Summary
В этой рукописи описывается, как оценить иммуногенность in vivo внеклеточных везикул опухолевых клеток (EV) с помощью проточной цитометрии. EV, полученные из опухолей, подвергающихся иммуногенной гибели клеток, вызванной лечением, кажутся особенно актуальными при иммунооперации опухолей. Этот протокол иллюстрирует оценку оксалиплатин-индуцированных иммуностимулирующих опухолевых EV, но может быть адаптирован к различным условиям.
Abstract
Иммуногенная гибель клеток опухолей, вызванная химиотерапией или облучением, может вызывать специфические для опухоли ответы Т-клеток, высвобождая связанные с опасностью молекулярные паттерны и индуцируя выработку интерферона I типа. Иммунотерапия, включая ингибирование контрольных точек, в первую очередь полагается на ранее существовавшие опухолеспецифические Т-клетки для раскрытия терапевтического эффекта. Таким образом, синергетические терапевтические подходы, которые используют иммуногенную гибель клеток в качестве внутренней противораковой вакцины, могут улучшить их реакцию. Однако спектр иммуногенных факторов, высвобождаемых клетками при стрессе, вызванном терапией, остается неполностью охарактеризованным, особенно в отношении внеклеточных везикул (EV). Считается, что EV, наноразмерные мембранные частицы, испускаемые практически из всех клеток, облегчают межклеточную связь и, при раке, опосредуют перекрестное праймирование против опухолевых антигенов. Для оценки иммуногенного эффекта EV, полученных из опухолей в различных условиях, ищутся адаптируемые, масштабируемые и валидные методы. Таким образом, в настоящем документе представлен относительно простой и надежный подход к оценке иммуногенности EV in vivo . Протокол основан на анализе проточной цитометрии селезеночных Т-клеток после иммунизации in vivo мышей EV, выделенных путем анализа на основе осаждения из культур опухолевых клеток в условиях терапии или стационарного состояния. Например, эта работа показывает, что воздействие оксалиплатина на клетки мышиной меланомы B16-OVA привело к высвобождению иммуногенных EV, которые могут опосредуть активацию опухолеспособных цитотоксических Т-клеток. Следовательно, скрининг EV с помощью иммунизации in vivo и проточной цитометрии выявляет условия, при которых могут возникать иммуногенные EV. Выявление условий иммуногенного высвобождения EV обеспечивает важную предпосылку для тестирования терапевтической эффективности EV против рака и изучения основных молекулярных механизмов, чтобы в конечном итоге раскрыть новое понимание роли EV в иммунологии рака.
Introduction
Иммунная система играет ключевую роль в борьбе с раком, как при инспирировании ингибирования иммунных контрольных точек, так и для эффективности традиционных методов лечения рака. Опухолевые клетки, поддающиеся генотоксической терапии, такой как химиотерапевтические агенты оксалиплатин и доксорубицин, или ионизирующее лучевое лечение, могут высвобождать антигены и связанные с опасностью молекулярные паттерны (DAMP), которые потенциально инициируют адаптивный противоопухолевый иммунный ответ1. Наиболее известные DAMP, в контексте иммуногенной гибели клеток, включают сигналы find-me, такие как хемотаксическая АТФ, сигналы eat-me, такие как воздействие калретикулина, который способствует поглощению опухолевых клеток антигенпрезентирующими клетками, и высвобождение HMGB1, который активирует рецепторы распознавания образов, тем самым усиливая перекрестную презентацию опухолевых антигенов2. Кроме того, интерфероны типа I (IFN-I), индуцированные через иммуногенные нуклеиновые кислоты или другие стимулы, полученные из опухоли, воспринимаются дендритными клетками, что позволяет им эффективно праймировать опухолеспецифические цитотоксические Т-клетки3,4. Клинически активированные и пролиферирующие CD8+ Т-клетки, проникающие в опухоль, обеспечивают независимый прогностический фактор для длительной выживаемости у многих больных раком. Высвобождаемый из таких активированных Т-клеток, IFN-γ опосредует прямое антипролиферативное воздействие на раковые клетки и стимулирует поляризацию Th1 и цитотоксическую дифференцировку Т-клеток, тем самым способствуя эффективному иммунонадзору против рака5,6. Оксалиплатин является добросовестным иммуногенным индуктором гибели клеток, опосредующим такой адаптивный иммунный ответ против рака7. Тем не менее, множество исходных иммуногенных сигналов, высвобождаемых опухолевыми клетками при стрессе, вызванном терапией, еще предстоит полностью раскрыть. Несмотря на значительные достижения в иммунотерапии рака, расширение ее преимуществ для большей части пациентов остается проблемой. Более подробное понимание иммуногенных сигналов, которые инициируют активацию Т-клеток, может направлять разработку новых методов лечения.
Гетерогенная группа мембранно-замкнутых структур, известная как внеклеточные везикулы (EV), по-видимому, служит межклеточными устройствами связи. Излучаемые практически всеми типами клеток, EV переносят функциональные белки, РНК, ДНК и другие молекулы в клетку-реципиент или могут изменять функциональное состояние клетки, просто связываясь с рецепторами на поверхности клетки. Их биологически активный груз значительно варьируется в зависимости от типа и функционального состояния генерирующей ячейки8. В иммунологии рака EV, высвобождаемые из опухолевых клеток, преимущественно рассматриваются как противоборствующие иммунотерапии, потому что они в конечном итоге способствуют инвазивному росту, преформируют метастатические ниши9 и подавляют иммунный ответ10. Напротив, некоторые исследования показали, что EV могут переносить опухолевые антигены в дендритные клетки для эффективного перекрестного представления11,12. EV могут обеспечивать иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, если они возникают при стрессе, вызванном терапией, облегчая противоопухолевый иммунный ответ13,14. Недавно было показано, что зондирование таких врожденных иммунных лигандов РНК и ДНК в микроокружении опухоли модулирует реакцию на блокаду контрольных точек 15,16,17. Следовательно, иммуногенная роль EV, высвобождаемых опухолевыми клетками при различном стрессе, вызванном терапией, должна быть дополнительно выяснена. Поскольку электромобили представляют собой молодую, но растущую область исследований, стандартизация методов все еще продолжается. Поэтому обмен знаниями имеет важное значение для улучшения воспроизводимости исследований взаимодействий между EV и иммунологией рака. Имея это в виду, эта рукопись описывает простой протокол оценки иммуногенного эффекта опухолевых EV in vivo.
Эта оценка выполняется путем генерации ЭВ, полученных из опухоли, иммунизации мышей-реципиентов этими ЭВ и анализа селезеночных Т-клеток с помощью проточной цитометрии. Генерация EV идеально выполняется путем посева опухолевых клеток мышей в культурную среду без EV для высокой степени чистоты. Клетки обрабатывают специфическим стимулом клеточного стресса, таким как химиотерапия, чтобы сравнить эффект индуцированных терапией EV с базовой иммуногенностью соответствующих EV, полученных из опухоли. Изоляция электромобилей вполне может быть выполнена различными методами, которые должны быть выбраны в соответствии с применимостью in vivo и местной доступностью. Следующий протокол описывает анализ на основе осаждения с коммерческим комплектом для очистки электромобилей. Мыши дважды иммунизируются этими электромобилями. Через четырнадцать дней после первой инъекции Т-клетки извлекаются из селезенки и анализируются на производство IFN-γ с помощью проточной цитометрии для оценки системного иммунного ответа. При этом потенциал опухолевых EV, возникающих при различных терапевтических схемах, для индуцирования противоопухолевых Т-клеточных ответов оценивается относительно легко, быстро и с высокой валидностью13. Поэтому этот метод подходит для иммунологического скрининга EV, полученных из раковых клеток в различных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В начале экспериментов мышам было не менее 6 недель и они содержались в определенных условиях, свободных от патогенов. Настоящий протокол соответствует институциональным этическим нормам и действующим местным нормам. Исследования на животных были одобрены местным регулирующим органом (Regierung von Oberbayern, Мюнхен, Германия). Возможные предубеждения, связанные с полом, не были исследованы в этих исследованиях.
1. Генерация и выделение EV, полученных из опухолевых клеток после воздействия химиотерапии
- Культивировать мышиные клетки меланомы B16, экспрессирующие овальбумин (B16-OVA) в DMEM (содержащий 4 мМ L-глутамина и 4,5 г/л D-глюкозы), дополненный FCS (10% v/v), пенициллином (100 ЕД/мл) и стрептомицином (100 мкг/мл) при 37 °C, пока клетки не будут стабильно расти и не будут примерно на 90% сливаться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот раздел протокола полностью в стерильных условиях, используя капюшон клеточной культуры. Для анализа других раковых образований клеточные линии, экспрессирующие мощный антиген, предпочтительны для оценки антиген-специфических Т-клеточных реакций, поскольку они позволяют проводить специфическую рестимуляцию антигена ex vivo . - Чтобы подготовить среду для культивирования клеток, необходимую для генерации ЭЛЕКТРОМОБИЛей, истощают бычьи EV в FCS путем ультрацентрифугирования при 100 000 х г в течение 24 ч при 4 °C, а затем выбрасывают гранулу. В качестве альтернативы, заранее выберите коммерческий препарат с низким содержанием электромобилей животных.
- Соберите клетки B16-OVA и дважды промыть их в PBS, а затем посеять в концентрации 400 000 клеток / мл в средах, обедненных EV.
ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптируйте концентрацию клеток к динамике роста исследуемой клеточной линии, чтобы клетки не перерастали. - Обрабатывают клетки B16-OVA путем добавления 30 мкг оксалиплатина на мл и инкубируют в течение 24 ч при 37 °C. Оставьте контрольные условия без лечения. При первом использовании генотоксического вещества титруйте желаемую цитотоксическую эффективность, используя анализы жизнеспособности клеток, такие как трипан синий исключение18.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ может также оценивать EV, генерируемые в клеточных культурах, обработанных другими иммуномодулирующими веществами или ионизирующим облучением, помимо химиотерапевтических средств.
ВНИМАНИЕ: Оксалиплатин вызывает раздражение кожи и глаз и может вызвать аллергическую реакцию кожи и раздражение дыхательных путей. Оксалиплатин подозревается в возникновении рака. В качестве меры предосторожности используйте средства индивидуальной защиты, включая соответствующие перчатки, очки, маски и одежду, очищенные перед повторным использованием. Избегайте вдыхания и тщательно мойте руки после обработки. Избегайте попадания в окружающую среду и утилизируйте оксалиплатин в соответствии с действующими правилами. Получите подробную информацию из паспорта безопасности. - Соберите культуру клеток супернатанта. Центрифугу сначала при 400 х г в течение 5 мин при 4 °С, а затем при 2000 х г в течение 30 мин при 4 °С, каждый раз отбрасывая гранулу. Наконец, фильтруйте через 220-нм PVDF-мембрану. Используйте свежую трубку для каждого шага, чтобы удалить любой клеточный мусор.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе EV-содержащий супернатант может храниться при 4 °C в течение дня до возобновления протокола. Тем не менее, настоятельно рекомендуется придерживаться описанного графика с немедленной очисткой EV. - Смешайте 1 мл супернатанта с 0,5 мл специального коммерчески доступного реагента для выделения экзосом (см. Таблицу материалов) в V-образной трубке объемом 1,5 мл. Тщательно пипетка вверх и вниз или вихрь для создания однородного раствора. Инкубировать в течение ночи при 4 °C.
- Центрифуга при 10 000 х г в течение 60 мин при 4 °C. Осторожно выбросьте супернатант. Удалите оставшиеся капли, постукивая трубкой объемом 1,5 мл вверх ногами по бумажному полотенцу и аспирацией через пипетку с тонким наконечником, не касаясь EV-гранулы внизу.
- Тщательно удалите все жидкости, чтобы предотвратить бесконтрольное разбавление EV-гранулы. Кроме того, выполняйте эти задачи быстро, чтобы предотвратить высыхание гранул.
- Повторно суспендируйте электромобили в холодном PBS путем пипетки вверх и вниз, не выцарапывая гранулу со стенки трубки наконечником. Теперь перенесите подвеску шаг за шагом от первой к последней трубе, чтобы объединить электромобили.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте объем PBS, равный 5 мкл, умноженный на количество трубок. 5 мкл конечной суспензии содержит изолированные EV, высвобождаемые из 400 000 клеток при химиотерапии или в устойчивом состоянии. - Предпочтительно использовать электромобили напрямую. Если это невозможно, храните суспензии EV при -80 °C в силиконизированных сосудах в течение 28 дней до нанесения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Электромобили, описанные здесь и в ряде других публикаций, не теряют своей соответствующей биологической функции при хранении при -80 °C в течение этого периода времени19. - Количественная оценка и характеристика изолятов EV в соответствии с руководящими принципами MISEV201820.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможные методы количественной оценки включают анализ отслеживания наночастиц (NTA)21 и обнаружение мембранно-связанных белков EV22. Возможные подходы к дальнейшей характеристике электромобилей включают электронную микроскопию23 и вестерн блот20.
2. Иммунизация мышей электромобилями
- Спланируйте эксперимент in vivo с мышами C57BL/6 (или другими сингенными мышами, соответствующими линии опухолевых клеток), включая группы лечения, получающие EV, полученные из обработанных клеток, необработанных клеток и PBS (транспортное средство), соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно использовать мышей в возрасте 6-8 недель, чтобы предотвратить физиологическое старение от снижения иммунного ответа24. - Смешайте 5 мкл EV-суспензии с 55 мкл холодного PBS для каждой мыши в соответствующей группе лечения, чтобы иммунизировать ее EV, выделенными из клеток 4,0 x 105 B16-OVA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это количество ev соответствует приблизительно 2 x 109 частицам, измеренным анализом отслеживания наночастиц (данные не показаны). Белок OVA, смешанный с адъювантом (например, LPS), может применяться в качестве мощного вакцинно-положительного контроля.- Наполните шприцы (размер иглы 26-30 г) 60 мкл разбавленных EV или PBS соответственно и сразу же положите на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе количество вводимых EV нормализуется до количества EV-высвобождающих опухолевых клеток для экспериментального рассмотрения как качественных, так и количественных эффектов оксалиплатина на биогенез EV опухолевых клеток. Для некоторых читателей нормализация до определенной концентрации произведенных электромобилей может лучше соответствовать их экспериментальной установке в зависимости от их научного вопроса.
- Наполните шприцы (размер иглы 26-30 г) 60 мкл разбавленных EV или PBS соответственно и сразу же положите на лед.
- Инокулируют EV или PBS подкожно в медиальный аспект бедра мышей и повторяют иммунизацию через 7 дней. Через четырнадцать дней после первого лечения приносят в жертву мышей, например, при вывихе шейки матки, чтобы проанализировать иммунный ответ.
ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с местными стандартами могут использоваться альтернативные пути подкожной инъекции.
3. Анализ проточной цитометрии селезеночных Т-клеток
- Приготовьте и охладите полный RPMI (cRPMI), дополняя RPMI-1640 FCS (10% v/v), пенициллином (100 ЕД/мл), стрептомицином (100 мкг/мл), L-глутамином (2 мМ) и β-меркаптоэтанолом (50 мкМ).
- Отделить селезенку от вскрытой брюшной полости. Размять селезенку с помощью смоченного клеточного сетчатого фильтра 100 мкм и пластикового плунжера шприца и промыть селезеночные клетки в трубку объемом 50 мл с 5-10 мл cRPMI. Центрифугу при 400 х г в течение 5 мин при 4 °С и выбросьте супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите клетки на льду, когда это возможно. Чтобы проанализировать местный, а не селезеночный иммунный ответ, резецируют дренирующие подколенные и паховые лимфатические узлы, следуя тому же протоколу. В этом случае пропустите следующий этап лизиса эритроцитов. - Для удаления эритроцитов из клеточной суспензии повторно суспендируют гранулу 2 мл буфера лизиса эритроцитов (см. Таблицу материалов) и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем остановите реакцию, добавив cRPMI. Центрифугу при 400 х г в течение 5 мин при 4 °С и выбросьте супернатант.
- Для посева повторно суспендируйте клеточную гранулу в cRPMI и подсчитайте клетки, чтобы поместить трипликаты из 200 000 клеток с 200 мкл cRPMI в каждую лунку, используя 96-луночную пластину с U-образным дном. Инкубировать в течение 48 ч при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для устранения антиген-специфичности активированных Т-клеток добавляют 1 мкг/мл растворимого овальбумина (или другого опухолевого антигена, соответствующего исследуемой клеточной линии) или оставляют без дополнительного стимула, соответственно. Добавление иммунодоминантного пептидного эпитопа SIINFEKL вместо полноразмерного овальбумина позволяет сократить инкубационный период. Помимо проточной цитометрии, сыворотка мышей и супернатант клеточной культуры после 48 ч инкубации могут быть проанализированы на наличие различных цитокинов. - Через 48 ч, чтобы усилить внутриклеточное окрашивание IFN-γ путем, в частности, блокирования опосредованной Гольджи секреции белков, добавляют в культуру клеток брефельдин А (5 нг/мл), ПМА (20 нг/мл) и иономицин (1 мкг/мл). Инкубировать в течение 4 ч при 37 °C.
- Перед окрашиванием поверхностных биомаркеров перенесите спленоциты на 96-луночную пластину с V-образным дном и дважды промыть PBS. Затем добавляют флуоресцентные антитела, совместимые с локально доступным проточным цитометром, направленные против поверхностных биомаркеров, CD3, CD8 и CD4 (см. Таблицу материалов), разбавленные 1:400, плюс поправимый краситель жизнеспособности, разбавленный 1:1000 в PBS. Повторно суспендировать гранулированные спленоциты в окрашивающем растворе и инкубировать в течение 30 мин при 4 °С, защищенные от света.
- Для фиксации и пермеабилизации спленоцитов дважды промыть в FACS-буфере (PBS плюс 3% v/v FCS), а затем повторно суспендировать в 100 мкл буфера фиксации/пермеабилизации (см. Таблицу материалов) на лунку. Инкубировать в течение 30 мин при 4 °C, защищенные от света.
- Для окрашивания внутриклеточных IFN-γ промыть спленоциты в буфере фиксации/пермеабилизации и повторно суспендировать флуоресцентными антителами против IFN-γ, разбавленным 1:200 в буфере. Инкубировать в течение не менее 1 ч (максимум до 12 ч) при 4 °C, защищенных от света.
- Перед измерением образцов методом проточной цитометрии дважды промывают спленоциты в буфере фиксации/пермеабилизации и повторно суспендируют в FACS-буфере. Проанализируйте активацию цитотоксических Т-клеток в соответствии со стратегией гастинга, показанной на рисунке 2.
- Во-первых, чтобы обнаружить одиночные клетки, промокните FSC-H против FSC-A. Затем, чтобы обнаружить лимфоидные клетки, промокните SSC против FSC-A. Впоследствии отбирают живые CD3+, CD4-, CD8+ клетки и определяют их IFN-γ-продуцирующее подмножество для количественной оценки активации цитотоксических Т-клеток в селезенке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Включить флуоресцентное пятно минус один (FMO) со всеми фторхромами, за исключением флуорохрома, направленного против IFN-γ в качестве отрицательного технического контроля.
- Во-первых, чтобы обнаружить одиночные клетки, промокните FSC-H против FSC-A. Затем, чтобы обнаружить лимфоидные клетки, промокните SSC против FSC-A. Впоследствии отбирают живые CD3+, CD4-, CD8+ клетки и определяют их IFN-γ-продуцирующее подмножество для количественной оценки активации цитотоксических Т-клеток в селезенке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол предназначен для облегчения простой и легко воспроизводимой оценки иммуногенности ЭВ, полученных из опухоли. Таким образом, мышей прививают EV, полученными из культур опухолевых клеток in vitro , экспрессирующих модельный антиген куриного овальбумина (OVA). Последующий иммунный ответ анализируется в селезеночных Т-клетках с помощью проточной цитометрии.
На рисунке 1 представлен обзор практических шагов всего протокола. Поскольку работа фокусируется на иммуногенной гибели клеток, перекрестной презентации и EV-индуцированном противоопухолевом иммунитете, этот протокол ограничен функцией CD8 + цитотоксических Т-клеток. Как показано на рисунке 2, клетки были закрыты как одиночные клетки, подмножество лимфоцитов (по размеру и зернистости), жизнеспособные клетки (исключая маркер жизни / мертвой смерти) и CD3 + CD4- CD8 + цитотоксические Т-клетки. Внутриклеточное накопление IFN-γ оценивали как суррогатный маркер активации. Возможные дополнительные маркеры, касающиеся дифференцировки и истощения Т-клеток, обсуждаются ниже.
Используя метод, описанный здесь, мышей иммунизировали EV, полученными из OVA-экспрессирующих опухолевых клеток, культивируемых либо в стационарных (необработанных), либо в генотоксических стрессовых условиях (обработанных оксалиплатином). Только мыши, которым вводили EV, полученные из опухолевых клеток в условиях генотоксического стресса, индуцировали мощную активацию селезеночных цитотоксических Т-клеток у животных-реципиентов (рисунок 3A). Инъекция EV, полученных из опухолей в стационарных условиях, привела к некоторой активации Т-клеток, но это существенно не отличалось от активации Т-клеток у мышей, которым вводили автомобиль PBS. Эти данные показывают, что при генотоксическом стрессе опухолевые клетки могут высвобождать мощно иммуногенные EV. Производство IFN-γ было особенно увеличено, когда спленоциты опухолевых EV-обработанных животных были ex vivo рестимулированы модельным опухолевым антигеном OVA перед анализом (рисунок 3B). Эти данные свидетельствуют о том, что ЭВ, полученные из опухоли, могут индуцировать опухолевые антиген-специфические иммунные реакции. Интересно, что IFN-γ-продукции - хотя и в гораздо меньшей степени - также обнаруживается при отсутствии антиген-специфической рестимуляции. Возможно, другие меланома-ассоциированные антигены, такие как дифференцированный антиген TRP225, могут быть нацелены на некоторую часть EV-индуцированного ответа Т-клеток.
Рисунок 1: Пиктографический обзор протокола. (A) Процедура выделения EV, генерируемых в культурах опухолевых клеток, напоминающих химиотерапию. (B) График иммунизации мышей EV. (C) Протокол окрашивания для анализа проточной цитометрии цитотоксических Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Стратегия проточной цитометрии для анализа активации цитотоксических Т-клеток в селезенке. Цифры представляют собой процент соответствующего родительского населения. FSC-A: область прямого рассеяния; FSC-H: высота прямого рассеяния; SSC: боковой разброс; живой/мертвый: маркер гибели клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: EV, полученные из опухолевых клеток при генотоксическом стрессе, могут индуцировать антиген-специфические Т-клеточные реакции у животных-реципиентов. (А) Мышей иммунизировали EV, полученными из опухолевых клеток, культивируемых либо в стационарных (необработанных), либо в генотоксических стрессовых условиях (обработанных оксалиплатином). В качестве отрицательного контроля использовались впрыски транспортных средств (PBS). Определяли ИФН-γ продукцию цитотоксическими Т-клетками в селезенке при иммунизации ЭВ. При этом суспензии селезеночных клеток перед анализом рестимулировали овальбумином ex vivo . (B) Мышей лечили EV, полученными из опухолевых клеток в условиях генотоксического стресса, как описано выше. Активацию селезеночных Т-клеток определяли после рестимуляции ex vivo либо в присутствии, либо в отсутствие овальбумина. На брусьях изображено среднее значение на группу и его стандартная погрешность. Односторонний дисперсионный тест (ANOVA) с посттестом Бонферрони использовался для множественных статистических сравнений набора данных. Уровень значимости установлен на уровне P < 0,05, P < 0,01 и P < 0,001 и обозначается здесь звездочками (*, **, и ***). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол обеспечивает иммунологическую оценку in vivo EV, полученных из клеток меланомы при стрессе, вызванном химиотерапией, при адаптации к EV, испускаемым различными видами рака при различных методах лечения. Например, иммунизация мышей EV, полученными из клеток B16-OVA, обработанных оксалиплатином, расширяет IFN-γ-продуцирующие CD8 + Т-клетки в селезенке, которые дополнительно стимулируются инкубацией ex vivo с овальбумином, что указывает на опухолеспецифический иммунный ответ. Таким образом, обнаружение иммуногенных EV путем скрининга с помощью этого протокола облегчает более полное понимание традиционных методов лечения рака и позволяет целенаправленно исследовать роль EV в иммунологии рака.
Следует отметить, что эксперименты с электромобилями требуют некоторых особых соображений. В этом протоколе EV полу количественно нормализуются до количества опухолевых клеток, высвобождаемых в течение 24 ч. Этот подход отражает цель выявления повышенной иммуногенности, независимо от того, возникает ли она в результате изменений в качестве или количестве высвобождаемых EV. Поэтому воспроизводимые результаты in vivo зависят от постоянной эффективности изоляции электромобилей. С этой целью обеспечение того, чтобы гранулы EV были полностью и быстро повторно суспендированы, чтобы избежать высыхания, является критическим шагом.
Кроме того, EV должны быть количественно определены и охарактеризованы, например, путем анализа отслеживания наночастиц и западного пятна канонического трансмембранного, просветного и, по крайней мере, одного отрицательного EV-маркера20. Количественная оценка и характеристика элементов управления электромобилями для непостоянной изоляции и устранение количественных различий в EV или подмножествах EV. Этот тип характеристики EV представляет собой часть минимальной информации, которая должна быть сообщена в исследованиях о внеклеточных везикулах, в соответствии с руководящими принципами Международного общества внеклеточных везикул (ISEV). Однако различные методы определения характеристик являются в равной степени законными и должны быть выбраны с учетом наличия на местном уровне и индивидуального исследовательского вопроса. Примечательно, что определение дозировки вещества, представляющего интерес, или ионизирующее облучение представляет собой еще один критический этап протокола, который может потребовать экспериментальной валидации для достижения адекватного уровня гибели клеток.
В целом, необходимо учитывать потенциальное загрязнение изолированных EV лечебным веществом, растворимыми белками и липопротеинами. Одна из стратегий в этом отношении заключается в воспроизведении эксперимента с дополнительными методами изоляции электромобилей, которые один и тот же тип загрязнения20 не может скомпрометировать. Иммуноаффинность, например, изолирует EV с более низким выходом, но более высокой специфичностью, чем методы, основанные исключительно на осаждении, и может обеспечить надлежащий контроль в этом отношении26. Альтернативный подход заключается в сравнении клеточных EV дикого типа с выделениями из генетически модифицированных клеток со специфической делецией генов, участвующих в биогенезе EV, или развертыванием веществ, которые уменьшают эмиссию EV20.
Результаты, полученные из этого протокола, должны быть дополнены более полной характеристикой EV-опосредованного иммунного ответа. В частности, классификация CD8 + Т-клеток на эффекторные и эффекторные клетки памяти через CD4427, а также антигенно-наивные и центральные клетки памяти через CD62L28 может дать более глубокое понимание. Кроме того, анализ Т-хелперных клеток, регуляторных Т-клеток и NK-клеток может представлять интерес. Для тестирования противоопухолевой эффективности EV мышам могут быть брошены вызов соответствующими раковыми клетками после получения иммунизации EV или лечения EV против предустановленного рака, тем самым адаптируя руководящие принципы по обнаружению иммуногенной гибели клеток2,29 к этому бесклеточному производному опухоли. Однако выводы из всех этих экспериментальных установок ограничены тем фактом, что раковые клетки в чашке Петри потенциально генерируют функционально другие EV, чем раковые клетки, встроенные в динамическое микроокружение опухоли30, которое часто подавляет противораковый иммунитет. Таким образом, оценка EV, полученных из опухолевых / фибробластных кокультур или опухолевой ткани ex vivo, может лучше отражать фактическую ситуацию. На следующем поступательном шаге к клинической реальности EV из материала пациента могут быть проанализированы на иммуногенность до и во время терапии, чтобы оценить их удобство использования в качестве биомаркеров.
Поскольку недавно было обнаружено, что электромобили, полученные из рака, при определенных обстоятельствах модулируют иммунную систему, путешествие по изучению их клинического потенциала только началось31. Для углубленного анализа иммунных механизмов, кооптированных иммуногенными EV, полезные инструменты включают флуоресцентную микроскопию, визуализирующую поглощение EV конкретными клетками, развертывание мышей с генетическими недостатками для конкретных иммунных путей и методы скрининга молекулярных изменений в содержании EV. В конечном счете, идентификация иммуногенных EV, полученных из опухоли, с помощью методов скрининга, описанных в настоящем описании, позволит лучше понять основные механизмы, лежащие в основе EV-опосредованного иммунитета, и, следовательно, представляет собой решающий шаг к использованию их потенциала против рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 и Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (H.P.), исследовательским грантом Мехтильд Харф от Фонда DKMS за дарение жизни (H.P.), премией молодого исследователя От Исследовательского альянса меланомы (для S.H.), стипендией Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (для F.S.), Посевной фонд Технического университета Мюнхена (S.H.) и исследовательский грант Фонда Вильгельма Сандера (2021.041.1, S.H.). H.P. поддерживается Программой молодых исследователей EMBO.
ВКЛАД АВТОРА:
F.S., H.P. и S.H. разработали исследование, проанализировали и интерпретировали результаты. Ф.С. и С.Х. написали рукопись. Х.П. и С.Х. руководили исследованием.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Clone 17A2 |
| Anti-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | Clone GK1.5 |
| Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Clone 53-6.7 |
| Anti-IFNγ PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
| Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
| Cell Strainer, 100 µm | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 µm |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM) |
| FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Calf Serum (FCS) |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | Fixation/Permeabilization Concentrate (10x) |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | 407952 | From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-032 | L-Glutamine (200 mM) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1 |
| Oxaliplatin | Pharmacy of MRI hospital | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 1514-122 | Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL) |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC) |
| PVDF filter, 0,22 µm, for syringes | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES |
| Syringe, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm) |
| Total Exosome Isolation Reagent | Invitrogen | 4478359 | For isolation from cell culture media |
| β-Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β-Mercaptoethanol (50 mM) |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).
- Kepp, O., et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death. Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).
- Fuertes, M. B., et al. Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).
- Sistigu, A., et al. Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy. Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Shankaran, V., et al. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).
- Tesniere, A., et al. Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin. Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Zomer, A., van Rheenen, J. Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications. Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).
- Whiteside, T. L. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).
- Wolfers, J., et al. Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming. Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).
- Zeelenberg, I. S., et al. Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses. Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).
- Diamond, J. M., et al. Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs. Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).
- Kitai, Y., et al. DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity. Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).
- Heidegger, S., et al. RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade. Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).
- Schadt, L., et al. Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity. Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).
- Cheng, Y., et al. In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).
- Yuana, Y., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice. European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).
- Bloom, M. B., et al. Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma. The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation. The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).
- Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes. PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).
- Bek, S., et al. Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines. Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).
- Nabet, B. Y., et al. Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer. Cell. 170 (2), 352-366 (2017).
- Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).
