Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

एकल-कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल, उच्च-थ्रूपुट, और पूरी तरह से स्वचालित डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62832
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Molecular Biophysics Unit, Indian Institute of Science, 2Gatan Inc.

Summary

एकल-कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी उच्च-थ्रूपुट स्वचालित डेटा अधिग्रहण के लिए एक उपयुक्त सॉफ़्टवेयर पैकेज और उपयोगकर्ता के अनुकूल पाइपलाइन की मांग करती है। यहां, हम एक पूरी तरह से स्वचालित छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पैकेज, अक्षांश-एस, और कम खुराक की स्थिति के तहत विट्रीफाइड बायोमोलेक्यूल्स के डेटा संग्रह के लिए एक व्यावहारिक पाइपलाइन के आवेदन को प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

पिछले कई वर्षों में, एकल-कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) में तकनीकी और पद्धतिगत प्रगति ने जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स के उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए एक नया एवेन्यू प्रशस्त किया है। क्रायो-ईएम में उल्लेखनीय प्रगति के बावजूद, एकल-कण विश्लेषण वर्कफ़्लो के विभिन्न पहलुओं में सुधार के लिए अभी भी गुंजाइश है। एकल-कण विश्लेषण उच्च-थ्रूपुट स्वचालित डेटा अधिग्रहण के लिए एक उपयुक्त सॉफ़्टवेयर पैकेज की मांग करता है। पिछले आठ वर्षों में एकल-कण क्रायो-ईएम के लिए स्वचालित इमेजिंग के लिए कई स्वचालित डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पैकेज विकसित किए गए थे। यह पेपर कम खुराक की स्थिति के तहत vitrified biomolecules के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित छवि अधिग्रहण पाइपलाइन का एक आवेदन प्रस्तुत करता है।

यह एक सॉफ़्टवेयर पैकेज को प्रदर्शित करता है, जो क्रायो-ईएम डेटा को पूरी तरह से, स्वचालित रूप से और सटीक रूप से एकत्र कर सकता है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न माइक्रोस्कोपिक पैरामीटर आसानी से इस सॉफ़्टवेयर पैकेज द्वारा नियंत्रित किए जाते हैं। यह प्रोटोकॉल गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम-कोरोनोवायरस 2 (SARS-CoV-2) स्पाइक प्रोटीन के स्वचालित इमेजिंग में इस सॉफ़्टवेयर पैकेज की क्षमता को प्रदर्शित करता है, जिसमें एक प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर (डीईडी) से सुसज्जित 200 केवी क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप होता है। डेटा संग्रह के एक सत्र (48 ज) में लगभग 3,000 क्रायो-ईएम फिल्म छवियों का अधिग्रहण किया गया था, जिससे सार्स-कोव -2 के स्पाइक प्रोटीन की परमाणु-रिज़ॉल्यूशन संरचना उत्पन्न हुई थी। इसके अलावा, यह संरचनात्मक अध्ययन इंगित करता है कि स्पाइक प्रोटीन दो प्रमुख संरचनाओं को अपनाता है, 1-आरबीडी (रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन) खुले और सभी आरबीडी बंद संरचनाओं को नीचे।

Introduction

एकल कण क्रायो-ईएम जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स 1 के उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए एक मुख्यधारा की संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीक बन गई है। एकल-कण पुनर्निर्माण दो-आयामी (2 डी) कण छवियों को निकालने के लिए विट्रीफाइड नमूनों के माइक्रोग्राफ की एक विशाल संख्या प्राप्त करने पर निर्भर करता है, जिसका उपयोग तब जैविक मैक्रोमोलेक्यूल 2,3 की तीन आयामी (3 डी) संरचना के पुनर्निर्माण के लिए किया जाता है। डीईडी के विकास से पहले, एकल-कण पुनर्निर्माण से प्राप्त संकल्प 4 और 30 Å4,5 के बीच था। हाल ही में, एकल कण क्रायो-ईएम से प्राप्त करने योग्य संकल्प 1.8 Å6 से परे पहुंच गया है। डीईडी और स्वचालित डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर इस संकल्प क्रांति 7 में प्रमुख योगदानकर्ता रहे हैं, जहां डेटा संग्रह के लिए मानव हस्तक्षेप न्यूनतम है। आम तौर पर, क्रायो-ईएम इमेजिंग जैविक नमूनों के इलेक्ट्रॉन बीम-प्रेरित विकिरण क्षति को कम करने के लिए कम इलेक्ट्रॉन खुराक दरों (20-100 ई / Å2) पर किया जाता है, जो छवि में कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) में योगदान देता है। यह कम एसएनआर एकल-कण विश्लेषण का उपयोग करके जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स की उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं के लक्षण वर्णन को बाधित करता है।

नई पीढ़ी के इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर CMOS (पूरक धातु-ऑक्साइड-अर्धचालक) -आधारित डिटेक्टर हैं, जो इन कम एसएनआर से संबंधित बाधाओं को दूर कर सकते हैं। ये प्रत्यक्ष पहचान CMOS कैमरे सिग्नल के तेजी से रीडआउट की अनुमति देते हैं, जिसके कारण कैमरा जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स के लिए बेहतर बिंदु प्रसार समारोह, उपयुक्त एसएनआर और उत्कृष्ट जासूस क्वांटम दक्षता (डीक्यूई) में योगदान देता है। प्रत्यक्ष पहचान कैमरे रिकॉर्ड की गई छवियों में उच्च एसएनआर 8 और कम शोर प्रदान करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप जासूस क्वांटम दक्षता (डीक्यूई) में मात्रात्मक वृद्धि होती है - एक डिटेक्टर एक छवि में कितना शोर जोड़ता है, इसका एक उपाय। ये कैमरे सैकड़ों फ्रेम प्रति सेकंड की गति से फिल्में भी रिकॉर्ड करते हैं, जो तेजी से डेटा अधिग्रहण 9,10 को सक्षम बनाता है। ये सभी विशेषताएं कम खुराक वाले अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त तेजी से प्रत्यक्ष पहचान कैमरों को बनाती हैं।

मोशन-सही स्टैक छवियों का उपयोग डेटा प्रोसेसिंग के लिए 2 डी वर्गीकरण की गणना करने और विभिन्न सॉफ़्टवेयर पैकेजों जैसे RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14, और EMAN215 का उपयोग करके मैक्रोमोलेक्यूल्स के 3 डी घनत्व मानचित्र का पुनर्निर्माण करने के लिए किया जाता है। हालांकि, एकल-कण विश्लेषण के लिए, एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना प्राप्त करने के लिए एक विशाल डेटासेट की आवश्यकता होती है। इसलिए, स्वचालित डेटा अधिग्रहण टोल डेटा संग्रह के लिए अत्यधिक आवश्यक हैं। बड़े क्रायो-ईएम डेटा सेट रिकॉर्ड करने के लिए, पिछले एक दशक में कई सॉफ़्टवेयर पैकेजों का उपयोग किया गया है। समर्पित सॉफ़्टवेयर पैकेज, जैसे AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS, और EPU, स्वचालित डेटा अधिग्रहण के लिए विकसित किए गए हैं।

ये सॉफ़्टवेयर पैकेज नियमित कार्यों का उपयोग करते हैं ताकि कम-आवर्धन छवियों को उच्च-आवर्धन छवियों से जोड़कर स्वचालित रूप से छेद की स्थिति को ढूंढा जा सके, जो कम खुराक की स्थिति के तहत छवि अधिग्रहण के लिए एप्रोप्रेटिव बर्फ की मोटाई के विट्रियस बर्फ के साथ छेद की पहचान करने में सहायता करता है। इन सॉफ़्टवेयर पैकेजों ने दोहराए जाने वाले कार्यों की संख्या को कम कर दिया है और क्रायो-ईएम डेटा संग्रह के थ्रूपुट को कई दिनों तक लगातार कई दिनों तक अच्छी गुणवत्ता वाले डेटा की एक विशाल मात्रा प्राप्त करके, बिना किसी रुकावट और ऑपरेटर की भौतिक उपस्थिति के बढ़ा दिया है। अक्षांश-एस एक समान सॉफ्टवेयर पैकेज है, जिसका उपयोग एकल-कण विश्लेषण के लिए स्वचालित डेटा अधिग्रहण के लिए किया जाता है। हालांकि, यह सॉफ़्टवेयर पैकेज केवल K2/K3 DEDs के लिए उपयुक्त है और इन डिटेक्टरों के साथ प्रदान किया जाता है।

यह प्रोटोकॉल सार्स-कोव-2 स्पाइक प्रोटीन के स्वचालित छवि अधिग्रहण में अक्षांश-एस की क्षमता को दर्शाता है, जिसमें 200 केवी क्रायो-ईएम से लैस एक प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर होता है ( सामग्री की तालिका देखें)। इस डेटा संग्रह उपकरण का उपयोग करते हुए, SARS-CoV-2 स्पाइक प्रोटीन की 3,000 मूवी फ़ाइलों को स्वचालित रूप से अधिग्रहित किया जाता है, और 3.9-4.4 Å रिज़ॉल्यूशन स्पाइक प्रोटीन संरचना प्राप्त करने के लिए आगे डेटा प्रोसेसिंग की जाती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट:: क्रायो-EM डेटा संग्रह के लिए तीन महत्वपूर्ण चरणों की आवश्यकता होती है: 1. क्रायो-ईएम ग्रिड तैयारी, 2. अंशांकन और माइक्रोस्कोप का संरेखण, 3. स्वचालित डेटा संग्रह (चित्रा 1)। इसके अलावा, स्वचालित डेटा संग्रह को a. उपयुक्त क्षेत्र चयन, b. अक्षांश-S का अनुकूलन, c. स्वचालित छेद चयन शुरू करने, और d. स्वचालित डेटा अधिग्रहण (चित्रा 1) शुरू करने में विभाजित किया गया है।

1. क्रायो-EM ग्रिड तैयारी और स्वचालित डेटा अधिग्रहण के लिए नमूना लोड हो रहा है

  1. एक चमक निर्वहनकर्ता का उपयोग कर ग्रिड को साफ करें और प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर चमक निर्वहन मापदंडों को अलग-अलग करें (यहां, 20 एमए पर 60 एस)।
  2. चमक-डिस्चार्ज किए गए ग्रिड में एक ताजा तैयार प्रोटीन नमूना (3 μL) जोड़ें और 10 s के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. 100% आर्द्रता पर 3-5 s के लिए ग्रिड को धब्बा और जल्दी से उन्हें क्रायो-प्लंजर का उपयोग करके तरल इथेन में डुबो दें।
  4. एक लचीला सी-क्लिप रिंग का उपयोग करके कारतूस बनाने के लिए ग्रिड को मैन्युअल रूप से क्लिप रिंग में क्लैंप करें।
  5. ऑटोलोडर कैसेट में जमे हुए कारतूस-घुड़सवार ग्रिड लोड करें और डेटा संग्रह के लिए माइक्रोस्कोप के प्रीकूल्ड ऑटोलोडर को नैनो कैप द्वारा कैसेट को स्थानांतरित करें।

2. स्वचालित डेटा अधिग्रहण से पहले माइक्रोस्कोप ट्यूनिंग और बुनियादी संरेखण

  1. बीम शिफ्ट
    1. डायरेक्ट अलाइनमेंट टैब से बीम शिफ्ट पर क्लिक करें।
    2. आवर्धन को कम करें, और मल्टीफंक्शन एक्स और वाई घुंडी का उपयोग करके बीम को ऑप्टिकल अक्ष पर केंद्र में रखें।
  2. पिवट बिंदु संरेखण
    1. प्रत्यक्ष संरेखण टैब से प्रत्यक्ष संरेखण पीपी एक्स में बीम झुकाव विकल्प पर क्लिक करें।
    2. बीम को एक स्थान पर संघनित करें और Multifunction X और Y घुंडी का उपयोग करके आंदोलन को कम करें।
  3. C2 एपर्चर केंद्रीकरण
    1. संरेखण टैब से संघनित्र एपर्चर का चयन करें।
    2. बीम को एक स्थान पर संघनित करें, बीम को ऑप्टिकल अक्ष पर केंद्रित करें, और फिर सर्कल को समान रूप से कवर करने के लिए बीम का विस्तार करें।
    3. इन चरणों को तब तक दोहराएं जब तक कि कंडेनसर 2 एपर्चर समायोजित न हो जाए।
  4. कोमा-मुक्त संरेखण
    1. ऑप्टिकल अक्ष के लिए बीम संरेखित करने के लिए प्रत्यक्ष संरेखण टैब से कोमा-मुक्त संरेखण X पर क्लिक करें।
    2. आकार और FFT के आंदोलन को कम करने के लिए Multifunction घुंडी का उपयोग करें (सुनिश्चित करें कि यह स्थिर है)।
    3. कोमा के लिए एक ही प्रक्रिया को दोहराएं - मुक्त संरेखण वाई।
  5. C जुड़वां लेंस के कारण क्रायो-EM में डेटा संग्रह से पहले समानांतर रोशनी सेट करें.
    1. विवर्तन मोड में उद्देश्य एपर्चर (70 μm) सम्मिलित करें।
    2. Defocus-तीव्रता घुंडी (उद्देश्य लेंस और C2 लेंस वर्तमान) को नियंत्रित करके विवर्तन लेंस के सामने फोकल विमान पर उद्देश्य एपर्चर पर ध्यान केंद्रित करें।
    3. सुनिश्चित करें कि उद्देश्य एपर्चर के कुरकुरा किनारे को उचित डीफोकसिंग के बाद देखा जाता है।
    4. बीम डाट डालें और तीव्रता को तब तक फैलाएं जब तक कि सोने के पाउडर विवर्तन के छल्ले कम से कम न हो जाएं।
      नोट: यदि बीम को ठीक से फैलाया जाता है, तो सोने के पाउडर की एक स्पष्ट विवर्तन अंगूठी स्क्रीन पर दिखाई देती है, जो इंगित करती है कि बीम समानांतर है।
    5. समानांतर रोशनी की स्थापना के बाद बीम स्टॉपर को वापस लें और माइक्रोस्कोप मोड को नैनो जांच में बदलें।
      नोट:: माइक्रोस्कोप के इष्टतम प्रदर्शन को सुनिश्चित करने के लिए डेटा संग्रह प्रारंभ करने से पहले माइक्रोस्कोप ट्यूनिंग की जाँच करें। इन सभी सेटिंग्स माइक्रोस्कोप प्रत्यक्ष संरेखण GUI टैब में प्रदर्शन किया जाएगा. सभी माइक्रोस्कोप ट्यूनिंग डेटा संग्रह से पहले एक परीक्षण ग्रिड का उपयोग करके किया जाता है।

3. अक्षांश-एस के साथ डेटा अधिग्रहण

  1. अक्षांश-S स्वचालित डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें.
    नोट:: अक्षांश-S स्थापना भी माइक्रोस्कोप अंशांकन, जो डेटा संग्रह से पहले किया जाएगा की आवश्यकता है, और सेटिंग्स स्थायी रूप से संग्रहीत किया जाएगा। डेटा संग्रह के लिए पांच अलग-अलग राज्यों को चार अलग-अलग आवर्धन (चित्रा 1 और चित्रा 2) के साथ कैलिब्रेट किया जाता है। एटलस राज्य और ग्रिड स्थिति एलएम मोड (कम आवर्धन श्रेणियों) में दो अलग-अलग आवर्धन में हैं। छेद राज्य एसए मोड (उच्च आवर्धन श्रेणियों) में है, लेकिन एक मध्यम आवर्धन के साथ। फ़ोकस और डेटा स्थिति उच्च-आवर्धन SA मोड का उपयोग करें।
    1. प्रारंभ मेनू से DigitalMicrograph पर क्लिक करें, या डेस्कटॉप पर DigitalMicrograph आइकन पर डबल-क्लिक करें।
    2. DigitalMicrograph से तकनीक प्रबंधक आइकन का चयन करें।
      नोट:: यह सिस्टम TEM और अक्षांश-S माउस (चित्रा 2 और पूरक चित्रा S1) दिखाएगा।
    3. एकल-कण स्वचालित डेटा संग्रह के लिए अक्षांश-S आइकन का चयन करें.
      नोट: K2 कैमरा तीन मोड में संचालित होता है: रैखिक / एकीकृत, गिना, और सुपर-रिज़ॉल्यूशन। उपयोगकर्ता DigitalMicrograph के इंटरफ़ेस में किसी भी मोड का चयन कर सकता है। डेटा छवियों को या तो खुराक-भिन्नित छवि स्टैक के रूप में सहेजा जा सकता है या MRC, TIF, या विभिन्न बिट गहराई के साथ .dm4 फ़ाइलों में अभिव्यक्त छवियों के रूप में सहेजा जा सकता है। इसके अलावा, डेटा को K3 कैमरे के लिए गति-सही छवियों के रूप में सहेजा जा सकता है। किसी K2 कैमरे पर, एक असंसाधित छवि स्टैक को 4-बिट MRC, 8-बिट TIF, या 8-बिट .dm4 फ़ाइलों के रूप में सहेजा जा सकता है.
  2. पिछले सत्र से सेटिंग्स के आधार पर एक नया सत्र बनाएँ.
    1. पैलेट में पूर्व सत्र पर आधारित चेकबॉक्स की जाँच करें।
    2. नया बटन चुनें.
    3. वह फ़ोल्डर चुनें जिसमें वह सत्र हो जिस पर नए सत्र की सेटिंग्स आधारित हैं. नया सत्र बनाने के लिए पिछली सत्र निर्देशिका पर जाएँ. नया सत्र और संबद्ध डेटा सहेजने के लिए फ़ोल्डर चुनें.
    4. उस फ़ोल्डर का चयन करें और चुनें जहाँ नया सत्र और संबद्ध डेटा सहेजा जाएगा.
      नोट:: प्रत्येक राज्य और इसकी अंतर्निहित सेटिंग्स (आवर्धन, रोशनी की स्थिति, छवि, या प्रोजेक्टर) और बीम शिफ्ट और कैमरा पैरामीटर (कुल एक्सपोज़र, एकल-फ़्रेम एक्सपोज़र, और बिनिंग) मौजूदा सत्र से नए सत्र में निर्यात किया जाएगा। फ़ोल्डर का पथ पैलेट के निचले भाग में एक पाठ स्ट्रिंग के रूप में दिखाया गया है। राज्यों और कॉन्फ़िगरेशन पैलेट में से प्रत्येक में एक तारांकन चिह्न (*) है जो शीर्षक में यह दिखाने के लिए जोड़ा गया है कि यह पहले से ही स्थापित किया जा चुका है और उपयोग करने के लिए तैयार है।
  3. कोई मौजूदा सत्र जारी रखें.
    1. किसी मौजूदा सत्र को जारी रखने के लिए पैलेट में जारी रखें बटन दबाएँ.
      नोट:: एटलस असेंबल संशोधित नहीं किया जा सकता।
    2. चुनें और उस फ़ोल्डर पर नेविगेट करें जिसमें वह सत्र है जिसे जारी रखने की आवश्यकता है.
  4. एक पूरी तरह से नया सत्र शुरू करें।
    1. पैलेट में नया टैब पर क्लिक करें। वह फ़ोल्डर चुनें जिसमें सत्र जारी रखने के लिए है. डेटा सहेजने के लिए किसी फ़ोल्डर का चयन करें.
      नोट:: डिफ़ॉल्ट फ़ोल्डर का नाम दिनांक और समय का उपयोग करके बनाया गया है।
    2. सेटिंग आइकन पर क्लिक करें। प्रकट होने वाली स्थिति का पता लगाने का प्रबंधन करें बॉक्स में, स्थिति जोड़ें, TEM स्थिति, कैमरा स्थिति, और छवि/स्टैक सेट करें, और तब स्थिति का नाम दें.
      नोट:: स्वचालित डेटा अधिग्रहण वर्कफ़्लो स्वचालित डेटा संग्रह के लिए 5 भिन्न स्थितियों का उपयोग करता है। इन राज्यों को कॉन्फ़िगर किया गया है और उनके संबंधित राज्य पैलेट में संग्रहीत किया जाता है। राज्य सारांश तालिका 1 में दिया गया है।
  5. एटलस स्थिति कॉन्फ़िगर करें।
    1. एटलस राज्य पैलेट पर क्लिक करें।
    2. निम्न पैरामीटर के साथ एटलस स्थिति को कॉन्फ़िगर करें: नैनो जांच में आवर्धन 115x LM मोड, रोशनी की स्थिति-स्पॉट आकार 8 और चमक 934400, binning: 1 और कैमरा एक्सपोज़र समय: कम आवर्धन पर इमेजिंग के लिए 1.0 s। तालिका 1 में दिए गए राज्य सारांश को देखें।
    3. अगले राज्य में जाने के लिए Next पर क्लिक करें।
      नोट: एटलस स्थिति सबसे कम आवर्धन स्थिति है, जो पूरे ग्रिड (पूरक चित्रा S2) का सर्वेक्षण प्रदान करता है। आम तौर पर, यह राज्य हमें कम आवर्धन पर पूरे ग्रिड की कल्पना करने में मदद करता है और बर्फ की मोटाई, सपाटता और ग्रिड के टूटे हुए वर्ग का न्याय करता है। ग्रिड के विभिन्न क्षेत्रों में एटलस उत्पन्न करने की सिफारिश की जाती है ताकि ग्रिड की इष्टतम बर्फ की मोटाई और सबऑप्टिमल बर्फ की मोटाई का निरीक्षण किया जा सके (पूरक चित्रा S3)। उल्लिखित पैरामीटर उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के अनुसार भिन्न हो सकते हैं।
  6. ग्रिड स्थिति कॉन्फ़िगर करें।
    1. ग्रिड राज्य पैलेट पर क्लिक करें।
    2. निम्नलिखित माइक्रोस्कोप इमेजिंग ऑप्टिक्स (नैनो जांच में आवर्धन 380x LM मोड), रोशनी की स्थिति (स्पॉट आकार: 8 और चमक 626,200), binning: 1 और कैमरा एक्सपोज़र समय: 1.0 s के साथ ग्रिड स्थिति को कॉन्फ़िगर करें।
    3. तालिका 1 में दिए गए अक्षांश-S स्थिति सारांश देखें।
    4. अगले राज्य में जाने के लिए Next पर क्लिक करें।
      नोट:: ग्रिड स्थिति एटलस स्थिति से अधिक आवर्धन पर सेट है जैसे कि दृश्य का फ़ील्ड एक ग्रिड वर्ग (चित्र2) है। इस विशेष आवर्धन में, एक ग्रिड वर्ग मनाया जाता है। इसलिए, इस आवर्धन में छेद सही ढंग से देखे जाते हैं, जो छेद की बर्फ की मोटाई की जांच करने में मदद करता है (पूरक चित्रा S4)। पेटेंट ग्रिड में छेद का पता लगाने के लिए ग्रिड राज्य में एक साधारण बैंडपास फ़िल्टर का उपयोग किया जाता है। उल्लिखित पैरामीटर उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के अनुसार भिन्न हो सकते हैं।
  7. छेद स्थिति कॉन्फ़िगर करें।
    1. छेद पैलेट पर क्लिक करें.
    2. निम्नलिखित माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के साथ होल राज्य को कॉन्फ़िगर करें: इमेजिंग ऑप्टिक्स (नैनो जांच में आवर्धन 4500x एसएम मोड), रोशनी की स्थिति (स्पॉट आकार: 7 और बीम व्यास 8.81 μm), बिनिंग: 1 और कैमरा एक्सपोजर समय: 1.0 s।
    3. ग्रिड प्रकार के आधार पर आवश्यक होने पर पैरामीटर परिवर्तित करें. तालिका 1 में दिए गए स्थिति सारांश को देखें।
    4. अगले राज्य में जाने के लिए Next पर क्लिक करें।
      नोट:: SA मोड इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में एक उच्च आवर्धन श्रेणी इंगित करता है। छेद राज्य कुछ माइक्रोमीटर (10-20 μm) (चित्रा 2 और पूरक चित्रा S4) के दृश्य के क्षेत्र के साथ एसए आवर्धन रेंज में है। यह आवर्धन श्रेणी एटलस या ग्रिड स्थिति से अधिक है लेकिन फ़ोकस/डेटा स्थिति से बहुत छोटी है. इस आवर्धन में, व्यक्तिगत छेद दिखाई देंगे। छेद का आकार संदूषणों की उच्च डिग्री, खाली छेद, और छेद की उचित बर्फ की मोटाई का निरीक्षण करने के लिए उपयुक्त है। इमेजिंग के लिए छेद इन मान्यताओं के आधार पर चुने जाते हैं। छेद राज्य में दो फिल्टर का उपयोग किया जाता है: एक नए छेद छवि के साथ एक छेद संदर्भ छवि को पार करने के लिए और दूसरा यूसेंट्रिक ऊंचाई के लिए मंच की ऊंचाई को समायोजित करने के लिए।
  8. फ़ोकस स्थिति कॉन्फ़िगर करें.
    1. Focus palette पर क्लिक करें।
    2. निम्नलिखित माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के साथ फ़ोकस स्थिति को कॉन्फ़िगर करें: इमेजिंग ऑप्टिक्स (नैनो प्रोब में आवर्धन 45,000x एसए मोड), रोशनी की स्थिति (स्पॉट आकार: 8 और चमक 934400), बिनिंग: 1 और कैमरा एक्सपोजर समय: 1.0 एस।
    3. छेद के पास अनाकार कार्बन क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करें। तालिका 1 में दिए गए अक्षांश-S स्थिति सारांश को देखें।
    4. अगले राज्य में जाने के लिए Next पर क्लिक करें।
      नोट:: SA मोड इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में एक उच्च आवर्धन श्रेणी इंगित करता है। फ़ोकस स्थिति उच्च SA श्रेणी आवर्धन है। फोकस मोड में, बीम को लक्ष्य छेद के पास के कार्बन क्षेत्र में स्थानांतरित कर दिया जाता है और डेटा स्थिति में डेटा एकत्र करने के लिए स्वचालित रूप से फोकस करता है। एक बैंडपास फ़िल्टर एक हैनिंग या नरम आयताकार फ़िल्टर के साथ संयुक्त एक ही क्षेत्र की दो फोकस राज्य छवियों के बीच ऑफसेट को मापने के लिए फोकस राज्य में उपयोग किया जाता है (चित्रा 2)। उल्लिखित पैरामीटर उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के अनुसार भिन्न हो सकते हैं।
  9. डेटा स्थिति कॉन्फ़िगर करें.
    1. Data Palette पर क्लिक करें।
    2. निम्नलिखित माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के साथ डेटा स्थिति को कॉन्फ़िगर करें: इमेजिंग ऑप्टिक्स (उदाहरण के लिए, नैनो जांच में एसए मोड में आवर्धन 28,000x, 45,000x, 54,000x), रोशनी की स्थिति (स्पॉट आकार: 8 और चमक 934400), बिनिंग: 1 और कैमरा एक्सपोजर समय: 1.0 s।
    3. तालिका 1 में दिए गए अक्षांश-S स्थिति सारांश को देखें।
    4. अगले राज्य में जाने के लिए Next पर क्लिक करें।
      नोट:: डेटा स्थिति पिक्सेल आकार आवश्यकताओं और लक्ष्य रिज़ॉल्यूशन (चित्र2) के आधार पर चयनित उच्चतम आवर्धन है। आम तौर पर, ध्यान केंद्रित करने के बाद, बीम को डेटा एकत्र करने के लिए स्वचालित रूप से लक्ष्य क्षेत्र में स्थानांतरित कर दिया जाता है। उपर्युक्त पैरामीटर को उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के आधार पर बदला जा सकता है।

4. फ़ोकस कॉन्फ़िगरेशन

  1. Focus Configuration Palette पर क्लिक करें। दिए गए टैब में डीफ़ोकस मानों की श्रेणी और चरण आकार निर्दिष्ट करें.
  2. अगले चरण पर ले जाने के लिए अगला बटन दबाएँ.
    नोट:: निम्न defocus मान उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटा अधिग्रहण के लिए उपयोग किया जा सकता है। आम तौर पर, -0.5 से -3.0 μm defocus मान 0.25 या 0.5 defocus चरण आकार के साथ छवि अधिग्रहण के लिए उपयोग किया जाता है। उपयोगकर्ता फोकस सेटअप चरण छोड़ सकते हैं यदि वे केवल नमूना स्क्रीन करना चाहते हैं। फोकस कॉन्फ़िगरेशन चरण को छोड़ने के लिए बस पैलेट पर अगला बटन दबाएं।

5. ठीक संरेखण

  1. ग्रिड पर कुछ विशेषताओं पर ध्यान केंद्रित करें (उदाहरण के लिए, बर्फ संदूषण हेक्सागोनल बर्फ); चित्र 3 देखें।
    नोट: सुविधाएँ बहुत बड़ी या बहुत छोटी नहीं होनी चाहिए। वे दोनों एटलस राज्य आवर्धन 115x (LA मोड) और डेटा आवर्धन पर दिखाई देना चाहिए.
  2. कैप्चर बटन पर क्लिक करें। विभिन्न राज्यों की प्रत्येक छवि पर एक ही सुविधा पर लाल क्रॉस चिह्न की स्थिति।
  3. फोकस, डेटा और छेद राज्यों के साथ शुरू करें क्योंकि उनके दृश्य का क्षेत्र एटलस और ग्रिड राज्यों की तुलना में बहुत बड़ा है। एटलस और ग्रिड राज्यों में एक ही सुविधा पर लाल क्रॉस मार्क की स्थिति के लिए एटलस और ग्रिड राज्यों पर ज़ूम करें।
  4. पांच अलग-अलग राज्यों की स्थिति की गणना करने के लिए गणना करें बटन पर क्लिक करें, जो प्रत्येक राज्य के बीच ऑफसेट की गणना करेगा और इन्हें आउटपुट विंडो पर प्रतिबिंबित करेगा।
    नोट:: ऑफसेट मान आगे उपयोग के लिए राज्यों में एकीकृत हैं (चित्र3)। प्रत्येक राज्य की स्थिति की उच्च सटीकता प्रदान करने के लिए ठीक संरेखण किया जाता है (चित्रा 3)। यह ठीक संरेखण सभी पांच राज्यों में सटीक स्थिति को इंगित करने में मदद करता है। ठीक संरेखण एकल कण डेटा अधिग्रहण के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, इमेजिंग से पहले ठीक संरेखण करने के लिए अत्यधिक अनुशंसित है।

6. अक्षांश-एस का उपयोग कर डेटा अधिग्रहण प्रक्रिया

  1. कैप्चर पैलेट पर क्लिक करें।
    नोट:: आम तौर पर, एटलस डेटा ग्रिड वर्गों के अधिकांश visualize करने के लिए कम आवर्धन (115x) पर एकत्र किया जाता है।
  2. आवश्यकता के आधार पर पूरे ग्रिड या ग्रिड के हिस्से को कवर करने के लिए एटलस का आकार चुनें (उदाहरण के लिए, 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8, या 8 x 12)।
    नोट: 16 से 16 एटलस आकार पूरे ग्रिड को कवर करता है।
  3. एटलस को कैप्चर करने के लिए कैप्चर बटन पर क्लिक करें।
    नोट:: मुख्य अक्षांश-S नेविगेशन विंडो खोलता है और DigitalMicrograph (पूरक चित्रा S5) में उपलब्ध स्थान भरता है। मुख्य नेविगेशन विंडो में तीन चित्र फलक तीन अलग-अलग आवर्धन पर सिस्टम राज्यों की छवियां दिखाते हैं। समग्र एटलस वर्तमान में सबसे बाएं फलक में अधिग्रहण की अपनी वर्तमान स्थिति में प्रदर्शित किया जाता है। एटलस में टाइलें भर जाएंगी क्योंकि प्रत्येक कैप्चर होता है।
  4. एटलस (पूरक चित्रा S5) पर नेविगेट करके बर्फ की मोटाई के आधार पर ग्रिड वर्ग का चयन करें। एक बार वांछित ग्रिड वर्गों का चयन कर रहे हैं, अनुसूची बटन पर क्लिक करें और ग्रिड वर्ग भरने में टाइल्स का निरीक्षण के रूप में प्रत्येक ग्रिड वर्ग पर कब्जा कर लिया है.
  5. ग्रिड वर्गों का चयन होने के बाद शेड्यूल बटन पर क्लिक करें।
  6. ग्रिड वर्ग में इसकी स्थिति जोड़कर एक प्रतिनिधि छेद का चयन करें। एक बार एक छेद छवि का अधिग्रहण किया जाता है, तो डेटा और फोकस पदों को परिभाषित करें और लेआउट को टेम्पलेट (पूरक चित्रा S6) के रूप में सहेजें।
  7. ऑटो खोज पर क्लिक करें, छेद का आकार दें (उदाहरण के लिए, R1.2/1.3), और प्रोग्राम में खोजें बटन पर क्लिक करें, जो छेद व्यास के आधार पर छेद को स्वचालित रूप से खोजने के लिए फाइंड प्रोग्राम का कारण बनेगा। इसके बाद, टेम्पलेट (चित्रा 4) जोड़ने के लिए मार्क बटन पर क्लिक करें और एक ग्रिड या आंशिक ग्रिड वर्ग में सभी छेदों में लाल सर्कल के निशान जोड़ें।
  8. ग्रिड वर्ग और बर्फ संदूषण (चित्रा 4) से छेद को हटाने के लिए तीव्रता सेट करें।
    नोट:: अंत में, चयनित छेद डेटा संग्रह शेड्यूल करने के लिए पीले रंग में चिह्नित किया जाएगा।
  9. ऑटो खोज के माध्यम से छेद जोड़ने के बाद अक्षांश कार्यों में अनुसूची बटन पर क्लिक करें।
    नोट:: स्वचालित डेटा संग्रह शेड्यूल करने से पहले, सुनिश्चित करें कि तरल नाइट्रोजन टैंक स्तर पर्याप्त है, autoloader टर्बो पंप बंद है, और RAID ड्राइव स्थान मुक्त है। अक्षांश-S कार्य प्रबंधक डेटा संग्रह के लिए निर्धारित एटलस, ग्रिड वर्ग, छेद और डेटा राज्यों की संख्या दिखाता है (चित्र5). अक्षांश-एस जीयूआई में, विभिन्न रंग योजनाएं दिखाई देंगी, और विभिन्न रंग योजनाओं का अर्थ प्रदर्शित किया जाएगा: 1. पीला अनिर्धारित इंगित करता है; 2. ग्रीन अनुसूचित इंगित करता है; 3. नीला इंगित करता है अधिग्रहित; 4. लाल विफल इंगित करता है.

7. क्रायो-EM डेटा प्रसंस्करण

नोट: स्पाइक प्रोटीन के क्रायो-ईएम छवि प्रसंस्करण को हाल के साहित्य 25 में विस्तार से वर्णित किया गया है।

  1. RELION 3.011 का उपयोग कर SARS-CoV2 के स्पाइक प्रोटीन की छवि प्रसंस्करण निष्पादित करें।
  2. अक्षांश-एस का उपयोग करके एकत्र की गई फिल्म छवियों को मैन्युअल रूप से स्क्रीन करें, और MotionCor2 software9 का उपयोग करके व्यक्तिगत फिल्मों के बीम-प्रेरित गति सुधार करें। cisTEM सॉफ़्टवेयर package14 की मदद से मैन्युअल रूप से गति-सही माइक्रोग्राफ की प्रारंभिक स्क्रीनिंग करें।
    नोट: स्वचालित रूप से अधिग्रहित माइक्रोग्राफ का लगभग 85% अच्छी गुणवत्ता का था, और डेटा में 3.7-5.2 Å के भीतर सिग्नल था, जिसकी गणना cisTEM software14 (पूरक चित्रा S7A, B) का उपयोग करके की जाती है।
  3. RELION 3.0 सॉफ़्टवेयर पैकेज11 का उपयोग कर डेटा संसाधित करें।
    1. स्पाइक कणों को मैन्युअल रूप से चुनें और उन्हें 2 डी वर्ग वर्गीकरण (पूरक चित्रा S7C) के अधीन करें। RELION ऑटोपिक tool11 का उपयोग कर माइक्रोग्राफ से ऑटोपिक 3,99,842 एकल स्पाइक कणों के लिए एक संदर्भ के रूप में सबसे अच्छा 2 डी वर्ग का उपयोग करें।
      नोट: कणों को 3 डी वर्गीकरण (पूरक चित्रा S8) के अधीन करने से पहले 2 डी वर्गीकरण के तीन दौर किए गए थे। लगभग 2,55,982 एकल कणों को 3 डी वर्गीकरण के लिए चुना गया था, और डेटा सेट को छह वर्गों में वर्गीकृत किया गया था। अंतिम 3 डी ऑटो-शोधन सबसे अच्छे वर्ग के साथ किया गया था; 85,227 स्पाइक कणों को 3 डी वर्गीकरण से प्राप्त किया गया था।
    2. ऑटो शोधन के बाद, संकल्प सुधार के लिए उचित बीम झुकाव मापदंडों के साथ प्रति कण defocus शोधन प्रदर्शन। अगला, RELION 3.0 सॉफ्टवेयर package11 का उपयोग कर Bayesian चमकाने के लिए कणों विषय. अंत में, RELION 3.011 का उपयोग कर 3 डी ऑटो-शोधन के एक और दौर के लिए पॉलिश कण सेट का उपयोग करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

वर्तमान महामारी की स्थिति में, क्रायो-ईएम सार्स-कोव -226,27,28,29 से विभिन्न प्रोटीनों की संरचनाओं की विशेषता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो वायरस के खिलाफ टीके और दवाओं को विकसित करने में मदद कर सकता है। 2019 की कोरोनोवायरस बीमारी से निपटने के लिए सीमित मानव संसाधनों के साथ तेजी से पुस्तक अनुसंधान प्रयासों की तत्काल आवश्यकता है। एकल-कण क्रायो-ईएम में डेटा अधिग्रहण मैक्रोमोलेक्यूल्स की संरचना निर्धारण में एक समय लेने वाला लेकिन महत्वपूर्ण कदम है। क्रायो-ईएम स्वचालित डेटा अधिग्रहण में हाल के विकास ने डेटा संग्रह में सीमित मानव हस्तक्षेप को सक्षम किया है। अक्षांश-एस सॉफ्टवेयर एक महत्वपूर्ण स्वचालित डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पैकेज है जिसका उपयोग यहां शुद्ध सार्स-कोव 2 स्पाइक प्रोटीन के स्वचालित डेटा संग्रह के लिए किया जाता है।

सार्स-कोव-2 स्पाइक प्रोटीन का क्रायो-ईएम डेटा अधिग्रहण के2 शिखर सम्मेलन डीईडी से सुसज्जित 200 केवी क्रायो-ईएम के साथ किया गया था। वांछनीय बर्फ मोटाई और कण वितरण के साथ ग्रिड पर डेटा अधिग्रहण के लिए स्थानों को मैन्युअल रूप से चिह्नित किया गया था। पृष्ठभूमि में होने वाले डेटा अधिग्रहण के दौरान पदों को समानांतर में चिह्नित किया गया था। चिह्नित पदों पर, अक्षांश-एस सॉफ्टवेयर ने नमूना स्तर पर 1.17 Å के पिक्सेल आकार पर 42,200x के नाममात्र आवर्धन पर स्वचालित डेटा अधिग्रहण किया। 42,200x आवर्धन पर डेटा संग्रह के लिए कॉन्फ़िगरेशन पूर्व-सेट किया गया था और पहले से ही परीक्षण किया गया था। प्रति फ्रेम 2 e−/Å2 की इलेक्ट्रॉन खुराक के साथ 8 s के लिए कुल 40 फ्रेम दर्ज किए गए थे; इस प्रकार, डेटा संग्रह के लिए 80 e−/Å2 की कुल खुराक का उपयोग किया गया था (पूरक चित्रा S9)। डेटा को -0.75 μm और -2.25 μm की एक डिफोकस रेंज पर अधिग्रहित किया गया था, जिसमें दो दिनों में 3,000 फिल्म फ़ाइलें एकत्र की गई थीं। हर 4 घंटे, आवधिक जांच और समायोजन सॉफ्टवेयर द्वारा यह सुनिश्चित करने के लिए किया गया था कि 48 घंटे से अधिक एकत्र की गई सभी फिल्म फ़ाइलें अच्छी गुणवत्ता की थीं और कोई बीम शिफ्ट या संरेखण शिफ्ट नहीं था। डेटा को बिना किसी मानवीय हस्तक्षेप के स्वतंत्र रूप से एकत्र किया गया था। इसके अतिरिक्त, अक्षांश-एस स्वचालित रूप से तरल नाइट्रोजन भरने के समय इमेजिंग बंद कर देता है, जो छवियों में अनावश्यक कंपन या यांत्रिक बहाव को कम करता है।

जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लेख किया गया है, गति-सही माइक्रोग्राफ की प्रारंभिक स्क्रीनिंग को सीआईएसटीईएम सॉफ़्टवेयर 14 का उपयोग करके मैन्युअल रूप से किया गया था। स्क्रीनिंग के आधार पर, अधिकांश डेटा 3.7-5.2 Å (पूरक चित्रा S7A) की सिग्नल सीमा के भीतर पाए गए थे। इससे पता चलता है कि अक्षांश-एस का उपयोग करके स्वचालित डेटा संग्रह अच्छा है, और अधिकांश डेटा उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी पुनर्निर्माण के लिए उपयुक्त हैं। इसके अतिरिक्त, छवियों को defocus रेंज (-0.75 से -2.25 μm) पर एकत्र किया गया था, और विभिन्न डिफोकस श्रेणियों को मैन्युअल रूप से cisTEM14 द्वारा चेक किया गया था। अधिग्रहित डेटा अक्षांश-एस (पूरक चित्रा S7A, B) में सेटअप defocus रेंज के बहुत करीब थे।

RELION 3.0 सॉफ़्टवेयर पैकेज11 का उपयोग कर डेटा संसाधन किया गया था। स्पाइक कणों को मैन्युअल रूप से 2 डी वर्ग औसत की गणना करने के लिए चुना गया था। विभिन्न संरचनात्मक विवरण (हेलिक्स और β-शीट) 2 डी वर्ग औसत (पूरक चित्रा S7C) में दिखाई देते हैं, जो दृढ़ता से सुझाव देते हैं कि इस डेटा सेट का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनात्मक लक्षण वर्णन संभव है। हालांकि, 3 डी वर्गीकरण यह भी इंगित करता है कि स्पाइक प्रोटीन में 1-रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (आरबीडी) खुला है और सभी आरबीडी बंद संरचना (पूरक चित्रा एस 8) है। 3 डी वर्गीकरण इंगित करता है कि वर्ग -1 में कणों की अधिकतम संख्या है, जो 1-आरबीडी अप ओपन संरचना के रूप में दिखाई देते हैं। इसके अलावा, वर्ग -3 और वर्ग -4 में कणों की एक समान संख्या है, और दोनों मॉडलों में सभी आरबीडी को बंद संरचना के नीचे दिखाई दिया। हालांकि, कक्षा -5 एक मध्यवर्ती संरचना दिखाता है, जहां 1-आरबीडी एक मध्यवर्ती स्थिति में है। हालांकि, स्पाइक प्रोटीन के 1-आरबीडी अप ओपन कंफर्मेशन को सी 1 समरूपता का उपयोग करके पुनर्निर्मित किया गया था, और समग्र रिज़ॉल्यूशन 4.4 Å (चित्रा 6 और पूरक चित्रा S10) है। इसी तरह, सभी आरबीडी डाउन क्लोज कंफर्मेशन (क्लास -3 और क्लास -4) को सी 3 समरूपता के साथ परिष्कृत किया गया था, और 0.143 एफएससी पर समग्र रिज़ॉल्यूशन ~ 3.9 Å (चित्रा 7) है।

समग्र छवि प्रसंस्करण इंगित करता है कि स्पाइक प्रोटीन सभी आरबीडी को बंद कर देता है और 1-आरबीडी को खुली संरचना को अपनाता है। इसके अतिरिक्त, स्पाइक प्रोटीन की एक मध्यवर्ती संरचना की पहचान की गई थी। स्पाइक प्रोटीन के एस 2 सबडोमेन की उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम संरचना व्यक्तिगत अमीनो एसिड अवशेषों (चित्रा 6 बी और चित्रा 7 सी) की साइड चेन को इंगित करती है। सभी 3 डी पुनर्निर्माण और क्रायो-ईएम परिणाम हाल ही में प्रकाशित साहित्य 25 में निष्कर्षों के समान हैं। हालांकि, स्पाइक प्रोटीन की उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम संरचना को 15 दिनों के भीतर विशेषता दी गई थी, जो केवल स्वचालित क्रायो-ईएम डेटा अधिग्रहण प्रोटोकॉल और स्वचालित कण-पिकिंग सॉफ़्टवेयर के कारण संभव है। इसलिए, अक्षांश-एस सहित स्वचालित डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर पैकेज, जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स की कई उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम संरचनाओं के लक्षण वर्णन में महत्वपूर्ण योगदान दे सकते हैं।

Figure 1
चित्र1: अक्षांश-S का उपयोग करके स्वचालित डेटा अधिग्रहण का वर्कफ़्लो: डेटा संग्रह (ग्रिड तैयारी, नमूना लोडिंग, और माइक्रोस्कोप ट्यूनिंग) से पहले पालन किए जाने वाले सामान्य चरणों का पालन किया जाना चाहिए। डेटा अधिग्रहण इस पांडुलिपि का मुख्य हिस्सा है, और डेटा अधिग्रहण के दौरान पालन की जाने वाली पाइपलाइन पर प्रकाश डाला गया है। संक्षिप्त रूप: क्रायो-ईएम = क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: अक्षांश-S GUI का उपयोग करके एकल-कण डेटा संग्रह के लिए विभिन्न राज्यों का सेटअप. (A) DM3 सॉफ़्टवेयर सूट में डेटा अधिग्रहण के लिए अक्षांश-S सॉफ़्टवेयर पैकेज. (B) डेटा अधिग्रहण प्रक्रिया का वर्कफ़्लो. (c) प्रत्येक पैनल का विस्तार। संक्षिप्त नाम: GUI = ग्राफ़िकल यूजर इंटरफ़ेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ध्यान केंद्रित करने और छवि अधिग्रहण के लिए उच्च सटीकता स्थापित करने के लिए ठीक संरेखण। ठीक संरेखण पांच राज्यों पर किया जाता है a. Atlas, b. Hole, c. Data, d. Grid, e. Focus. एक ही स्थिति पर लाल निशान रखकर प्रत्येक राज्य पर ध्यान केंद्रित करें। किसी भी नए सत्र को शुरू करने से पहले ठीक संरेखण करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है, जो किसी विशेष स्थिति में इमेजिंग करने में मदद करेगा। एक विशेष स्थिति में छवि अधिग्रहण (किसी भी प्रमुख बदलाव के बिना) पूरी तरह से ठीक संरेखण की सटीकता पर निर्भर करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: अक्षांश-एस का उपयोग कर स्वचालित छेद चयन. डेटा अधिग्रहण के लिए छेद का स्वत: पता लगाना छेद आकार के आधार पर स्वचालित रूप से किया जाता है। (ए) छेदों को ऑटो-खोजने के लिए छेद-खोज वेक्टर की स्थिति दिखाता है। स्केल बार = 20 μm. (B) छेद खोज वेक्टर का उपयोग करके छेद के अंकन को दर्शाता है और सीमा क्षेत्र और बर्फ संदूषण से मार्कर को हटाने के लिए तीव्रता को समायोजित करता है। स्केल सलाखों = 20 μm (बाएं) और 10 μm (मध्य). (सी) इमेजिंग (पीला) के लिए छेद के स्वचालित जोड़ने से पता चलता है। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: डेटा अधिग्रहण का लाइव दृश्य। (A) पदों को प्रत्येक स्थिति में डेटा अधिग्रहण की स्थिति के आधार पर पीले, हरे, नीले और लाल रंग में चिह्नित किया गया है। (बी) डेटा अधिग्रहण की स्थिति की निगरानी के लिए रंग कोड। हरा: अनुसूचित, पीला: अनिर्धारित, नीला: अधिग्रहण, लाल: विफल रहा। बाएं पैनल में हरे रंग के कई छेद (अनुसूचित) और नीले रंग के चिह्नित कुछ छेद (अधिग्रहित) दिखाए गए हैं; स्केल बार = 10 μm. मध्य पैनल एक व्यक्तिगत छेद के 4,300x आवर्धन को दर्शाता है। एक छेद (मध्य पैनल) की इस छवि में, नीला वर्ग बॉक्स फोकस क्षेत्र दिखाता है, और हरा वर्ग बॉक्स इमेजिंग क्षेत्र दिखाता है; स्केल बार = 1000 एनएम। सही पैनल अधिग्रहित छवि दिखाता है। चरम सही पैनल अनुसूचित छवि संख्याओं, इमेजिंग के लिए आवश्यक कुल समय, और इमेजिंग के लिए कितनी छवियों को निर्धारित किया गया है, को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: स्पाइक 1RBD खुला के साथ 3 डी मोड. (ए) 1-आरबीडी के ऑटो-परिष्कृत और तेज स्पाइक प्रोटीन मानचित्र को ऊपर की ओर, ऊपर और नीचे के दृश्यों में दर्शाया गया है। (बी) ईएम मानचित्र को साइड चेन के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए क्रिस्टल संरचना के साथ फिट किया गया है। मानचित्र में हाइलाइट किए गए क्षेत्रों में साइड चेन के लिए घनत्व है। संक्षिप्त रूप: 3 डी = तीन आयामी; आरबीडी = रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन; EM = इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी; NTD = N- टर्मिनल डोमेन; S1 = सबयूनिट 1; S2 = सबयूनिट 2. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: सभी आरबीडी नीचे स्पाइक प्रोटीन की करीबी संरचना। (ए) सभी आरबीडी के ऑटो-परिष्कृत और तेज स्पाइक प्रोटीन मानचित्र को साइड और टॉप व्यू में दर्शाए गए क्लोज़ कंफर्मेशन के नीचे। (बी) ईएम मानचित्र को साइड चेन के बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए क्रिस्टल संरचना के साथ फिट किया गया है। तीरों से पता चलता है कि मानचित्र में क्षेत्रों में साइड चेन (सी) के लिए घनत्व है। संक्षिप्त रूप: आरबीडी = रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन; EM = इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी; NTD = N- टर्मिनल डोमेन; S1 = सबयूनिट 1; S2 = सबयूनिट 2. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा S1: अक्षांश-एस छवि अधिग्रहण GUI: विभिन्न माइक्रोस्कोप नियंत्रकों (उदाहरण के लिए, कॉलम वाल्व खुला / बंद, स्क्रीन सम्मिलित / पीछे हटना अक्षांश-एस जीयूआई द्वारा नियंत्रित किया जाता है। कॉलम वाल्व, कैमरा, स्क्रीन की स्थिति, और तरल नाइट्रोजन भरने को बाएं पैनल में नियंत्रित किया जा सकता है। इस पैनल के नीचे, विभिन्न अंशांकन पैरामीटर हरे रंग के दिखाई देते हैं (उदाहरण के लिए, आवर्धन, बीम झुकाव, उद्देश्य फोकस)। यदि कोई पैरामीटर काला दिखाई देता है, तो यह इंगित करता है कि पैरामीटर ठीक से ऑप्टिमाइज़ नहीं किया गया है। इसलिए, किसी भी नए सत्र को शुरू करने से पहले सभी पैरामीटर अनुकूलित किया जाना चाहिए। संक्षिप्त नाम: GUI = ग्राफ़िकल यूजर इंटरफ़ेस। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S2: एटलस राज्य का प्रतिनिधित्व। विभिन्न एटलस राज्यों ग्रिड वर्गों और बर्फ का प्रकार का गठन दिखा. (A-F) विभिन्न एटलस आकारों को भी हाइलाइट किया गया है। (A, B, D, F) एक मोटी बर्फ पैटर्न पर प्रकाश डाला गया है। (C, D) टूटे हुए वर्गों को हाइलाइट किया गया है। मोटी बर्फ और टूटे हुए क्षेत्र (आकृति में चिह्नित) इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं। (E, F) इमेजिंग के लिए अच्छा ग्रिड वर्ग; ए, बी, सी, डी, और एफ ग्रिड वर्गों को उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए उपयुक्त दिखाते हैं। हालांकि, मोटी बर्फ ग्रिड वर्गों और टूटे हुए ग्रिड वर्गों को बाहर रखा जाना चाहिए। स्केल बार = 100 μm (A-C), 50 μm (D, E), और 25 μm (F)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S3: ग्रिड राज्य और छेद राज्य का प्रतिनिधित्व। ग्रिड स्थिति और इसी छेद स्थिति छवि में दिखाए गए हैं। (A, E) खाली छेद, (एफ, जी) मोटी बर्फ, (ई) बर्फ संदूषण, और (ए, बी, सी, डी, ई, और जी) उपयुक्त बर्फ की मोटाई छवि में चिह्नित की गई है। छवि अधिग्रहण (ए, बी, सी, डी, ई, और जी) के लिए उपयुक्त बर्फ मोटाई छेद का चयन किया जाता है। स्केल सलाखों = 10 μm (A, E, F, G), 2 μm (B), 50 μm (C), 5 μm (D). कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S4: स्वचालित इमेजिंग के लिए छेद संदर्भ। होल छवि (QUANTIFOIL-Holey कार्बन ग्रिड QUANTIFOIL R 1.2/1.3) पर कब्जा कर लिया है और भविष्य के संदर्भ के लिए सहेजा गया है। छेद संदर्भ का आकार विभिन्न प्रकार के ग्रिड के आधार पर भिन्न हो सकता है। किसी भी नए सत्र को शुरू करने से पहले हमेशा छेद संदर्भ पर कब्जा करने की सिफारिश की जाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S5: विभिन्न आवर्धन और छेद चयन पर छवि पर कब्जा पैनल. (ए) कैप्चर पैनल डेटा अधिग्रहण के लिए सेटिंग्स दिखाता है। (बी) अक्षांश-एस मुख्य नेविगेशन विंडो तीन लगातार आवर्धन दिखाती है। एटलस स्थिति (150x) में, ग्रिड वर्गों को डेटा अधिग्रहण के लिए चुना जाता है (बाएं हाथ का पैनल, स्केल बार = 50 μm)। उच्च आवर्धन (380x) में, एक एकल वर्ग केंद्रित होता है (मध्य पैनल, स्केल बार = 20 μm)। आगे उच्च आवर्धन (4,300x), प्रत्येक वर्ग के अंदर छेद केंद्रित हैं (दाएं हाथ पैनल, स्केल बार = 5 μm)। हालांकि, ये आवर्धन ग्रिड के आकार और आकार के अनुसार बदल जाएंगे। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S6: छेद चयन और इमेजिंग के लिए एक टेम्पलेट बनाना। टेम्पलेट पीढ़ी डेटा के लिए छेद पर एक स्थिति जोड़कर किया जाता है, और फोकस कार्बन सतह पर छेद के बगल में स्थित है। फोकस को कार्बन क्षेत्र पर स्थित होना चाहिए ताकि बीम व्यास किसी भी आसन्न छेद को स्पर्श न करे। स्केल सलाखों = 20 μm (बाएं पैनल), 10 μm (मध्य पैनल), 1000 एनएम (सही पैनल). कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S7: सार्स-CoV2 के क्रायो-ईएम इमेजिंग अक्षांश-एस और छवि स्क्रीनिंग का उपयोग कर। (ए) अधिग्रहित माइक्रोग्राफ की स्क्रीनिंग: 1 डी सीटीएफ फिट, 2 डी सीटीएफ फिट, और सीटीएफ पैरामीटर; CISTEM का उपयोग करके SARS-CoV2 स्पाइक प्रोटीन डेटा का अनुमान। 1D CTF फिट और थॉन रिंग से पता चलता है कि समग्र संकेत 4.8 Å है( B) स्पाइक प्रोटीन के दो अलग-अलग डिफोकस मूल्य पर माइक्रोग्राफ अक्षांश-एस का उपयोग करके अधिग्रहित किए जाते हैं। स्केल सलाखों = 50 एनएम। (c) अंतिम 2D वर्ग औसत। 2 डी वर्ग औसत स्पाइक प्रोटीन के ऊपर, नीचे और पक्ष दृश्यों को दिखाता है। सभी उच्च-रिज़ॉल्यूशन विवरण 2 डी वर्ग औसत में दिखाई देते हैं। संक्षिप्त रूप: क्रायो-ईएम = क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी; 1D = एक आयामी; 2D = दो आयामी; CTF = इसके विपरीत स्थानांतरण समारोह; SARS-CoV2 = Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S8: सार्स-CoV2 स्पाइक प्रोटीन डेटा का डेटा प्रसंस्करण अक्षांश-एस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया। छवि स्पाइक प्रोटीन के क्रायो-ईएम डेटा को संसाधित करने के लिए अनुसरण किए गए वर्कफ़्लो को दिखाती है। स्पाइक प्रोटीन का 3 डी वर्गीकरण Relion 3.0 का उपयोग करके किया जाता है। कक्षा -1 1-आरबीडी अप खुली संरचना को दर्शाता है। कक्षा -3 और कक्षा -4 स्पाइक-प्रोटीन की सभी आरबीडी को बंद करने के लिए दिखाते हैं। कक्षा -5 स्पाइक प्रोटीन की मध्यवर्ती संरचना को दर्शाता है। संक्षिप्त रूप: क्रायो-ईएम = क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी; 3D = तीन आयामी; आरबीडी = रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन; SARS-CoV2 = Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S9: खुराक-fractionated छवि अंतिम छवि अधिग्रहण के लिए एक संदर्भ के रूप में कब्जा कर लिया. खुराक फ्रैक्शनेशन छवियों को 8.0 s एक्सपोज़र और 0.2 s / फ्रेम एक्सपोज़र के साथ कैप्चर किया जाता है। स्वचालित रूप से फिल्म फ़ाइलों को बचाने के लिए कैमरे के पास ऑटो सहेजें बटन पर क्लिक करें। छवि अधिग्रहण के बाद, छवि पर क्लिक करें और डेटा संग्रह स्थिति में छवि अद्यतन बटन का उपयोग करके खुराक-fractionated छवि पैरामीटर सहेजें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा S10: कोणीय वितरण और उत्पन्न SARS-CoV-2 1 RBD अप खुला संरचना स्पाइक प्रोटीन मानचित्र के फूरियर खोल सहसंबंध. (ए) 1-आरबीडी के अंतिम 3 डी मॉडल का कोणीय वितरण स्पाइक प्रोटीन की खुली संरचना को बढ़ाता है। नीला कम मूल्यों का प्रतिनिधित्व करता है, और लाल सामान्यीकृत कण वितरण के उच्च मूल्यों का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) फूरियर शेल सहसंबंध वक्र 1-आरबीडी अप स्पाइक प्रोटीन की खुली संरचना के 4.4 Å रिज़ॉल्यूशन को दर्शाता है, जिसका अनुमान कट-ऑफ पर लगाया गया है। संक्षिप्त रूप: 3 डी = तीन आयामी; आरबीडी = रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन; SARS-CoV2 = गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनोवायरस 2; FSC = फूरियर खोल सहसंबंध। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

एटलस छवि राज्य एटलस 115
आवर्धन 115, पिक्सेल आकार 34.7 एनएम
संकेतित Defocus 4.38 मिमी
स्पॉट आकार 8
चमक 934400
मोड इमेजिंगआईएलएम
बिनिंग 1
एक्सपोज़र समय 1.0 सेकंड
ग्रिड सर्वेक्षण स्थिति ग्रिड 380
आवर्धन 380, पिक्सेल आकार 11.2 एनएम
संकेतित Defocus 2.37 मिमी
स्पॉट आकार 8
चमक 626200
मोड इमेजिंगआईएलएम
बिनिंग 1
एक्सपोज़र समय 1.0 सेकंड
छेद सर्वेक्षण राज्य छेद 3400
आवर्धन 3,400, पिक्सेल आकार 1.20 एनएम
संकेतित Defocus -0.75 μm
स्पॉट आकार 7
बीम व्यास 8.81 μm
मोड इमेजिंगआईएलएम, एसए, एमएच
बिनिंग 1
एक्सपोज़र समय 1.0 सेकंड
फोकस राज्य फोकस 45k
आवर्धन 45,000, पिक्सेल आकार 0.0924 nm
संकेतित Defocus 4.51 μm
स्पॉट आकार 6
बीम व्यास 0.716 μm
मोड इमेजिंगआईएलएम, एसए, एमएच
बिनिंग 1
एक्सपोज़र समय 1.0 सेकंड
अधिग्रहण राज्य डेटा 45k
आवर्धन 45,000, पिक्सेल आकार 0.0924 nm
डीफोकस सेटअप न्यूनतम: -4,500 एनएम, अधिकतम: -1,500 एनएम, कदम: 250 एनएम
स्पॉट आकार 6
बीम व्यास 0.752 μm
मोड इमेजिंगआईएलएम, एसए, एमएच
बिनिंग 1
एक्सपोज़र समय 20 फ्रेम के लिए कुल 8 s एक्सपोजर
कैमरा सेटअप गिना, लाभ सामान्यीकृत, दोष सही
डेटा सहेजें सेटअप MRC

तालिका 1: अक्षांश-S स्थिति सेटअप सारांश.

विनिर्देश K2 आधार K2 शिखर सम्मेलन
TEM प्रचालन वोल्टता 200-400 kV
सेंसर सक्रिय क्षेत्र 19.2 मिमी × 18.6 मिमी
पिक्सेल में सेंसर आकार 3838 × 3710 7676 × 7420 सुपर-
प्रस्ताव
Physic अल पिक्सेल आकार 5 μm
बिनिंग 1–8x
सेंसर रीड-आउट कोई भी मनमाना क्षेत्र
फिल्म के सापेक्ष आवर्धन 1.3–1.5x
सेंसर रीड-आउट गति 50 पूर्ण fps 400 पूर्ण fps
कंप्यूटर पर गति स्थानांतरित करें 8 पूर्ण fps 40 पूर्ण fps
छवि प्रदर्शन 8 पूर्ण fps 10 पूर्ण fps
DQE प्रदर्शन (300 kV) >0.30 (शिखर) >0.25 भौतिक Nyquist के 0.5 पर >0.7 (शिखर) भौतिक Nyquist > 0.5 पर भौतिक Nyquist >0.06 के 0.5 पर भौतिक Nyquist के 1.25 पर
सॉफ़्टवेयर डिजिटल माइक्रोग्राफ सहित Gatan माइक्रोस्कोपी सुइट

तालिका 2: कैमरा विनिर्देशों.

कॉन्फ़िगरेशन विकल्प मूल्य
माइक्रोस्कोप प्रकार Talos आर्कटिका G2
उच्च तनाव 200 kV
स्रोत XFEG
लेंस क्रायो ट्विन
वैक्यूम सिस्टम Talos TMP IGP
नमूना लोडर AutoLoader

तालिका 3: माइक्रोस्कोप कॉन्फ़िगरेशन.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

अक्षांश-एस एक सहज उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस है, जो स्वचालित रूप से स्थापित करने और दो दिनों में हजारों उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोग्राफ या मूवी फ़ाइलों को इकट्ठा करने के लिए एक वातावरण प्रदान करता है। यह ग्रिड में आसान नेविगेशन प्रदान करता है और माइक्रोस्कोप चरण की स्थिति को बनाए रखता है जबकि यह कम आवर्धन से उच्च आवर्धन तक जाता है। अक्षांश-एस के साथ डेटा अधिग्रहण का प्रत्येक चरण समय-कुशल है, जिसमें एक साधारण उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस, 4.5 जीबी / एस गति तक डेटा की तेज स्ट्रीमिंग और अधिग्रहण के दौरान डेटा का एक साथ प्रदर्शन जैसी विशेषताएं हैं। इसके अतिरिक्त, precalibrated खुराक fractionation, खुराक दर, फोकस, और आवर्धन पैरामीटर आसानी से स्वचालित डेटा अधिग्रहण का एक नया सत्र शुरू करने और समय बचाने के लिए पुनः लोड किए गए थे।

निरंतर निगरानी की अनुपस्थिति में और डेटा सेट की गुणवत्ता से समझौता किए बिना स्वचालित रूप से डेटा प्राप्त करना एक चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाला कार्य है। अक्षांश-एस सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके स्वचालित डेटा संग्रह सुविधाजनक है जब समय और संसाधन प्रमुख बाधाएं हैं, खासकर इस महामारी के दौरान। हालांकि, पिछले कुछ महीनों में सार्स-कोव-2 के विभिन्न प्रोटीनों के कई क्रायो-ईएम संरचनाओं को हल किया गया है, जिससे दवा कंपनियों को टीके विकसित करने में मदद मिलेगी। विभिन्न प्रयोगशालाएं डेटा एकत्र करने के लिए विभिन्न प्रकार के स्वचालित डेटा संग्रह सॉफ़्टवेयर पैकेजों का उपयोग करती हैं। हम एक K2 शिखर सम्मेलन DED के साथ अक्षांश-एस cryo-EM स्वचालित डेटा संग्रह के लिए holey कार्बन ग्रिड या घर का बना जाओ लेपित grids30 पर इस्तेमाल किया.

यह अध्ययन प्रोटोकॉल अनुभाग में उपर्युक्त मापदंडों का उपयोग करके किया गया था, जो मजबूत सबूत प्रदान करता है कि अक्षांश-एस एकल-कण क्रायो-ईएम के लिए स्वचालित डेटा संग्रह के लिए एक उपयुक्त और आदर्श सॉफ्टवेयर पैकेज है। हालांकि, के 2 कैमरे का उपयोग करके इमेजिंग शुरू करने से पहले कुछ प्रोटोकॉल का पालन करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। K2 प्रत्यक्ष पहचान कैमरा उच्चतम प्रदर्शन प्राप्त करने के लिए बुनियादी रखरखाव दिनचर्या की आवश्यकता है। 24 घंटे के लिए 50 ° के लिए कैमरे की नियमित एनीलिंग सेंसर को सतह के स्तर पर पृष्ठभूमि शोर और संदूषण को कम करके बेहतर प्रदर्शन करने में मदद करती है। हालांकि, कैमरा एनीलिंग के बाद, कैमरे के लाभ और अंधेरे संदर्भों को अपडेट करना किसी भी छवि अधिग्रहण को करने से पहले एक अनिवार्य कदम (~ 45 मिनट लेता है) है।

यद्यपि अक्षांश-एस क्रायो-ईएम स्वचालित डेटा संग्रह के लिए एक स्थिर और उपयोगकर्ता के अनुकूल सॉफ्टवेयर पैकेज है, शुरुआत में अक्षांश-एस के 5 अलग-अलग राज्यों में विभिन्न मापदंडों (आवर्धन, स्पॉट आकार, चमक और खुराक दर) को अनुकूलित करना आवश्यक है। छेद या ग्रिड राज्यों का आवर्धन छेद ग्रिड या छेद ग्रिड प्रकारों के छेद आकारों पर निर्भर करता है (उदाहरण के लिए, R2/2 या R1.2/1.3 या R 0.6/1)। उदाहरण के लिए, R0.6/1 प्रकार ग्रिड छेद का आकार 0.6 μm है, और R2/2 ग्रिड का छेद आकार 2 μm है। इस प्रकार, ग्रिड प्रकारों R0.6/1 और R2/2 के लिए ग्रिड प्रकारों और अक्षांश-S में छेद राज्यों में छेदों को ठीक से देखने के लिए दो अलग-अलग प्रकार के आवर्धन की आवश्यकता होती है।

इसलिए, 5 अलग-अलग राज्यों में विभिन्न प्रकार के ग्रिड के लिए आवर्धन सेटिंग्स चर होंगे। स्पॉट आकार और चमक अत्यधिक आवर्धन पर निर्भर करती है। इसलिए, ये मान विभिन्न आवर्धन मानों पर बदल सकते हैं। इसलिए, स्वचालित डेटा अधिग्रहण शुरू करने से पहले विभिन्न प्रकार के क्रायो-ईएम ग्रिड का उपयोग करके अक्षांश-एस के 5 अलग-अलग राज्यों के विभिन्न मापदंडों को अनुकूलित करने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, एक बार जब सभी पैरामीटर अनुकूलित और सहेजे जाते हैं, तो उपयोगकर्ता की आवश्यकता के आधार पर सभी मापदंडों को फिर से लोड करना और विभिन्न आवर्धन या ग्रिड प्रकारों पर अक्षांश-एस का उपयोग करना आसान होता है।

अक्षांश-एस के साथ K2 का उपयोग करने का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि उपयोगकर्ता आसानी से बीम वाल्व को खोलने / बंद करने को विनियमित कर सकते हैं, कैमरे को सम्मिलित / वापस ले सकते हैं, माइक्रोस्कोप के फॉस्फोर स्क्रीन को सम्मिलित / वापस ले सकते हैं, और अक्षांश-एस के जीयूआई का उपयोग करके तरल नाइट्रोजन भरने को विनियमित कर सकते हैं। हालांकि, किसी भी अन्य विकल्प (जैसे बंदूक झुकाव, बंदूक शिफ्ट, बीम शिफ्ट, धुरी अंक, सी 2 एपर्चर सेंटरिंग, रोटेशन सेंटर, कोमा-मुक्त संरेखण) K2 अक्षांश-एस जीयूआई टैब (पूरक चित्रा S1 और चित्रा 2) के माध्यम से सुलभ नहीं हैं। डेटा संग्रह के लंबे घंटों के दौरान, बीम की स्थिति बदल सकती है।

अक्षांश-एस डेटा अधिग्रहण अवधि के दौरान सिस्टम की स्थिरता का ट्रैक रखने के लिए स्वचालित आवधिक जांच और सुधार निष्पादित कर सकता है। बीम को केंद्रित करके और अंधेरे संदर्भों को अपडेट करके सिस्टम की स्थिरता को बनाए रखा जाता है। निरंतर जांच अधिग्रहित डेटा की उच्च गुणवत्ता सुनिश्चित करती है। अक्षांश-S में, eucentric ऊंचाई (Z-height) को डेटा संग्रह से पहले केवल एक बार सही किया जाता है, और eucentric ऊंचाई की गणना स्वचालित रूप से अक्षांश-S द्वारा की जाती है जब यह ग्रिड वर्ग को बदलता है। फ़ोकस स्वचालित रूप से मापा जाता है और उपयोगकर्ता-परिभाषित फ़ोकस श्रेणी के आधार पर समायोजित किया जाता है. यदि यह दिए गए थ्रेशोल्ड मान से अधिक है, तो प्रोग्राम चरण Z स्थिति को रीसेट करेगा. यह स्थिरता सिस्टम स्थिरता पैलेट के माध्यम से नियंत्रित की जाती है। हालांकि, अन्य स्वचालित डेटा अधिग्रहण पैकेजों की तरह, अक्षांश-एस की भी कुछ सीमाएं हैं।

यदि ग्रिड असमान है, तो अक्षांश-S eucentric ऊंचाई (Z-ऊँचाई) की गणना नहीं कर सकता है। इस परिदृश्य में, यह कोई भी डेटा एकत्रित नहीं कर सकता, या defocus मान पूरी तरह से सीमा से बाहर हो जाएगा। इसलिए, उपयोगकर्ताओं को किसी भी मोड़ के बिना अपने ग्रिड तैयार करने के लिए बेहद सतर्क रहना चाहिए और अक्षांश-एस का उपयोग करके केवल फ्लैट-सतह ग्रिड की छवि होनी चाहिए। इसके अलावा, Leginon, SerialEM, और UCSF-Image के विपरीत, अक्षांश-S एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर पैकेज नहीं है। अक्षांश-एस Gatan कैमरों के साथ संगत है, जिसमें फ़िल्टर किए गए या स्टैंडअलोन K2, K3, और K3 बेस डायरेक्ट डिटेक्शन कैमरों के साथ-साथ रियो और वनव्यू कैमरे भी शामिल हैं। उपयोगकर्ताओं के लिए एक और महत्वपूर्ण नुकसान यह है कि यह फाल्कन डीईडी जैसे अन्य लोकप्रिय डीईडी के साथ संगत नहीं है। हालांकि, यह ईपीयू के लिए भी सच है, एक और स्वचालित डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पैकेज, जो क्रायो माइक्रोस्कोप के साथ उपलब्ध है और केवल फाल्कन कैमरे के साथ संगत है। हालांकि, EPU एक ऊर्जा फ़िल्टर (BioQuantum K3 इमेजिंग फ़िल्टर) के साथ K2/ K3 के साथ भी कार्यात्मक है, लेकिन स्टैंडअलोन K2 / K3 कैमरे के साथ नहीं।

अक्षांश-एस काफी EPU, SerialEM, AutoEM, AutoEMation, और Leginon के समान है, जो एकल कण क्रायो-EM के लिए स्वचालित डेटा अधिग्रहण के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर पैकेज हैं। हालांकि, अक्षांश-S केवल K2 DED, K3 DED, या BioQuantum K3 इमेजिंग फ़िल्टर के साथ संगत है। इसके अतिरिक्त, अक्षांश-एस उपयोगकर्ताओं के लिए कंपनी द्वारा निरंतर तकनीकी सहायता प्रदान की जाती है। यह तकनीकी समर्थन छोटे उपयोगकर्ता समूहों के लिए फायदेमंद है, जिन्हें डेटा अधिग्रहण के लिए K2 DED, K3 DED, या BioQuantum K3 इमेजिंग फ़िल्टर उपकरणों का उपयोग करने की आवश्यकता है और सीरियलईएम और लीजिनन जैसे मुफ्त सॉफ़्टवेयर पैकेजों को सेट करने या उपयोग करने के तरीके के बारे में कोई पूर्व ज्ञान नहीं है।

कई अन्य विशेषताएं हैं, जैसे माइक्रोक्रिस्टल इलेक्ट्रॉन विवर्तन (माइक्रोईडी), टोमोग्राफी, और ऊर्जा-फैलाव एक्स-रे स्पेक्ट्रोमेट्री (ईडीएस), जो अक्षांश के विभिन्न अन्य संस्करणों में उपलब्ध हैं। इसलिए, उपयोगकर्ता अन्य मोड में डेटा संग्रह के लिए एक ही सॉफ़्टवेयर पैकेज का उपयोग कर सकते हैं। हमारी जानकारी के लिए, माइक्रोईडी, टोमोग्राफी और ईडीएस के लिए डेटा संग्रह ईपीयू या किसी अन्य सॉफ़्टवेयर पैकेज में उपलब्ध नहीं है। इसलिए, यह अक्षांश सॉफ़्टवेयर पैकेज एकल-कण क्रायोईएम में स्वचालित डेटा अधिग्रहण के अलावा विभिन्न उद्देश्यों के लिए उपयोगी हो सकता है। हालांकि, SerialEM और Leginon, दोनों मुफ्त सॉफ्टवेयर पैकेज, फाल्कन या K2 / K3 कैमरों के लिए उपयुक्त हैं और नए उपयोगकर्ताओं के लिए बेहद उपयोगी हैं। हालांकि, अक्षांश-एस स्वतंत्र रूप से उपलब्ध नहीं है, जो इस सॉफ़्टवेयर पैकेज का नुकसान हो सकता है।

संक्षेप में, अक्षांश-एस स्वचालित डेटा अधिग्रहण उपकरण अन्य स्वचालित डेटा अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर पैकेज (जैसे, EPU, Leginon, SerialEM, UCSF-Image) के रूप में अच्छा है। अक्षांश-एस एक बेहद स्थिर और उपयोगकर्ता के अनुकूल डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पैकेज है, जो फ़िल्टर किए गए या स्टैंडअलोन K2, K3, और K3 बेस डायरेक्ट डिटेक्शन कैमरों के साथ-साथ रियो और वनव्यू कैमरों के साथ उपलब्ध है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी या हितों का वित्तीय संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम जैव प्रौद्योगिकी विभाग, विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग (डीएसटी) और विज्ञान विभाग और मानव संसाधन विकास मंत्रालय (एमएचआरडी), भारत को आईआईएससी-बैंगलोर में वित्त पोषण और क्रायो-ईएम सुविधा के लिए स्वीकार करते हैं। हम आईआईएससी, बैंगलोर में राष्ट्रीय क्रायो-ईएम सुविधा के लिए डीबीटी-बिल्डर प्रोग्राम (बीटी / आईएनएफ / 22 / एसपी 22844 /2017) और डीएसटी-फिस्ट (एसआर / एफएसटी / एलएसआईआई -039 / 2015) को स्वीकार करते हैं। हम विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड (SERB) (अनुदान संख्या-SB/ S2/ RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 और SERB-IPA/2020/000094), DBT (अनुदान संख्या 145/2015) से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं। BT/PR25580/BRB/10/1619/2017)। हम क्रायो-ईएम ग्रिड, क्रायो-ईएम डेटा संग्रह तैयार करने और सामग्री की तालिका तैयार करने के लिए सुश्री इशिका प्रमानिक को धन्यवाद देते हैं। हम क्रायो-ईएम छवि प्रसंस्करण के लिए और आंकड़े तैयार करने में हमारी मदद करने के लिए श्री सुमन मिश्रा को भी धन्यवाद देते हैं। हम इस अध्ययन के लिए शुद्ध स्पाइक प्रोटीन नमूना प्राप्त करने में हमारी मदद करने के लिए प्रोफेसर राघवन वरदराजन को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blotting paper Ted Pella, INC. 47000-100 EM specimen preparation item
Capsule Thermo Fisher Scientific 9432 909 97591 EM specimen preparation unit
Cassette Thermo Fisher Scientific 1020863 EM specimen preparation unit
C-Clip Thermo Fisher Scientific 1036171 EM specimen preparation item
C-Clip Insertion Tool Thermo Fisher Scientific 9432 909 97571 EM specimen preparation tool
C-Clip Ring Thermo Fisher Scientific 1036173 EM specimen preparation item
EM grid (Quantifoil) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold
Glow discharge Machine Quorum N/A Quorum GlowQube glow discharge machine
K2 DED Gatan Inc. N/A Cryo-EM data collection device (Camera)
Latitude S Software Gatan Inc. Imaging software
Loading station Thermo Fisher Scientific 1130698 EM specimen preparation unit
Talos 200 kV Arctica Thermo Scientific™ N/A Cryo-Electron Microscope
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A EM specimen preparation unit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
  2. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  3. Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
  4. Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
  5. Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  8. McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
  9. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  10. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  11. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  12. Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  13. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  14. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
  15. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  16. Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
  17. Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
  18. Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  20. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  21. Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
  22. Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
  23. Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).
  24. Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
  25. Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
  26. Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
  27. Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
  28. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  29. Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
  30. Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 173 क्रायो-ईएम अक्षांश-एस एकल कण विश्लेषण सार्स-कोव -2 स्पाइक-प्रोटीन टैलोस आर्कटिका
एकल-कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल, उच्च-थ्रूपुट, और पूरी तरह से स्वचालित डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumar, A., P., S., Gulati, S.,… More

Kumar, A., P., S., Gulati, S., Dutta, S. User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62832, doi:10.3791/62832 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter