Summary
Dit manuscript beschrijft hoe in vivo immunogeniciteit van tumorcel-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV's) kunnen worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie. EV's afgeleid van tumoren die door behandeling geïnduceerde immunogene celdood ondergaan, lijken bijzonder relevant in tumorimmunosurveillance. Dit protocol is een voorbeeld van de beoordeling van door oxaliplatine geïnduceerde immunostimulerende tumor-EV's, maar kan worden aangepast aan verschillende instellingen.
Abstract
Immunogene celdood van tumoren, veroorzaakt door chemotherapie of bestraling, kan tumorspecifieke T-celreacties veroorzaken door gevaargerelateerde moleculaire patronen vrij te geven en de productie van type I-interferon te induceren. Immunotherapieën, waaronder checkpoint-remming, vertrouwen voornamelijk op reeds bestaande tumorspecifieke T-cellen om een therapeutisch effect te ontvouwen. Synergetische therapeutische benaderingen die immunogene celdood gebruiken als een intrinsiek antikankervaccin kunnen dus hun reactievermogen verbeteren. Het spectrum van immunogene factoren die vrijkomen door cellen onder therapie-geïnduceerde stress blijft echter onvolledig gekarakteriseerd, vooral met betrekking tot extracellulaire blaasjes (EV's). EV's, vliezige deeltjes op nanoschaal die door vrijwel alle cellen worden uitgestoten, worden beschouwd als vergemakkelijken intercellulaire communicatie en bij kanker is aangetoond dat ze cross-priming tegen tumorantigenen bemiddelen. Om het immunogene effect van EV's afgeleid van tumoren onder verschillende omstandigheden te beoordelen, wordt gezocht naar aanpasbare, schaalbare en geldige methoden. Daarom wordt hierin een relatief eenvoudige en robuuste aanpak gepresenteerd om de in vivo immunogeniciteit van EV's te beoordelen. Het protocol is gebaseerd op flowcytometrie-analyse van milt T-cellen na in vivo immunisatie van muizen met EV's, geïsoleerd door op neerslag gebaseerde assays van tumorcelculturen onder therapie of steady-state omstandigheden. Dit werk toont bijvoorbeeld aan dat oxaliplatineblootstelling van B16-OVA-muizenmelanoomcellen resulteerde in de afgifte van immunogene EV's die de activering van tumorreactieve cytotoxische T-cellen kunnen bemiddelen. Daarom identificeert screening van EV's via in vivo immunisatie en flowcytometrie omstandigheden waaronder immunogene EV's kunnen ontstaan. Het identificeren van de voorwaarden voor immunogene EV-afgifte biedt een essentiële voorwaarde voor het testen van de therapeutische werkzaamheid van EV's tegen kanker en het verkennen van de onderliggende moleculaire mechanismen om uiteindelijk nieuwe inzichten te onthullen in de rol van EV's in de immunologie van kanker.
Introduction
Het immuunsysteem speelt een cruciale rol in de strijd tegen kanker, zowel wanneer het wordt aangezet door immuuncheckpointremming als voor de werkzaamheid van conventionele kankertherapieën. Tumorcellen die bezwijken voor genotoxische therapieën zoals de chemotherapeutische middelen oxaliplatine en doxorubicine, of ioniserende bestralingsbehandeling kunnen antigenen en gevaar-geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs) vrijgeven die mogelijk een adaptieve anti-tumor immuunrespons initiëren1. De meest prominente DAMPs, in de context van immunogene celdood, omvatten find-me-signalen zoals chemotactische ATP, eat-me-signalen zoals de blootstelling van calreticuline, die de opname van tumorcellen door antigeen-presenterende cellen bevordert, en de afgifte van HMGB1, die patroonherkenningsreceptoren activeert, waardoor de kruispresentatie van tumorantigenen2 wordt verbeterd. Bovendien worden type I-interferonen (IFN-I), geïnduceerd via tumor-afgeleide immunogene nucleïnezuren of andere stimuli, waargenomen door dendritische cellen, waardoor ze tumorspecifieke cytotoxische T-cellen effectief kunnen primen3,4. Klinisch gezien bieden geactiveerde en prolifererende CD8 + T-cellen die de tumor infiltreren een onafhankelijke prognostische factor voor langdurige overleving bij veel kankerpatiënten. Vrijgegeven uit dergelijke geactiveerde T-cellen, bemiddelt IFN-γ directe antiproliferatieve effecten op kankercellen en drijft Th1-polarisatie en cytotoxische T-celdifferentiatie aan, waardoor wordt bijgedragen aan effectieve immunosurveillance tegen kanker5,6. Oxaliplatine is een bonafide immunogene celdoodinductor, die een dergelijke adaptieve immuunrespons tegen kanker bemiddelt7. De overvloed aan initiële immunogene signalen die door tumorcellen worden afgegeven onder door therapie veroorzaakte stress, moet echter nog volledig worden onthuld. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in kankerimmunotherapie, blijft het uitbreiden van de voordelen ervan naar een groter deel van de patiënten een uitdaging. Een meer gedetailleerd begrip van immunogene signalen die T-celactivatie initiëren, kan de ontwikkeling van nieuwe therapieën begeleiden.
Een heterogene groep van membraan-ingesloten structuren, bekend als extracellulaire blaasjes (EV's), lijken te dienen als intercellulaire communicatie-apparaten. Uitgezonden door vrijwel alle celtypen, dragen EV's functionele eiwitten, RNA, DNA en andere moleculen naar een ontvangende cel of kunnen de functionele toestand van een cel veranderen door zich te binden aan receptoren op het celoppervlak. Hun biologisch actieve lading varieert aanzienlijk door het type en de functionele toestand van de genererende cel8. In de kankerimmunologie worden EV's die vrijkomen uit tumorcellen voornamelijk beschouwd als vijandig tegenover immunotherapie omdat ze uiteindelijk invasieve groei bevorderen, gemetastaseerde niches prevormen9 en de immuunrespons onderdrukken10. Daarentegen hebben sommige studies aangetoond dat EV's tumorantigenen kunnen overbrengen naar dendritische cellen voor effectieve kruispresentatie11,12. EV's kunnen immunostimulerende nucleïnezuren leveren als ze ontstaan onder door therapie geïnduceerde stress, waardoor een antitumorimmuunrespons wordt vergemakkelijkt13,14. Het is onlangs aangetoond dat detectie van dergelijke RNA- en DNA-aangeboren immuunliganden in de micro-omgeving van de tumor de responsiviteit op checkpointblokkade aanzienlijk moduleert15,16,17. Daarom moet de immunogene rol van EV's die vrijkomen door tumorcellen onder verschillende therapie-geïnduceerde stress verder worden opgehelderd. Aangezien EV's een jong maar groeiend onderzoeksgebied vormen, is de standaardisatie van methoden nog steeds aan de gang. Daarom is het delen van kennis essentieel om de reproduceerbaarheid van onderzoek naar interacties tussen EV's en kankerimmunologie te verbeteren. Met dit in gedachten beschrijft dit manuscript een eenvoudig protocol om het immunogene effect van tumor-afgeleide EV's in vivo te beoordelen.
Deze beoordeling wordt uitgevoerd door tumor-afgeleide EV's te genereren, ontvangende muizen met die EV's te immuniseren en milt-T-cellen te analyseren via flowcytometrie. EV-generatie wordt idealiter uitgevoerd door muriene tumorcellen te zaaien in een EV-vrij celkweekmedium voor een hoge mate van zuiverheid. Cellen worden behandeld met een specifieke celstressprikkel, zoals chemotherapie, om het effect van therapie-geïnduceerde EV's te vergelijken met baseline immunogeniciteit van de respectieve tumor-afgeleide EV's. De isolatie van EV's kan heel goed worden uitgevoerd door verschillende technieken die moeten worden geselecteerd op basis van in vivo toepasbaarheid en lokale beschikbaarheid. Het volgende protocol beschrijft een op neerslag gebaseerde test met een commerciële kit voor EV-zuivering. Muizen worden twee keer geïmmuniseerd met die EV's. Veertien dagen na de eerste injectie worden T-cellen uit de milt geëxtraheerd en geanalyseerd op IFN-γ productie via flowcytometrie om een systemische immuunrespons te evalueren. Hiermee wordt het potentieel van tumor-afgeleide EV's, die onder verschillende therapeutische regimes ontstaan, om anti-tumor T-celresponsen te induceren relatief eenvoudig, snel en met hoge validiteit beoordeeld13. Daarom is deze methode geschikt voor een immunologische screening van EV's afgeleid van kankercellen onder verschillende omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aan het begin van de experimenten waren muizen minstens 6 weken oud en werden ze onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden. Dit protocol voldoet aan de institutionele ethische normen en de geldende lokale regelgeving. Dierstudies werden goedgekeurd door de lokale regelgevende instantie (Regierung von Oberbayern, München, Duitsland). Mogelijke geslachtsgerelateerde vooroordelen werden in deze studies niet onderzocht.
1. Generatie en isolatie van EV's afgeleid van tumorcellen na blootstelling aan chemotherapie
- Kweekmuun B16 melanoomcellen die ovalbumine (B16-OVA) tot expressie brengen in DMEM (met 4 mM L-glutamine en 4,5 g/L D-glucose) aangevuld met FCS (10% v/v), penicilline (100 eenheden/ml) en streptomycine (100 μg/ml) bij 37 °C, totdat de cellen gestaag groeien en ongeveer 90% confluent zijn.
OPMERKING: Voer dit gedeelte van het protocol volledig onder steriele omstandigheden uit met behulp van een celkweekkap. Voor analyse van andere kankerentiteiten hebben cellijnen die een krachtig antigeen tot expressie brengen de voorkeur om antigeenspecifieke T-celresponsen te beoordelen, omdat ze specifieke ex vivo antigeen restimulatie mogelijk maken. - Om de celkweekmedia voor te bereiden die nodig zijn voor ev-generatie, deputeert u bovine EV's binnen FCS door ultracentrifugatie bij 100.000 x g gedurende 24 uur bij 4 °C en gooit u de pellet vervolgens weg. U kunt ook vooraf een commercieel preparaat kiezen met weinig ev's voor dieren.
- Oogst B16-OVA-cellen en was ze twee keer in PBS en zaai vervolgens in een concentratie van 400.000 cellen / ml in EV-uitgeputte media.
OPMERKING: Pas de celconcentratie aan de groeidynamiek van de onderzochte cellijn aan, zodat cellen niet overgroeien. - Behandel B16-OVA-cellen door 30 μg oxaliplatine per ml toe te voegen en incamineer gedurende 24 uur bij 37 °C. Laat de controleomstandigheden onbehandeld. Titreer bij het eerste gebruik van een genotoxische stof de gewenste cytotoxische werkzaamheid met behulp van cel-levensvatbaarheidstests zoals trypan blue exclusion18.
OPMERKING: Deze test kan ook EV's evalueren die worden gegenereerd in celculturen die zijn behandeld met andere immuunmodulerende stoffen of ioniserende bestraling naast chemotherapeutica.
LET OP: Oxaliplatine veroorzaakt huid- en ernstige oogirritatie en kan een allergische huidreactie en irritatie van de luchtwegen veroorzaken. Oxaliplatine wordt verdacht van het veroorzaken van kanker. Gebruik uit voorzorg persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder geschikte handschoenen, brillen, maskers en kleding, gereinigd voor hergebruik. Vermijd inademing en was de handen grondig na het hanteren. Vermijd lozing in het milieu en gooi oxaliplatine weg volgens de geldende voorschriften. Verkrijg gedetailleerde informatie uit het veiligheidsinformatieblad. - Verzamel celkweek supernatant. Centrifugeer eerst bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en vervolgens bij 2.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C, waarbij telkens de pellet wordt weggegooid. Filter ten slotte door een 220 nm PVDF-membraan. Gebruik voor elke stap een nieuwe buis om celresten te verwijderen.
OPMERKING: In dit stadium kan het EV-bevattende supernatant gedurende een dag bij 4 °C worden bewaard voordat het protocol wordt hervat. Het wordt echter sterk aanbevolen om zich te houden aan het beschreven schema met onmiddellijke EV-zuivering. - Meng 1 ml supernatant met 0,5 ml van een specifiek in de handel verkrijgbaar exosoomisolatiereagens (zie materiaaltabel) in een V-vormige buis van 1,5 ml. Pipetteer grondig op en neer of vortex om een homogene oplossing te creëren. Incubeer een nacht bij 4 °C.
- Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 60 min bij 4 °C. Gooi het supernatant voorzichtig weg. Verwijder de resterende druppels door de buis van 1,5 ml ondersteboven op een papieren handdoek te tikken en door een pipet met een fijne punt te zuigen zonder de EV-pellet aan de onderkant aan te raken.
- Verwijder alle vloeistoffen grondig om ongecontroleerde verdunning van de EV-pellet te voorkomen. Voer deze taken ook snel uit om te voorkomen dat de pellet uitdroogt.
- Resuspend de EV's in koude PBS door op en neer te pipetteren zonder de pellet met de punt uit de wand van de buis te krassen. Breng nu de ophanging stap voor stap over van de eerste naar de laatste buis om de EV's te poolen.
OPMERKING: Gebruik een volume PBS dat gelijk is aan 5 μL vermenigvuldigd met het aantal buisjes. 5 μL van de eindsuspensie bevat de geïsoleerde EV's die vrijkomen uit 400.000 cellen onder chemotherapie of in een steady state. - Gebruik ev's bij voorkeur direct. Als dit niet mogelijk is, bewaar EV-suspensies bij -80 °C in gesiliconiseerde vaten gedurende maximaal 28 dagen tot de toepassing.
OPMERKING: De EV's die hier en in verschillende andere publicaties worden beschreven, verliezen hun respectieve biologische functie niet wanneer ze gedurende die periode bij -80 °C worden bewaard19. - Kwantificeer en karakteriseer EV-isolaten volgens de MISEV2018-richtlijnen20.
OPMERKING: Mogelijke methoden voor kwantificering zijn nanodeeltjesvolganalyse (NTA)21 en de detectie van EV's membraangebonden eiwitten22. Mogelijke benaderingen om EV's verder te karakteriseren zijn elektronenmicroscopie23 en western blot20.
2. Immunisatie van muizen met EV's
- Plan het in vivo experiment met C57BL/6-muizen (of andere syngenetische muizen die overeenkomen met de tumorcellijn), inclusief behandelingsgroepen die EV's ontvangen die zijn afgeleid van respectievelijk behandelde cellen, onbehandelde cellen en PBS (vehikel).
OPMERKING: Gebruik bij voorkeur muizen op de leeftijd van 6-8 weken om te voorkomen dat fysiologische senescentie de immuunrespons vermindert24. - Meng 5 μL EV-suspensie met 55 μL koude PBS voor elke muis binnen de respectieve behandelingsgroep om deze te immuniseren met EV's geïsoleerd uit 4,0 x 105 B16-OVA-cellen.
OPMERKING: Dit aantal EV's komt overeen met ongeveer 2 x 109 deeltjes gemeten door nanodeeltjes tracking analyse (gegevens niet getoond). OVA-eiwit gemengd met een adjuvans (bijv. LPS) kan worden toegepast als een krachtige vaccinpositieve controle.- Vul spuiten (naaldgrootte 26-30 G) met respectievelijk 60 μL van de verdunde EV's of PBS en zet ze onmiddellijk op ijs.
OPMERKING: In het protocol wordt de hoeveelheid geïnjecteerde EV's genormaliseerd naar het aantal EV-vrijgevende tumorcellen om experimenteel zowel kwalitatieve als kwantitatieve effecten van oxaliplatine op tumorcel EV-biogenese te overwegen. Voor sommige lezers kan normalisatie tot een specifieke concentratie van geproduceerde EV's beter passen bij hun experimentele opstelling, afhankelijk van hun wetenschappelijke vraag.
- Vul spuiten (naaldgrootte 26-30 G) met respectievelijk 60 μL van de verdunde EV's of PBS en zet ze onmiddellijk op ijs.
- Ent EV's of PBS subcutaan in het mediale aspect van de dij van de muis en herhaal de immunisatie na 7 dagen. Veertien dagen na de eerste behandeling offert u muizen op, bijvoorbeeld door cervicale dislocatie om de immuunrespons te analyseren.
OPMERKING: Alternatieve subcutane injectieroutes kunnen worden gebruikt, volgens de lokale normen.
3. Flowcytometrie analyse van milt T-cellen
- Bereid en koel volledige RPMI (cRPMI), aangevuld met RPMI-1640 met FCS (10% v / v), penicilline (100 eenheden / ml), streptomycine (100 μg / ml), L-glutamine (2 mM) en β-mercaptoethanol (50 μM).
- Reseceer de milt uit de geopende buikholte. Pureer de milt met een bevochtigde celzeef van 100 μm en de plastic zuiger van een spuit en spoel de miltcellen in een buis van 50 ml met 5-10 ml cRPMI. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
OPMERKING: Houd cellen waar mogelijk op ijs. Om de lokale in plaats van de miltimmuunrespons te analyseren, reseceer je de drainerende popliteale en inguinale lymfeklieren, volgens hetzelfde protocol. Sla in dit geval de volgende stap over voor de lysis van erytrocyten. - Om erytrocyten uit de celsuspensie te verwijderen, resuspendeert u de pellet met 2 ml lysisbuffer voor rode bloedcellen (zie materiaaltabel) en incubeert u gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Stop vervolgens de reactie door cRPMI toe te voegen. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
- Voor het zaaien, resuspend de celkorrel in cRPMI en tel de cellen om drievoudige van 200.000 cellen met 200 μL cRPMI in elke put te plaatsen, met behulp van een 96-putplaat met een U-vormige bodem. Incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C.
OPMERKING: Om de antigeenspecificiteit van geactiveerde T-cellen aan te pakken, voegt u respectievelijk 1 μg /ml oplosbaar ovalbumine (of een ander tumorantigeen dat overeenkomt met de onderzochte cellijn) toe of laat u zonder extra stimulus. Het toevoegen van het immuun-dominante peptide epitoop SIINFEKL, in plaats van ovalbumine over de volledige lengte, zorgt voor een kortere incubatietijd. Naast flowcytometrie kunnen het serum van de muizen en het celkweeksupernatant na 48 uur incubatie worden geanalyseerd op verschillende cytokines. - Na 48 uur, om intracellulaire IFN-γ kleuring te verbeteren door onder andere de Golgi-gemedieerde secretie van eiwitten te blokkeren, voegt u Brefeldin A (5 ng / ml), PMA (20 ng / ml) en ionomycine (1 μg / ml) toe aan de celcultuur. Incubeer gedurende 4 uur bij 37 °C.
- Voordat u oppervlaktebiomarkers kleurt, brengt u splenocyten over naar een 96-putplaat met een V-vormige bodem en wast u tweemaal met PBS. Voeg vervolgens fluorescerende antilichamen toe, compatibel met de lokaal beschikbare flowcytometer, gericht tegen oppervlaktebiomarkers, CD3, CD8 en CD4 (zie Tabel met materialen), verdund 1:400, plus een fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof, verdund 1:1.000 in PBS. Resuspend gepelleteerde splenocyten in de kleuringsoplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C, beschermd tegen licht.
- Voor fixatie en permeabilisatie van splenocyten tweemaal wassen in FACS-buffer (PBS plus 3% v/v FCS), en vervolgens resuspend in 100 μL fixatie/permeabilisatiebuffer (zie Tabel met materialen) per put. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C, beschermd tegen licht.
- Voor kleuring van intracellulaire IFN-γ, was splenocyten in fixatie/permeabilisatiebuffer en resuspend met fluorescerende antilichamen tegen IFN-γ, verdund 1:200 in de buffer. Incubeer gedurende ten minste 1 uur (tot een maximum van 12 uur) bij 4 °C, beschermd tegen licht.
- Voordat de monsters met flowcytometrie worden gemeten, moet u splenocyten tweemaal wassen in fixatie-/permeabilisatiebuffer en resuspend in FACS-buffer. Analyseer de activering van cytotoxische T-cellen volgens de gating-strategie in figuur 2.
- Ten eerste, om afzonderlijke cellen te detecteren, dep FSC-H tegen FSC-A. Om vervolgens lymfoïde cellen te detecteren, dep ssc tegen FSC-A. Selecteer vervolgens levende CD3+,CD4-, CD8+-cellen en bepaal hun IFN-γ-producerende subset om de activering van cytotoxische T-cellen in de milt te kwantificeren.
OPMERKING: Voeg een fluorescentie-minus-één (FMO) vlek toe met alle fluorochchromen behalve het fluorochroom gericht tegen IFN-γ als negatieve technische controle.
- Ten eerste, om afzonderlijke cellen te detecteren, dep FSC-H tegen FSC-A. Om vervolgens lymfoïde cellen te detecteren, dep ssc tegen FSC-A. Selecteer vervolgens levende CD3+,CD4-, CD8+-cellen en bepaal hun IFN-γ-producerende subset om de activering van cytotoxische T-cellen in de milt te kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol is bedoeld om de eenvoudige en gemakkelijk reproduceerbare beoordeling van de immunogeniciteit van tumor-afgeleide EV's te vergemakkelijken. Hierbij worden muizen geënt met EV's afgeleid van in vitro culturen van tumorcellen die het modelantigeen kippenovoalbumine (OVA) tot expressie brengen. De daaropvolgende immuunrespons wordt geanalyseerd in milt T-cellen via flowcytometrie.
Figuur 1 geeft een overzicht van de praktische stappen van het gehele protocol. Omdat het werk zich richt op immunogene celdood, kruispresentatie en EV-geïnduceerde antitumorimmuniteit, is dit protocol beperkt tot de functie van CD8 + cytotoxische T-cellen. Zoals weergegeven in figuur 2, waren cellen gated als afzonderlijke cellen, lymfocytensubset (naar grootte en granulariteit), levensvatbare cellen (exclusief een leven / dode marker) en CD3 + CD4- CD8 + cytotoxische T-cellen. Intracellulaire accumulatie van IFN-γ werd beoordeeld als een surrogaatmarker voor activering. Mogelijke aanvullende markers met betrekking tot T-celdifferentiatie en uitputting worden hieronder besproken.
Met behulp van de hier beschreven methode werden muizen geïmmuniseerd met EV's afgeleid van OVA-tot expressie brengende tumorcellen gekweekt onder steady-state (onbehandeld) of genotoxische stressomstandigheden (met oxaliplatine behandeld). Alleen muizen geïnjecteerd met EV's afgeleid van tumorcellen onder genotoxische stressomstandigheden veroorzaakten krachtige activering van miltcytotoxische T-cellen bij ontvangende dieren (figuur 3A). Injectie van EV's afgeleid van tumoren onder steady-state omstandigheden resulteerde in enige T-celactivatie, maar dat verschilde niet significant van T-celactivatie bij muizen geïnjecteerd met het PBS-voertuig. Deze gegevens tonen aan dat tumorcellen onder genotoxische stress krachtig immunogene EV's kunnen afgeven. De productie van IFN-γ was met name verhoogd wanneer splenocyten van met tumor-EV behandelde dieren ex vivo werden geherimuleerd met het modeltumorantigeen OVA vóór analyse (figuur 3B). Deze gegevens suggereren dat tumor-afgeleide EV's tumorantigeenspecifieke immuunresponsen kunnen induceren. Interessant is dat IFN-γ-productie - hoewel in veel mindere mate - ook wordt gedetecteerd in afwezigheid van antigeenspecifieke restimulatie. Mogelijk kunnen andere melanoom-geassocieerde antigenen, zoals het differentiatieantigeen TRP225, het doelwit zijn van een deel van de EV-geïnduceerde T-celrespons.
Figuur 1: Pictografisch overzicht van het protocol. (A) Isolatieprocedure van EV's gegenereerd in tumorcelculturen die lijken op chemotherapie. (B) Schema voor de immunisatie van muizen met EV's. (C) Kleuringsprotocol voor flowcytometrie-analyse van cytotoxische T-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Flowcytometrie gating strategie om cytotoxische T-cel activatie in de milt te analyseren. De cijfers vertegenwoordigen het percentage van de respectieve ouderpopulatie. FSC-A: voorwaarts strooigebied; FSC-H: voorwaartse strooihoogte; SSC: zijwaartse verstrooiing; levend/dood: celdoodmarker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: EV's afgeleid van tumorcellen onder genotoxische stress kunnen antigeenspecifieke T-celresponsen induceren bij ontvangende dieren. (A) Muizen werden geïmmuniseerd met EV's afgeleid van tumorcellen gekweekt onder steady-state (onbehandeld) of genotoxische stressomstandigheden (met oxaliplatine behandeld). Voertuig (PBS) injecties werden gebruikt als een negatieve controle. Ifn-γ productie door cytotoxische T-cellen in de milt na EV-immunisatie werd bepaald. Hiermee werden miltcelsuspensies vóór analyse opnieuw geïmuleerd met ovoalbumine ex vivo . (B) Muizen werden behandeld met EV's afgeleid van tumorcellen onder genotoxische stressomstandigheden zoals hierboven beschreven. Milt-T-celactivatie werd bepaald na ex vivo restimulatie, hetzij in de aan- of afwezigheid van ovalbumine. Balken geven het gemiddelde per groep weer en snorren zijn standaardfout. De one-way analysis of variance (ANOVA) test met Bonferroni posttest werd gebruikt voor meerdere statistische vergelijkingen van een dataset. Het significantieniveau is vastgesteld op P < 0,05, P < 0,01 en P < 0,001 en wordt hier aangegeven met sterretjes (*, **, en ***). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol biedt een immunologische in vivo beoordeling van EV's afgeleid van melanoomcellen onder chemotherapie-geïnduceerde stress, terwijl het zich aanpast aan EV's die worden uitgezonden door verschillende kankers onder verschillende behandelingen. Het immuniseren van muizen met EV's afgeleid van met oxaliplatine behandelde B16-OVA-cellen, bijvoorbeeld, breidt IFN-γ-producerende CD8 + T-cellen in de milt uit, die verder worden gestimuleerd door ex vivo incubatie met ovalbumine, wat wijst op een tumorspecifieke immuunrespons. Detectie van immunogene EV's door screening via dit protocol vergemakkelijkt dus een uitgebreider begrip van conventionele kankertherapieën en maakt een gericht onderzoek mogelijk naar de rol van EV's in de immunologie van kanker.
Let op, experimenten met EV's vereisen enkele speciale overwegingen. In dit protocol worden EV's semikwantitatief genormaliseerd naar het aantal tumorcellen dat binnen 24 uur vrijkomt. Deze benadering weerspiegelt het doel om verbeterde immunogeniciteit te identificeren, ongeacht of deze het gevolg is van veranderingen in kwaliteit of kwantiteit van vrijgegeven EV's. Daarom zijn reproduceerbare in vivo resultaten afhankelijk van de constante isolatie-efficiëntie van EV's. Hiertoe is het een cruciale stap om ervoor te zorgen dat EV-pellets volledig en snel worden geresuspendeerd om uitdroging te voorkomen.
Bovendien moeten EV's worden gekwantificeerd en gekarakteriseerd, bijvoorbeeld door nanodeeltjesvolganalyse en western blot van canonieke transmembraan, luminale en ten minste één negatieve EV-marker20. Het kwantificeren en karakteriseren van EV's regelt voor inconsistente isolatie en pakt kwantitatieve verschillen in EV's of EV-subsets aan. Dit type EV-karakterisering maakt deel uit van de minimale informatie die moet worden gerapporteerd in studies over extracellulaire blaasjes, volgens de richtlijnen van de International Society of Extracellular Vesicles (ISEV). Verschillende karakteriseringsmethoden zijn echter even legitiem en moeten worden geselecteerd met betrekking tot lokale beschikbaarheid en de individuele onderzoeksvraag. Met name het bepalen van de dosering van een stof van belang of ioniserende bestraling vormt een andere kritieke stap van het protocol, die experimentele validatie kan vereisen om een adequaat niveau van celdood te bereiken.
Over het algemeen moet rekening worden gehouden met mogelijke besmetting van geïsoleerde EV's met de behandelingsstof, oplosbare eiwitten en lipoproteïnen. Een strategie in dit verband bestaat erin het experiment te reproduceren met complementaire EV-isolatietechnieken die hetzelfde type verontreiniging20 niet in gevaar mag brengen. Immunoaffiniteit isoleert bijvoorbeeld EV's met een lagere opbrengst maar een hogere specificiteit dan zuiver op neerslag gebaseerde methoden en kan in dit opzicht een passende controle bieden26. Een alternatieve benadering is om van wild-type cellen afgeleide EV's te vergelijken met isolaties van genetisch gemanipuleerde cellen met een specifieke deletie van genen die betrokken zijn bij EV-biogenese of stoffen in te zetten die de emissie van EV's verminderen20.
De resultaten van dit protocol moeten worden aangevuld met een uitgebreidere karakterisering van de EV-gemedieerde immuunrespons. Vooral de classificatie van CD8+ T-cellen in effector- en effectorgeheugencellen, via CD4427, evenals antigeen-naïeve en centrale geheugencellen, via CD62L28, kan dieper inzicht geven. Bovendien kan de analyse van T-helpercellen, regulerende T-cellen en NK-cellen van belang zijn. Voor het testen van de anti-tumor werkzaamheid van EV's, kunnen muizen worden uitgedaagd met de overeenkomstige kankercellen na ontvangst van EV-immunisatie of behandeld met EV's tegen een vooraf vastgestelde kanker, waardoor de richtlijnen voor detectie van immunogene celdood2,29 worden aangepast aan dit celvrije tumorderivaat. De conclusies van al deze experimentele opstellingen worden echter beperkt door het feit dat kankercellen in een petrischaal mogelijk functioneel andere EV's genereren dan kankercellen die zijn ingebed in een dynamische tumormicro-omgeving30 die vaak de immuniteit tegen kanker onderdrukt. Het beoordelen van EV's afgeleid van tumor / fibroblast-coculturen of ex vivo tumorweefsel kan dus de werkelijke situatie beter weerspiegelen. In een volgende translationele stap naar de klinische realiteit kunnen EV's uit patiëntenmateriaal voor en tijdens de therapie worden geanalyseerd op immunogeniciteit om hun bruikbaarheid als biomarkers te beoordelen.
Aangezien onlangs van kanker afgeleide EV's het immuunsysteem bleken te moduleren, is de reis van het verkennen van hun klinische potentieel nog maar net begonnen31. Voor een diepgaande analyse van de immuunmechanismen gecoöpteerd door immunogene EV's, omvatten nuttige hulpmiddelen fluorescentiemicroscopie die de EV-opname door specifieke cellen visualiseert, de inzet van muizen met genetische tekortkomingen voor specifieke immuunroutes en screeningsmethoden voor moleculaire veranderingen in de EV-inhoud. Uiteindelijk zal het identificeren van immunogene tumor-afgeleide EV's, met screeningsmethoden die hierin worden beschreven, een beter begrip mogelijk maken van de onderliggende mechanismen achter EV-gemedieerde immuniteit en vormt daarom een cruciale stap in de richting van het benutten van hun potentieel tegen kanker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 en Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (aan H.P.), een Mechtild Harf Research Grant van de DKMS Foundation for Giving Life (aan H.P.), een Young Investigator Award van de Melanoma Research Alliance (aan S.H.), een beurs van de Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (aan F.S.), een Seed Fund van de Technische Universiteit München (aan S.H.) en een onderzoekssubsidie van de Wilhelm Sander Stichting (2021.041.1, aan S.H.). H.P. wordt ondersteund door het EMBO Young Investigator Program.
BIJDRAGEN VAN DE AUTEUR:
F.S., H.P. en S.H. ontwierpen het onderzoek, analyseerden en interpreteerden de resultaten. F.S. en S.H. schreven het manuscript. H.P. en S.H. begeleidden het onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Clone 17A2 |
| Anti-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | Clone GK1.5 |
| Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Clone 53-6.7 |
| Anti-IFNγ PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
| Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
| Cell Strainer, 100 µm | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 µm |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM) |
| FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Calf Serum (FCS) |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | Fixation/Permeabilization Concentrate (10x) |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | 407952 | From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-032 | L-Glutamine (200 mM) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1 |
| Oxaliplatin | Pharmacy of MRI hospital | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 1514-122 | Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL) |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC) |
| PVDF filter, 0,22 µm, for syringes | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES |
| Syringe, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm) |
| Total Exosome Isolation Reagent | Invitrogen | 4478359 | For isolation from cell culture media |
| β-Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β-Mercaptoethanol (50 mM) |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).
- Kepp, O., et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death. Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).
- Fuertes, M. B., et al. Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).
- Sistigu, A., et al. Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy. Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Shankaran, V., et al. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).
- Tesniere, A., et al. Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin. Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Zomer, A., van Rheenen, J. Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications. Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).
- Whiteside, T. L. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).
- Wolfers, J., et al. Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming. Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).
- Zeelenberg, I. S., et al. Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses. Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).
- Diamond, J. M., et al. Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs. Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).
- Kitai, Y., et al. DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity. Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).
- Heidegger, S., et al. RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade. Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).
- Schadt, L., et al. Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity. Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).
- Cheng, Y., et al. In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).
- Yuana, Y., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice. European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).
- Bloom, M. B., et al. Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma. The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation. The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).
- Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes. PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).
- Bek, S., et al. Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines. Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).
- Nabet, B. Y., et al. Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer. Cell. 170 (2), 352-366 (2017).
- Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).
