 (v/v) mischen.
  2. Gießen Sie ein Fenster, indem Sie eine kleine Menge PDMS auf eine sterile, glatte Oberfläche abscheiden und das Verhältnis von Volumen zu Fläche auf die gewünschte Dicke einstellen.
    HINWEIS: Die Verwendung von 200 mg Polymerlösung für einen Kreis mit einem Durchmesser von 22 mm auf dem Deckel eines 24-Well-Plate-Deckels führt zu einem guten Kompromiss zwischen Fensterrobustheit und optischer Klarheit.
  3. Optional: Um Landmarken für die wiederholte Bildgebung derselben Geweberegionen bereitzustellen, drücken Sie leicht ein Edelstahlgitter in das Silikon, nachdem sich das PDMS auf der gewünschten Gießoberfläche befindet.
  4. Um Luftblasen zu entfernen, legen Sie die beschichtete Oberfläche für 45 Minuten in einen Vakuum-Exsikkator, um das Polymer zu entgasen.
  5. Die Silikonfenster in einem Ofen bei 80 °C für 45 min aushärten.
  6. Ritzen Sie das Polymer an den Rändern der Form und ziehen Sie die ausgehärteten Fenster vorsichtig von der Oberfläche ab, die für das Gießen mit Pinzetten verwendet wird.
  7. Sterilisieren Sie vor der Operation die Fenster durch Autoklavieren.

2. Vorbereitung der Maus für das Einsetzen des Silikonfensters

  1. Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer mit 4% (v/v) Isofluran. Bewegen Sie die Maus zu einem Wärmekissen auf dem Operationstisch, legen Sie die Maus in die Anästhesie-Nasenmaske und senken Sie die Isofluran-Konzentration auf 2% für die Aufrechterhaltung während der gesamten Operation.
  2. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Zehen der Hinterbeine kneifen. Fahren Sie nicht fort, bis die Maus inaktiv ist und keine Zehenklemmreflexreaktion zeigt.
  3. Tragen Sie ophthalmisches Gleitmittel auf die Augen auf, um zu verhindern, dass sie austrocknen und ein Trauma verhindern.
  4. Präventive Analgesie (Buprenorphin 0,05 mg/kg) subkutan verabreichen.
  5. Rasieren Sie die Operationsstelle und entfernen Sie die Haare vollständig mit einer Haarentfernungscreme.
  6. Tragen Sie Povidon-Jod-Lösung (10% v/v) und Ethanol (70% v/v) 3x nacheinander auf, um eine Infektion an der Operationsstelle zu verhindern.

3. Einführen eines ventralen Fensters für die Bildgebung in der Leber; anpassbar für andere Bauchorgane (Abbildung 1)

  1. Stellen Sie die Maus in Rückenlage.
  2. Machen Sie einen 10-mm-Einschnitt, der 3 mm nach unten mit sterilen Scheren und Pinzetten beginnt.
  3. Entfernen Sie einen 1–1,5 cm2 großen Hautabschnitt entlang der Mittellinie.
  4. Verwenden Sie eine zweite sterile Schere und Pinzette, um einen Abschnitt des Peritoneums zu entfernen, der etwas kleiner ist als der Hautabschnitt.
  5. Optional: Um einen größeren Teil der Leber sichtbar zu machen, verwenden Sie sterile Wattestäbchen, die mit steriler Kochsalzlösung angefeuchtet sind, um die Leber vom Zwerchfell nach unten zu drücken und das falciforme Band freizulegen, das die Leber mit dem Zwerchfell verbindet. Durchtrennen Sie das Band und achten Sie darauf, die untere Hohlvene nicht zu schneiden.
  6. Ziehen Sie den chirurgischen Klebstoff mit einer 31-G-Spritze ab, tragen Sie eine kleine Menge davon auf die Oberfläche der Leber an den Rändern des abzubildenden Bereichs auf. Dieser Klebstoff erzeugt eine kreisförmige Dichtung, die den mittleren Bereich für die Bildgebung intakt lässt.
    VORSICHT: Beschränken Sie den Klebstoff auf kleine Tröpfchen, die ein kreisförmiges Muster um den Bildbereich bilden. Gewebe, das unmittelbar mit dem Klebstoff in Berührung kommt, kann nicht abgebildet werden. Es ist nicht notwendig, das Gewebe vor dem Auftragen des Klebstoffs zu trocknen.
    HINWEIS: Alle Klebstoffe auf Cyanacrylatbasis können für dieses Verfahren erfolgreich eingesetzt werden. Chirurgischer Klebstoff sorgt für Sterilität. Für Klemmenverfahren liefern Allzweck-Sekundenkleber gute Ergebnisse.
  7. Positionieren Sie das Fenster mit einer Pinzette und halten Sie es fest an der Leber, bis der Klebstoff getrocknet ist (~ 2 min).
  8. Falten Sie die Kanten des Fensters unter dem Peritoneum.
  9. Tragen Sie mit einer Spritze eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf die Ränder des Fensters auf, die sich jetzt unter dem Peritoneum befinden. Drücken Sie das Peritoneum mit einer Pinzette nach unten, um es am Fenster zu befestigen.
  10. Tragen Sie in ähnlicher Weise eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf das Peritoneum auf, bevor Sie es mit einer Pinzette auf die Haut drücken, um es am Peritoneum zu befestigen.
    HINWEIS: Bei korrekter Durchführung sollte nun ein kreisförmiger Bereich des Lebergewebes durch das Fenster sichtbar sein.
  11. Tragen Sie Kleber um die Kanten des Fensters auf, um einen Rand zu schaffen, der verhindert, dass die Haut über das Fenster zurückwächst.
    ACHTUNG: Wenn der Eingriff mit sterilen chirurgischen Techniken durchgeführt wird und das Fenster vor dem Einsetzen sterilisiert wird, reicht das Versiegeln der Wunde mit chirurgischem Klebstoff aus, um Infektionen zu vermeiden. Das Versäumnis, die richtigen aseptischen Techniken während des chirurgischen Einführens oder eines unvollkommenen Verschlusses zu befolgen, kann jedoch zu einer offensichtlichen oder subklinischen Infektion und zum Austrocknen des Gewebes führen.

4. Einfügen eines seitlichen Fensters für die Bildgebung in der Leber; kompatibel mit der gleichzeitigen Injektion von Krebszellen in die Pfortader (Abbildung 2)

  1. Platzieren Sie die Maus auf der linken seitlichen Dekubitusposition
  2. Machen Sie einen 10-mm-Schnitt an der rechten Flanke 3 mm unterhalb des Rippenbogens mit steriler Schere und Pinzette.
  3. Entfernen Sie einen 1 cm2 großen Hautabschnitt.
  4. Verwenden Sie eine zweite sterile Schere und Pinzette, um einen Abschnitt des Peritoneums zu entfernen, der etwas kleiner ist als der Hautabschnitt.
  5. Ziehen Sie den chirurgischen Klebstoff mit einer 31-G-Spritze ab, tragen Sie eine kleine Menge davon auf die Oberfläche der Leber an den Rändern des abzubildenden Bereichs auf.
    VORSICHT: Beschränken Sie den Klebstoff auf kleine Tröpfchen, die ein kreisförmiges Muster um den Bildbereich bilden. Gewebe, das unmittelbar mit dem Klebstoff in Berührung kommt, kann nicht abgebildet werden.
    HINWEIS: Alle Klebstoffe auf Cyanacrylatbasis können für dieses Verfahren erfolgreich eingesetzt werden. Chirurgischer Klebstoff sorgt für Sterilität. Für Klemmenverfahren liefern Allzweck-Sekundenkleber gute Ergebnisse.
  6. Positionieren Sie das Fenster mit einer Pinzette und halten Sie es fest an der Leber, bis der Klebstoff getrocknet ist (~ 2 min).
  7. Falten Sie die Kanten des Fensters unter dem Peritoneum.
  8. Tragen Sie mit einer Spritze eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf die Ränder des Fensters auf, die sich jetzt unter dem Peritoneum befinden. Drücken Sie das Peritoneum mit einer Pinzette nach unten, um es am Fenster zu befestigen.
  9. Tragen Sie in ähnlicher Weise eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf das Peritoneum auf, bevor Sie es mit einer Pinzette auf die Haut drücken, um es am Peritoneum zu befestigen.
    HINWEIS: Bei korrekter Durchführung sollte nun ein kreisförmiger Bereich des Lebergewebes durch das Fenster sichtbar sein.
  10. Tragen Sie Kleber um die Kanten des Fensters auf, um einen Rand zu schaffen, der verhindert, dass die Haut über das Fenster zurückwächst.
  11. Wenn eine Pfortaderinjektion erforderlich ist:
    1. Stellen Sie die Maus in Rückenlage.
    2. Machen Sie einen 10-mm-Einschnitt, beginnend mit dem Xiphoid-Prozess in der Haut.
    3. Machen Sie mit einer zweiten sterilen Schere und Pinzette einen 10-mm-Schnitt im Peritoneum.
    4. Tauchen Sie zwei Wattestäbchen in sterile Kochsalzlösung.
    5. Verwenden Sie die Wattestäbchen, um den Darm vorsichtig auf sterile Gaze zu ziehen, die mit steriler Kochsalzlösung angefeuchtet ist, und achten Sie darauf, die Ausrichtung nicht zu verdrehen oder anderweitig zu stören.
    6. Verschieben Sie den Darm aus der Bauchhöhle, bis die Pfortader auf der rechten Seite des Abdomens sichtbar ist.
    7. Führen Sie eine 31–33 G Nadel 5–7 mm Caudal zum Eintrittspunkt der Pfortader in die Leber ein und achten Sie darauf, innerhalb des Blutgefäßes und nicht durch es hindurch zu gehen.
    8. Injizieren Sie langsam die Krebszellen (resuspendiert in 100 μL sterilem PBS).
      HINWEIS: Für dieses Experiment kann die Amurinzelllinie für Bauchspeicheldrüsenkrebs (z. B. KPC-BL / 6-1199) in vollständigen DMEM-Medien kultiviert und 1 x 105 Zellen in 100 μL steriles PBS injiziert werden.
    9. Um Blutungen zu vermeiden, üben Sie unmittelbar nach dem Zurückziehen der Nadel mit einem kleinen Stück chirurgischem Schwamm für 1–2 min sanften Druck auf die Injektionsstelle aus.
    10. Nachdem der Druck nachgelassen hat, überwachen Sie die Stelle für 1-2 Minuten, um die Hämostase sicherzustellen.
    11. Mit angefeuchteten Wattestäbchen den Darm nach der physiologischen Orientierung des Organs in die Bauchhöhle zurückbringen.
    12. Verwenden Sie eine sterile Pinzette und setzen Sie das Fenster unmittelbar unter dem Peritoneum auf der linken Seite der Bauchhöhle der Maus ein.
    13. Nähen Sie mit 4-0 Seidennähten und heften Sie den Mittellinienschnitt mit 7 mm gewickelten Edelstahlclips.
    14. Bewegen Sie die Maus in die linke seitliche Dekubitusposition
    15. Machen Sie einen 10 mm Einschnitt an der rechten Flanke 3 mm unter dem Rippenbogen durch die Haut mit steriler Schere und Pinzette.
    16. Entfernen Sie einen 1 cm2 großen Hautabschnitt um den Schnitt herum.
    17. Verwenden Sie eine zweite sterile Schere und Pinzette, um einen Abschnitt des Peritoneums zu entfernen, der etwas kleiner ist als der Hautabschnitt.
    18. Ziehen Sie das Fenster über die Leber, bevor Sie es an Ort und Stelle kleben, wie unter den Schritten 4.8 bis 4.10 beschrieben.

5. Einfügen des Fensters für die Bildgebung in der Bauchspeicheldrüse (Abbildung 3)

  1. Platzieren Sie die Maus auf der rechten seitlichen Dekubitusposition.
  2. Machen Sie einen 10-mm-Schnitt an der linken Flanke 3 mm unterhalb des Rippenbogens mit steriler Schere und Pinzette.
  3. Entfernen Sie einen 1 cm2 großen Hautabschnitt um den Schnitt herum.
  4. Verwenden Sie eine zweite sterile Schere und Pinzette, um einen Abschnitt des Peritoneums zu entfernen, der etwas kleiner ist als der Hautabschnitt.
  5. Ziehen Sie mit sterilen Wattestäbchen, die mit steriler Kochsalzlösung getränkt sind, vorsichtig an der Milz, um die Bauchspeicheldrüse zu visualisieren. Positionieren Sie die Bauchspeicheldrüse mit den angefeuchteten Wattestäbchen neu, um durch den Schnitt mehr Oberfläche sichtbar zu machen.
    HINWEIS: An diesem Punkt können Bauchspeicheldrüsenkrebszellen orthotop in die Bauchspeicheldrüse injiziert werden, wenn dies Teil des experimentellen Designs ist.
  6. Ziehen Sie den chirurgischen Klebstoff mit einer 31-G-Spritze zurück und tragen Sie eine kleine Menge davon auf die Oberfläche der Bauchspeicheldrüse an den Rändern des abzubildenden Bereichs auf.
    VORSICHT: Beschränken Sie den Klebstoff auf kleine Tröpfchen, die ein kreisförmiges Muster um den Bildbereich bilden. Gewebe, das unmittelbar mit dem Klebstoff in Berührung kommt, kann nicht abgebildet werden.
  7. Positionieren Sie das Fenster mit einer Pinzette und halten Sie es fest an der Bauchspeicheldrüse, bis der Klebstoff getrocknet ist (~ 2 min).
  8. Falten Sie die Kanten des Fensters unter dem Peritoneum.
  9. Tragen Sie mit einer Spritze eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf die Ränder des Fensters auf, die sich jetzt unter dem Peritoneum befinden. Drücken Sie das Peritoneum mit einer Pinzette nach unten, um es am Fenster zu befestigen.
  10. Tragen Sie in ähnlicher Weise eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf das Peritoneum auf, bevor Sie es mit einer Pinzette auf die Haut drücken, um es am Peritoneum zu befestigen.
    HINWEIS: Bei korrekter Ausführung sollte nun ein kreisförmiger Bereich des Bauchspeicheldrüsengewebes durch das Fenster sichtbar sein.
  11. Tragen Sie Kleber um die Kanten des Fensters auf, um einen Rand zu schaffen, der verhindert, dass die Haut über das Fenster zurückwächst.

6. Einfügen des Fensters für die Bildgebung in die Brustdrüse (Abbildung 4)

  1. Legen Sie die Maus auf die Rückenlage.
  2. Machen Sie einen 10-mm-Schnitt medial zu einem der Leistenbrustwarzen mit steriler Schere und Pinzette.
  3. Entfernen Sie einen 0,5 cm2 großen Hautabschnitt oberhalb der Brustdrüse.
  4. Verwenden Sie eine zweite sterile Schere, um die Brustdrüse vorsichtig von der Haut zu trennen, indem Sie die Schere zwischen den beiden Oberflächen verteilen, um die Haftung zu stören.
    HINWEIS: Um die Bildgebung des Leisten-Brustdrüsenbereichs zu erleichtern, achten Sie darauf, einen Teil der Haut oberhalb der Brustdrüse, aber oberhalb des Hinterbeins zu sezieren, damit das Fenster die Beweglichkeit der Maus nicht einschränkt.
  5. Ziehen Sie den chirurgischen Klebstoff mit einer 31-G-Spritze zurück und tragen Sie eine kleine Menge davon auf die Oberfläche der Brustdrüse an den Rändern des abzubildenden Bereichs auf.
    VORSICHT: Beschränken Sie den Klebstoff auf kleine Tröpfchen, die ein kreisförmiges Muster um den Bildbereich bilden. Gewebe, das unmittelbar mit dem Klebstoff in Berührung kommt, kann nicht abgebildet werden.
  6. Positionieren Sie das Fenster mit einer Pinzette und halten Sie es fest an der Brustdrüse, bis der Klebstoff getrocknet ist (~ 2 min).
    HINWEIS: Ein kreisförmiger Bereich des Brustdrüsengewebes sollte jetzt durch das Fenster sichtbar sein, wenn er korrekt ausgeführt wird.
  7. Falten Sie die Ränder des Fensters unter die Haut.
  8. Tragen Sie mit einer Spritze eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf die Ränder des Fensters auf, die sich jetzt unter der Haut befinden. Drücken Sie mit einer Pinzette auf die Haut, um die Haut am Fenster zu befestigen.
  9. Tragen Sie Kleber um die Kanten des Fensters auf, um einen Rand zu schaffen, der verhindert, dass die Haut über das Fenster zurückwächst.

7. Nachchirurgische Genesung

  1. Legen Sie die Maus in einen sauberen Erholungskäfig mit reichlich Nistmaterial und stellen Sie sicher, dass ein Teil des Käfigs auf einem Heizkissen ruht.
  2. Überwachen Sie die Maus kontinuierlich, bis sie bewusst und mobil ist.
  3. Falls erforderlich, geben Sie eine zusätzliche Dosis Analgetikum 12 h nach der präventiven Dosis.
    HINWEIS: Zusätzliche Analgesie ist im Allgemeinen unnötig, aber konsultieren Sie einen Tierarzt, wenn die Maus Anzeichen von Stress zeigt (wie gebeugter Rücken, ungepflegtes Fell oder verlorenes Interesse an Nahrung). Überwachen Sie die Maus täglich für die ersten 3 Tage nach der Operation auf Anzeichen einer Infektion oder andere Nebenwirkungen. Weniger als 2% der Mäuse benötigen tierärztliche Hilfe oder Euthanasie, typischerweise aufgrund einer teilweisen Ablösung des Fensters. Es ist wichtig zu beachten, dass bei männlichen Mäusen mit ventralen Leberbildgebungsfenstern der Kampf zwischen Mäusen zu einer Ablösung der Fenster führen kann. Dies wird vermieden, indem die Mäuse separat untergebracht werden.

8. Bildgebung durch das Fenster

  1. Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer mit 4% (v/v) Isofluran.
  2. Tragen Sie ophthalmisches Gleitmittel auf die Augen auf, um zu verhindern, dass sie austrocknen und ein Trauma verhindern.
  3. Bewegen Sie die Maus von der Induktionskammer in die Mikroskopstufe. Legen Sie die Maus in die Anästhesie-Nasenmaske und senken Sie die Isofluran-Konzentration auf etwa 1-1,5% für die Erhaltungsanästhesie während des gesamten bildgebenden Verfahrens.
  4. Platzieren Sie einen Druckkissensensor unter der Maus, um die Atemfrequenz zu überwachen, und fixieren Sie die Maus mit weichem chirurgischem Klebeband auf der Bühne.
  5. Setzen Sie ein Rektalthermometer ein, um die Körpertemperatur während der gesamten Bildgebungssitzung zu überwachen.
  6. Schalten Sie das beheizte Pad ein und überwachen Sie die Maus genau, um sicherzustellen, dass die Körpertemperatur 37 ° C nicht überschreitet.
  7. Verwenden Sie Software, um die Atemfrequenz der Maus zu überwachen. Die optimale Rate beträgt ~ 1 Atem / Sekunde. Stellen Sie die Anästhesie nach Bedarf ein.
  8. Reinigen Sie vor jeder Bildgebungssitzung das Fenster von Restlinsentauchmedium und Ablagerungen, indem Sie es vorsichtig mit einem Wattestäbchen abwischen, das in 70% Ethanol (v / v) getaucht ist.
  9. Wenn Sie eine Wassertauchlinse verwenden, tragen Sie Ultraschallgel auf das Fenster auf und vermeiden Sie Blasen.
    HINWEIS: Destilliertes Wasser kann ebenfalls verwendet werden, erfordert jedoch möglicherweise eine erneute Anwendung während der Bildgebung.
  10. Um die optimale Tiefe für die Bildgebung zu finden, lokalisieren Sie zuerst das Raster und platzieren Sie es im Fokus.
  11. Bestimmen Sie die ungefähre Gewebebildgebungstiefe, indem Sie den unteren Rand des Gitters auf 0 setzen. Diese Informationen sind notwendig, um die entsprechende z-Ebene in nachfolgenden Bildgebungssitzungen zu lokalisieren.
  12. Um dieselbe Position über mehrere Bildgebungssitzungen hinweg zu identifizieren, verwenden Sie die Quadrate auf dem Raster als Referenzpunkt. Notieren Sie sich während der Bildgebung die Ausrichtung des Rasters und die Position innerhalb des Rasters jedes abgebildeten Sichtfelds (z. B. 2. Reihe von oben, 4. Quadrat von links).
  13. Verwenden Sie während aufeinanderfolgender Bildgebungssitzungen das Raster, um zu bestimmten Rasterbereichen - und damit zu Bildfeldern - zu navigieren.
  14. Entfernen Sie nach jeder Bildgebungssitzung alle verbleibenden Linsentauchmedien und Ablagerungen, indem Sie das Fenster vorsichtig mit einem Wattestäbchen abwischen, das in 70% Ethanol (v / v) getaucht ist.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die intravitale Bildgebung durch Bildgebungsfenster kann verwendet werden, um eine breite Palette von zellulären und molekularen Ereignissen mit Einzelzellauflösung über einen Zeitraum von Stunden bis Wochen zu beobachten, zu verfolgen und zu quantifizieren. Zu den idealen Merkmalen für ein Bildgebungsfenster gehören: a) begrenzte Auswirkungen auf das Wohlbefinden der Maus und die Physiologie des Gewebes; b) Haltbarkeit; c) Einfachheit des Einfügens; und d) Freie Landmarken für wiederholte Bildgebung derselben Region. Da...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intravitale Bildgebungsfenster sind wichtige Werkzeuge, um physiologische und pathologische Prozesse in zellulärer Auflösung direkt sichtbar zu machen, während sie sich im Laufe der Zeit entfalten. Das neuartige Verfahren zum Gießen und Einsetzen flexibler Silikonbildgebungsfenster in Mäuse überwindet einige der häufigsten Probleme mit derzeit verwendeten Bildgebungsfenstern (Exsudat, Bruch und Störung der normalen Mobilität), bietet zusätzliche Sicherheit für die Maus und erhöht die Zugänglichkeit dieser Technik.

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.E. ist Mitglied des Forschungsbeirats für brensocatib bei Insmed , Inc.; Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Vividion Therapeutics, Inc.; ein Berater für Protalix, Inc.; und hält Anteile an Agios Pharmaceuticals, Inc. D.A.T. ist Mitbegründer von Mestag Therapeutics, Mitglied des wissenschaftlichen Beirats und hält Anteile an Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology und Cygnal Therapeutics. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Rob Eifert für seine Unterstützung bei der Konstruktion und Optimierung der lasergeschnittenen Edelstahlgitter. Diese Arbeit wurde vom CSHL Cancer Center (P30-CA045508) und Mitteln für M.E. von den National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 und 5P01CA013106-49) unterstützt; CSHL und Northwell Health; die Thompson Family Foundation; Schwimmen Sie durch Amerika; und ein Stipendium der Simons Foundation an CSHL. M.S. wurde vom National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) und dem National Cancer Institute des NIH unter der Preisnummer 1F30CA253993-01 unterstützt. L.M. wird durch ein James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship unterstützt. J.M.A. erhielt ein Cancer Research Institute/Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI Award #3435). D.A.T. wird von der Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research und der Thompson Family Foundation unterstützt. Cartoons wurden mit Biorender.com erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape3M70200770819
Seidennaht 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2Ethicon N267H
ACTB-ECFP MäuseJackson Laboratory22974
AEC Substrat Kit, Peroxidase (HRP), (3-Amino-9-ethylcarbazol)Vector Laboratories SK-4200
AlkoholtupferBD 
AnästhesiesystemMolecular Imaging Products Co.
Acqknowledge Software und Sensoren BIOPACACK100W, ACK100M, TSD110
Betadin-Spray LORIS109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) MäuseJackson Laboratory18549
C57BL/6J MäuseJackson Laboratory664
CD45 Monoklonaler Antikörper (30-F11)Invitrogen14-0451-82
CD68 AntikörperAbcamab125212
Curity MullschwämmeCovidien
Esel Anti-Ziege IgG H& L (HRP) Abcamab6885
Esel Anti-Kaninchen IgG H& L (HRP) Abcamab97064
Esel Anti-Ratte IgG H& L (HRP) Abcamab102182
Dow SYLGARD 184 Silikon-Verkapselungsmittel KlareElektronenmikroskopie Sciences24236-10einem Mischungsverhältnis von 10:1
mm Durchmesser, #1,5 Dicke Elektronenmikroskopie Wissenschaften72296-08
Ender-3 Pro 3D-DruckerShenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Ferninfrarot-HeizdeckeKent ScientificRT-0520
Fc-RezeptorblockerInnovex BiosciencesNB309
Fidschi Bildverarbeitungspakethttps://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres Carboxylat, 0,04 μm; m, gelb-grün (505/515)InvitrogenF8795
Angusssystem:BIOPAC Systems Inc.Die Komponenten zusammen ermöglichen die Überwachung der Vitalwerte von Mäusen während der Bildgebung und die Gating-Bildaufnahme bei der Mausatmung. Alle wurden von BIOPAC Systems erworben.
Acqknowledge Software ACK100W, ACK100M
Diff.-Verstärker-Modul, C-Serie DA100C
Dual Gating Sys für KleintierDTU200 
MP160 für Windows - AnalysesystemMP160WSW 
MouseOx Plus 120V MOX-120V; 015000 
Druckkissen TSD110 
GelfoamPfizer9031508Resorbierbarer Gelatineschwamm
Gehärtete feine SchereFine Science Tools14090-11Zwei Paare; Edelstahl, scharfscharfe
Spitzen, gerade Spitze, 26 mm
Schneide, 11 cm Länge
Mensch/Maus Myeloperoxidase/MPO AntikörperR& D SystemsAF3667
HeißperlensterilisatorFine Science Tools18000-45Schalten Sie ca. 30 min
vor Gebrauch ein; sterilisieren Sie Werkzeuge bei >200
&/de; C für 30 s
Imaris Bitplanewww.bitplane.com
Immersionsmedium Immersol W 2010Zeiss444969-0000-000 
Insulinspritzen mit BD Ultrafeine Nadel 6mm x 31G 1 mL/ccBD324912
Isofluran (Fluriso)VetOne502017
Lycopersicon Esculentum (Tomate) Lectin (UEG, TL), DyLight® 594Vector Laboratories DL-1177-1
LysM-eGFP Mäusewww.mmrrc.org012039-MU
Mikro-PräparierzangeRobozRS-5135gezahnt, leicht gebogen, 0,8 mm Spitzenbreite; 4" Länge
Mikro-PräparierzangeRobozRS-51531 x 2 Zähne, leicht gebogen, 0,8 mm Spitze
Breite, 4" Länge
MTS MiniBionix II 808MTS SystemsServohydraulische Materialprüfmaschine
Neutrophil Elastase 680 FAST SondePerkinElmerNEV11169
NitrogenGeneral Welding Supply Corp.
OxygenGeneral Welding Supply Corp.
Polymilchsäure FilamentHatchbox1,75 mm Durchmesser
ProLong Diamond Antifade EindeckmittelInvitrogenP36970
Puralube AugensalbeDechra NDC17033-211-38
Reflex 7 gewickelte ClipsRoboz SurgicalRS-9255
EdelstahlgitterFotofabEin Gitter hat einen Durchmesser von 0,200 Zoll und besteht aus insgesamt 52 einzelnen Rasterquadraten mit den Maßen 0,016 x 0,016 Zoll. Zwischen jedem Quadrat ist ein Abstand von 0,003 Zoll.  
Oberflächenbehandelte sterile GewebekulturplattenFisher ScientificFB012929Deckel als Aushärtungsfläche für die Bildgebung von Fenstern
TriM Scope Multiphotonenmikroskop LaVision BioTecDie Bildgebung wurde an einem aufrechten 2-Photonen-Mikroskop (Trimscope, LaVision BioTec) durchgeführt, das mit zwei Ti:Saphir-Lasern (Mai Tai und InSight, Spectra-Physics) und einem optisch-parametrischen Oszillator ausgestattet war. Die folgenden dichroitischen Langpass-Strahlteiler (Chroma) wurden verwendet, um das Signal auf vier Photomultipler-Röhren zu lenken:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond3M70200742529
VWR Mikro-DeckglasVWR48404-453
326895 Zweiteiliges rundes Deckglas mit , 8

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184(2020).
  3. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  4. Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
  5. Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
  6. Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
  7. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  8. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  9. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  10. Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917(2014).
  12. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818(2016).
  13. Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
  14. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088(2013).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562(2016).
  18. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).

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