Summary
Ce manuscrit décrit comment évaluer l’immunogénicité in vivo des vésicules extracellulaires dérivées de cellules tumorales (VE) à l’aide de la cytométrie en flux. Les VE dérivés de tumeurs subissant une mort cellulaire immunogène induite par le traitement semblent particulièrement pertinents dans l’immunosurveillance tumorale. Ce protocole illustre l’évaluation des VE des tumeurs immunostimulantes induites par l’oxaliplatine, mais peut être adapté à divers contextes.
Abstract
La mort cellulaire immunogène des tumeurs, causée par la chimiothérapie ou l’irradiation, peut déclencher des réponses des lymphocytes T spécifiques à la tumeur en libérant des modèles moléculaires associés au danger et en induisant la production d’interféron de type I. Les immunothérapies, y compris l’inhibition des points de contrôle, reposent principalement sur des cellules T préexistantes spécifiques à la tumeur pour déployer un effet thérapeutique. Ainsi, les approches thérapeutiques synergiques qui exploitent la mort cellulaire immunogène comme vaccin anticancéreux intrinsèque peuvent améliorer leur réactivité. Cependant, le spectre des facteurs immunogènes libérés par les cellules soumises à un stress induit par le traitement reste incomplètement caractérisé, en particulier en ce qui concerne les vésicules extracellulaires (VE). Les VE, des particules membraneuses à l’échelle nanométrique émises par pratiquement toutes les cellules, sont considérés comme facilitant la communication intercellulaire et, dans le cancer, il a été démontré qu’ils médient l’amorçage croisé contre les antigènes tumoraux. Pour évaluer l’effet immunogène des VE dérivés de tumeurs dans diverses conditions, des méthodes adaptables, évolutives et valides sont recherchées. Par conséquent, une approche relativement simple et robuste est présentée ici pour évaluer l’immunogénicité in vivo des VE. Le protocole est basé sur l’analyse par cytométrie en flux des lymphocytes T spléniques après l’immunisation in vivo de souris avec des VE, isolées par des tests basés sur les précipitations à partir de cultures de cellules tumorales sous thérapie ou dans des conditions d’état d’équilibre. Par exemple, ces travaux montrent que l’exposition à l’oxaliplatine des cellules de mélanome murin B16-OVA a entraîné la libération de VE immunogènes qui peuvent servir de médiateur dans l’activation des lymphocytes T cytotoxiques réactifs à la tumeur. Par conséquent, le dépistage des VE par immunisation in vivo et cytométrie en flux identifie les conditions dans lesquelles les VE immunogènes peuvent émerger. L’identification des conditions de libération immunogène des VE fournit une condition préalable essentielle pour tester l’efficacité thérapeutique des VE contre le cancer et explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents afin de dévoiler de nouvelles perspectives sur le rôle des VE dans l’immunologie du cancer.
Introduction
Le système immunitaire joue un rôle central dans la lutte contre le cancer, à la fois lorsqu’il est incité par l’inhibition du point de contrôle immunitaire et pour l’efficacité des thérapies conventionnelles contre le cancer. Les cellules tumorales succombant à des thérapies génotoxiques telles que les agents chimiothérapeutiques oxaliplatine et doxorubicine, ou la radiothérapie ionisante peuvent libérer des antigènes et des modèles moléculaires associés au danger (DAMP) qui initient potentiellement une réponse immunitaire antitumorale adaptative1. Les DAMP les plus importants, dans le contexte de la mort cellulaire immunogène, comprennent les signaux find-me tels que l’ATP chimiotactique, les signaux eat-me tels que l’exposition à la calréticuline, qui favorise l’absorption des cellules tumorales par les cellules présentatrices d’antigènes, et la libération de HMGB1, qui active les récepteurs de reconnaissance de formes, améliorant ainsi la présentation croisée des antigènes tumoraux2. En outre, les interférons de type I (IFN-I), induits par des acides nucléiques immunogènes dérivés de tumeurs ou d’autres stimuli, sont détectés par les cellules dendritiques, ce qui leur permet d’amorcer efficacement les cellules T cytotoxiques spécifiques à la tumeur3,4. Cliniquement, les lymphocytes T CD8+ activés et proliférants infiltrant la tumeur fournissent un facteur pronostique indépendant pour une survie prolongée chez de nombreux patients atteints de cancer. Libéré par ces lymphocytes T activés, l’IFN-γ médie les effets antiprolifératifs directs sur les cellules cancéreuses et entraîne la polarisation Th1 et la différenciation des lymphocytes T cytotoxiques, contribuant ainsi à une immunosurveillance efficace contre le cancer5,6. L’oxaliplatine est un véritable inducteur immunogène de la mort cellulaire, médiant une telle réponse immunitaire adaptative contre le cancer7. Cependant, la pléthore de signaux immunogènes initiaux libérés par les cellules tumorales sous stress induit par le traitement reste à dévoiler pleinement. Malgré les progrès significatifs de l’immunothérapie du cancer, l’extension de ses avantages à une plus grande partie des patients reste un défi. Une compréhension plus détaillée des signaux immunogènes qui initient l’activation des lymphocytes T pourrait guider le développement de nouvelles thérapies.
Un groupe hétérogène de structures enfermées dans la membrane, connues sous le nom de vésicules extracellulaires (VE), semble servir de dispositifs de communication intercellulaire. Émis par pratiquement tous les types de cellules, les VE transportent des protéines fonctionnelles, de l’ARN, de l’ADN et d’autres molécules vers une cellule réceptrice ou peuvent modifier l’état fonctionnel d’une cellule simplement en se liant aux récepteurs à la surface de la cellule. Leur cargaison biologiquement active varie considérablement selon le type et l’état fonctionnel de la cellule génératrice8. En immunologie du cancer, les VE libérés par les cellules tumorales ont été principalement considérés comme antagonistes à l’immunothérapie parce qu’ils finissent par favoriser la croissance invasive, préformer des niches métastatiques9 et supprimer la réponse immunitaire10. En revanche, certaines études ont montré que les VE peuvent transférer des antigènes tumoraux aux cellules dendritiques pour une présentation croisée efficace11,12. Les VE peuvent fournir des acides nucléiques immunostimulants s’ils émergent sous un stress induit par le traitement, facilitant une réponse immunitaire antitumorale13,14. Il a récemment été démontré que la détection de tels ligands immunitaires innés à l’ARN et à l’ADN dans le microenvironnement tumoral module de manière significative la réactivité au blocage des points de contrôle15,16,17. Par conséquent, le rôle immunogène des VE libérés par les cellules tumorales sous différents stress induits par la thérapie doit être élucidé davantage. Étant donné que les véhicules électriques constituent un domaine de recherche jeune mais en pleine croissance, la normalisation des méthodes est toujours en cours. Par conséquent, le partage des connaissances est essentiel pour améliorer la reproductibilité de la recherche sur les interactions entre les VE et l’immunologie du cancer. Dans cet esprit, ce manuscrit décrit un protocole simple pour évaluer l’effet immunogène des VE dérivés de tumeurs in vivo.
Cette évaluation est réalisée en générant des VE dérivés de tumeurs, en immunisant les souris réceptrices avec ces VE et en analysant les lymphocytes T spléniques par cytométrie en flux. La génération de VE est idéalement réalisée en ensemençant des cellules tumorales murines dans un milieu de culture cellulaire sans EV pour un haut degré de pureté. Les cellules sont traitées avec un stimulus de stress cellulaire spécifique, tel que la chimiothérapie, pour comparer l’effet des VE induits par le traitement à l’immunogénicité de base des VE dérivés de tumeurs respectifs. L’isolement des véhicules électriques peut très bien être effectué par diverses techniques qui doivent être sélectionnées en fonction de l’applicabilité in vivo et de la disponibilité locale. Le protocole suivant décrit un test basé sur les précipitations avec un kit commercial pour la purification des véhicules électriques. Les souris sont immunisées deux fois avec ces VE. Quatorze jours après la première injection, les lymphocytes T sont extraits de la rate et analysés pour la production d’IFN-γ par cytométrie en flux afin d’évaluer une réponse immunitaire systémique. Avec cela, le potentiel des VE dérivés de tumeurs, émergeant sous différents schémas thérapeutiques, pour induire des réponses anti-cellules T tumorales est évalué relativement facilement, rapidement et avec une validité élevée13. Par conséquent, cette méthode convient à un dépistage immunologique des VE dérivés de cellules cancéreuses dans diverses conditions.
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Protocol
Au début des expériences, les souris étaient âgées d’au moins 6 semaines et étaient maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes. Le présent protocole est conforme aux normes éthiques institutionnelles et aux réglementations locales en vigueur. Les études sur les animaux ont été approuvées par l’organisme de réglementation local (Regierung von Oberbayern, Munich, Allemagne). Les biais possibles liés au sexe n’ont pas été étudiés dans ces études.
1. Génération et isolement de VE dérivés de cellules tumorales après une exposition à la chimiothérapie
- Cultiver des cellules de mélanome B16 murin exprimant l’ovalbumine (B16-OVA) dans le DMEM (contenant 4 mM de L-glutamine et 4,5 g/L de D-glucose) complétées par FCS (10 % v/v), pénicilline (100 unités/mL) et streptomycine (100 μg/mL) à 37 °C, jusqu’à ce que les cellules se développent régulièrement et soient confluentes à environ 90 %.
REMARQUE: Effectuer cette section du protocole entièrement dans des conditions stériles à l’aide d’une cagoule de culture cellulaire. Pour l’analyse d’autres entités cancéreuses, les lignées cellulaires exprimant un antigène puissant sont préférables pour évaluer les réponses des lymphocytes T spécifiques à l’antigène, car elles permettent une restimulation ex vivo spécifique de l’antigène. - Pour préparer les milieux de culture cellulaire nécessaires à la génération de VE, épuiser les véhicules électriques bovins dans le FCS par ultracentrifugation à 100 000 x g pendant 24 h à 4 °C, puis jeter les granulés. Alternativement, choisissez une préparation commerciale faible en VE d’animaux au préalable.
- Récoltez les cellules B16-OVA et lavez-les deux fois dans du PBS, puis ensemencez à une concentration de 400 000 cellules / mL dans des milieux appauvris en EV.
REMARQUE: Adapter la concentration cellulaire à la dynamique de croissance de la lignée cellulaire étudiée afin que les cellules ne surcroissent pas. - Traiter les cellules B16-OVA en ajoutant 30 μg d’oxaliplatine par mL et incuber pendant 24 h à 37 °C. Laissez les conditions de contrôle non traitées. Lors de la première utilisation d’une substance génotoxique, titrer l’efficacité cytotoxique souhaitée à l’aide de tests de viabilité cellulaire tels que l’exclusion du bleu de trypan18.
REMARQUE: Ce test peut également évaluer les VE générés dans des cultures cellulaires traitées avec d’autres substances immunomodulatrices ou une irradiation ionisante en plus des agents chimiothérapeutiques.
ATTENTION: L’oxaliplatine provoque une irritation cutanée et oculaire grave et peut provoquer une réaction allergique cutanée et une irritation respiratoire. L’oxaliplatine est soupçonné de causer le cancer. Par mesure de précaution, utilisez un équipement de protection individuelle, y compris des gants, des lunettes, des masques et des vêtements adéquats, nettoyés avant d’être réutilisés. Évitez l’inhalation et lavez-vous soigneusement les mains après la manipulation. Évitez les rejets dans l’environnement et éliminez l’oxaliplatine conformément à la réglementation en vigueur. Obtenez des informations détaillées à partir de la fiche de données de sécurité. - Recueillir le surnageant de culture cellulaire. Centrifuger d’abord à 400 x g pendant 5 min à 4 °C, puis à 2 000 x g pendant 30 min à 4 °C, en jetant à chaque fois la pastille. Enfin, filtrez à travers une membrane PVDF de 220 nm. Utilisez un tube frais pour chaque étape afin d’éliminer les débris cellulaires.
REMARQUE: À ce stade, le surnageant contenant du VE peut être stocké à 4 ° C pendant une journée avant de reprendre le protocole. Cependant, il est fortement recommandé de respecter le calendrier décrit avec une purification immédiate des ves. - Mélanger 1 mL de surnageant avec 0,5 mL d’un réactif d’isolement d’exosome spécifique disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux) dans un tube de 1,5 mL en forme de V. Pipettez soigneusement de haut en bas ou vortexez pour créer une solution homogène. Incuber toute la nuit à 4 °C.
- Centrifuger à 10 000 x g pendant 60 min à 4 °C. Jetez soigneusement le surnageant. Retirez les gouttes restantes en tapotant le tube de 1,5 mL à l’envers sur une serviette en papier et en aspirant à travers une pipette avec une pointe fine sans toucher la pastille EV au fond.
- Retirez soigneusement tous les fluides pour éviter une dilution incontrôlée de la pastille EV. En outre, exécutez ces tâches rapidement pour empêcher le granulé de se dessécher.
- Remettez en suspension les véhicules électriques dans un PBS froid en pipetant de haut en bas sans rayer la pastille de la paroi du tube avec la pointe. Maintenant, transférez la suspension étape par étape du premier au dernier tube pour mettre en commun les véhicules électriques.
REMARQUE: Utilisez un volume de PBS égal à 5 μL multiplié par le nombre de tubes. 5 μL de la suspension finale contient les VE isolés libérés par 400 000 cellules sous chimiothérapie ou à l’état d’équilibre. - De préférence, utilisez directement les véhicules électriques. Si cela n’est pas possible, conservez les suspensions de VE à -80 °C dans des récipients siliconés jusqu’à 28 jours jusqu’à l’application.
REMARQUE: Les véhicules électriques décrits ici et dans plusieurs autres publications ne perdent pas leur fonction biologique respective lorsqu’ils sont entreposés à -80 °C pendant cette période19. - Quantifier et caractériser les isolats EV conformément aux directives MISEV201820.
REMARQUE : Les méthodes possibles de quantification comprennent l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA)21 et la détection des protéines liées à la membrane d’EV22. Les approches possibles pour caractériser davantage les VE comprennent la microscopie électronique23 et le transfert western20.
2. Immunisation des souris avec des VE
- Planifiez l’expérience in vivo avec des souris C57BL/6 (ou d’autres souris syngéniques correspondant à la lignée cellulaire tumorale), y compris des groupes de traitement recevant des VE dérivés de cellules traitées, de cellules non traitées et de PBS (véhicule), respectivement.
REMARQUE: De préférence, utilisez des souris à l’âge de 6 à 8 semaines pour empêcher la sénescence physiologique de diminuer la réponse immunitaire24. - Mélanger 5 μL de suspension EV avec 55 μL de PBS froid pour chaque souris du groupe de traitement respectif afin de l’immuniser avec des VE isolés à partir de cellules B16-OVA de 4,0 x 105 .
REMARQUE: Cette quantité de VE correspond à environ 2 x 109 particules mesurées par analyse de suivi des nanoparticules (données non présentées). La protéine OVA mélangée à un adjuvant (p. ex., LPS) peut être appliquée comme témoin positif puissant du vaccin.- Remplissez les seringues (taille de l’aiguille 26-30 G) avec 60 μL des VE dilués ou PBS, respectivement, et mettez immédiatement sur la glace.
REMARQUE: Dans le protocole, la quantité de VE injectés est normalisée au nombre de cellules tumorales libérant des VE pour prendre en compte expérimentalement les effets qualitatifs et quantitatifs de l’oxaliplatine sur la biogenèse des cellules tumorales EV. Pour certains lecteurs, la normalisation à une concentration spécifique de véhicules électriques produits peut mieux correspondre à leur configuration expérimentale en fonction de leur question scientifique.
- Remplissez les seringues (taille de l’aiguille 26-30 G) avec 60 μL des VE dilués ou PBS, respectivement, et mettez immédiatement sur la glace.
- Inoculez les VE ou le PBS par voie sous-cutanée dans l’aspect médian de la cuisse de la souris et répétez l’immunisation après 7 jours. Quatorze jours après le premier traitement, sacrifier des souris, par exemple par luxation cervicale pour analyser la réponse immunitaire.
REMARQUE: D’autres voies d’injection sous-cutanée peuvent être utilisées, conformément aux normes locales.
3. Analyse par cytométrie en flux des lymphocytes T spléniques
- Préparer et refroidir le RPMI complet (cRPMI), en complétant le RPMI-1640 avec du FCS (10 % v/v), de la pénicilline (100 unités/mL), de la streptomycine (100 μg/mL), de la L-glutamine (2 mM) et du β-mercaptoéthanol (50 μM).
- Réséquez la rate de la cavité abdominale ouverte. Écraser la rate avec une passoire cellulaire humidifiée de 100 μm et le piston en plastique d’une seringue et rincer les cellules spléniques dans un tube de 50 mL avec 5-10 mL de cRPMI. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
REMARQUE: Gardez les cellules sur la glace autant que possible. Pour analyser la réponse immunitaire locale plutôt que splénique, réséquez les ganglions lymphatiques poplités et inguinaux drainants, en suivant le même protocole. Dans ce cas, sautez l’étape suivante pour la lyse des érythrocytes. - Pour retirer les érythrocytes de la suspension cellulaire, remettez en suspension la pastille avec 2 mL de tampon de lyse des globules rouges (voir tableau des matériaux) et incubez pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite, arrêtez la réaction en ajoutant cRPMI. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
- Pour l’ensemencement, remettez en suspension la pastille cellulaire dans cRPMI et comptez les cellules pour placer des triples de 200 000 cellules avec 200 μL cRPMI dans chaque puits, à l’aide d’une plaque de 96 puits avec un fond en forme de U. Incuber pendant 48 h à 37 °C.
REMARQUE: Pour traiter la spécificité de l’antigène des lymphocytes T activés, ajouter 1 μg / mL d’ovalbumine soluble (ou un autre antigène tumoral correspondant à la lignée cellulaire étudiée) ou laisser sans stimulus supplémentaire, respectivement. L’ajout de l’épitope peptidique à dominance immunitaire SIINFEKL, au lieu de l’ovalbumine pleine longueur, permet une période d’incubation plus courte. Outre la cytométrie en flux, le sérum des souris et le surnageant de culture cellulaire après 48 h d’incubation peuvent être analysés pour diverses cytokines. - Après 48 h, pour améliorer la coloration intracellulaire de l’IFN-γ, notamment en bloquant la sécrétion de protéines médiée par Golgi, ajouter la brefeldine A (5 ng/mL), la PMA (20 ng/mL) et l’ionomycine (1 μg/mL) à la culture cellulaire. Incuber pendant 4 h à 37 °C.
- Avant de colorer les biomarqueurs de surface, transférez les splenocytes sur une plaque de 96 puits avec un fond en forme de V et lavez-les deux fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez des anticorps fluorescents, compatibles avec le cytomètre en flux disponible localement, dirigés contre les biomarqueurs de surface, CD3, CD8 et CD4 (voir tableau des matériaux), dilués à 1:400, plus un colorant de viabilité réparable, dilué 1:1 000 dans du PBS. Remettre en suspension les splenocytes granulés dans la solution de coloration et incuber pendant 30 min à 4 °C, à l’abri de la lumière.
- Pour la fixation et la perméabilisation des splenocytes, laver deux fois dans un tampon FACS (PBS plus 3 % v/v FCS), puis remettre en suspension dans 100 μL de tampon de fixation/perméabilisation (voir tableau des matériaux) par puits. Incuber pendant 30 min à 4 °C, à l’abri de la lumière.
- Pour la coloration des γ intracellulaires de l’IFN, laver les splenocytes dans un tampon de fixation/perméabilisation et les remettre en suspension avec des anticorps fluorescents contre l’IFN-γ, dilués à 1:200 dans le tampon. Incuber pendant au moins 1 h (jusqu’à un maximum de 12 h) à 4 °C, à l’abri de la lumière.
- Avant de mesurer les échantillons par cytométrie en flux, laver les splenocytes deux fois dans un tampon de fixation/perméabilisation et les remettre en suspension dans un tampon FACS. Analyser l’activation des lymphocytes T cytotoxiques selon la stratégie de contrôle illustrée à la figure 2.
- Tout d’abord, pour détecter des cellules individuelles, épongez FSC-H contre FSC-A. Ensuite, pour détecter les cellules lymphoïdes, épongez SSC contre FSC-A. Par la suite, sélectionnez les cellules CD3+, CD4-, CD8+ vivantes et déterminez leur sous-ensemble producteur d’IFN-γ pour quantifier l’activation des lymphocytes T cytotoxiques dans la rate.
REMARQUE: Inclure une coloration fluorescence moins un (FMO) avec tous les fluorochromes à l’exception du fluorochrome ciblé contre l’IFN-γ comme contrôle technique négatif.
- Tout d’abord, pour détecter des cellules individuelles, épongez FSC-H contre FSC-A. Ensuite, pour détecter les cellules lymphoïdes, épongez SSC contre FSC-A. Par la suite, sélectionnez les cellules CD3+, CD4-, CD8+ vivantes et déterminez leur sous-ensemble producteur d’IFN-γ pour quantifier l’activation des lymphocytes T cytotoxiques dans la rate.
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Representative Results
Ce protocole vise à faciliter l’évaluation simple et facilement reproductible de l’immunogénicité des VE dérivés de tumeurs. Ainsi, les souris sont inoculées avec des VE dérivées de cultures in vitro de cellules tumorales exprimant l’antigène modèle de l’ovalbumine de poulet (OVA). La réponse immunitaire subséquente est analysée dans les lymphocytes T spléniques par cytométrie en flux.
La figure 1 donne un aperçu des étapes pratiques de l’ensemble du protocole. Étant donné que les travaux portent sur la mort cellulaire immunogène, la présentation croisée et l’immunité antitumorale induite par EV, ce protocole est limité à la fonction des lymphocytes T cytotoxiques CD8+. Comme le montre la figure 2, les cellules ont été regroupées en tant que cellules individuelles, sous-ensemble de lymphocytes (par taille et granularité), cellules viables (à l’exclusion d’un marqueur vie/mort) et lymphocytes T cytotoxiques CD3+ CD4-CD8+. L’accumulation intracellulaire d’IFN-γ a été évaluée comme marqueur de substitution pour l’activation. Les marqueurs supplémentaires possibles concernant la différenciation et l’épuisement des lymphocytes T sont discutés ci-dessous.
En utilisant la méthode décrite ici, les souris ont été immunisées avec des VE dérivés de cellules tumorales exprimant l’OVA cultivées soit dans des conditions de stress stable (non traitées) ou génotoxiques (traitées à l’oxaliplatine). Seules les souris auxquelles on a injecté des VE dérivées de cellules tumorales dans des conditions de stress génotoxique ont induit une activation puissante des lymphocytes T cytotoxiques spléniques chez les animaux receveurs (figure 3A). L’injection de VE dérivés de tumeurs dans des conditions d’équilibre a entraîné une certaine activation des lymphocytes T, mais cela n’était pas significativement différent de l’activation des lymphocytes T chez les souris injectées avec le véhicule PBS. Ces données montrent que sous stress génotoxique, les cellules tumorales peuvent libérer des VE potentiellement immunogènes. La production d’IFN-γ a été particulièrement augmentée lorsque les splenocytes d’animaux traités par EV tumoraux ont été restimulés ex vivo avec l’antigène tumoral modèle OVA avant analyse (Figure 3B). Ces données suggèrent que les VE dérivés de tumeurs peuvent induire des réponses immunitaires spécifiques à l’antigène tumoral. Il est intéressant de noter que la production d’IFN-γ - même si dans une bien moindre mesure - est également détectée en l’absence de restimulation spécifique de l’antigène. Il est possible que d’autres antigènes associés au mélanome, tels que l’antigène de différenciation TRP225, puissent être ciblés par une partie de la réponse des lymphocytes T induite par ev.
Figure 1 : Vue d’ensemble pictographique du protocole. (A) Procédure d’isolement des VE générés dans des cultures de cellules tumorales ressemblant à une chimiothérapie. (B) Calendrier d’immunisation des souris atteintes de VE. (C) Protocole de coloration pour l’analyse par cytométrie en flux des lymphocytes T cytotoxiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Stratégie de contrôle de cytométrie en flux pour analyser l’activation des lymphocytes T cytotoxiques dans la rate. Les chiffres représentent le pourcentage de sa population mère respective. FSC-A : zone de dispersion vers l’avant; FSC-H: hauteur de dispersion vers l’avant; SPC : dispersion latérale; vivant/mort : marqueur de mort cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Les VE dérivés de cellules tumorales soumises à un stress génotoxique peuvent induire des réponses de lymphocytes T spécifiques à l’antigène chez les animaux receveurs. (A) Les souris ont été immunisées avec des VE dérivés de cellules tumorales cultivées soit dans des conditions de stress stable (non traitées) ou génotoxiques (traitées à l’oxaliplatine). Les injections de véhicules (PBS) ont été utilisées comme témoin négatif. La production d’IFN-γ par les lymphocytes T cytotoxiques dans la rate lors de l’immunisation EV a été déterminée. Avec cela, les suspensions de cellules spléniques ont été restimulées avec de l’ovalbumine ex vivo avant l’analyse. (B) Les souris ont été traitées avec des VE dérivés de cellules tumorales dans des conditions de stress génotoxiques comme décrit ci-dessus. L’activation des lymphocytes T spléniques a été déterminée après restimulation ex vivo en présence ou en l’absence d’ovalbumine. Les barres représentent la moyenne par groupe et fouettent son erreur-type. Le test d’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) avec le posttest de Bonferroni a été utilisé pour plusieurs comparaisons statistiques d’un ensemble de données. Le niveau de signification a été fixé à P < 0,05, P < 0,01 et P < 0,001 et est indiqué ici par des astérisques (*, ** et ***). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole fournit une évaluation immunologique in vivo des VE dérivés de cellules de mélanome sous stress induit par la chimiothérapie tout en s’adaptant aux VE émis par divers cancers sous divers traitements. L’immunisation des souris avec des VE dérivés de cellules B16-OVA traitées à l’oxaliplatine, par exemple, élargit les lymphocytes T CD8+ producteurs d’IFN-γ dans la rate, qui sont ensuite stimulés par incubation ex vivo avec de l’ovalbumine, indiquant une réponse immunitaire spécifique à la tumeur. Ainsi, la détection des VE immunogènes par dépistage par ce protocole facilite une compréhension plus complète des thérapies conventionnelles contre le cancer et permet une enquête ciblée sur le rôle des VE dans l’immunologie du cancer.
Il est à noter que les expériences avec les véhicules électriques nécessitent des considérations particulières. Dans ce protocole, les VE sont semi-quantitativement normalisés au nombre de cellules tumorales libérées dans les 24 heures. Cette approche reflète l’objectif d’identifier une immunogénicité accrue, qu’elle résulte d’altérations de la qualité ou de la quantité de VE libérés. Par conséquent, les résultats reproductibles in vivo reposent sur l’efficacité constante de l’isolement des VE. À cette fin, il est essentiel de s’assurer que les granulés de VE sont remis en suspension entièrement et rapidement pour éviter la dessiccation.
De plus, les véhicules électriques doivent être quantifiés et caractérisés, par exemple par une analyse de suivi des nanoparticules et un transfert western de la transmembrane canonique, du luminal et d’au moins un marqueur EV négatif20. La quantification et la caractérisation des VE contrôlent l’isolement inconstant et traitent des différences quantitatives dans les VE ou les sous-ensembles de VE. Ce type de caractérisation des VE fait partie de l’information minimale qui doit être rapportée dans les études sur les vésicules extracellulaires, selon les directives de l’International Society of Extracellular Vesicles (ISEV). Cependant, diverses méthodes de caractérisation sont tout aussi légitimes et doivent être choisies en fonction de la disponibilité locale et de la question de recherche individuelle. Notamment, la définition de la posologie d’une substance d’intérêt ou l’irradiation ionisante constitue une autre étape critique du protocole, qui peut nécessiter une validation expérimentale pour atteindre un niveau adéquat de mort cellulaire.
En général, la contamination potentielle des VE isolés par la substance de traitement, les protéines solubles et les lipoprotéines doit être prise en compte. Une stratégie à cet égard consiste à reproduire l’expérience avec des techniques complémentaires d’isolation EV que le même type de contamination20 ne peut compromettre. L’immunoaffinité, par exemple, isole les VE avec un rendement inférieur mais une spécificité plus élevée que les méthodes purement basées sur les précipitations et peut fournir un contrôle approprié à cet égard26. Une autre approche consiste à comparer les VE dérivés de cellules de type sauvage avec des isolements de cellules génétiquement modifiées avec une délétion spécifique des gènes impliqués dans la biogenèse des VE ou à déployer des substances qui réduisent les émissions de VE20.
Les résultats obtenus à partir de ce protocole devraient être complétés par une caractérisation plus complète de la réponse immunitaire médiée par l’EV. En particulier, la classification des lymphocytes T CD8+ en cellules de mémoire effectrice et effectrice, par le biais de CD4427, ainsi que de cellules de mémoire centrale et naïves d’antigènes, par le biais de CD62L28, peut transmettre des informations plus approfondies. En outre, l’analyse des cellules T auxiliaires, des cellules T régulatrices et des cellules NK peut être intéressante. Pour tester l’efficacité antitumorale des VE, les souris peuvent être confrontées aux cellules cancéreuses correspondantes après avoir reçu l’immunisation EV ou traitées avec des VE contre un cancer préétabli, adaptant ainsi les directives de détection de la mort cellulaire immunogène2,29 à ce dérivé tumoral sans cellule. Cependant, les conclusions de toutes ces configurations expérimentales sont limitées par le fait que les cellules cancéreuses d’une boîte de Pétri génèrent potentiellement des VE fonctionnellement différents de ceux des cellules cancéreuses intégrées dans un microenvironnement tumoral dynamique30 qui supprime souvent l’immunité anticancéreuse. Ainsi, l’évaluation des VE dérivés de cocultures tumorales / fibroblastiques ou de tissus tumoraux ex vivo peut mieux refléter la situation réelle. Dans une prochaine étape translationnelle vers la réalité clinique, les VE du matériel du patient peuvent être analysés pour l’immunogénicité avant et pendant le traitement afin d’évaluer leur utilisabilité en tant que biomarqueurs.
Comme il a été récemment découvert que les VE dérivés du cancer modulent - dans certaines circonstances - le système immunitaire, le voyage d’exploration de leur potentiel clinique ne fait que commencer31. Pour une analyse approfondie des mécanismes immunitaires cooptés par les VE immunogènes, les outils utiles comprennent la microscopie à fluorescence visualisant l’absorption des VE par des cellules spécifiques, le déploiement de souris présentant des déficiences génétiques pour des voies immunitaires spécifiques et des méthodes de dépistage des altérations moléculaires du contenu des VE. En fin de compte, l’identification des VE immunogènes dérivés de tumeurs, avec les méthodes de dépistage décrites ici, permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de l’immunité médiée par la VE et constitue donc une étape cruciale vers l’exploitation de leur potentiel contre le cancer.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 et Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (à H.P.), une subvention de recherche Mechtild Harf de la Fondation DKMS pour donner la vie (à H.P.) une bourse de jeune chercheur de la Melanoma Research Alliance (à S.H.), une bourse de la Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (à F.S.), un fonds d’amorçage de l’Université technique de Munich (à S.H.) et une subvention de recherche de la Fondation Wilhelm Sander (2021.041.1, à S.H.). H. P. est soutenu par le Programme des jeunes chercheurs de l’EMBO.
CONTRIBUTIONS DES AUTEURS :
F.S., H.P. et S.H. ont conçu la recherche, analysé et interprété les résultats. F.S. et S.H. ont écrit le manuscrit. H.P. et S.H. ont guidé l’étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Clone 17A2 |
| Anti-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | Clone GK1.5 |
| Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Clone 53-6.7 |
| Anti-IFNγ PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
| Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
| Cell Strainer, 100 µm | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 µm |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM) |
| FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Calf Serum (FCS) |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | Fixation/Permeabilization Concentrate (10x) |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | 407952 | From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-032 | L-Glutamine (200 mM) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1 |
| Oxaliplatin | Pharmacy of MRI hospital | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 1514-122 | Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL) |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC) |
| PVDF filter, 0,22 µm, for syringes | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES |
| Syringe, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm) |
| Total Exosome Isolation Reagent | Invitrogen | 4478359 | For isolation from cell culture media |
| β-Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β-Mercaptoethanol (50 mM) |
References
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