Im lebenden Organismus Immunogenitätsscreening von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln durch Durchflusszytometrie von Milz-T-Zellen

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt, wie die In-vivo-Immunogenität von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie beurteilt werden kann. EVs, die von Tumoren stammen, die einem behandlungsinduzierten immunogenen Zelltod unterzogen werden, scheinen in der Tumorimmunüberwachung besonders relevant zu sein. Dieses Protokoll veranschaulicht die Beurteilung von Oxaliplatin-induzierten immunstimulierenden Tumor-EVs, kann aber an verschiedene Einstellungen angepasst werden.

Zusammenfassung

Der durch Chemotherapie oder Bestrahlung verursachte immunogene Zelltod von Tumoren kann tumorspezifische T-Zell-Reaktionen auslösen, indem er gefahrenassoziierte molekulare Muster freisetzt und die Produktion von Typ-I-Interferon induziert. Immuntherapien, einschließlich der Checkpoint-Hemmung, sind in erster Linie auf bereits vorhandene tumorspezifische T-Zellen angewiesen, um eine therapeutische Wirkung zu entfalten. Daher können synergistische Therapieansätze, die den immunogenen Zelltod als intrinsischen Krebsimpfstoff nutzen, ihre Reaktionsfähigkeit verbessern. Das Spektrum immunogener Faktoren, die von Zellen unter therapieinduziertem Stress freigesetzt werden, bleibt jedoch unvollständig charakterisiert, insbesondere in Bezug auf extrazelluläre Vesikel (EVs). EVs, nanoskalige membranöse Partikel, die von praktisch allen Zellen emittiert werden, sollen die interzelluläre Kommunikation erleichtern und bei Krebs nachweislich Cross-Priming gegen Tumorantigene vermitteln. Um die immunogene Wirkung von EVs aus Tumoren unter verschiedenen Bedingungen zu beurteilen, werden anpassungsfähige, skalierbare und valide Methoden gesucht. Daher wird hierin ein relativ einfacher und robuster Ansatz zur Beurteilung der In-vivo-Immunogenität von Elektrofahrzeugen vorgestellt. Das Protokoll basiert auf der Durchflusszytometrie-Analyse von Milz-T-Zellen nach In-vivo-Immunisierung von Mäusen mit EVs, isoliert durch fällungsbasierte Assays aus Tumorzellkulturen unter Therapie oder stationären Bedingungen. Zum Beispiel zeigt diese Arbeit, dass die Oxaliplatin-Exposition von B16-OVA-murinen Melanomzellen zur Freisetzung immunogener EVs führte, die die Aktivierung tumorreaktiver zytotoxischer T-Zellen vermitteln können. Daher identifiziert das Screening von EVs durch In-vivo-Immunisierung und Durchflusszytometrie Bedingungen, unter denen immunogene EVs entstehen können. Die Identifizierung der Bedingungen der immunogenen EV-Freisetzung ist eine wesentliche Voraussetzung, um die therapeutische Wirksamkeit von EVs gegen Krebs zu testen und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erforschen, um letztendlich neue Erkenntnisse über die Rolle von EVs in der Krebsimmunologie zu gewinnen.

Einleitung

Das Immunsystem spielt eine zentrale Rolle im Kampf gegen Krebs, sowohl wenn es durch Immun-Checkpoint-Hemmung angeregt wird, als auch für die Wirksamkeit konventioneller Krebstherapien. Tumorzellen, die genotoxischen Therapien wie den Chemotherapeutika Oxaliplatin und Doxorubicin oder der ionisierenden Strahlenbehandlung erliegen, können Antigene und gefahrenassoziierte molekulare Muster (DAMPs) freisetzen, die möglicherweise eine adaptive Antitumor-Immunantwort ^auslösen1. Zu den bekanntesten DAMPs im Zusammenhang mit dem immunogenen Zelltod gehören Find-me-Signale wie chemotaktisches ATP, Eat-Me-Signale wie die Exposition von Calreticulin, da....

Protokoll

Zu Beginn der Experimente waren die Mäuse mindestens 6 Wochen alt und wurden unter bestimmten pathogenfreien Bedingungen gehalten. Das vorliegende Protokoll entspricht den institutionellen ethischen Standards und den geltenden lokalen Vorschriften. Tierversuche wurden von der örtlichen Zulassungsbehörde (Regierung von Oberbayern, München, Deutschland) genehmigt. Mögliche geschlechtsspezifische Verzerrungen wurden in diesen Studien nicht untersucht.

1. Erzeugung und Isolierung von EVs aus Tumorzellen nach Chemotherapie-Exposition

1. Kultur murine B16-Melanomzellen, die Ovalbumin (B16-OVA) in DMEM (mit 4 mM L-Glutamin und 4,5 g/L D-Glu....

Ergebnisse

Dieses Protokoll soll die einfache und leicht reproduzierbare Beurteilung der Immunogenität von tumorabgeleiteten EVs erleichtern. Dabei werden Mäuse mit EVs beimpft, die aus In-vitro-Kulturen von Tumorzellen gewonnen werden, die das Modellantigen Hühnerovalbumin (OVA) exprimieren. Die anschließende Immunantwort wird in Milz-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Abbildung 1 gibt einen Überblick über die praktischen Schritte des gesamt.......

Diskussion

Dieses Protokoll bietet eine immunologische In-vivo-Bewertung von EVs, die aus Melanomzellen unter chemotherapieinduziertem Stress gewonnen werden, während es sich an EVs anpasst, die von verschiedenen Krebsarten unter verschiedenen Behandlungen emittiert werden. Die Immunisierung von Mäusen mit EVs, die aus Oxaliplatin-behandelten B16-OVA-Zellen gewonnen werden, erweitert beispielsweise IFN-γ-produzierende CD8⁺ T-Zellen in der Milz, die durch Ex-vivo-Inkubation mit Ovalbumin weiter stimulier.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-CD3 FITC	Biolegend	100204	Klon 17A2
Anti-CD4 PacBlue	Biolegend	100428	Klon GK1.5
Anti-CD8 APC	Biolegend	100712	Klon 53-6.7
Anti-IFNγ PE	eBioscience	RM90022	Klon XMG1.2
Brefeldin A	Biolegend	420601	Brefeldin A Lösung (1.000x)
Zellsieb, 100 & Mikro; m	Greiner	542000	EASYstrainer 100 & micro; m
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Dulbecco's Modified Eagle's Medium mit D-Glucose (4,5 g/L) und L-Glutamin (4 mM)
FBS Good Forte	PAN BIOTECH	P40-47500	Fetal Calf Serum (FCS)
Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor 506	eBioscience, Abteilung Thermo Fischer Scientific	65-0866-14
Fixierungs-/Permeabilisierungskonzentrat	eBioscience	00-5123-43	Fixierungs-/Permeabilisierungskonzentrat (10x)
Fixierungs-/Permeabilisierungsverdünnungsmittel	eBioscience	00-5223-56
Ionomycin	Sigma-Aldrich	407952	aus Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC)
L-Glutamin	Gibco	25030-032	L-Glutamin (200 mM)
Ovalbumin	InvivoGen	vac-pova	Ovalbumin mit < 1 EU/mg Endotoxin - CAS 9006-59-1
Oxaliplatin	Apotheke des MRT-Krankenhauses
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid
Penicillin-Streptomycin	Gibco	1514-122	Mischung aus Penicillin (10.000 U/ml) und Streptomycin (10.000 ug/ml)
PMA	Sigma-Aldrich	P1585	Phorbol 12-Myristat-13-acetat, &ge 99% (HPLC)
PVDF-Filter, 0,22 & Mikro; m, für Spritzen	Merck Millipore	SLGV033RS	Millex-GV Filtereinheit 0,22 µ m Durapore PVDF Membran
Lysepuffer für rote Blutkörperchen	Invitrogen	00-4333-57
RPMI 1640	Thermo Fischer Scientific	11875	Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium mit D-Glucose (2,00 g/L) und L-Glutamin (300 mg/L), ohne HEPES-Spritze
, 26 g	BD Biosciences	305501	1 mL Sub-Q Spritzen mit Nadel (0,45 mm x 12,7 mm)
Reagenz zur vollständigen Exosomenisolierung	Invitrogen	4478359	Zur Isolierung aus Zellkulturmedien
β -Mercaptoethanol	Thermo Fischer Scientific	31350	β -Mercaptoethanol (50 mM)