Summary
La microscopia crioelettronica a singola particella richiede un pacchetto software adatto e una pipeline user-friendly per l'acquisizione automatica dei dati ad alto rendimento. Qui presentiamo l'applicazione di un pacchetto software di acquisizione di immagini completamente automatizzato, Latitude-S, e una pratica pipeline per la raccolta di dati di biomolecole vetrificate in condizioni a basso dosaggio.
Abstract
Negli ultimi anni, i progressi tecnologici e metodologici nella microscopia crioelettronica a singola particella (cryo-EM) hanno aperto una nuova strada per la determinazione della struttura ad alta risoluzione delle macromolecole biologiche. Nonostante i notevoli progressi nella crio-EM, c'è ancora spazio per miglioramenti in vari aspetti del flusso di lavoro di analisi delle singole particelle. L'analisi a singola particella richiede un pacchetto software adatto per l'acquisizione automatica dei dati ad alta produttività. Negli ultimi otto anni sono stati sviluppati diversi pacchetti software di acquisizione automatica dei dati per l'imaging automatico per la crio-EM a singola particella. Questo documento presenta un'applicazione di una pipeline di acquisizione di immagini completamente automatizzata per biomolecole vetrificate in condizioni a basso dosaggio.
Dimostra un pacchetto software in grado di raccogliere dati crio-EM in modo completo, automatico e preciso. Inoltre, vari parametri microscopici sono facilmente controllabili da questo pacchetto software. Questo protocollo dimostra il potenziale di questo pacchetto software nell'imaging automatizzato della proteina spike della sindrome respiratoria acuta grave-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) con un microscopio crioelettronico da 200 keV dotato di un rilevatore di elettroni diretti (DED). Circa 3.000 immagini di film crio-EM sono state acquisite in una singola sessione (48 ore) di raccolta dati, producendo una struttura a risoluzione atomica della proteina spike di SARS-CoV-2. Inoltre, questo studio strutturale indica che la proteina spike adotta due conformazioni principali, 1-RBD (dominio di legame del recettore) in alto aperto e tutte le conformazioni RBD giù chiuse.
Introduction
La crio-EM a singola particella è diventata una tecnica di biologia strutturale tradizionale per la determinazione della struttura ad alta risoluzione delle macromolecole biologiche1. La ricostruzione di singole particelle dipende dall'acquisizione di un vasto numero di micrografie di campioni vetrificati per estrarre immagini di particelle bidimensionali (2D), che vengono poi utilizzate per ricostruire una struttura tridimensionale (3D) di una macromolecola biologica2,3. Prima dello sviluppo dei DED, la risoluzione ottenuta dalla ricostruzione di singole particelle variava tra 4 e 30 Å4,5. Recentemente, la risoluzione raggiungibile dalla crio-EM a singola particella ha raggiunto oltre 1,8 Å6. Il DED e il software di acquisizione dati automatizzato hanno contribuito in modo determinante a questa rivoluzione della risoluzione7, in cui l'intervento umano per la raccolta dei dati è minimo. Generalmente, l'imaging crio-EM viene eseguito a basse dosi di elettroni (20-100 e / Å2) per ridurre al minimo il danno da radiazioni indotto dal fascio di elettroni dei campioni biologici, che contribuisce al basso rapporto segnale-rumore (SNR) nell'immagine. Questo basso SNR impedisce la caratterizzazione delle strutture ad alta risoluzione delle macromolecole biologiche utilizzando l'analisi a singola particella.
I rivelatori di elettroni di nuova generazione sono rivelatori basati su CMOS (complementare metallo-ossido-semiconduttore), che possono superare questi ostacoli legati al basso SNR. Queste telecamere CMOS a rilevamento diretto consentono una lettura rapida del segnale, grazie alla quale la telecamera contribuisce a una migliore funzione di diffusione del punto, un SNR adatto e un'eccellente efficienza quantistica detective (DQE) per macromolecole biologiche. Le telecamere a rilevamento diretto offrono un elevato SNR8 e un basso rumore nelle immagini registrate, con conseguente aumento quantitativo dell'efficienza quantistica del detective (DQE), una misura della quantità di rumore che un rilevatore aggiunge a un'immagine. Queste telecamere registrano anche filmati alla velocità di centinaia di fotogrammi al secondo, il che consente una rapida acquisizione dei dati9,10. Tutte queste caratteristiche rendono le telecamere a rilevamento diretto rapido adatte per applicazioni a basso dosaggio.
Le immagini stack con correzione del movimento vengono utilizzate per l'elaborazione dei dati per calcolare la classificazione 2D e ricostruire una mappa di densità 3D delle macromolecole utilizzando vari pacchetti software come RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 e EMAN215. Tuttavia, per l'analisi a singola particella, è necessario un enorme set di dati per ottenere una struttura ad alta risoluzione. Pertanto, i pedaggi di acquisizione automatica dei dati sono estremamente essenziali per la raccolta dei dati. Per registrare grandi set di dati crio-EM, negli ultimi dieci anni sono stati utilizzati diversi pacchetti software. Pacchetti software dedicati, come AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS ed EPU, sono stati sviluppati per l'acquisizione automatica dei dati.
Questi pacchetti software utilizzano attività di routine per trovare automaticamente le posizioni dei fori correlando le immagini a basso ingrandimento alle immagini ad alto ingrandimento, che aiutano a identificare i fori con ghiaccio vitreo di spessore di ghiaccio appropriato per l'acquisizione di immagini in condizioni a basso dosaggio. Questi pacchetti software hanno ridotto il numero di attività ripetitive e aumentato il throughput della raccolta dati crio-EM acquisendo una grande quantità di dati di buona qualità per diversi giorni in modo continuo, senza alcuna interruzione e la presenza fisica dell'operatore. Latitude-S è un pacchetto software simile, che viene utilizzato per l'acquisizione automatica dei dati per l'analisi di singole particelle. Tuttavia, questo pacchetto software è adatto solo per ID K2 / K3 e viene fornito con questi rilevatori.
Questo protocollo dimostra il potenziale di Latitude-S nell'acquisizione automatica di immagini della proteina spike SARS-CoV-2 con un rivelatore di elettroni diretto dotato di un crio-EM da 200 keV (vedi la Tabella dei materiali). Utilizzando questo strumento di raccolta dati, 3.000 file di filmati della proteina spike SARS-CoV-2 vengono acquisiti automaticamente e viene effettuata un'ulteriore elaborazione dei dati per ottenere una struttura proteica spike con risoluzione 3,9-4,4 Å.
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Protocol
NOTA: per la raccolta dei dati crio-EM sono necessari tre passaggi importanti: 1. preparazione della griglia crio-EM, 2. calibrazione e allineamento del microscopio, 3. raccolta automatica dei dati (Figura 1). Inoltre, la raccolta automatizzata dei dati è suddivisa in a. selezione dell'area adatta, b. ottimizzazione di Latitude-S, c. avvio della selezione automatica dei fori e d. avvio automatico dell'acquisizione automatica dei dati (Figura 1).
1. Preparazione della griglia Cryo-EM e caricamento dei campioni per l'acquisizione automatica dei dati
- Pulire le griglie utilizzando uno scaricatore a bagliore e variare i parametri di scarica del bagliore in base ai requisiti sperimentali (qui, 60 s a 20 mA).
- Aggiungere un campione proteico appena preparato (3 μL) alla griglia a scarica di bagliore e incubare per 10 s.
- Tamponare le griglie per 3-5 s al 100% di umidità e immergerle rapidamente nell'etano liquido usando un crio-stantuffo.
- Bloccare manualmente le griglie in un anello di clip per formare la cartuccia utilizzando un anello C-clip flessibile.
- Caricare le griglie congelate montate sulla cartuccia nella cassetta del caricatore automatico e trasferire la cassetta dal nano tappo al caricatore automatico preraffreddato del microscopio per la raccolta dei dati.
2. Sintonizzazione del microscopio e allineamento di base prima dell'acquisizione automatica dei dati
- Spostamento del fascio
- Fare clic su Beam shift dalla scheda Allineamento diretto .
- Ridurre l'ingrandimento e centrare il fascio sull'asse ottico utilizzando la manopola X e Y multifunzione .
- Allineamento del punto di rotazione
- Fate clic sull'opzione Inclinazione fascio (Beam tilt ) in Allineamento diretto pp X (Direct Alignment pp X ) della scheda Allineamento diretto (Direct Alignment ).
- Condensare il fascio in un punto e ridurre al minimo il movimento utilizzando la manopola multifunzione X e Y .
- Centraggio dell'apertura C2
- Selezionate l'apertura del condensatore dalla scheda Allineamento .
- Condensare il raggio in un punto, centrare il raggio sull'asse ottico e quindi espandere il raggio per coprire il cerchio in modo uniforme.
- Ripetere questi passaggi fino a quando l'apertura del condensatore 2 non viene regolata.
- Allineamento senza coma
- Fare clic su Allineamento X senza coma dalla scheda Allineamento diretto per allineare il fascio all'asse ottico.
- Utilizzare la manopola multifunzione per ridurre al minimo la forma e il movimento dell'FFT (assicurarsi che sia stabile).
- Ripetere la stessa procedura per Coma - allineamento libero Y.
- Impostare l'illuminazione parallela prima della raccolta dei dati nella crio-EM a causa della doppia lente C.
- Inserire l'apertura dell'obiettivo (70 μm) in modalità diffrazione.
- Focalizzare l'apertura dell'obiettivo sul piano focale anteriore dell'obiettivo di diffrazione controllando la manopola di intensità di sfocatura (obiettivo obiettivo e corrente dell'obiettivo C2).
- Assicurarsi che il bordo nitido dell'apertura dell'obiettivo sia visualizzato dopo la corretta sfocatura.
- Inserire il tappo del fascio e distribuire l'intensità fino a ridurre al minimo gli anelli di diffrazione della polvere d'oro.
NOTA: se il raggio è distribuito correttamente, sullo schermo è visibile un anello di diffrazione trasparente della polvere d'oro, che indica che il raggio è parallelo. - Ritrarre il tappo del fascio dopo aver impostato l'illuminazione parallela e cambiare la modalità del microscopio in nano sonda.
NOTA: Controllare la messa a punto del microscopio prima di iniziare la raccolta dei dati per garantire le prestazioni ottimali del microscopio. Tutte queste impostazioni verrebbero eseguite nel microscopio Direct Alignment GUI Tab. Tutta la messa a punto del microscopio viene eseguita utilizzando una griglia di prova prima della raccolta dei dati.
3. Acquisizione dati con Latitude-S
- Avviare il software di acquisizione dati automatizzato Latitude-S.
NOTA: l'installazione di Latitude-S richiede anche la calibrazione del microscopio, che verrà eseguita prima della raccolta dei dati e le impostazioni verranno memorizzate in modo permanente. Cinque diversi stati per la raccolta dei dati sono calibrati con quattro diversi ingrandimenti (Figura 1 e Figura 2). Lo stato dell'atlante e lo stato della griglia sono in due diversi ingrandimenti in modalità LM (intervalli a basso ingrandimento). Lo stato del foro è in modalità SA (intervalli ad alto ingrandimento) ma con un ingrandimento moderato. Lo stato attivo e lo stato dei dati utilizzano la modalità SA ad alto ingrandimento.- Fare clic su DigitalMicrograph dal menu Start oppure fare doppio clic sull'icona DigitalMicrograph sul desktop.
- Selezionare l'icona Gestione tecnica da DigitalMicrograph.
NOTA: questo sistema mostrerà le icone TEM e Latitude-S (Figura 2 e Figura supplementare S1). - Selezionare l'icona Latitude-S per la raccolta automatica dei dati a particella singola.
NOTA: la telecamera K2 funziona in tre modalità: lineare/integrata, conteggiata e super-risoluzione. L'utente può selezionare qualsiasi modalità nell'interfaccia di DigitalMicrograph. Le immagini di dati possono essere salvate come stack di immagini frazionate in dose o come immagini sommate in file MRC, TIF o .dm4 con profondità di bit diverse. Inoltre, i dati potrebbero essere salvati come immagini corrette dal movimento per la fotocamera K3. Su una fotocamera K2, uno stack di immagini non elaborato può essere salvato come file MRC a 4 bit, TIF a 8 bit o .dm4 a 8 bit.
- Creare una nuova sessione in base alle impostazioni di una sessione precedente.
- Seleziona la casella di controllo In base alla sessione precedente nella tavolozza.
- Seleziona il pulsante Nuovo .
- Scegliere la cartella contenente la sessione su cui si basano le impostazioni della nuova sessione. Passare alla directory della sessione precedente per creare la nuova sessione. Scegliere la cartella in cui salvare la nuova sessione e i dati associati.
- Selezionare e scegliere la cartella in cui verranno salvati la nuova sessione e i dati associati.
NOTA: ogni stato e le relative impostazioni sottostanti (ingrandimento, condizioni di illuminazione, immagine o proiettore) e lo spostamento del fascio e i parametri della fotocamera (esposizione totale, esposizione a fotogramma singolo e binning) verranno esportati dalla sessione esistente alla nuova sessione. Il percorso della cartella viene visualizzato come stringa di testo nella parte inferiore della tavolozza. A ciascuna delle tavolozze degli stati e di configurazione è aggiunto un asterisco (*) al titolo per indicare che è già stato configurato ed è pronto per l'uso.
- Continuare una sessione esistente.
- Premere il pulsante Continua nella tavolozza per continuare una sessione esistente.
NOTA: il montaggio dell'atlante non può essere modificato. - Scegliere e passare alla cartella che contiene la sessione che deve essere continuata.
- Premere il pulsante Continua nella tavolozza per continuare una sessione esistente.
- Inizia una sessione completamente nuova.
- Fare clic su Nuova scheda nella tavolozza. Scegliere la cartella che contiene la sessione da continuare. Selezionare una cartella in cui salvare i dati.
Nota : il nome di cartella predefinito viene compilato utilizzando la data e l'ora. - Fare clic sull'icona Impostazioni . Nella casella Gestisci esplorazione stato visualizzata, aggiungere stato, impostare la condizione TEM, la condizione fotocamera e immagine/stack, quindi assegnare un nome allo stato.
NOTA: il flusso di lavoro di acquisizione automatica dei dati utilizza 5 stati diversi per la raccolta automatica dei dati. Questi stati vengono configurati e memorizzati nelle rispettive tavolozze di stati. Il riepilogo dello stato è riportato nella Tabella 1.
- Fare clic su Nuova scheda nella tavolozza. Scegliere la cartella che contiene la sessione da continuare. Selezionare una cartella in cui salvare i dati.
- Configurare lo stato dell'atlante.
- Fare clic sulla tavolozza degli stati dell'atlante.
- Configurare lo stato dell'atlante con i seguenti parametri: ingrandimento 115x modalità LM in nano sonda, condizioni di illuminazione-dimensione spot 8 e luminosità 934400, binning: 1 e tempo di esposizione della fotocamera: 1.0 s per l'imaging a basso ingrandimento. Fare riferimento al riepilogo dello stato fornito nella Tabella 1.
- Fare clic su Avanti per passare allo stato successivo.
NOTA: lo stato dell'atlante è lo stato di ingrandimento più basso, che fornisce il rilevamento dell'intera griglia (Figura supplementare S2). Generalmente, questo stato ci aiuta a visualizzare le intere griglie a basso ingrandimento e giudicare lo spessore del ghiaccio, la planarità e il quadrato rotto delle griglie. Si consiglia di generare l'atlante in diverse aree della griglia per osservare lo spessore ottimale del ghiaccio e lo spessore di ghiaccio non ottimale delle griglie (Figura supplementare S3). I parametri citati potrebbero essere variati in base alle esigenze dell'utente.
- Configurare lo stato della griglia.
- Fare clic sulla tavolozza Stato griglia.
- Configurare lo stato grid con le seguenti ottiche di imaging al microscopio (ingrandimento 380x modalità LM nella sonda Nano), condizioni di illuminazione (dimensione dello spot: 8 e luminosità 626.200), binning: 1 e tempo di esposizione della fotocamera: 1,0 s.
- Vedere il riepilogo dello stato Latitude-S fornito nella Tabella 1.
- Fare clic su Avanti per passare allo stato successivo.
NOTA: lo stato della griglia è impostato con un ingrandimento superiore allo stato dell'atlante in modo tale che il campo visivo sia di un quadrato della griglia (Figura 2). In questo particolare ingrandimento, si osserva un quadrato della griglia. Pertanto, i fori sono osservati correttamente in questo ingrandimento, che aiuta a controllare lo spessore del ghiaccio dei fori (Figura supplementare S4). Un semplice filtro passa-banda viene utilizzato nello stato della griglia per individuare i fori nella griglia del brevetto. I parametri citati potrebbero essere variati in base alle esigenze dell'utente.
- Configurate lo stato del foro.
- Fate clic sulla tavolozza dei fori.
- Configurare lo stato del foro con le seguenti impostazioni del microscopio: ottica di imaging (ingrandimento 4500x modalità SM in nano sonda), condizioni di illuminazione (dimensione dello spot: 7 e diametro del fascio 8,81 μm), binning: 1 e tempo di esposizione della fotocamera: 1,0 s.
- Modificare i parametri, se necessario, in base al tipo di griglia. Vedere il riepilogo dello stato fornito nella Tabella 1.
- Fare clic su Avanti per passare allo stato successivo.
NOTA: la modalità SA indica un intervallo di ingrandimento elevato nel microscopio elettronico. Lo stato del foro è nell'intervallo di ingrandimento SA con un campo visivo di pochi micrometri (10-20 μm) (Figura 2 e Figura supplementare S4). Questo intervallo di ingrandimento è superiore allo stato Atlante o Griglia ma molto più piccolo dello stato Messa a fuoco/Dati. In questo ingrandimento, i singoli fori saranno visibili. La dimensione del foro è appropriata per osservare alti gradi di contaminazione, fori vuoti e il corretto spessore del ghiaccio dei fori. I fori per l'imaging sono selezionati in base a queste ipotesi. Nello stato del foro vengono utilizzati due filtri: uno per correlare un'immagine di riferimento del foro con una nuova immagine del foro e un altro per regolare l'altezza dello stage all'altezza eucentrica.
- Configurare lo stato attivo.
- Fare clic sulla tavolozza Messa a fuoco.
- Configurare lo stato di messa a fuoco con le seguenti impostazioni del microscopio: ottica di imaging (ingrandimento 45.000x modalità SA in nano sonda), condizioni di illuminazione (dimensione dello spot: 8 e luminosità 934400), binning: 1 e tempo di esposizione della fotocamera: 1,0 s.
- Concentrati sull'area del carbonio amorfo vicino al foro. Fare riferimento al riepilogo dello stato Latitude-S fornito nella Tabella 1.
- Fare clic su Avanti per passare allo stato successivo.
NOTA: la modalità SA indica un intervallo di ingrandimento elevato nel microscopio elettronico. Lo stato Focus è l'ingrandimento dell'intervallo SA più elevato. In modalità di messa a fuoco, il raggio viene spostato in un'area di carbonio vicina del foro di destinazione ed esegue automaticamente la messa a fuoco per raccogliere i dati nello stato dei dati. Un filtro passa-banda combinato con un filtro hanning o soft rettangolare viene utilizzato nello stato di messa a fuoco per misurare l'offset tra due immagini dello stato di messa a fuoco della stessa area (Figura 2). I parametri citati potrebbero essere variati in base alle esigenze dell'utente.
- Configurare lo stato dei dati.
- Fare clic su Tavolozza dati.
- Configurare lo stato dei dati con le seguenti impostazioni del microscopio: ottica di imaging (ad esempio, ingrandimento 28.000x, 45.000x, 54.000x in modalità SA in nano sonda), condizioni di illuminazione (dimensione dello spot: 8 e luminosità 934400), binning: 1 e tempo di esposizione della fotocamera: 1.0 s.
- Fare riferimento al riepilogo dello stato Latitude-S fornito nella Tabella 1.
- Fare clic su Avanti per passare allo stato successivo.
NOTA: lo stato dei dati è l'ingrandimento più elevato selezionato in base ai requisiti di dimensione dei pixel e alla risoluzione di destinazione (Figura 2). Generalmente, dopo la messa a fuoco, il raggio viene automaticamente spostato nell'area di destinazione per raccogliere i dati. I parametri sopra menzionati potrebbero essere modificati in base alle esigenze dell'utente.
4. Configurazione della messa a fuoco
- Fare clic sulla tavolozza di configurazione Messa a fuoco. Specificate l'intervallo di valori di sfocatura e la dimensione del passo nella scheda specificata.
- Premere il pulsante Avanti per passare al passaggio successivo.
NOTA: valori di sfocatura più bassi possono essere utilizzati per l'acquisizione di dati ad alta risoluzione. Generalmente, per l'acquisizione delle immagini vengono utilizzati valori di sfocatura da -0,5 a -3,0 μm con dimensioni del gradino di sfocatura di 0,25 o 0,5 5. Gli utenti possono saltare il passaggio di configurazione dello stato attivo se desiderano solo esaminare l'esempio. Basta premere il pulsante Avanti sulla tavolozza per saltare la fase di configurazione della messa a fuoco.
5. Allineamento fine
- Concentrarsi su alcune caratteristiche della griglia (ad esempio, ghiaccio esagonale di contaminazione del ghiaccio); vedere la Figura 3.
NOTA: le funzionalità non devono essere troppo grandi o troppo piccole. Dovrebbero essere visibili sia con l'ingrandimento dello stato Atlas 115x (modalità LA) che con l'ingrandimento dei dati. - Fare clic sul pulsante Cattura . Posiziona il segno della croce rossa sulla stessa caratteristica su ogni immagine di stati diversi.
- Inizia con lo stato attivo, i dati e gli stati dei fori perché il loro campo visivo è molto più grande degli stati dell'atlante e della griglia. Eseguire lo zoom sugli stati atlante e griglia per posizionare il segno della croce rossa sulla stessa feature negli stati atlante e griglia.
- Fare clic sul pulsante Calcola per calcolare le posizioni di cinque stati diversi, che calcoleranno gli offset tra ciascuno degli stati e li rifletteranno nella finestra di output.
NOTA: i valori di offset sono integrati negli stati per un ulteriore utilizzo (Figura 3). L'allineamento fine viene eseguito per fornire un'elevata precisione della posizione di ciascuno stato (Figura 3). Questo allineamento fine aiuta a individuare la posizione esatta in tutti e cinque gli stati. L'allineamento fine è fondamentale per l'acquisizione di dati a singola particella. Pertanto, si consiglia vivamente di eseguire l'allineamento fine prima dell'imaging.
6. Procedura di acquisizione dati con Latitude-S
- Fare clic sulla tavolozza Cattura.
NOTA: Generalmente, i dati dell'atlante vengono raccolti a basso ingrandimento (115x) per visualizzare la maggior parte dei quadrati della griglia. - Scegli le dimensioni dell'atlante per coprire l'intera griglia o parte della griglia in base al requisito (ad esempio, 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 o 8 x 12).
NOTA: la dimensione dell'atlante 16 x 16 copre l'intera griglia. - Fare clic sul pulsante Cattura per acquisire l'atlante.
NOTA: viene visualizzata la finestra di navigazione principale di Latitude-S che riempie lo spazio disponibile in DigitalMicrograph (Figura supplementare S5). Tre riquadri immagine nella finestra di navigazione principale mostrano le immagini degli stati del sistema a tre diversi ingrandimenti. L'atlante complessivo è attualmente visualizzato nel suo stato corrente di acquisizione nel riquadro più a sinistra. Le tessere nell'atlante si riempiranno man mano che si verifica ogni acquisizione. - Selezionare il quadrato della griglia in base allo spessore del ghiaccio navigando sull'atlante (Figura supplementare S5). Una volta selezionati i quadrati della griglia desiderati, fare clic sul pulsante Pianifica e osservare le tessere nel quadrato della griglia riempirsi mentre ogni quadrato della griglia viene acquisito.
- Fare clic sul pulsante Pianifica una volta selezionati i quadrati della griglia.
- Selezionate un foro rappresentativo nel quadrato della griglia aggiungendone la posizione. Una volta acquisita l'immagine di un foro, definire i dati e le posizioni di messa a fuoco e salvare il layout come modello (Figura supplementare S6).
- Fare clic su Ricerca automatica, indicare la dimensione del foro (ad esempio, R1.2 / 1.3) e fare clic sul pulsante Trova nel programma, che farà sì che il programma Trova trovi automaticamente i fori in base al diametro del foro. Quindi, fare clic sul pulsante Contrassegna per aggiungere il modello (Figura 4) e aggiungere segni di cerchi rossi in tutti i fori in una griglia o in un quadrato parziale della griglia.
- Impostare l'intensità per rimuovere i fori dal quadrato della griglia e la contaminazione da ghiaccio (Figura 4).
NOTA: Infine, i fori selezionati saranno contrassegnati in giallo per la pianificazione della raccolta dei dati. - Fare clic sul pulsante Pianifica nelle attività Latitude dopo aver aggiunto i fori tramite Ricerca automatica.
NOTA: prima di pianificare la raccolta automatica dei dati, assicurarsi che il livello del serbatoio dell'azoto liquido sia sufficiente, che la pompa turbo del caricatore automatico sia spenta e che lo spazio dell'unità RAID sia libero. Il task manager Latitude-S mostra il numero di stati dell'atlante, del quadrato della griglia, del foro e dei dati pianificati per la raccolta dei dati (Figura 5). Nella GUI di Latitude-S, saranno visibili varie combinazioni di colori e verrà visualizzato il significato delle diverse combinazioni di colori: 1. Il giallo indica non programmato; 2. Il verde indica programmato; 3. Il blu indica Acquisito; 4. Il rosso indica non riuscito.
7. Elaborazione dati Cryo-EM
NOTA: l'elaborazione delle immagini Cryo-EM della proteina spike è descritta in dettaglio nella letteratura recente25.
- Eseguire l'elaborazione delle immagini della proteina spike di SARS-CoV2 utilizzando RELION 3.011.
- Scherma manualmente le immagini dei filmati raccolte utilizzando Latitude-S ed esegui la correzione del movimento indotta dal fascio dei singoli filmati utilizzando il software MotionCor29. Eseguire manualmente lo screening iniziale delle micrografie corrette in movimento con l'aiuto del pacchetto software cisTEM14.
NOTA: Quasi l'85% delle micrografie acquisite automaticamente erano di buona qualità e i dati avevano un segnale compreso tra 3,7-5,2 Å, che viene calcolato utilizzando il software cisTEM14 (Figura supplementare S7A,B). - Elaborare i dati utilizzando il pacchetto software RELION 3.011.
- Prelevare manualmente le particelle spike e sottoporle alla classificazione di classe 2D (Figura supplementare S7C). Utilizzare la migliore classe 2D come riferimento per selezionare automaticamente 3.99.842 particelle a picco singolo dalle micrografie utilizzando lo strumento di selezione automatica RELION11.
NOTA: Sono stati effettuati tre cicli di classificazione 2D prima di sottoporre le particelle alla classificazione 3D (Figura supplementare S8). Circa 2.55.982 singole particelle sono state selezionate per la classificazione 3D e il set di dati è stato classificato in sei classi. L'auto-perfezionamento 3D finale è stato eseguito con la migliore classe; 85.227 particelle spike sono state ottenute dalla classificazione 3D. - Dopo il perfezionamento automatico, eseguire il perfezionamento per sfocatura per particella con parametri di inclinazione del fascio appropriati per il miglioramento della risoluzione. Successivamente, sottoporre le particelle alla lucidatura bayesiana utilizzando il pacchetto software RELION 3.011. Infine, utilizzare il set di particelle lucide per un altro ciclo di auto-raffinamento 3D utilizzando RELION 3.011.
- Prelevare manualmente le particelle spike e sottoporle alla classificazione di classe 2D (Figura supplementare S7C). Utilizzare la migliore classe 2D come riferimento per selezionare automaticamente 3.99.842 particelle a picco singolo dalle micrografie utilizzando lo strumento di selezione automatica RELION11.
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Representative Results
Nell'attuale situazione pandemica, la crio-EM svolge un ruolo chiave nel caratterizzare le strutture di varie proteine da SARS-CoV-226,27,28,29, che possono aiutare a sviluppare vaccini e farmaci contro il virus. Vi è un urgente bisogno di sforzi di ricerca rapidi con risorse umane limitate per combattere la malattia da coronavirus del 2019. L'acquisizione dei dati nella crio-EM a singola particella è un passo che richiede tempo ma è cruciale nella determinazione della struttura delle macromolecole. I recenti sviluppi nell'acquisizione automatica dei dati crio-EM hanno consentito un'interferenza umana limitata nella raccolta dei dati. Il software Latitude-S è un importante pacchetto software di acquisizione automatica dei dati utilizzato qui per la raccolta automatica dei dati della proteina spike SARS-CoV2 purificata.
L'acquisizione dati Cryo-EM della proteina spike SARS-CoV-2 è stata eseguita con un cryo-EM da 200 keV dotato di un K2 Summit DED. Le posizioni per l'acquisizione dei dati sulla griglia con lo spessore del ghiaccio desiderato e la distribuzione delle particelle sono state contrassegnate manualmente. Le posizioni sono state contrassegnate in parallelo durante l'acquisizione dei dati che si verifica in background. Nelle posizioni contrassegnate, il software Latitude-S ha effettuato l'acquisizione automatica dei dati con un ingrandimento nominale di 42.200x alla dimensione dei pixel di 1,17 Å a livello di campione. La configurazione per la raccolta dei dati con ingrandimento 42.200x era già preimpostata e testata. Un totale di 40 fotogrammi sono stati registrati per 8 s con la dose di elettroni di 2 e−/Å2 per fotogramma; pertanto, una dose totale di 80 e−/Å2 è stata utilizzata per la raccolta dei dati (Figura supplementare S9). I dati sono stati acquisiti in un intervallo di sfocatura di -0,75 μm e -2,25 μm, con 3.000 file di filmati raccolti in due giorni. Ogni 4 ore, controlli e regolazioni periodiche sono stati eseguiti dal software per garantire che tutti i file di film raccolti su 48 ore fossero di buona qualità e non ci fosse alcun cambiamento di fascio o spostamento di allineamento. I dati sono stati raccolti in modo indipendente senza alcun intervento umano. Inoltre, Latitude-S interrompe automaticamente le immagini al momento del riempimento di azoto liquido, riducendo le vibrazioni non necessarie o la deriva meccanica nelle immagini.
Come accennato nella sezione protocollo, lo screening iniziale delle micrografie corrette in movimento è stato eseguito manualmente utilizzando il software cisTEM14. Sulla base dello screening, la maggior parte dei dati è risultata essere all'interno dell'intervallo di segnale di 3,7-5,2 Å (Figura supplementare S7A). Ciò suggerisce che la raccolta automatica dei dati utilizzando Latitude-S è buona e la maggior parte dei dati è adatta per la ricostruzione 3D ad alta risoluzione. Inoltre, le immagini sono state raccolte a intervalli di sfocatura (da -0,75 a -2,25 μm) e vari intervalli di sfocatura sono stati controllati manualmente da cisTEM14. I dati acquisiti erano molto vicini all'intervallo di sfocatura della configurazione in Latitude-S (Figura supplementare S7A,B).
L'elaborazione dei dati è stata effettuata utilizzando il pacchetto software RELION 3.011. Le particelle spike sono state scelte manualmente per calcolare le medie delle classi 2D. Vari dettagli strutturali (elica e β-foglio) sono visibili nelle medie di classe 2D (Figura supplementare S7C), il che suggerisce fortemente che la caratterizzazione strutturale ad alta risoluzione è possibile utilizzando questo set di dati. Tuttavia, la classificazione 3D indica anche che la proteina spike ha un dominio di legame del recettore 1 (RBD) aperto e tutta la conformazione RBD verso il basso (Figura supplementare S8). La classificazione 3D indica che la classe-1 ha il numero massimo di particelle, che appaiono come una conformazione 1-RBD aperta. Inoltre, la classe-3 e la classe-4 hanno un numero simile di particelle, ed entrambi i modelli sembravano avere tutti i RBD verso il basso a conformazione ravvicinata. Tuttavia, la classe-5 mostra una conformazione intermedia, dove 1-RBD si trova in una posizione intermedia. Tuttavia, le conformazioni aperte 1-RBD della proteina spike sono state ricostruite utilizzando la simmetria C1 e la risoluzione complessiva è di 4,4 Å (Figura 6 e Figura supplementare S10). Allo stesso modo, tutte le conformazioni ravvicinate RBD down (classe-3 e classe-4) sono state perfezionate insieme alla simmetria C3 e la risoluzione complessiva a 0,143 FSC è ~ 3,9 Å (Figura 7).
L'elaborazione complessiva dell'immagine indica che la proteina spike adotta tutti i RBD verso il basso e 1-RBD verso l'alto con la conformazione aperta. Inoltre, è stata identificata una conformazione intermedia della proteina spike. La struttura crio-EM ad alta risoluzione del sottodominio S2 della proteina spike indica le catene laterali dei singoli residui di amminoacidi (Figura 6B e Figura 7C). Tutte le ricostruzioni 3D e i risultati crio-EM sono molto simili ai risultati della letteratura pubblicata di recente25. Tuttavia, la struttura crio-EM ad alta risoluzione della proteina spike è stata caratterizzata entro 15 giorni, il che è possibile solo grazie ai protocolli di acquisizione dati crio-EM automatici e al software di selezione automatica delle particelle. Pertanto, i pacchetti software di acquisizione automatica dei dati, incluso Latitude-S, possono contribuire in modo significativo alla caratterizzazione di diverse strutture crio-EM ad alta risoluzione di macromolecole biologiche.
Figura 1: Flusso di lavoro di acquisizione dati automatizzata utilizzando Latitude-S: Passaggi generali da seguire prima della raccolta dei dati (preparazione della griglia, caricamento del campione e messa a punto del microscopio). L'acquisizione dei dati è la parte principale di questo manoscritto e viene evidenziata la pipeline da seguire durante l'acquisizione dei dati. Abbreviazioni: cryo-EM = crio-microscopia elettronica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Configurazione di stati diversi per la raccolta di dati a particella singola utilizzando latitude-S GUI. (A) Pacchetto software Latitude-S per l'acquisizione dei dati nella tuta software DM3. (B) Flusso di lavoro della procedura di acquisizione dei dati. (C) Espansione di ciascun pannello. Abbreviazione: GUI = interfaccia utente grafica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Allineamento fine per impostare un'elevata precisione per la messa a fuoco e l'acquisizione delle immagini. L'allineamento fine viene eseguito su cinque stati a. Atlas, b. Hole, c. Data, d. Grid, e. Focus. Focalizzare ogni stato posizionando il segno rosso sulla stessa posizione. Si consiglia vivamente di eseguire l'allineamento fine prima di iniziare qualsiasi nuova sessione, che aiuterà a eseguire l'imaging in una particolare posizione. L'acquisizione dell'immagine in una particolare posizione (senza alcun cambiamento importante) dipende completamente dalla precisione dell'allineamento fine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Selezione automatica dei fori mediante Latitude-S. La ricerca automatica dei fori per l'acquisizione dei dati viene eseguita automaticamente in base alle dimensioni del foro. (A) Mostra la posizione del vettore di ricerca dei fori per la ricerca automatica dei fori. Barra della scala = 20 μm. (B) Mostra la marcatura dei fori utilizzando il vettore di ricerca del foro e regolando l'intensità per rimuovere il marcatore dall'area del bordo e la contaminazione del ghiaccio. Barre di scala = 20 μm (a sinistra) e 10 μm (al centro). (C) Mostra l'aggiunta automatica dei fori per l'imaging (giallo). Barra della scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Visualizzazione dal vivo dell'acquisizione dei dati. (A) Le posizioni sono contrassegnate in giallo, verde, blu e rosso in base allo stato di acquisizione dei dati in ciascuna posizione. (B) Codice colore per il monitoraggio dello stato di acquisizione dei dati. Verde: Pianificato, Giallo: Non programmato, Blu: Acquisizione, Rosso: Non riuscito. Il pannello di sinistra mostra diversi fori di colore verde (programmato) e alcuni fori contrassegnati in blu (acquisiti); barra della scala = 10 μm. Il pannello centrale mostra un ingrandimento di 4.300x di un singolo foro. In questa immagine di un foro (pannello centrale), la casella quadrata blu mostra l'area di messa a fuoco e la casella quadrata verde mostra la regione di imaging; barra della scala = 1000 nm. Il pannello di destra mostra l'immagine acquisita. Il pannello all'estrema destra mostra i numeri di immagine pianificati, il tempo totale necessario per l'imaging e il numero di immagini pianificate per l'imaging. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Modalità Spike 3D con 1RBD aperto. (A) La mappa della proteina spike auto-raffinata e affilata di 1-RBD aperto è rappresentata nelle viste laterali, superiori e inferiori. (B) La mappa EM è dotata di struttura cristallina per una migliore visualizzazione delle catene laterali. Le regioni evidenziate nella mappa hanno densità per le catene laterali. Abbreviazioni: 3D = tridimensionale; RBD = dominio di legame del recettore; EM = microscopia elettronica; NTD = N- dominio terminale; S1 = subunità 1; S2 = subunità 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Tutta la conformazione ravvicinata rbD verso il basso della proteina spike. (A) Mappa della proteina spike auto-raffinata e affilata di tutta la conformazione ravvicinata RBD down rappresentata nelle viste laterali e superiori. (B) La mappa EM è dotata di struttura cristallina per una migliore visualizzazione delle catene laterali. Le frecce mostrano che le regioni nella mappa hanno densità per catene laterali (C). Abbreviazioni: RBD = dominio legante il recettore; EM = microscopia elettronica; NTD = N- dominio terminale; S1 = subunità 1; S2 = subunità 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare S1: GUI di acquisizione immagini Latitude-S: Vari controller per microscopi (ad esempio, apertura/chiusura della valvola a colonna, inserimento/retrazione dello schermo) sono controllati dalla GUI Latitude-S. La valvola a colonna, la telecamera, lo stato dello schermo e il riempimento di azoto liquido potrebbero essere controllati nel pannello di sinistra. Nella parte inferiore di questo pannello, vari parametri di calibrazione appaiono verdi (ad esempio, ingrandimento, inclinazione del fascio, messa a fuoco dell'obiettivo). Se un parametro appare nero, indica che il parametro non è ottimizzato correttamente. Pertanto, tutti i parametri devono essere ottimizzati prima di iniziare qualsiasi nuova sessione. Abbreviazione: GUI = interfaccia utente grafica. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Rappresentazione dello stato dell'Atlante. Diversi stati dell'Atlante mostrano i quadrati della griglia e il tipo di ghiaccio formato. (A-F) Sono evidenziate anche varie dimensioni dell'Atlante. (A, B, D, F) Viene evidenziato un motivo di ghiaccio spesso. (C, D) I quadrati rotti sono evidenziati. Il ghiaccio spesso e le regioni rotte (contrassegnate nella figura) non sono adatti per l'imaging. (E, F) Buoni quadrati di griglia per l'imaging; A, B, C, D e F mostrano i quadrati della griglia adatti per l'imaging ad alta risoluzione. Tuttavia, devono essere esclusi i quadrati spessi della griglia di ghiaccio e i quadrati della griglia spezzata. Barre di scala = 100 μm (A-C), 50 μm (D, E) e 25 μm (F). Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S3: Rappresentazione dello stato della griglia e dello stato del foro. Lo stato della griglia e lo stato del foro corrispondente sono mostrati nell'immagine. (A, E) Il foro vuoto, (F, G) il ghiaccio spesso, (E) la contaminazione del ghiaccio e (A, B, C, D, E e G) lo spessore del ghiaccio adatto sono contrassegnati nell'immagine. Per l'acquisizione dell'immagine vengono selezionati fori di spessore del ghiaccio adatti (A, B, C, D, E e G). Barre di scala = 10 μm (A, E, F, G), 2 μm (B), 50 μm (C), 5 μm (D). Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S4: Riferimento del foro per l'imaging automatico. L'immagine del foro (QUANTIFOIL-Holey Carbon grid QUANTIFOIL R 1.2/1.3) viene acquisita e salvata per riferimento futuro. La dimensione del riferimento del foro può essere variata in base ai diversi tipi di griglie. Si consiglia di acquisire sempre il riferimento del foro prima di iniziare qualsiasi nuova sessione. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S5: Pannello di acquisizione di immagini a vari ingrandimenti e selezione dei fori. (A) Il pannello di acquisizione mostra le impostazioni per l'acquisizione dei dati. (B) La finestra di navigazione principale di Latitude-S mostra tre ingrandimenti consecutivi. Nello stato Atlas (150x), i quadrati della griglia vengono selezionati per l'acquisizione dei dati (pannello di sinistra, barra della scala = 50 μm). In un ingrandimento più elevato (380x), viene focalizzato un singolo quadrato (pannello centrale, barra della scala = 20 μm). Ulteriore ingrandimento più elevato (4.300x), i fori all'interno di ciascun quadrato sono focalizzati (pannello di destra, barra della scala = 5 μm). Tuttavia, questi ingrandimenti cambierebbero in base alle dimensioni e alla forma delle griglie. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S6: Creazione di un modello per la selezione dei fori e l'imaging. La generazione della maschera viene eseguita aggiungendo una posizione sul foro per i dati e lo stato attivo viene posizionato adiacente al foro sulla superficie del carbonio. La messa a fuoco deve posizionarsi sull'area di carbonio in modo che il diametro del fascio non tocchi alcun foro adiacente. Barre della scala = 20 μm (pannello di sinistra), 10 μm (pannello centrale), 1000 nm (pannello di destra). Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S7: Imaging crio-EM di SARS-CoV2 utilizzando Latitude-S e screening delle immagini. (A) Screening delle micrografie acquisite: 1D CTF fit, 2D CTF fit e parametri CTF; stima dei dati della proteina spike SARS-CoV2 utilizzando cisTEM. 1D CTF fit e Thon ring mostrano che il segnale complessivo è 4,8 Å. (B) Le micrografie a due diversi valori di sfocatura della proteina spike vengono acquisite utilizzando Latitude-S. Barre della scala = 50 nm. (C) Media finale della classe 2D. La media delle classi 2D mostra le viste superiore, inferiore e laterale della proteina spike. Tutti i dettagli ad alta risoluzione sono visibili nelle medie di classe 2D. Abbreviazioni: cryo-EM = crio-microscopia elettronica; 1D = unidimensionale; 2D = bidimensionale; CTF = funzione di trasferimento del contrasto; SARS-CoV2 = sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S8: Elaborazione dei dati della proteina spike SARS-CoV2 acquisiti utilizzando il software Latitude-S. L'immagine mostra il flusso di lavoro seguito per l'elaborazione dei dati crio-EM della proteina spike. La classificazione 3D della proteina spike viene eseguita utilizzando Relion 3.0. La classe-1 mostra la conformazione aperta 1-RBD. Classe-3 e Classe-4 mostrano tutta la conformazione ravvicinata RBD down della proteina spike. La classe-5 mostra la conformazione intermedia della proteina spike. Abbreviazioni: cryo-EM = crio-microscopia elettronica; 3D = tridimensionale; RBD = dominio di legame del recettore; SARS-CoV2 = sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S9: Immagine frazionata con dose acquisita come riferimento per l'acquisizione dell'immagine finale. Le immagini di frazionamento della dose vengono acquisite con un'esposizione di 8,0 s e un'esposizione di 0,2 s/frame. Fare clic sul pulsante Salvataggio automatico vicino alla fotocamera per salvare automaticamente i file del filmato. Dopo l'acquisizione dell'immagine, fare clic sull'immagine e salvare i parametri dell'immagine frazionati in dose utilizzando il pulsante dell'immagine aggiornata nello stato di raccolta dei dati. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S10: Distribuzione angolare e correlazione del guscio di Fourier della mappa della proteina spike di conformazione aperta SARS-CoV-2 1 RBD generata. (A) Distribuzione angolare del modello 3D finale di 1-RBD fino alla conformazione aperta della proteina spike. Il blu rappresenta valori più bassi e il rosso rappresenta valori più alti della distribuzione normalizzata delle particelle. (B) Curva di correlazione del guscio di Fourier che mostra una risoluzione di 4,4 Å della conformazione aperta 1-RBD della proteina spike, stimata al cut-off. Abbreviazioni: 3D = tridimensionale; RBD = dominio di legame del recettore; SARS-CoV2 = sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2; FSC = correlazione della shell di Fourier. Fare clic qui per scaricare questo file.
| Stato immagine Atlante | Atlante 115 |
| Ingrandimento | 115, dimensione del pixel 34.7 nm |
| Sfocatura indicata | 4,38 mm |
| Dimensione spot | 8 |
| Luminosità | 934400 |
| Modo | IMAGINGILM |
| Binning | 1 |
| Tempo di esposizione | 1,0 s |
| Stato di rilevamento della griglia | Griglia 380 |
| Ingrandimento | 380, dimensione del pixel 11.2 nm |
| Sfocatura indicata | 2,37 mm |
| Dimensione spot | 8 |
| Luminosità | 626200 |
| Modo | IMAGINGILM |
| Binning | 1 |
| Tempo di esposizione | 1,0 s |
| Stato di rilevamento del foro | Buca 3400 |
| Ingrandimento | 3.400, dimensione pixel 1,20 nm |
| Sfocatura indicata | -0,75 μm |
| Dimensione spot | 7 |
| Diametro della trave | 8,81 μm |
| Modo | IMAGINGILM, SA, Mh |
| Binning | 1 |
| Tempo di esposizione | 1,0 s |
| Stato di messa a fuoco | Messa a fuoco 45k |
| Ingrandimento | 45.000, dimensione pixel 0,0924 nm |
| Sfocatura indicata | 4,51 μm |
| Dimensione spot | 6 |
| Diametro della trave | 0,716 μm |
| Modo | IMAGINGILM, SA, Mh |
| Binning | 1 |
| Tempo di esposizione | 1,0 s |
| Stato di acquisizione | Dati 45k |
| Ingrandimento | 45.000, dimensione pixel 0,0924 nm |
| Impostazione di sfocatura | Min: -4.500 nm, Max: -1.500 nm, Passi: 250 nm |
| Dimensione spot | 6 |
| Diametro della trave | 0,752 μm |
| Modo | IMAGINGILM,SA,Mh |
| Binning | 1 |
| Tempo di esposizione | Esposizione totale di 8 s per 20 fotogrammi |
| Configurazione della fotocamera | Conteggiato, Guadagno normalizzato, Difetto corretto |
| Configurazione del salvataggio dei dati | MRC |
Tabella 1: Riepilogo della configurazione dello stato di Latitude-S.
| Specificazione | K2 Base | Vertice K2 |
| Tensione di esercizio TEM | 200-400 kV | |
| Area attiva del sensore | 19.2 mm × 18.6 mm | |
| Dimensione del sensore in pixel | 3838 × 3710 | 7676 × 7420 Super- Risoluzione |
| Dimensione fisica al pixel | 5 μm | |
| Binning | 1–8x | |
| Lettura del sensore | Qualsiasi area arbitraria | |
| Ingrandimento rispetto alla pellicola | 1,3–1,5x | |
| Velocità di lettura del sensore | 50 fps completi | 400 fps completi |
| Velocità di trasferimento al computer | 8 fps completi | 40 fps completi |
| Visualizzazione delle immagini | 8 fps completi | 10 fps completi |
| Prestazioni DQE (300 kV) | >0.30 (picco) >0.25 a 0.5 di Nyquist fisico | >0,7 (picco) >0,50 a 0,5 di Nyquist fisico >0,06 a 1,25 di Nyquist fisico |
| Software | Gatan Microscopy Suite con DigitalMicrograph |
Tabella 2: Specifiche della fotocamera.
| Opzione di configurazione | Valore |
| Tipo di microscopio | Talos Arctica G2 |
| Alta tensione | 200 kV |
| Fonte | XFEG · |
| Lente | Cryo Gemello |
| Sistema del vuoto | Talos TMP IGP |
| Caricatore di campioni | Autoloader |
Tabella 3: Configurazione del microscopio.
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Discussion
Latitude-S è un'interfaccia utente intuitiva, che fornisce un ambiente per configurare e raccogliere automaticamente migliaia di micrografie ad alta risoluzione o file di filmati in due giorni. Fornisce una facile navigazione attraverso le griglie e mantiene la posizione dello stadio del microscopio mentre passa da un basso ingrandimento ad un ingrandimento elevato. Ogni fase dell'acquisizione dei dati con Latitude-S è efficiente in termini di tempo, con funzionalità come una semplice interfaccia utente, uno streaming rapido di dati fino a 4,5 GB/s di velocità e la visualizzazione simultanea dei dati durante l'acquisizione. Inoltre, il frazionamento della dose precalibrato, l'intensità di dose, la messa a fuoco e i parametri di ingrandimento sono stati facilmente ricaricati per avviare una nuova sessione di acquisizione automatica dei dati e risparmiare tempo.
Acquisire i dati automaticamente in assenza di un monitoraggio costante e senza compromettere la qualità del set di dati è un compito impegnativo e dispendioso in termini di tempo. La raccolta automatizzata dei dati con il software Latitude-S è conveniente quando il tempo e le risorse sono vincoli importanti, in particolare durante questa pandemia. Tuttavia, diverse strutture crio-EM di varie proteine di SARS-CoV-2 sono state risolte negli ultimi mesi, il che aiuterà le aziende farmaceutiche a sviluppare vaccini. Diversi laboratori utilizzano diversi tipi di pacchetti software di raccolta automatica dei dati per raccogliere i dati. Abbiamo utilizzato Latitude-S con un K2 Summit DED per la raccolta automatica dei dati crio-EM su griglie di carbonio bucate o griglie rivestite GO fatte in casa30.
Tale studio è stato eseguito utilizzando i parametri sopra menzionati nella sezione del protocollo, che fornisce una forte evidenza che Latitude-S è un pacchetto software adatto e ideale per la raccolta automatica dei dati per la crio-EM a singola particella. Tuttavia, si consiglia vivamente di seguire determinati protocolli prima di iniziare l'imaging utilizzando una fotocamera K2. La telecamera a rilevamento diretto K2 richiede routine di manutenzione di base per ottenere le massime prestazioni. La ricottura regolare della telecamera a 50° per 24 ore aiuta il sensore a funzionare in modo ottimale riducendo il rumore di fondo e la contaminazione a livello superficiale. Tuttavia, dopo la ricottura della fotocamera, l'aggiornamento dei riferimenti di guadagno e scuri della fotocamera è un passaggio obbligatorio (richiede ~ 45 minuti) prima di eseguire qualsiasi acquisizione di immagini.
Sebbene Latitude-S sia un pacchetto software stabile e intuitivo per la raccolta automatica dei dati crio-EM, è essenziale ottimizzare vari parametri (ingrandimenti, dimensioni dello spot, luminosità e intensità di dose) in 5 diversi stati di Latitude-S all'inizio. L'ingrandimento dei fori o degli stati della griglia dipende dalle dimensioni dei fori delle griglie bucate o dei tipi di griglia bucata (ad esempio, R2/2 o R1.2/1.3 o R 0.6/1). Ad esempio, la dimensione del foro della griglia di tipo R0.6/1 è di 0,6 μm e la dimensione del foro della griglia R2/2 è di 2 μm. Pertanto, sono necessari due diversi tipi di ingrandimento per visualizzare correttamente i fori per i tipi di griglia R0.6/1 e R2/2 negli stati della griglia e del foro in Latitude-S.
Pertanto, le impostazioni di ingrandimento per vari tipi di griglie in 5 stati diversi saranno variabili. La dimensione dello spot e la luminosità dipendono fortemente dall'ingrandimento. Quindi, questi valori possono cambiare a diversi valori di ingrandimento. Pertanto, si consiglia di ottimizzare i vari parametri dei 5 diversi stati di Latitude-S utilizzando diversi tipi di griglie crio-EM prima di avviare l'acquisizione automatica dei dati. Tuttavia, una volta che tutti i parametri sono stati ottimizzati e salvati, è facile ricaricare tutti i parametri in base alle esigenze dell'utente e utilizzare Latitude-S a diversi ingrandimenti o tipi di griglia.
Un importante vantaggio dell'utilizzo di K2 con Latitude-S è che gli utenti possono facilmente regolare l'apertura/chiusura della valvola del fascio, inserire/ritrarre la telecamera, inserire/ritrarre lo schermo al fosforo del microscopio e regolare il riempimento di azoto liquido utilizzando la GUI di Latitude-S. Tuttavia, qualsiasi altra opzione (come l'inclinazione della pistola, lo spostamento della pistola, lo spostamento del fascio, i punti di rotazione, il centraggio dell'apertura C2, il centro di rotazione, l'allineamento senza coma) non sono accessibili tramite la scheda GUI K2 Latitude-S (Figura supplementare S1 e Figura 2). Durante le lunghe ore di raccolta dei dati, la posizione del raggio può cambiare.
Latitude-S è in grado di eseguire controlli e correzioni periodici automatizzati per tenere traccia della stabilità del sistema durante tutto il periodo di acquisizione dei dati. La stabilità del sistema viene mantenuta centrando il raggio e aggiornando i riferimenti scuri. Il controllo costante garantisce l'alta qualità dei dati acquisiti. In Latitude-S, l'altezza eucentrica (altezza Z) viene corretta una sola volta prima della raccolta dei dati e l'altezza eucentrica viene calcolata automaticamente da Latitude-S quando cambia il quadrato della griglia. La messa a fuoco viene misurata e regolata automaticamente in base all'intervallo di messa a fuoco definito dall'utente. Il programma ripristinerà la posizione dello stage Z se supera il valore di soglia specificato. Questa stabilità è controllata tramite la tavolozza Stabilità sistema. Tuttavia, come altri pacchetti di acquisizione dati automatica, Latitude-S ha anche alcune limitazioni.
Latitude-S non può calcolare l'altezza eucentrica (altezza Z) se la griglia non è uniforme. In questo scenario, non è possibile raccogliere dati o i valori di sfocatura saranno completamente fuori portata. Pertanto, gli utenti dovrebbero essere estremamente cauti nel preparare le loro griglie senza piegatura e visualizzare solo griglie a superficie piana utilizzando Latitude-S. Inoltre, a differenza di Leginon, SerialEM e UCSF-Image, Latitude-S non è un pacchetto software disponibile gratuitamente. Latitude-S è compatibile con le telecamere Gatan, incluse le telecamere a rilevamento diretto di base K2, K3 e K3 filtrate o autonome, nonché con le telecamere Rio e OneView. Un altro importante svantaggio per gli utenti è che non è compatibile con altri DED popolari come Falcon DED. Tuttavia, questo è vero anche per EPU, un altro pacchetto software di acquisizione automatica dei dati, disponibile con criomicroscopi e compatibile solo con la fotocamera Falcon. Tuttavia, l'EPU è anche funzionale con K2 / K3 con un filtro di energia (BioQuantum K3 Imaging Filter) ma non con una telecamera K2 / K3 autonoma.
Latitude-S è abbastanza simile a EPU, SerialEM, AutoEM, AutoEMation e Leginon, che sono pacchetti software utilizzati per l'acquisizione automatica dei dati per la crio-EM a singola particella. Tuttavia, Latitude-S è compatibile solo con K2 DED, K3 DED o BioQuantum K3 Imaging Filter. Inoltre, l'azienda fornisce supporto tecnico continuo per gli utenti Latitude-S. Questo supporto tecnico è vantaggioso per piccoli gruppi di utenti, che hanno bisogno di utilizzare i dispositivi K2 DED, K3 DED o BioQuantum K3 Imaging Filter per l'acquisizione dei dati e non hanno alcuna conoscenza preliminare su come configurare o utilizzare pacchetti software gratuiti come SerialEM e Leginon.
Ci sono molte altre caratteristiche, come la diffrazione elettronica microcristallina (microED), la tomografia e la spettrometria a raggi X a dispersione di energia (EDS), che sono disponibili in varie altre versioni di Latitude. Pertanto, gli utenti possono utilizzare lo stesso pacchetto software per la raccolta dei dati in altre modalità. Per quanto ne sappiamo, la raccolta dei dati per microED, tomografia ed EDS non è disponibile in EPU o in altri pacchetti software. Pertanto, questo pacchetto software Latitude potrebbe essere utile per scopi diversi oltre all'acquisizione automatica dei dati in crioEM a singola particella. Tuttavia, SerialEM e Leginon, entrambi pacchetti software gratuiti, sono adatti per telecamere Falcon o K2 / K3 e sono estremamente utili per i nuovi utenti. Tuttavia, Latitude-S non è disponibile gratuitamente, il che potrebbe essere uno svantaggio di questo pacchetto software.
In sintesi, lo strumento di acquisizione automatica dei dati Latitude-S è valido quanto altri pacchetti software di acquisizione automatica dei dati (ad esempio, EPU, Leginon, SerialEM, UCSF-Image). Latitude-S è un pacchetto software di acquisizione dati estremamente stabile e facile da usare, disponibile con telecamere di rilevamento diretto di base K2, K3 e K3 filtrate o standalone, nonché telecamere Rio e OneView.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse concorrenti o finanziari da dichiarare.
Acknowledgments
Riconosciamo il Dipartimento di Biotecnologia, il Dipartimento di Scienza e Tecnologia (DST) e Scienza, e il Ministero dello Sviluppo delle Risorse Umane (MHRD), India, per i finanziamenti e la struttura crio-EM di IISc-Bangalore. Riconosciamo il programma DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) e DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) per la struttura National Cryo-EM di IISc, Bangalore. Riconosciamo il sostegno finanziario del Science and Engineering Research Board (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 e SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Ringraziamo la signora Ishika Pramanick per aver preparato le griglie crio-EM, la raccolta dei dati crio-EM e la preparazione della Tabella dei materiali. Ringraziamo anche il signor Suman Mishra per l'elaborazione delle immagini crio-EM e per averci aiutato a preparare le figure. Ringraziamo il Prof. Raghavan Varadarajan per averci aiutato a ottenere il campione di proteina spike purificato per questo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
- Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
- Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
- Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Kühlbrandt, W.
- McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
- Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
- Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
- Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
- Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
- Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).
- Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
- Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
- Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
- Hillen, H. S., et al.
- Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
- Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
- Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).
