Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vivo Metoder for å vurdere retinal ganglioncelle og optisk nervefunksjon og struktur hos store dyr

Published: February 26, 2022 doi: 10.3791/62879
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1The Eye Hospital, School of Ophthalmology & Optometry, Wenzhou Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Her demostrate vi flere in vivo tester (flash visuell fremkalt potensial, mønster elektroretinogram og optisk koherens tomografi) i geit og rhesus macaque å forstå strukturen og funksjonen til synsnerven og dens nevroner.

Abstract

Synsnerven samler aksoner signaler fra retinal ganglion celler og overfører visuelt signal til hjernen. Store dyremodeller av optisk nerveskade er avgjørende for å oversette nye terapeutiske strategier fra gnagermodeller til klinisk anvendelse på grunn av deres nærmere likheter med mennesker i størrelse og anatomi. Her beskriver vi noen in vivo-metoder for å evaluere funksjonen og strukturen til netthinne ganglioncellene (RGC) og optisk nerve (ON) hos store dyr, inkludert visuelt fremkalt potensial (VEP), mønsterelektroretinogram (PERG) og optisk koherenstomografi (OCT). Både geit og ikke-menneskelig primat ble ansatt i denne studien. Ved å presentere disse in vivo-metodene trinnvis, håper vi å øke eksperimentell reproduserbarhet blant forskjellige laboratorier og lette bruken av store dyremodeller av optiske nevropatier.

Introduction

Synsnerven (ON), som består av axoner fra netthinnen ganglion celler (RGC), overfører visuelt signal fra netthinnen til hjernen. PÅ sykdommer, som glaukom, traumatisk eller iskemisk optisk nevropati, forårsaket ofte irreversibel ON / RGC degenerasjon og ødeleggende visuelt tap. Selv om det for tiden er mange gjennombrudd i ON regenerering og RGC-beskyttelse i gnagermodeller1,2,3,4,5,6, forble kliniske behandlinger for de fleste ON-sykdommene i hovedsak de samme i løpet av det siste halve århundret med utilfredsstillende utfall7,8 . For å fylle gapet mellom grunnleggende forskning og klinisk praksis, er translasjonsstudier ved hjelp av stor dyremodell av ON-sykdommer ofte nødvendige og fordelaktige på grunn av deres nærmere anatomiske likhet med mennesker enn gnagermodeller.

Geit og rhesus macaques er to store dyrearter som brukes i laboratoriet vårt for å modellere menneskets ON-sykdom. Størrelsen på en geit øyeboll, PÅ, og den tilstøtende strukturen (orbital og nesehule, hodeskalle base, etc.) ligner på et menneske basert på skallen CT scan9. Som sådan gir geitmodell en mulighet til å evaluere og foredle terapeutiske enheter eller kirurgiske prosedyrer før bruk hos mennesker. Rhesus macaque, som ikke-menneskelig primat (NHP), har menneskelignende unikt visuelt system som ikke eksisterer i andre arter10,11. I tillegg er patofysiologiske responser på skader og behandlinger i NHP mye lik den hos mennesker12.

In vivo-tester for å vurdere ON og RGCs struktur og funksjon langsgående er viktige i store dyrestudier. Mønsterelektroretinogram (PERG) har blitt brukt til å evaluere RGC-funksjonen. Flash visuelt fremkalt potensial (FVEP) gjenspeiler integriteten til retino-geniculo-kortikale veier i det visuelle systemet. Dermed kan PERG kombinert med FVEP gjenspeile ON-funksjonen9,13,14 . Den retinal optiske koherenstomografien (OCT) avbildningen kan vise retinalstrukturen med høy temporal og romlig oppløsning, noe som muliggjør måling av tykkelsen på retinal ganglion-komplekset (GCC) 9,15. For elektrofysiologiske undersøkelser i denne studien er overvåking av vitale tegn (varmefrekvens, bruddfrekvens, blodtrykk) og oksygenmetningsnivå (SpO2) før testing avgjørende siden disse parametrene har potente effekter på okulær blodstrøm og dermed funksjonen til det visuelle systemet. Vi overvåket imidlertid ikke de vitale tegnene når vi utførte OCT retinal avbildning for enkelhets skyld. Ifølge vår forrige studie9 er GCC-tykkelsen målt ved OCT retinal imaging ganske stabil, med inter-session koeffisient av variasjon nær 3%. Disse in vivo-testene i geit og rhesus macaque har blitt beskrevet i detalj i vår forrige studie9. Her presenterer vi disse metodene for å bidra til å øke eksperimentell transparens og reproduserbarhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimenter ble utført strengt i samsvar med ARRIVE-retningslinjene og National Institutes of Health guide for pleie og bruk av laboratoriedyr, og overholde protokollene godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee i Wenzhou Medical University (WMU) og Joinn Laboratory (Suzhou). De mannlige Saanen geiter, i alderen 4 til 6 måneder med vekt på 19-23 kg, ble plassert i WMU dyreanlegg. De mannlige Rhesus macaques, i alderen 5 til 6 år med vekt på 5-7 kg, ble plassert i Joinn dyreanlegg. Alle dyrene ble vedlikeholdt i et luftkondisjonerte rom med kontrollert temperatur (21 ± 2 °C) under en mørk syklus på 12 timer/ 12 timer med matannonse libitum.

1. Flash visuelt fremkalt potensial (FVEP) i geit

  1. Generell bedøvelse
    1. Barber hock-håret med en elektronisk barberhøvel.
    2. Forbered huden ved å gni med 70% alkohol tre ganger for å rense huden, og eksponer deretter den subkutane venen.
    3. Sett inn et perifert venekateter intravenøst (0,9 mm x 25 mm), og injiser deretter atropin (0,025 mg/kg) og propofol (5 mg/kg).
    4. Intuber geiten med et 6 mm trakealrør og koble det til en kunstig åndedrettsvern.
    5. Opprettholde anestesi med 3,5% isofluran i oksygen med en konstant strømningshastighet på 2 l / min.
      MERK: Geiten gjenoppretter fra anestesi indusert av propofol i løpet av få minutter, så vær rask til å intubere geiten.
  2. Overvåking av kardiopulmonal
    1. Plasser temperatursensoren under tungen.
    2. Koble pulsoksymeteret til den proksimale enden av øret.
    3. Bind blodtrykksmansjetten til bunnen av låret.
    4. Klem EKG-klipsene på lemmer tilsvarende.
      MERK: Den normale hjertefrekvensen på geiter er 68-150 bpm. På grunn av bruk av gassbedøvelse vil hjertefrekvensen av geiter øke. Derfor er pulsen vår under inspeksjon 170 ± 30 bpm. Det systoliske blodtrykket til geiter under normale forhold er 110-130 mmHg, og det diastoliske blodtrykket er 50-60 mmHg. I tilstanden av innånding av oksygen kan geitens oksygenmetning i blodet alltid opprettholdes på 99%. Pustehastigheten til geiter under anestesi synkroniseres med respiratorens, som er 10 pust / min. Siden temperaturen ble målt fra under geitens tunge, ikke kjernetemperaturen, er geitens temperatur generelt 35 ± 2 °C.
  3. Plassering av hodeskalleskruer implantasjon og elektroder
    1. Barber håret med en hårklipper. Desinfiser huden i midten av frontbenet ved å gni med en bomullsdott gjennomvåt i betadin og 70% alkohol tre ganger.
    2. Bruk steriliserte skruer og saks.
      MERK: Autoklaver alle kirurgiske instrumenter for sterilisering (121 °C, 20 min).
    3. Lag et 5 mm hudinnsnitt for å eksponere frontbenet med en oftalmisk saks, og implanter deretter en sterilisert skrue i midten av frontbenet ved hjelp av en skrutrekker.
    4. Barber håret og desinfiser huden på det sentrale oksipitale beinet mellom to ører med betadine og 70% alkohol, den ene etterfulgt av den andre, tre ganger.
    5. Lag et 5 mm hudinnsnitt for å eksponere oksipitalt bein med en oftalmisk saks, og implanter deretter en sterilisert skrue i midten av oksipitale bein.
      MERK: Jordnålelektroden settes subkutant inn under frontskalleskruen. De aktive elektrodene og referanseelektrodene er koblet til henholdsvis occipital og frontal skruer, med alligatorklemmer for å redusere elektrodeimpedansen16.
  4. Dyreforberedelse
    1. Bruk lystett klut til å dekke øyet og fest med bind for øynene for å lappe ett øye.
    2. Påfør aktuelle bedøvelsesøyedråper (proparakainhydroklorid øyedråper) på begge øynene. Bilaterale elever utvides ved aktuell administrering av mydriaterstatiske øyedråper med tropicamid (5%) og fenylefrin (5%).
    3. Plasser geitens hode inn i Ganzfeld-stimulatoren og svakt omgivelseslyset.
      MERK: Det ble funnet at geiter kan opprettholde god øyebollfiksering under anestesi, så det er ikke nødvendig med ekstra øyebollfikseringsoperasjon.
    4. Dekk stimulatoren og geitens hode med et svart teppe i 5 min for tilpasning.
    5. Bruk øyelokk spekulum for å eksponere bulbar conjunctiva. Brett den øvre ringen, trekk det øvre øyelokket opp, og sett den øvre ringen først inn i konjunktivsekken på øvre øyelokk og deretter inn i det nedre øyelokket på en lignende måte.
    6. Trykk på Impedance-knappen for å kontrollere elektrodevevskontaktimpedansen, og verdiene av impedans vises i hver kanal.
    7. Sørg for at impedansen er under 10 kΩ for hver elektrode for å unngå elektromagnetisk interferens fra andre elektriske apparater i samme rom.
      MERK: Hvis den er over 10 kΩ, kobler du til elektroden igjen eller bytter den ut. Impedansen kan virke unormalt høy hvis den elektriske metallkirurgiske sengen, hvor geiten ligger, er plugget. Impedansen bør variere med mindre enn 1 kΩ mellom de aktive og referanseelektrodene for å redusere elektrisk interferens17.
    8. Trykk på Oscillograph-knappen for å kontrollere grunnstøyen uten lysstimulering.
      MERK: Hvis det er stor basisstøy, kobler du fra alle andre elektriske apparater i samme rom og slår av mobiltelefoner. Hvis grunnlinjeproblemet vedvarer, går du til trinn 1.3.10. for å sjekke om en typisk FVEP-bølgeform kan frembringes. Hvis ikke, må du planlegge FVEP-testen på nytt på et annet tidspunkt.
    9. Start FVEP-opptak ved å velge lysintensiteten på henholdsvis 0,025, 0,5 og 3,0 cd·s/m2 i den hvite bakgrunnsboksen øverst til høyre. Trykk deretter på Eksamen-knappen . Vær oppmerksom på at FVEP-opptak ved hver lysintensitet utføres to ganger.
      MERK: Hvis de to bølgeformene åpenbart ser annerledes ut, er det nødvendig med en repetisjon til.
    10. Fukt hornhinnen med kunstige tåredråper, hvis det ser tørt ut på det infrarøde kameraet.
      MERK: Overvåk øyeposisjonen fra det innebygde infrarøde kameraet før du tar opp for å sikre at det visuelle blikket er riktig og at eleven er helt eksponert (slik at feltstørrelsen på en blitsemulans er 90°. Øyeposisjonen til en bedøvet geit kan justeres ved å snu hodet tilsvarende. Basert på vår observasjon oppstår blikkvandring sjelden under FVEP-opptak (~ 10 min) i geit under generell anestesi9. Så det er ikke nødvendig å pause og justere blikket mens du spiller inn.
    11. Gjenta trinnene ovenfor for det kontralaterale øyet.
    12. Avslutt isofluranforsyningen og øk tidevannsvolumet litt på respiratoren for å hjelpe geiten med å komme seg fra generell anestesi.
    13. Etter generell anestesi, behandle geiten med gentamicin (4 mg / kg, IM) og ceftiofur natrium (en cephalosporin, 2 mg / kg, IM) for å forhindre infeksjon.
  5. FVEP-måling og kvantitativ analyse
    MERK: Som vist i figur 1A, er de første positive og negative toppene i FVEP-bølgeformen angitt som P1 og N1, og den andre positive toppen som P2. Den typiske implisitte tiden for P1, N1 og P2 er henholdsvis rundt 40, 60 og 120 ms. P1- og P2-amplituder måles fra N1-bølgeformens trough til toppene P1 og P2 bølgeformer.
    1. Ved monokulær skade, bruk interokulær sammenligning av amplitude og implisitt tid for å redusere intersession variasjon og øke følsomheten17.

2. PVEP i rhesus macaque

MERK: Mønster VEPer kan fremkalles i rhesus macaques9 og er mer stabile enn Flash VEP i amplitude og implisitt tid17. Derfor ble PVEP brukt til å oppdage integriteten til retino-geniculo-kortikale banen hos ikke-menneskelige primater.

  1. Dyreforberedelse
    1. Bedøv apen med isofluran (1,5%-2%) etter induksjon med Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, tiletamin/zolazepam).
    2. Plasser den steriliserte jordelektroden ved øreflippen. Sett inn de steriliserte aktive elektrodene og referanseelektrodene subkutant langs midtlinjen ved henholdsvis front- og oksipitale bein.
    3. Påfør øyelokkspesulum for å eksponere bulbar conjunctiva.
    4. Bruk selvklebende ugjennomsiktig svart tape for å lappe det kontralaterale øyet.
  2. PVEP-opptak
    1. Trykk på Impedance-knappen for å kontrollere elektrodevevskontaktimpedansen, og verdiene av impedans vil bli vist i hver kanal; sørg for at den er under 10k Ω. Hvis ikke, koble til elektroden på nytt eller skift den ut.
    2. Kontroller verdiene av impedans i Impedance Test Window og sørg for at impedansen varierer med mindre enn 1 kΩ mellom aktive og referanseelektroder for å redusere elektrisk interferens17.
    3. Trykk på Oscillograph-knappen for å kontrollere grunnstøyen uten stimulering.
      MERK: Hvis det er stor grunnlinjestøy, kobler du fra alle andre elektriske apparater i samme rom og slår av mobiltelefonene. Hvis grunnlinjeproblemet vedvarer, gjør du om PVEP-testen en annen dag.
    4. Registrer PVEP-svarene fra det ikke-oppdaterte øyet ved å velge lysintensiteten på henholdsvis 0,5 og 1,0 syklus/grad i den hvite bakgrunnsboksen øverst til høyre, og trykk deretter på Undersøkelse-knappen .
      MERK: For hver innspilling er 64 spor i gjennomsnitt for å gi en bølgeform. For hver frekvens oppnås et minimum av to opptak for å verifisere reproduserbarheten av PVEP-signaler.
    5. Gjenta prosedyren for det kontralaterale øyet.
    6. Når du er ferdig, slutt isofluranforsyningen for å vekke apen.
    7. Etter generell anestesi, behandle apen med gentamicin (4 mg/kg IM) og ceftiofur natrium (2 mg/kg IM) for å forhindre infeksjon.
  3. PVEP-måling og kvantitativ analyse
    1. Som vist i figur 1B ble de første negative og positive toppene i PVEP-bølgeformen utpekt som N1 og P1, som vanligvis forekommer på rundt 50 og 90 ms. P1-amplituden måles fra N1 til toppen av P1.
    2. Ved monokulær skade, bruk interokulær sammenligning av amplitude og implisitt tid for å redusere intersession variasjon og for å øke følsomheten17.

3. Mønster ERG (PERG) i geit

MERK: I forrige studie ble det ikke observert noen interokulær krysstale av PERG-signal hos geiter, slik at PERG-svar kan registreres samtidig fra begge øynene9.

  1. Forberedelse av eksamen
    1. Bedøv geiten ved hjelp av xylazin (3 mg/kg, IM), og plasser den på et eksamensbord.
    2. Plasser en temperatursensor under geitens tunge.
    3. Koble pulsoksymeteret til den proksimale enden av geitens øre.
    4. Bind blodtrykksmansjetten til låret.
    5. Klem EKG-klipsene på lemmer tilsvarende.
    6. For å redusere elektrodeimpedans, plasser en sterilisert hodeskalleskrue på frontbenet og koble til jordelektroden med en alligatorklemme.
    7. Plasser to steriliserte nåleereferanseelektroder subkutant 1 cm bak sidekantettene på begge sider.
    8. Bruk øyelokkets spekulum for å eksponere bulbar konjunktivene.
    9. Plasser to desinfiserte ERG-Jet-registreringselektroder i sentrum av bilaterale hornhinner etter aktuell påføring av kunstig tåre.
    10. Plasser to 47,6 cm x 26,8 cm LED-skjermer foran begge øynene med en visningsavstand på 50 cm.
    11. Juster hver skjerm slik at den er parallell med elevplanet på samme side, og juster midten av skjermen til elevplanet.
    12. Kontroller at det kontrast reverserte sjakkbrettet (tidsfrekvens, 2,4 Hz) vises på begge skjermene og har et maksimalt størrelsesforhold på 4:3, som stilles inn av utstyrsinnstillinger.
    13. Forsikre deg om at kontrasten mellom hvite og svarte brikker forblir 96%, og gjennomsnittlig lystetthet er 200 cd / m2 (Candela per kvadratmeter), som kontrolleres av lystetthetsmåleren.
      MERK: Ifølge ISCEV er det nødvendig med en gjennomsnittlig fotopisk lystetthet på 40-60 cd/m2 hos mennesker17. I en annen studie med musmodell forble mønsteret med en gjennomsnittlig lystetthet på 800 cd/m2,18. En feltstørrelse på minst 15° i sin smaleste dimensjon er nødvendig for en standard PERG-test hos mennesker17. Juster plasseringen av hornhinnen elektrode hvis den ikke er i midten av hornhinnen overflaten.
  2. PERG-opptak
    1. Demp omgivelseslyset og trykk på Impedance-knappen for å kontrollere kontaktimpedansen for elektrodevevet. Impedansverdiene vises i hver kanal.
    2. Kontroller verdiene av impedans i Impedance Test Window og sørg for at impedansen er under 10 kΩ. Hvis ikke, koble til elektroden på nytt eller skift den ut.
    3. Trykk på Oscillograph-knappen for å kontrollere grunnstøyen uten lysstimulering.
      MERK: Vær oppmerksom på å beskytte de skjøre ERG-Jet-opptakselektrodene. Baseline støy i PERG er vanligvis mindre enn det i FVEP i geit.
    4. Start PERG-opptak fra begge øynene samtidig ved de romlige frekvensene på 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 og 12,6 sykluser/grad etter hverandre. For hver romlige frekvens er 64 spor i gjennomsnitt for å gi en avlesning.
    5. Til slutt slår du av skjermen for å registrere PERG uten visuell stimulans som en negativ kontroll.
      MERK: PERG-signaler er vanligvis stabile og trenger ikke gjenta.
    6. Fjern den fremerste skalleskruen og vekk geiten ved å injisere Idzoxan (1,5 mg/kg), som er en xylazinantagonist.
    7. Etter generell anestesi, behandle geiten med gentamicin (4 mg / kg IM) og ceftiofur natrium (2 mg / kg IM) for å forhindre infeksjon.
  3. PERG-måling og kvantitativ analyse
    1. Sett bandpassfilteret i området fra 1 til 75 Hz. For 3,0 cpd PERG er bandpassfilteret satt til å være fra 1 til 50 Hz for å glatte ut sporet uten å påvirke amplituden.
    2. Som vist i figur 1C, er de første positive og negative toppene i bølgeformen angitt som P1 (vanligvis rundt 25 ms) og N1 (vanligvis rundt 55 ms). PERG-amplituden måles fra N1 til P1.
    3. Ved monokulær skade bruker vi interokulær sammenligning av amplitude og implisitt tid for å redusere intersession variasjon og redusere følsomhet17.

4. PERG i rhesus macaque

MERK: Det er uklart om det er interokulær krysstale av PERG-signal i rhesus macaque, så PERG-responser fra begge øynene registreres separat.

  1. Forberedelse av eksamen
    1. Bedøv apen med isofluran (1,5%-2%) etter injeksjon av Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, tiletamin/zolazepam) og trakeal intubasjon.
    2. Plasser en sterilisert bakkeelektrode subkutant på frontbenet. Sett inn en sterilisert nåleeksjonselektrode subkutant, 1 cm bak sidekanthus på samme side.
    3. Plasser en desinfisert ERG-Jet-registreringselektrode på den sentrale hornhinnen etter aktuell påføring av kunstig tåre.
      MERK: Juster plasseringen av hornhinnen elektrode, hvis den ikke er i midten av hornhinnen overflaten.
    4. Bruk selvklebende ugjennomsiktig svart tape for å lappe ett øye.
    5. Plasser en skjerm (47,6 x 26,8 cm) i en visningsavstand på 50 cm.
    6. Kontroller at skjermen er justert slik at den er parallell med elevplanet. Juster midten av skjermen til elevplanet.
    7. Kontroller at det svarte og hvite sjakkbrettet reverseres med en frekvens på 2,4 Hz, og størrelsesforholdet er 4:3, som stilles inn av utstyrsinnstillinger.
    8. Kontroller at kontrasten mellom de hvite og svarte damene er 96 %, og at den gjennomsnittlige lystettheten forblir 200 cd/m2, som kontrolleres av lystetthetsmåleren.
  2. PERG-opptak
    1. Demp omgivelseslyset og kontroller kontaktimpedansen for elektrodevevet.
    2. Forsikre deg om at impedansen er under 10 kΩ. Hvis ikke, koble til elektroden på nytt eller skift den ut.
    3. Kontroller grunnlinjestøyen uten lysstimulering.
    4. Lappe det ene øyet og starte PERG-opptak fra det andre øyet ved romlige frekvenser på 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 og 12,6 sykluser /grad etter hverandre.
    5. Gjenta trinn 4.2.1-4.2.4 for det kontralaterale øyet.
    6. Slutt isofluranforsyningen for å vekke apen.
    7. Etter generell anestesi, behandle apen med gentamicin (4mg/kg IM) og ceftiofur natrium (2 mg/kg IM) for å forhindre infeksjon.
  3. PERG-måling og kvantitativ analyse
    1. Som vist i figur 1D, er de første positive og negative toppene i bølgeformen angitt som P1 (vanligvis rundt 40 ms) og N1 (vanligvis rundt 85 ms). PERG-amplituden måles fra N1 til P1.
    2. Ved monokulær skade bruker vi interokulær sammenligning av amplitude og implisitt tid for å bidra til å redusere intersession variasjon og øke følsomheten17.

5. OKT i geit

  1. Dyreforberedelse
    1. Bedøv geiten ved hjelp av xylazin (3mg/kg, IM), og intuber deretter.
    2. Fortynn eleven ved aktuell administrering av mydriatiske øyedråper med tropicamid (5%) og fenylefrin (5%).
    3. Bruk øyelokkspekulumet til å eksponere eleven fullstendig.
    4. Plasser geitens hode på hakestøtten.
      MERK: Selv om gassbedøvelse ikke utføres, intuberer du geiten regelmessig for å beskytte luftveiene mot å bli komprimert av hakestøtten.
  2. OKT-bildebehandling
    MERK: Retinal OCT-bildet utføres ved hjelp av OCT-systemet med en bølgelengde på 870 nm i denne studien. Den optiske aksialoppløsningen til OCT-skanneren er 12 μm. Sirkulær skannemodus brukes til å skanne synsnerven (ONH) med høyoppløselig modus. 100 bilder er i gjennomsnitt for å optimalisere bildekvaliteten. Den detaljerte opplæringsveiledningen er tilgjengelig online (se Materialliste).
    1. Første OCT-skanning (baseline eksamen)
      1. Klikk på Start-knappen for å gå inn i deteksjonsgrensesnittet. Vent til maskinen er ferdig lastet inn, og trykk deretter på den gule Start-knappen for å starte avbildningen.
      2. Juster geiten etter det infrarøde kameraet for å midtstille ONH i det konfiskeringsbildet Laser Ophthalmoscopy (cSLO) ved å endre hodeposisjonen.
      3. Juster styrespaken slik at hele det infrarøde bildet lyser jevnt for å forbedre bildekvaliteten.
      4. Flytt styrespaken fremover til et oppreist retinal OCT-bilde vises på skjermen oppreist.
      5. Endre styrespaken slik at den har et jevnt og horisontalt plassert retinal OCT-bilde.
      6. Trykk på knappen på styrespaken for å fange bildet automatisk og hold styrespaken for å opprettholde bildekvaliteten på live-bildeskjermen til bildeinnhentingen er fullført. Trykk deretter på Hent.
      7. Vekk geiten ved å injisere Idzoxan (1,5 mg/kg), som er en xylazinantagonist.
        MERK: Sentrering av ONH i basislinjeeksamen bidrar til å justere skanningen og oppfølgingsskanningen etter vår erfaring.
    2. Oppfølging av OCT-skanning
      1. Velg et innledende OCT-bilde av høy kvalitet. Høyreklikk, og velg Angi referanse.
      2. Start OCT-avbildning som nevnt ovenfor.
      3. Trykk oppfølgingsknappen for å tillate automatisk samsvar med gjeldende skanning med referanseskanningen.
      4. Når den er matchet (den sirkulære skanneringen blir grønn), trykker du på knappen på styrespaken for å aktivere automatisk sanntidssporing.
      5. Vekk geiten ved å injisere Idzoxan (1,5 mg/kg ), som er en xylazinantagonist.
        MERK: For å lette prosessen med å matche, (1) flytt ONH i live-vinduet ved å dreie hodet tilsvarende eller (2) rotere ONH i livevinduet ved å vippe hodet for å få det nåværende cSLO-bildet til å se mer ut som grunnlinjebildet. Denne vestibulo-okulære refleksen fungerer godt under xylazine anestesi19.
  3. OKT-måling
    1. Klikk på Mål-knappen for å gå inn i målevinduet.
    2. Velg viskelærverktøyet og tørk av RNFL-linjen, som automatisk merkes av programmet.
    3. Velg linjetegningsverktøyet for å skissere grensen mellom IPL og INL manuelt (figur 2).
      MERK: GCC-tykkelse i seks peripapillære områder (T, TS, TI, N, NS, NI) og gjennomsnittlig GCC-tykkelse rundt ONH (G) kan leses på skjermen (figur 2). Studenttesten, enveis ANOVA eller toveis ANOVA kan brukes til å kvantifisere OCT-dataene ved normalfordeling.

6. OKT i rhesus macaque

  1. Utfør retinal OCT-avbildning i rhesus macaque ved hjelp av samme utstyr og prosedyre som gjort i tilfelle geit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1A viser representative resultater av FVEP i geit. Selv om bølgeformene i samme blitsintensitet har relativ likhet, anbefaler vi fortsatt å undersøke bølgeformene to ganger. Elektromagnetiske bølger generert av elektroniske enheter vil forstyrre de innsamlede elektriske signalene, noe som resulterer i høy baseline støy og dårlig repeterbarhet av bølgeformen. Derfor anbefales det å sikre at det ikke er noen redundante elektroniske enheter koblet til omgivelsene under elektrofysiologisk undersøkelse for å unngå slik interferens, og det anbefales å gjenta minst to målinger for å bestemme stabiliteten og repeterbarheten av eksperimentelle resultater. Når du begge øynene, er bølgeformene helt flate på begge øynene, noe som viser at bølgeformene absolutt genererer seg fra vår flash-stimulans. Figur 1B viser representative resultater av PERG i geit. På grunn av stabiliteten og det høye signalet, får vi pålitelig bølgeform bare ved engangsmåling ved hver romlige frekvens. Etter hvert som den romlige frekvensen øker, vil størrelsen på sjakkbrettet gradvis overstige anerkjennelsen av geitens øyne. Så vi kan se at på 12.7 cpd har PVEP-bølgeformen falt mye. Analogt med FVEP forsvinner bølgeformen når vi lukker skjermen. Figur 1C viser representative resultater av PVEP i rhesus macaque. Vi gjentar målingen to ganger ved hver romlige frekvens. Etter hvert som den romlige frekvensen øker, vil amplituden reduseres. Dette skyldes det faktum at den romlige frekvensen overstiger oppfatningen av øyet. Figur 1D viser representative resultater av PERG i rhesus macaque. Årsaken til at amplituden reduseres med romlig frekvens er den samme som beskrevet ovenfor. Når du analyserer disse dataene, kan du velge å analysere amplituden mellom toppene og troughs eller latenstiden til toppene eller troughs som statistikken.

Figur 2 viser de representative resultatene av OCT i geit. Bildet lengst til venstre viser et fundusfotografi tatt av infrarødt kamera. Tett til høyre er et tomogram av netthinnen, som viser den totale tykkelsen på netthinnen rundt ONH og tykkelsen på hvert lag. Som vist på bildet, kan vi tydelig se at geiter har større retinal blodårer enn aper. De grønne platene helt til høyre er en kvantitativ analyse av tykkelsen på GCC rundt ONH. G står for generelt, T står for timelig side, N står for nesesiden, S står for overlegen, og jeg står for dårligere. Den svarte skriften representerer målingsverdien for GCC-tykkelsen i mikrometre, og den grønne er den kliniske referansemålingsverdien for mennesker, ikke som referanse for dette eksperimentet.

Figure 1
Figur 1: Representative elektrofysiologiske bølgeformer i geit og rhesus macaques. (A) Representative FVEP bølgeformer ved forskjellige lysintensiteter fra en individuell geit i samme bedøvelsesøkt. (B,D) Representative PERG-bølgeformer ved ulike romlige frekvenser fra en individuell geit (B) eller rhesus macaque (D) i samme bedøvelsesøkt. (C) Representative PVEP-bølgeformer ved ulike romlige frekvenser fra en individuell rhesus macaque i samme bedøvelsesøkt. Den typiske implisitte tiden for hver bølgeform er nevnt i Protokoll-delen. n = 1 emne for hver prøve. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Resultater for oktober. Representative retinal OCT bilder rundt synsnerven hodet (venstre panel) og tykkelsen på GCC i ulike peripapillære regioner (høyre panel) i geit (A) og rhesus macaque (B). n = 1 emne for hver prøve. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien presenterer vi en protokoll av VEP, PERG og OCT i geit og rhesus macaque. Disse in vivo-metodene kan brukes i store dyremodeller av ulike optiske nevropatier, som glaukom, iskemisk eller traumatisk optisk nevropati og optisk nevritt9.

PVEP er mer stabil og følsom enn FVEP17; Det kan imidlertid ikke fremkalles i goat9. Som sådan utføres FVEP i geit og PVEP utføres i rhesus macaque i laboratoriet vårt for å evaluere integriteten til retino-geniculo-kortikale banen. Mekanismen som ligger til grunn for observasjonen om at PERG, men ikke PVEP, kan induserer i geit, er fortsatt uklar i henhold til vår kunnskap. Det er mulig at den optiske nervefunksjonen og strukturen fra geit kan være forskjellig fra mennesket.

Siden amplituden til FVEP kan påvirkes av pupillstørrelse og omgivelseslys, utvider vi eleven og legger et svart teppe over geitens hode under FVEP-opptak. Det skal be merkes at pupillutvidelse ikke er nødvendig for FVEP i klinikker17. På samme måte, selv om mørk tilpasning ikke er nødvendig for FVEP-opptak i klinikker, fant vi at en 5 min tilpasning til omgivelseslyset før FVEP-opptak kan øke intrasession repeterbarhet i amplitude.

PERG-signal antas å stamme fra RGCene, og dermed kan amplituden brukes til å estimere funksjonen til RGCene13,20. Sammenlignet med noen spesielle flash ERG-komponenter, for eksempel scotopic threshold response (STR) og fotopisk negativ respons (PhNR), er PERG mer følsom for RGC-dysfunksjon13. Potensielle begrensninger ved PERG-test i denne studien er som følger. For det første anbefaler ISCEV å bruke klassiske CRT-stimulator (katodestrålerør) for PERG-opptak for å holde gjennomsnittlig lystetthet konstant. Den klassiske CRT-stimulatoren er imidlertid mindre tilgjengelig enn LCD (Liquid Crystal Display). Selv om skjermen på LCD vanligvis presenterer forbigående lystetthetsendringer under mønster reversering, potensielt forårsaker luminans artefakt17, bidro det ikke til amplituden av PERG i geit i henhold til vårt tidligere funn: amplituden til PERG ved romlig frekvens på 12,6 cpd er vanligvis forsømmes sammenlignet med de ved lavere romlige frekvenser9 . En annen begrensning er at vi ikke korrigerte brytningsfeil før PERG-test for enkelhets skyld. For å gjøre opp for denne begrensningen, bør baseline PERG amplitude registreres som en referanse.

Vår forrige studie hadde vurdert og optimalisert intra- og intersesjonsvariasjonen av VEP og PERG9. Vi fant at sammenlignet med xylazin resulterte isofluran i mer repeterbare FVEP, men mer variable PERG-bølgeformer i geiter9. Derfor brukte vi isofluran i FVEP-test og xylazin i PERG- og OCT-test hos geiter. I tillegg, sammenlignet med PERG, er VEP-opptak potensielt mer variabel. Som sådan gjentar vi regelmessig VEP-opptak ved hver lysintensitet eller romlige frekvens for å sjekke intrasessionvariasjonen. Derimot er PERG-bølgeformer mye mer stabile. Derfor gjentar vi generelt ikke PERG-opptak. Selv om gjentatt opptak på en annen dag om samme emne generelt anbefales, gjentar vi ikke regelmessig VEP- eller PERG-opptak om samme emne på en annen dag av hensyn til enkelhet og dyreetikk. Likevel er FVEP- og PERG-opptak uten repetisjon mellom øktene følsomme nok til å oppdage optisk nerveskade i henhold til vår forrige studie9.

Retinal OCT-avbildning er en praktisk, pålitelig og ikke-invasiv teknikk for å langsgående overvåke og kvantifisere dynamiske endringer i netthinnestrukturen. Sammenlignet med PERG og VEP, har OCT-avbildning mye bedre intersession repeterbarhet9. Videre kan OCT-avbildning fange og kvantifisere all optisk nervefiber i løpet av få minutter uten prøvetakingsfeil, noe som gir en mye billigere og effektiv mulighet til å undersøke retinalstrukturen enn tradisjonell histologisk analyse. Imidlertid er den romlige oppløsningen av nåværende OCT-avbildning fortsatt for begrenset til å fortelle individuell RGC soma eller optisk nervefiber. I tillegg bør det be merkes at en tykkere GCC målt ved OCT ikke nødvendigvis betyr en mer intakt indre netthinne fordi GCC-fortykning kan skyldes retinal ødem eller blødning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble finansiert av følgende tilskudd: National Key R&D Program of China (2021YFA1101200); Medisinsk forskningsprosjekt av Wenzhou (Y20170188), National Key FoU Program of China (2016YFC1101200); National Natural Science Foundation of China (81770926;81800842); Nøkkel-FoU-program i Zhejiang-provinsen (2018C03G2090634); og Key FoU-programmet til Wenzhou Eye Hospital (YNZD1201902). Sponsor- eller finansieringsorganisasjonen hadde ingen rolle i utformingen eller gjennomføringen av denne forskningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
47.6 x 26.8 cm monitors DELL Inc. E2216HV The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens
6.0 mm tracheal tube Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd PVC 6.0 ensure the airway
alligator clip
atropine Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd. reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation
Carbomer Eye Gel Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb moisten the cornea and stabilize the recording electrodes
ERG-Jet recording electrodes Roland Consult Stasche&Finger GmbH 2300 La Chaux-De-Fonds ERG recording
eye speculum Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd ZYD020 open palpebral fissure
Heidelberg Spectralis OCT system Heidelberg Engineering OCT system
Imaging (https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)
isoflurane RWD Life Science Co., Ltd R510-22 isoflurane anesthesia
male Saanen goats Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China) The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg
needle electrode Roland Consult Stasche&Finger GmbH U51-426-G-D use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes
periphery venous catheter intravenously BD shanghai Medical Device Co., Ltd 383019 intravenous access for atropine and propofol
propofol Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd. induce Isoflurane anesthesia in goat
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops SANTEN OY, Japan 5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride
visual electrophysiology device Gotec Co., Ltd GT-2008V-III use for FVEP & PERG
xylazine Huamu Animal Health Products Co., Ltd. xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg
zoletil50 Virbac induce Isoflurane anesthesia in monkey

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benowitz, L., Yin, Y. Rewiring the injured CNS: lessons from the optic nerve. Experimental Neurology. 209 (2), 389-398 (2008).
  2. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
  3. Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).
  4. Bei, F., et al. Restoration of visual function by enhancing conduction in regenerated axons. Cell. 164 (1-2), 219-232 (2016).
  5. He, Z., Jin, Y. Intrinsic control of axon regeneration. Neuron. 90 (3), 437-451 (2016).
  6. Yang, S. -G., et al. Strategies to promote long-distance optic nerve regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 119 (2020).
  7. Foroozan, R. New treatments for nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Neurologic Clinics. 35 (1), 1-15 (2017).
  8. Singman, E. L., et al. Indirect traumatic optic neuropathy. Military Medical Research. 3, 2 (2016).
  9. Zhang, Y., et al. In vivo evaluation of retinal ganglion cells and optic nerve's integrity in large animals by multi-modality analysis. Experimental Eye Research. 197, 108117 (2020).
  10. Tolbert, W. D., et al. From Rhesus macaque to human: structural evolutionary pathways for immunoglobulin G subclasses. mAbs. 11 (4), 709-724 (2019).
  11. Preuss, T., et al. Specializations of the human visual system: the monkey model meets human reality. , CRC Press. Boca Raton, FL. 231-259 (2004).
  12. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
  13. Porciatti, V. Electrophysiological assessment of retinal ganglion cell function. Experimental Eye Research. 141, 164-170 (2015).
  14. Smith, C. A., Vianna, J. R., Chauhan, B. C. Assessing retinal ganglion cell damage. Eye. 31 (2), 209-217 (2017).
  15. Schuman, J. S., et al. Optical coherence tomography and histologic measurements of nerve fiber layer thickness in normal and glaucomatous monkey eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (8), 3645-3654 (2007).
  16. You, Y., et al. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Documenta Ophthalmologica. 123 (2), 109-119 (2011).
  17. Odom, J. V., et al. ISCEV standard for clinical visual evoked potentials: (2016 update). Documenta Ophthalmologica. 133 (1), 1-9 (2016).
  18. Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. eLife. 8, 45881 (2019).
  19. Seidman, S. H., Telford, L., Paige, G. D. Vertical, horizontal, and torsional eye movement responses to head roll in the squirrel monkey. Experimental Brain Research. 104 (2), 218-226 (1995).
  20. Porciatti, V. The mouse pattern electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 145-153 (2007).

Tags

Nevrovitenskap utgave 180
<em>In Vivo</em> Metoder for å vurdere retinal ganglioncelle og optisk nervefunksjon og struktur hos store dyr
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ye, Q., Yu, Z., Xia, T., Lu, S.,… More

Ye, Q., Yu, Z., Xia, T., Lu, S., Sun, J., Li, M., Xia, Y., Zhang, S., Wu, W., Zhang, Y. In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals. J. Vis. Exp. (180), e62879, doi:10.3791/62879 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter