Summary
Bu yazıda, akım sitometrisi kullanılarak tümör hücresi kaynaklı hücre dışı veziküllerin (EV'ler) in vivo immünojenisitesinin nasıl değerlendirileceği açıklanmaktadır. Tedaviye bağlı immünojenik hücre ölümü geçiren tümörlerden türetilen EV'ler, tümör immünosürveyansı ile özellikle ilgili görünmektedir. Bu protokol, oksaliplatin ile indüklenen immünostimülatör tümör EV'lerin değerlendirilmesini örneklemektedir, ancak çeşitli ortamlara uyarlanabilir.
Abstract
Kemoterapi veya ışınlamanın neden olduğu tümörlerin immünojenik hücre ölümü, tehlikeyle ilişkili moleküler paternleri serbest bırakarak ve tip I interferon üretimini indükleyerek tümöre özgü T hücresi yanıtlarını tetikleyebilir. Kontrol noktası inhibisyonu da dahil olmak üzere immünoterapiler, terapötik bir etki ortaya çıkarmak için öncelikle önceden var olan tümöre özgü T hücrelerine dayanır. Bu nedenle, immünojenik hücre ölümünü içsel bir anti-kanser aşısı olarak kullanan sinerjik terapötik yaklaşımlar yanıtlarını artırabilir. Bununla birlikte, tedaviye bağlı stres altındaki hücreler tarafından salınan immünojenik faktörlerin spektrumu, özellikle hücre dışı veziküller (EV'ler) ile ilgili olarak eksik karakterize olmaya devam etmektedir. EV'lerin, hemen hemen tüm hücrelerden yayılan nano ölçekli membranöz parçacıkların, hücreler arası iletişimi kolaylaştırdığı düşünülmektedir ve kanserde, tümör antijenlerine karşı çapraz astarlamaya aracılık ettiği gösterilmiştir. Çeşitli koşullar altında tümörlerden türetilen EV'lerin immünojenik etkisini değerlendirmek için uyarlanabilir, ölçeklenebilir ve geçerli yöntemler aranmaktadır. Bu nedenle, burada EV'lerin in vivo immünojenisitesini değerlendirmek için nispeten kolay ve sağlam bir yaklaşım sunulmaktadır. Protokol, farelerin EV'lerle in vivo immünizasyonundan sonra, tedavi veya kararlı durum koşulları altında tümör hücre kültürlerinden çökeltme bazlı tahlillerle izole edilen dalak T hücrelerinin akış sitometrisi analizine dayanmaktadır. Örneğin, bu çalışma, B16-OVA murin melanom hücrelerinin oksaliplatin maruziyetinin, tümör-reaktif sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonuna aracılık edebilecek immünojenik EV'lerin salınımıyla sonuçlandığını göstermektedir. Bu nedenle, EV'lerin in vivo immünizasyon ve akış sitometrisi yoluyla taranması, immünojenik EV'lerin ortaya çıkabileceği koşulları tanımlar. İmmünojenik EV salınımının koşullarını belirlemek, EV'lerin kansere karşı terapötik etkinliğini test etmek ve sonuçta EV'lerin kanser immünolojisindeki rolüne dair yeni bilgiler ortaya çıkarmak için altta yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için önemli bir ön koşul sağlar.
Introduction
Bağışıklık sistemi, hem bağışıklık kontrol noktası inhibisyonu tarafından kışkırtıldığında hem de geleneksel kanser tedavilerinin etkinliği için kansere karşı mücadelede çok önemli bir rol oynar. Kemoterapötik ajanlar oksaliplatin ve doksorubisin gibi genotoksik tedavilere yenik düşen tümör hücreleri veya iyonlaştırıcı radyasyon tedavisi, potansiyel olarak adaptif bir anti-tümör immün yanıtı başlatan antijenleri ve tehlikeyle ilişkili moleküler paternleri (DAMP'ler) serbest bırakabilir1. İmmünojenik hücre ölümü bağlamında en belirgin DAMP'ler, kemotaktik ATP gibi beni bul sinyallerini, antijen sunan hücreler tarafından tümör hücresi alımını teşvik eden calreticulin maruziyeti gibi yeme-beni sinyalleri ve desen tanıma reseptörlerini aktive eden HMGB1'in salınımını içerir. Ayrıca, tümör kaynaklı immünojenik nükleik asitler veya diğer uyaranlar yoluyla indüklenen tip I interferonlar (IFN-I), dendritik hücreler tarafından algılanır ve tümöre özgü sitotoksik T hücrelerini etkili bir şekilde astarlamalarını sağlar3,4. Klinik olarak, tümöre sızan aktive ve proliferasyon CD8 + T hücreleri, birçok kanser hastasında uzun süreli sağkalım için bağımsız bir prognostik faktör sağlar. Bu tür aktive edilmiş T hücrelerinden salınan IFN-γ, kanser hücreleri üzerinde doğrudan antiproliferatif etkilere aracılık eder ve Th1 polarizasyonunu ve sitotoksik T hücresi farklılaşmasını yönlendirir, böylece kansere karşı etkili immünossürveyana katkıda bulunur5,6. Oksaliplatin, kansere karşı bu tür adaptif immün yanıta aracılık eden iyi niyetli bir immünojenik hücre ölümü indükleyicisidir7. Bununla birlikte, tedaviye bağlı stres altında tümör hücreleri tarafından salınan ilk immünojenik sinyallerin bolluğu tam olarak ortaya çıkarılmaya devam etmektedir. Kanser immünoterapisindeki önemli ilerlemelere rağmen, faydalarını hastaların daha büyük bir kısmına genişletmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. T hücresi aktivasyonunu başlatan immünojenik sinyallerin daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılması, yeni tedavilerin geliştirilmesine rehberlik edebilir.
Hücre dışı veziküller (EV'ler) olarak bilinen membranla çevrili heterojen bir yapı grubu, hücreler arası iletişim cihazları olarak hizmet ediyor gibi görünmektedir. Hemen hemen tüm hücre tipleri tarafından yayılan EV'ler, fonksiyonel proteinleri, RNA'yı, DNA'yı ve diğer molekülleri bir alıcı hücreye taşır veya sadece hücre yüzeyindeki reseptörlere bağlanarak bir hücrenin fonksiyonel durumunu değiştirebilir. Biyolojik olarak aktif kargoları, üreten hücrenin türüne ve fonksiyonel durumuna göre önemli ölçüde değişir8. Kanser immünolojisinde, tümör hücrelerinden salınan EV'ler ağırlıklı olarak immünoterapiye düşman olarak kabul edilmiştir, çünkü sonunda invaziv büyümeyi teşvik eder, metastatik nişleri önceden şekillendirir9 ve bağışıklık tepkisini baskılar10. Buna karşılık, bazı çalışmalar EV'lerin etkili çapraz sunum için tümör antijenlerini dendritik hücrelere aktarabildiğini göstermiştir11,12. EV'ler, tedaviye bağlı stres altında ortaya çıktıkları takdirde immünostimülatör nükleik asitler sağlayabilir ve anti-tümör immün yanıtını kolaylaştırır13,14. Tümör mikroortamında bu tür RNA ve DNA'dan gelen immün ligandların algılanmasının son zamanlarda kontrol noktası blokajına duyarlılığı önemli ölçüde modüle ettiği gösterilmiştir15,16,17. Bu nedenle, farklı tedaviye bağlı stres altında tümör hücreleri tarafından salınan EV'lerin immünojenik rolünün daha da açıklığa kavuşturulması gerekmektedir. EV'ler genç ama büyüyen bir araştırma alanı oluşturduğundan, yöntemlerin standardizasyonu hala devam etmektedir. Bu nedenle, EV'ler ve kanser immünolojisi arasındaki etkileşimler üzerine araştırma tekrarlanabilirliğini geliştirmek için bilgi paylaşımı esastır. Bunu akılda tutarak, bu makale tümör kaynaklı EV'lerin immünojenik etkisini in vivo olarak değerlendirmek için basit bir protokolü açıklamaktadır.
Bu değerlendirme, tümör kaynaklı EV'ler üreterek, alıcı fareleri bu EV'lerle bağışıklayarak ve dalak T hücrelerini akış sitometrisi ile analiz ederek gerçekleştirilir. EV üretimi, murin tümör hücrelerinin EV'siz bir hücre kültürü ortamında yüksek derecede saflık için tohumlanmasıyla ideal olarak gerçekleştirilir. Hücreler, tedaviye bağlı EV'lerin etkisini, ilgili tümör kaynaklı EV'lerin temel immünojenisitesine karşı karşılaştırmak için kemoterapi gibi spesifik bir hücre stres uyaranı ile tedavi edilir. EV'lerin izolasyonu, in vivo uygulanabilirliğe ve yerel mevcudiyete göre seçilmesi gereken çeşitli tekniklerle iyi bir şekilde gerçekleştirilebilir. Aşağıdaki protokol, EV saflaştırması için ticari bir kit ile çökeltme bazlı bir tahlili açıklamaktadır. Fareler bu EV'lerle iki kez aşılanır. İlk enjeksiyondan on dört gün sonra, T hücreleri dalaktan çıkarılır ve sistemik bir bağışıklık tepkisini değerlendirmek için akış sitometrisi yoluyla IFN-γ üretimi için analiz edilir. Bununla birlikte, farklı terapötik rejimler altında ortaya çıkan tümör kaynaklı EV'lerin anti-tümör T hücresi yanıtlarını indükleme potansiyeli nispeten kolay, hızlı ve yüksek geçerlilikle değerlendirilir13. Bu nedenle, bu yöntem çeşitli koşullar altında kanser hücrelerinden türetilen EV'lerin immünolojik taraması için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneylerin başlangıcında, fareler en az 6 haftalıktı ve spesifik patojensiz koşullar altında tutuldu. Bu protokol, Kurumsal etik standartlara ve geçerli yerel düzenlemelere uygundur. Hayvan çalışmaları yerel düzenleyici kurum (Regierung von Oberbayern, Münih, Almanya) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmalarda cinsiyetle ilgili olası önyargılar araştırılmamıştır.
1. Kemoterapiye maruz kaldıktan sonra tümör hücrelerinden elde edilen EV'lerin üretimi ve izolasyonu
- Kültür murin B16 melanom hücreleri DMEM'de (4 mM L-glutamin ve 4.5 g / L D-glikoz içeren) eksprese eden ve FCS (% 10 v / v), penisilin (100 Ünite / mL) ve streptomisin (100 μg / mL) ile desteklenmiş 37 ° C'de, hücreler istikrarlı bir şekilde büyüyene ve yaklaşık% 90 birleşene kadar.
NOT: Protokolün bu bölümünü, bir hücre kültürü başlığı kullanarak tamamen steril koşullar altında gerçekleştirin. Diğer kanser varlıklarının analizi için, güçlü bir antijen eksprese eden hücre hatları, spesifik ex vivo antijen restirasyonuna izin verdikleri için antijene özgü T hücresi yanıtlarını değerlendirmek için tercih edilir. - EV üretimi için gerekli hücre kültürü ortamını hazırlamak için, FCS içindeki sığır EV'lerini, 4 ° C'de 24 saat boyunca 100.000 x g'de ultrasantrifüjleme ile tüketin ve ardından peleti atın. Alternatif olarak, önceden hayvan EV'lerinde düşük bir ticari preparat seçin.
- B16-OVA hücrelerini hasat edin ve PBS'de iki kez yıkayın ve daha sonra EV-tükenmiş ortamda 400.000 hücre / mL konsantrasyonunda tohumlayın.
NOT: Hücre konsantrasyonunu, incelenen hücre hattının büyüme dinamiğine uyarlayın, böylece hücreler aşırı büyümez. - B16-OVA hücrelerini mL başına 30 μg oksaliplatin ekleyerek tedavi edin ve 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edin. Kontrol koşullarını tedavi edilmeden bırakın. Genotoksik bir maddenin ilk kullanımında, tripan mavisi dışlama gibi hücre canlılığı testlerini kullanarak istenen sitotoksik etkinliği titre edin18.
NOT: Bu tahlil, kemoterapötiklerin yanı sıra diğer bağışıklık modüle edici maddelerle veya iyonlaştırıcı ışınlamayla tedavi edilen hücre kültürlerinde üretilen EV'leri de değerlendirebilir.
DİKKAT: Oksaliplatin cilde ve ciddi göz tahrişine neden olur ve alerjik cilt reaksiyonuna ve solunum tahrişine neden olabilir. Oksaliplatinin kansere neden olduğundan şüphelenilmektedir. Bir önlem olarak, yeterli eldiven, gözlük, maske ve giysiler de dahil olmak üzere yeniden kullanmadan önce temizlenmiş kişisel koruyucu ekipman kullanın. Solumaktan kaçının ve kullandıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın. Çevreye salınımdan kaçının ve oksaliplatini geçerli düzenlemelere göre atın. Güvenlik bilgi formundan ayrıntılı bilgi edinin. - Hücre kültürü süpernatan toplayın. Önce 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj, daha sonra 4 °C'de 30 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüj, her seferinde peleti atın. Son olarak, 220 nm PVDF membrandan süzün. Herhangi bir hücre kalıntılarını çıkarmak için her adım için taze bir tüp kullanın.
NOT: Bu aşamada, EV içeren süpernatant, protokole devam etmeden önce bir gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Bununla birlikte, derhal EV saflaştırma ile açıklanan programa uyulması şiddetle tavsiye edilir. - 1 mL süpernatantı 0,5 mL'lik ticari olarak temin edilebilen belirli bir eksozom izolasyon reaktifi ile karıştırın (bakınız Malzeme Tablosu) V şeklinde 1,5 mL'lik bir tüpte. Homojen bir çözelti oluşturmak için yukarı ve aşağı iyice pipet veya vorteks yapın. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- 4 °C'de 60 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj. Süper natantı dikkatlice atın. Kalan damlaları, 1,5 mL'lik tüpü bir kağıt havlu üzerinde baş aşağı dokundurarak ve alttaki EV-peletine dokunmadan ince uçlu bir pipetten aspirasyon yaparak çıkarın.
- EV-peletinin kontrolsüz seyreltilmesini önlemek için tüm sıvıları iyice çıkarın. Ayrıca, peletin kurumasını önlemek için bu görevleri hızlı bir şekilde yerine getirin.
- EV'leri soğuk PBS'de, peleti tüpün duvarından ucuyla çizmeden yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın. Şimdi, EV'leri bir araya getirmek için süspansiyonu ilk tüpten son tüpe adım adım aktarın.
NOT: Tüp sayısı ile çarpımına 5 μL'ye eşit bir PBS hacmi kullanın. Son süspansiyonun 5 μL'si, kemoterapi altında veya kararlı bir durumda 400.000 hücreden salınan izole EV'leri içerir. - Tercihen, EV'leri doğrudan kullanın. Bu mümkün değilse, EV süspansiyonlarını uygulamaya kadar 28 güne kadar silikonize kaplarda -80 ° C'de saklayın.
NOT: Burada ve diğer bazı yayınlarda açıklanan EV'ler, bu süre zarfında -80 ° C'de saklandıklarında biyolojik işlevlerini kaybetmezler19. - EV izolatlarını MISEV2018 yönergelerine göre ölçün ve karakterize edin20.
NOT: Niceleme için olası yöntemler arasında nanopartikül izleme analizi (NTA)21 ve EV'nin membrana bağlı proteinlerinin tespiti22 bulunmaktadır. EV'leri daha da karakterize etmek için olası yaklaşımlar arasında elektron mikroskobu23 ve batı blot20 bulunur.
2. Farelerin EV'lerle bağışıklanması
- Sırasıyla tedavi edilen hücrelerden, tedavi edilmemiş hücrelerden ve PBS'den (araç) türetilen EV'leri alan tedavi grupları da dahil olmak üzere C57BL / 6 fareleri (veya tümör hücre hattına karşılık gelen diğer sinjenik fareler) ile in vivo deneyi planlayın.
NOT: Tercihen, fizyolojik yaşlanmanın bağışıklık tepkisini azaltmasını önlemek için 6-8 haftalıkken fareler kullanın24. - 4.0 x 105 B16-OVA hücrelerinden izole edilmiş EV'lerle bağışıklamak için ilgili tedavi grubundaki her fare için 5 μL EV-süspansiyonunu 55 μL soğuk PBS ile karıştırın.
NOT: Bu miktarda EV, nanopartikül izleme analizi ile ölçülen yaklaşık 2 x 109 parçacığa karşılık gelir (veriler gösterilmemiştir). Bir adjuvan (örneğin, LPS) ile karıştırılmış OVA proteini, güçlü bir aşı pozitif kontrolü olarak uygulanabilir.- Şırıngaları (iğne boyutu 26-30 G) sırasıyla 60 μL seyreltilmiş EV'ler veya PBS ile doldurun ve hemen buza koyun.
NOT: Protokolde, enjekte edilen EV'lerin miktarı, oksaliplatinin tümör hücresi EV biyogenezi üzerindeki hem kalitatif hem de kantitatif etkilerini deneysel olarak değerlendirmek için EV salgılayan tümör hücrelerinin sayısına normalleştirilmiştir. Bazı okuyucular için, üretilen EV'lerin belirli bir konsantrasyonuna normalleşme, bilimsel sorularına bağlı olarak deneysel kurulumlarına daha iyi uyabilir.
- Şırıngaları (iğne boyutu 26-30 G) sırasıyla 60 μL seyreltilmiş EV'ler veya PBS ile doldurun ve hemen buza koyun.
- EV'leri veya PBS'yi deri altından farelerin uyluğunun medial yönüne aşılayın ve 7 gün sonra bağışıklamayı tekrarlayın. İlk tedaviden on dört gün sonra, bağışıklık tepkisini analiz etmek için fareleri feda edin, örneğin servikal çıkık ile.
NOT: Yerel standartlara göre alternatif deri altı enjeksiyon yolları kullanılabilir.
3. Dalak T hücrelerinin akış sitometri analizi
- RPMI-1640'ı FCS (% 10 v / v), penisilin (100 Birim / mL), streptomisin (100 μg / mL), L-glutamin (2 mM) ve β-merkaptoetanol (50 μM) ile tamamlayan tam RPMI (cRPMI) hazırlayın ve soğutun.
- Dalağı açılan karın boşluğundan rezeke edin. Dalağı nemlendirilmiş bir 100 μm hücre süzgeci ve bir şırınganın plastik pistonu ile ezin ve dalak hücrelerini 5-10 mL cRPMI ile 50 mL'lik bir tüpe yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
NOT: Hücreleri mümkün olduğunca buz üzerinde tutun. Dalak immün yanıtından ziyade lokal immün yanıtı analiz etmek için, aynı protokolü izleyerek drenaj popliteal ve inguinal lenf düğümlerini rezeke edin. Bu durumda, eritrositlerin lizisi için bir sonraki adımı atlayın. - Eritrositleri hücre süspansiyonundan çıkarmak için, peleti 2 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile yeniden askıya alın ( bakınız Malzeme Tablosu) ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Ardından, cRPMI ekleyerek tepkiyi durdurun. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
- Tohumlama için, hücre peletini cRPMI'de yeniden askıya alın ve hücreleri, U şeklinde bir tabana sahip 96 delikli bir plaka kullanarak, 200 μL cRPMI ile 200.000 hücrenin üçlüsünü her bir kuyucuğa yerleştirmek için sayın. 37 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Aktif T hücrelerinin antijen özgüllüğünü ele almak için, sırasıyla 1 μg / mL çözünür ovalbümin (veya incelenen hücre hattına karşılık gelen başka bir tümör antijeni) ekleyin veya ek uyaran olmadan bırakın. Tam uzunlukta ovalbümin yerine bağışıklık baskın peptid epitopu SIINFEKL'in eklenmesi, daha kısa bir kuluçka süresine izin verir. Akış sitometrisinin yanı sıra, farelerin serumu ve 48 saatlik inkübasyondan sonra hücre kültürü süpernatantı çeşitli sitokinler için analiz edilebilir. - 48 saat sonra, diğerlerinin yanı sıra, proteinlerin Golgi aracılı sekresyonunu bloke ederek hücre içi IFN-γ boyamasını arttırmak için, hücre kültürüne Brefeldin A (5 ng / mL), PMA (20 ng / mL) ve İyonomisin (1 μg / mL) ekleyin. 37 °C'de 4 saat inkübe edin.
- Yüzey biyobelirteçlerini boyamadan önce, V şeklinde bir tabana sahip 96 delikli bir plakaya aktarın ve PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, yüzey biyobelirteçlerine, CD3, CD8 ve CD4'e (bkz. Malzeme Tablosu) yönlendirilmiş, yerel olarak mevcut akış sitometresi ile uyumlu, 1:400 seyreltilmiş floresan antikorları ve PBS'de 1:1.000 seyreltilmiş sabitlenebilir bir canlılık boyası ekleyin. Pelet edilmiş plenositleri boyama çözeltisinde yeniden askıya alın ve ışıktan korunarak 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- fiksasyonu ve geçirgenliği için, FACS-tamponunda (PBS artı% 3 v / v FCS ) iki kez yıkayın ve daha sonra kuyu başına 100 μL fiksasyon/geçirgenlik tamponunda (bkz. Işıktan korunarak 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Hücre içi IFN-γ boyanması için, plenositleri fiksasyon/permeabilizasyon tamponunda yıkayın ve tamponda 1:200 seyreltilmiş IFN-γ karşı floresan antikorlarla yeniden askıya alın. Işıktan korunarak 4 °C'de en az 1 saat (maksimum 12 saate kadar) inkübe edin.
- Numuneleri akış sitometrisi ile ölçmeden önce, plenositleri fiksasyon/permeabilizasyon tamponunda iki kez yıkayın ve FACS-tamponunda yeniden askıya alın. Sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonunu Şekil 2'de gösterilen geçit stratejisine göre analiz edin.
- İlk olarak, tek hücreleri tespit etmek için FSC-H'yi FSC-A'ya karşı lekeleyin. Daha sonra, lenfoid hücreleri tespit etmek için, SSC'yi FSC-A'ya karşı lekeleyin. Daha sonra, canlı CD3 +, CD4-, CD8 + hücrelerini seçin ve dalaktaki sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonunu ölçmek için IFN γ üreten alt kümelerini belirleyin.
NOT: Negatif teknik kontrol olarak IFN-γ karşı hedeflenen florokrom hariç tüm florokromlarla birlikte bir Floresan-eksi-bir (FMO) boyası ekleyin.
- İlk olarak, tek hücreleri tespit etmek için FSC-H'yi FSC-A'ya karşı lekeleyin. Daha sonra, lenfoid hücreleri tespit etmek için, SSC'yi FSC-A'ya karşı lekeleyin. Daha sonra, canlı CD3 +, CD4-, CD8 + hücrelerini seçin ve dalaktaki sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonunu ölçmek için IFN γ üreten alt kümelerini belirleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, tümör kaynaklı EV'lerin immünojenisitesinin basit ve kolay tekrarlanabilir değerlendirmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Bu sayede fareler, model antijen tavuk ovalbümini (OVA) eksprese eden tümör hücrelerinin in vitro kültürlerinden türetilen EV'lerle aşılanır. Sonraki immün yanıt, dalak T hücrelerinde akış sitometrisi ile analiz edilir.
Şekil 1 , tüm protokolün pratik adımlarına genel bir bakış sunmaktadır. Çalışma immünojenik hücre ölümü, çapraz sunum ve EV-indüklenen anti-tümör bağışıklığına odaklandığından, bu protokol CD8 + sitotoksik T hücrelerinin işlevi ile sınırlıdır. Şekil 2'de gösterildiği gibi, hücreler tek hücreler, lenfosit alt kümesi (boyut ve granülerliğe göre), canlı hücreler (bir yaşam / ölü belirteci hariç) ve CD3 + CD4 - CD8 + sitotoksik T hücreleri olarak kapatılmıştır. IFN-γ hücre içi birikimi aktivasyon için vekil belirteç olarak değerlendirildi. T hücre farklılaşması ve tükenmesi ile ilgili olası ek belirteçler aşağıda tartışılmıştır.
Burada açıklanan yöntem kullanılarak, fareler, kararlı durum (tedavi edilmemiş) veya genotoksik stres koşulları (oksaliplatin ile tedavi edilmiş) altında kültürlenmiş OVA eksprese eden tümör hücrelerinden türetilen EV'lerle bağışıklandı. Sadece genotoksik stres koşulları altında tümör hücrelerinden türetilen EV'lerle enjekte edilen fareler, alıcı hayvanlarda dalak sitotoksik T hücrelerinin güçlü aktivasyonunu indükledi (Şekil 3A). Kararlı durum koşulları altında tümörlerden türetilen EV'lerin enjeksiyonu, bazı T hücresi aktivasyonu ile sonuçlandı, ancak bu, PBS aracına enjekte edilen farelerde T hücresi aktivasyonundan önemli ölçüde farklı değildi. Bu veriler, genotoksik stres altında, tümör hücrelerinin güçlü immünojenik EV'leri serbest bırakabileceğini göstermektedir. IFN-γ üretimi, tümör EV ile tedavi edilen hayvanların plenositleri, analizden önce model tümör antijeni OVA ile ex vivo olarak yeniden uyarıldığında özellikle artmıştır (Şekil 3B). Bu veriler, tümör kaynaklı EV'lerin tümör antijenine özgü bağışıklık tepkilerini indükleyebileceğini düşündürmektedir. İlginçtir ki, IFN-γ-üretimi - çok daha az ölçüde olsa da - antijene özgü yeniden uyarılma yokluğunda da tespit edilir. Muhtemelen, farklılaşma antijeni TRP225 gibi melanom ile ilişkili diğer antijenler, EV'nin neden olduğu T hücresi yanıtının bir kısmı tarafından hedeflenebilir.
Şekil 1: Protokole piktografik genel bakış . (A) Kemoterapiye benzeyen tümör hücre kültürlerinde üretilen EV'lerin izolasyon prosedürü. (B) Farelerin EV'lerle aşılanması için program. (C) Sitotoksik T hücrelerinin akış sitometri analizi için boyama protokolü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Dalaktaki sitotoksik T hücre aktivasyonunu analiz etmek için akış sitometrisi geçit stratejisi. Sayılar, ilgili ana popülasyonunun yüzdesini temsil eder. FSC-A: ileri dağılım alanı; FSC-H: ileri saçılma yüksekliği; SSC: yana doğru dağılım; canlı/ölü: hücre ölüm belirteci. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Genotoksik stres altındaki tümör hücrelerinden türetilen EV'ler, alıcı hayvanlarda antijene özgü T hücresi yanıtlarını indükleyebilir. (A) Fareler, kararlı durum (tedavi edilmemiş) veya genotoksik stres koşulları (oksaliplatin ile tedavi edilmiş) altında kültürlenmiş tümör hücrelerinden türetilen EV'lerle bağışıklanmıştır. Araç (PBS) enjeksiyonları negatif kontrol olarak kullanıldı. EV immünizasyonu üzerine dalaktaki sitotoksik T hücreleri tarafından IFN-γ üretimi belirlendi. Bununla, dalak hücre süspansiyonları analizden önce ovalbumin ex vivo ile yeniden uyarıldı. (B) Fareler, yukarıda tarif edildiği gibi genotoksik stres koşulları altında tümör hücrelerinden türetilen EV'lerle tedavi edildi. Eplenik T hücre aktivasyonu, ex vivo restimüle sonrası ovalbümin varlığında veya yokluğunda belirlendi. Çubuklar grup başına ortalamayı gösterir ve standart hatasını bıyıklar. Bonferroni sontesti ile tek yönlü varyans analizi (ANOVA) testi, bir veri kümesinin çoklu istatistiksel karşılaştırmaları için kullanılmıştır. Anlamlılık düzeyi P < 0.05, P < 0.01 ve P < 0.001 olarak belirlenmiştir ve burada yıldız işaretleriyle (*, ** ve ***) belirtilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, kemoterapiye bağlı stres altında melanom hücrelerinden türetilen EV'lerin immünolojik in vivo bir değerlendirmesini sağlarken, çeşitli tedaviler altında çeşitli kanserlerden yayılan EV'lere uyum sağlar. Örneğin, oksaliplatin ile tedavi edilen B16-OVA hücrelerinden türetilen EV'lerle farelerin bağışıklanması, dalaktaki IFN γ üreten CD8 + T hücrelerini genişletir, bunlar da ovalbümin ile ex vivo inkübasyon ile daha da uyarılır ve tümöre özgü bir bağışıklık tepkisini gösterir. Bu nedenle, bu protokol aracılığıyla tarama yoluyla immünojenik EV'lerin saptanması, geleneksel kanser tedavilerinin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırır ve EV'lerin kanser immünolojisindeki rolüne odaklanmış bir araştırma yapılmasını sağlar.
Not olarak, EV'lerle yapılan deneyler bazı özel hususlar gerektirir. Bu protokolde, EV'ler 24 saat içinde salınan tümör hücrelerinin sayısına yarı kantitatif olarak normalleştirilir. Bu yaklaşım, salınan EV'lerin kalitesindeki veya miktarındaki değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığına bakılmaksızın, gelişmiş immünojeniteyi tanımlama amacını yansıtmaktadır. Bu nedenle, tekrarlanabilir in vivo sonuçlar, EV'lerin sürekli izolasyon etkinliğine dayanır. Bu amaçla, kurumayı önlemek için EV peletlerinin tamamen ve derhal yeniden askıya alınmasını sağlamak kritik bir adımdır.
Ek olarak, EV'ler, örneğin nanopartikül izleme analizi ve kanonik transmembran, luminal ve en az bir negatif EV-marker20'nin batı lekesi ile nicelleştirilmeli ve karakterize edilmelidir. EV'lerin sabit olmayan izolasyon kontrollerini ölçmesi ve karakterize etmesi ve EV'lerdeki veya EV alt kümelerindeki nicel farklılıkları ele alır. Bu tip EV karakterizasyonu, Uluslararası Hücre Dışı Veziküller Derneği (ISEV) kılavuzlarına göre, hücre dışı veziküllerle ilgili çalışmalarda bildirilmesi gereken minimum bilginin bir parçasını oluşturur. Bununla birlikte, çeşitli karakterizasyon yöntemleri eşit derecede meşrudur ve yerel mevcudiyet ve bireysel araştırma sorusu ile ilgili olarak seçilmelidir. Özellikle, ilgilenilen bir maddenin dozajının tanımlanması veya iyonlaştırıcı ışınlama, protokolün yeterli düzeyde hücre ölümüne ulaşmak için deneysel doğrulama gerektirebilecek bir başka kritik adımını oluşturur.
Genel olarak, izole EV'lerin tedavi maddesi, çözünür proteinler ve lipoproteinler ile potansiyel kontaminasyonu göz önünde bulundurulmalıdır. Bu bağlamda bir strateji, deneyin aynı tip kontaminasyonun20 ödün vermeyebileceği tamamlayıcı EV-izolasyon teknikleriyle çoğaltılmasından ibarettir. Örneğin, immünoaffinite, EV'leri tamamen yağış bazlı yöntemlerden daha düşük verim ancak daha yüksek özgüllükle izole eder ve bu konuda uygun bir kontrol sağlayabilir26. Alternatif bir yaklaşım, vahşi tip hücre kaynaklı EV'leri, genetiği değiştirilmiş hücrelerden izolasyonlarla, EV biyogenezinde yer alan genlerin spesifik bir silinmesiyle karşılaştırmak veya EV'lerin emisyonunu azaltan maddeleri dağıtmaktır20.
Bu protokolden elde edilen sonuçlar, EV aracılı immün yanıtın daha kapsamlı bir karakterizasyonu ile tamamlanmalıdır. Özellikle CD8+ T hücrelerinin CD4427 aracılığıyla efektör ve efektör bellek hücrelerine, ayrıca CD62L28 aracılığıyla antijen-naif ve merkezi bellek hücrelerine sınıflandırılması daha derin bir içgörü sağlayabilir. Ayrıca, T yardımcı hücrelerinin, düzenleyici T hücrelerinin ve NK hücrelerinin analizi ilgi çekici olabilir. EV'lerin anti-tümör etkinliğini test etmek için, farelere EV bağışıklaması yapıldıktan sonra karşılık gelen kanser hücreleri ile meydan okunabilir veya önceden belirlenmiş bir kansere karşı EV'lerle tedavi edilebilir, böylece immünojenik hücre ölümünün tespiti için kılavuzlar2,29 bu hücresiz tümör türevine uyarlanabilir. Bununla birlikte, tüm bu deneysel kurulumlardan elde edilen sonuçlar, bir Petri kabındaki kanser hücrelerinin, genellikle anti-kanser bağışıklığını baskılayan dinamik bir tümör mikroçevresine30 gömülü kanser hücrelerinden işlevsel olarak farklı EV'ler üretmesi gerçeğiyle sınırlıdır. Bu nedenle, tümör / fibroblast kokültürlerinden veya ex vivo tümör dokusundan türetilen EV'lerin değerlendirilmesi gerçek durumu daha iyi yansıtabilir. Klinik gerçekliğe doğru bir sonraki translasyonel adımda, hasta materyalinden EV'ler, biyobelirteçler olarak kullanılabilirliklerini değerlendirmek için tedaviden önce ve tedavi sırasında immünojenisite açısından analiz edilebilir.
Kanserden türetilmiş EV'lerin yakın zamanda - belirli koşullar altında - bağışıklık sistemini modüle ettiği tespit edildiğinden, klinik potansiyellerini keşfetme yolculuğu daha yeni başlamıştır31. İmmünojenik EV'ler tarafından ortaklaşa seçilen bağışıklık mekanizmalarının derinlemesine bir analizi için, yararlı araçlar, spesifik hücreler tarafından EV alımını görselleştiren floresan mikroskopisi, spesifik bağışıklık yolları için genetik eksiklikleri olan farelerin konuşlandırılması ve EV içeriğindeki moleküler değişiklikler için tarama yöntemlerini içerir. Nihayetinde, immünojenik tümör kaynaklı EV'lerin tanımlanması, burada açıklanan tarama yöntemleriyle, EV aracılı bağışıklığın arkasındaki altta yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlayacak ve bu nedenle kansere karşı potansiyellerini kullanmaya yönelik çok önemli bir adım oluşturacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 ve Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (H.P.'ye), DKMS Yaşam Verme Vakfı'ndan (H.P.'ye) bir Mechtild Harf Araştırma Bursu, Melanom Araştırma İttifakı (S.H.'ye) tarafından Genç Araştırmacı Ödülü, Else-Kröner-Fresenius-Stiftung tarafından verilen bir burs (F.S.'ye), Münih Teknik Üniversitesi tarafından bir Tohum Fonu (S.H.'ye) ve Wilhelm Sander Vakfı tarafından bir araştırma hibesi (2021.041.1, S.H.'ye). H. P., EMBO Genç Araştırmacı Programı tarafından desteklenmektedir.
YAZAR KATKILARI:
F.S., H.P. ve S.H. araştırmayı tasarladı, analiz etti ve sonuçları yorumladı. F.S. ve S.H. el yazmasını yazdı. H.P. ve S.H. çalışmaya rehberlik etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Clone 17A2 |
| Anti-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | Clone GK1.5 |
| Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Clone 53-6.7 |
| Anti-IFNγ PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
| Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
| Cell Strainer, 100 µm | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 µm |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM) |
| FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Calf Serum (FCS) |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | Fixation/Permeabilization Concentrate (10x) |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | 407952 | From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-032 | L-Glutamine (200 mM) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1 |
| Oxaliplatin | Pharmacy of MRI hospital | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 1514-122 | Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL) |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC) |
| PVDF filter, 0,22 µm, for syringes | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES |
| Syringe, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm) |
| Total Exosome Isolation Reagent | Invitrogen | 4478359 | For isolation from cell culture media |
| β-Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β-Mercaptoethanol (50 mM) |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).
- Kepp, O., et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death. Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).
- Fuertes, M. B., et al. Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).
- Sistigu, A., et al. Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy. Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Shankaran, V., et al. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).
- Tesniere, A., et al. Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin. Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Zomer, A., van Rheenen, J. Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications. Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).
- Whiteside, T. L. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).
- Wolfers, J., et al. Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming. Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).
- Zeelenberg, I. S., et al. Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses. Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).
- Diamond, J. M., et al. Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs. Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).
- Kitai, Y., et al. DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity. Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).
- Heidegger, S., et al. RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade. Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).
- Schadt, L., et al. Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity. Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).
- Cheng, Y., et al. In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).
- Yuana, Y., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice. European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).
- Bloom, M. B., et al. Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma. The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation. The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).
- Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes. PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).
- Bek, S., et al. Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines. Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).
- Nabet, B. Y., et al. Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer. Cell. 170 (2), 352-366 (2017).
- Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).
