Summary
Här demostrate vi flera in vivo tester (flash visuella framkallad potential, mönster elektroretinogram och optisk koherens tomografi) i get och rhesus makak för att förstå strukturen och funktionen av optik nerv och dess nervceller.
Abstract
Synnerven samlar in axoner signaler från näthinnan ganglion celler och överför visuell signal till hjärnan. Stora djurmodeller av optisk nervskada är viktiga för att översätta nya terapeutiska strategier från gnagare modeller till klinisk tillämpning på grund av deras närmare likheter med människor i storlek och anatomi. Här beskriver vi några in vivo metoder för att utvärdera funktionen och strukturen hos retinal ganglion celler (RGCs) och optik nerv (ON) i stora djur, inklusive visuella framkallade potential (VEP), mönster elektroretinogram (PERG) och optisk koherens tomografi (OCT). Både get och icke-mänskliga primater användes i denna studie. Genom att presentera dessa in vivo-metoder steg för steg hoppas vi kunna öka experimentell reproducerbarhet bland olika laboratorier och underlätta användningen av stora djurmodeller av optiska neuropatier.
Introduction
Den optiska nerven (ON), som består av axoner från näthinnans ganglionceller (RGC), överför visuell signal från näthinnan till hjärnan. ON sjukdomar, såsom glaukom, traumatiska eller skandinaviska optik neurotoxiskt, ofta orsakade irreversibla ON/RGC degeneration och förödande visuella förlust. Även om det för närvarande finns många genombrott inom ON-regenerering och RGC-skydd i gnagaremodeller1,2,3,4,5,6, förblev kliniska behandlingar för de flesta ON-sjukdomar i huvudsak desamma under det senaste halvseklet med otillfredsställande resultat7,8 . För att fylla klyftan mellan grundforskning och klinisk praxis är translationella studier med stor djurmodell av ON-sjukdomar ofta nödvändiga och fördelaktiga på grund av deras närmare anatomiska likhet med människor än gnagaremodeller.
Get- och rhesusmakaker är två stora djurarter som används i vårt labb för att modellera människans ON-sjukdom. Storleken på en getöga, ON och den intilliggande strukturen (orbital och nasal hålighet, skallebas, etc.) liknar en människas som baseras på skalle CT scan9. Som sådan ger getmodellen en möjlighet att utvärdera och förfina terapeutiska enheter eller kirurgiska ingrepp före användning på människor. Rhesus makaker, som icke-mänsklig primat (NHP), har människoliknande unikt visuellt system som inte finns i andra arter10,11. Dessutom är patofysiologiska svar på skador och behandlingar i NHP mycket lik det hos människor12.
In vivo-tester för att bedöma ON och RGC:s struktur och funktion längsgående är viktiga i stora djurstudier. Mönsterelektroretinogram (PERG) har använts för att utvärdera funktionen RGC. Flash visual evoked potential (FVEP) återspeglar integriteten hos retino-geniculo-cortical utbildningsavsnittet i det visuella systemet. Således kan PERG i kombination med FVEP återspegla ON-funktionen9,13,14 . Retinal optic coherence tomography (OCT) imaging kan visa retinal struktur med hög tidsmässiga och rumslig upplösning, vilket möjliggör mätning av tjockleken på retinal ganglion komplex (GCC)9,15. För elektrofysiologiska undersökningar i denna studie är övervakning av vitala tecken (värmehastighet, brottsfrekvens, blodtryck) och nivå av syremättnad (SpO2) före testning avgörande eftersom dessa parametrar har potenta effekter på okulärt blodflöde och därmed det visuella systemets funktion. Vi övervakade dock inte de vitala tecknen när vi utförde OCT retinal imaging för enkelhetens skull. Enligt vår tidigare studie9 är GCC-tjockleken mätt med OCT retinal imaging ganska stabil, med intersessionskoefficient för variation nära 3%. Dessa in vivo-tester i get- och rhesusmakaque har beskrivits i detalj i vår tidigare studie9. Här presenterar vi dessa metoder för att öka experimentell transparens och reproducerbarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experiment utfördes strikt i enlighet med ARRIVE-riktlinjerna och National Institutes of Health guide för vård och användning av laboratoriedjur, och följer de protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee i Wenzhou Medical University (WMU) och Joinn Laboratory (Suzhou). Hanen Saanen getter, i åldern från 4 till 6 månader med en vikt av 19-23 kg, var inhyst i WMU djur anläggning. De manliga Rhesus makakerna, i åldern 5 till 6 år med en vikt på 5-7 kg, var inrymda i Joinn djuranläggning. Alla djuren hölls i ett luftkonditionerat rum med kontrollerad temperatur (21 ± 2 °C) under en 12 h ljus/12 h mörk cykel med mat ad libitum.
1. Flash visuell framkallad potential (FVEP) hos get
- Allmän sövdhet
- Raka hockhåret med en elektronisk rakhyvel.
- Förbered huden genom att gnugga med 70% alkohol tre gånger för att rengöra huden och exponera sedan den subkutana venen.
- Sätt in en perifer venkateter intravenöst (0,9 mm x 25 mm) och injicera sedan atropin (0,025 mg/kg) och propofol (5 mg/kg).
- Intubera geten med ett 6 mm trakealrör och anslut den till en konstgjord andningsskydd.
- Bibehåll anestesi med 3,5% isofluran i syre med en konstant flödeshastighet på 2 L/min.
OBS: Geten återhämtar sig från anestesin inducerad av propofol inom några minuter, så var snabb att intubera geten.
- Cardiopulmonary övervakning
- Placera temperatursensorn under tungan.
- Anslut pulsoximetern till örats proximala ände.
- Knyt blodtrycksmanschetten vid lårets botten.
- Kläm fast EKG-klämmorna på lemmarna i enlighet därmed.
OBS: Den normala hjärtfrekvensen hos getter är 68-150 bpm. På grund av användningen av gasbedövning kommer hjärtfrekvensen hos getter att öka. Därför är vår puls under inspektion 170 ± 30 fpm. Det systoliska blodtrycket hos getter under normala förhållanden är 110-130 mmHg, och det diastoliska blodtrycket är 50-60 mmHg. I tillståndet att andas in syre kan getens blodsyremättnad alltid bibehållas vid 99%. Andningshastigheten hos getter under anestesi synkroniseras med ventilatorns, som är 10 andetag/min. Eftersom temperaturen mättes under getens tunga, inte kärntemperaturen, är getens temperatur i allmänhet 35 ± 2 °C.
- Skallskruvar implantation och elektroder placering
- Raka håret med en klippare. Desinficera huden på mitten av frontbenet genom att gnugga med en bomullsboll som blötläggs i betadin och 70% alkohol tre gånger.
- Använd steriliserade skruvar och saxar.
OBS: Autoklav alla kirurgiska instrument för sterilisering (121 °C, 20 min). - Gör ett 5 mm hudsnitt för att exponera frontbenet med en oftalmisk sax och implantera sedan en steriliserad skruv i mitten av frontbenet med en skruvmejsel.
- Raka håret och desinficera huden på det centrala occipitala benet mellan två öron med betadin och 70% alkohol, en följt av den andra, tre gånger.
- Gör ett 5 mm hudsnitt för att exponera occipitalbenet med en oftalmisk sax och implantera sedan en steriliserad skruv i mitten av occipitalbenet.
OBS: Den malda nålelektroden sätts in subkutant under den främre skallskruven. De aktiva elektroderna och referenselektroderna är anslutna till occipital- respektive frontskruvarna med alligatorklämmor för att minska elektrodimpedansen16.
- Beredning av djur
- Använd ljustät trasa för att täcka ögat och fixera med ögonbindeln för att lappa ett öga.
- Applicera topikala anestesiögondroppar (proparakainhydrokloridögondroppar) på båda ögonen. Bilaterala elever utvidgas av aktuella administrering av mydriatic eyedrops med tropicamid (5%) och fenylefrin (5%).
- Placera getens huvud i Ganzfeld-stimulatorn och dämpa det omgivande ljuset.
OBS: Det konstaterades att getter kan upprätthålla god ögonglob fixering under anestesi, så ingen extra ögonglob fixering operation intervention krävs. - Täck stimulatorn och gethuvudet med en svart filt i 5 min för anpassning.
- Använd ögonlocksspekulum för att exponera bulbarkonjunktiva. Vik den övre ringen, dra upp det övre ögonlocket och för först in den övre ringen i det övre ögonlockets konjunktivalsäck och sedan in i det nedre ögonlocket på ett liknande sätt.
- Tryck på impedansknappen för att kontrollera elektrod-vävnadskontaktimpedansen och impedansvärdena kommer att visas i varje kanal.
- Se till att impedansen är under 10 kΩ för varje elektrod för att undvika elektromagnetisk interferens från andra elektriska apparater i samma rum.
OBS: Om den är över 10 kΩ, återanslut eller byt ut elektroden. Impedansen kan verka onormalt hög om den elektriska metallkirurgbädden, där geten ligger, är pluggad. Impedansen bör skilja sig med mindre än 1 kΩ mellan de aktiva elektroderna och referenselektroderna för att minska elektriska störningar17. - Tryck på oscillografknappen för att kontrollera baslinjeljudet utan ljusstimulering.
OBS: Om det finns ett stort baslinjeljud, koppla ur alla andra elektriska enheter i samma rum och stäng av mobiltelefoner. Om baslinjeproblemet kvarstår hoppar du till steg 1.3.10. för att kontrollera om en typisk FVEP-vågform kan framkallas. Om inte, boka om FVEP-testet vid ett annat tillfälle. - Starta FVEP-inspelningen genom att välja ljusintensiteten 0,025, 0,5 respektive 3,0 cd/m2 i den vita bakgrundsrutan i det övre högra hörnet. Tryck sedan på knappen Undersökning . Observera att FVEP-inspelning vid varje ljusintensitet utförs två gånger.
OBS: Om de två vågformerna verkar uppenbart olika behövs ytterligare en upprepning. - Fukta hornhinnan med konstgjorda tårögondroppar, om det verkar torrt på den infraröda kameran.
OBS: Övervaka ögonpositionen från den inbyggda infraröda kameran före inspelningen för att se till att den visuella blicken är korrekt och att pupillen är helt exponerad (så att fältstorleken på en blixtstimulans är 90°. Ögonpositionen hos en sövd get kan justeras genom att vrida huvudet i enlighet därmed. Baserat på vår observation sker blickvandring sällan under FVEP-inspelning (~ 10 min) hos get under generell anestesi9. Så det finns inget behov av att pausa och justera blicken medan du spelar in. - Upprepa ovanstående steg för det kontralaterala ögat.
- Upphör med isoflurantillförseln och öka tidvattenvolymen något på ventilatorn för att hjälpa geten att återhämta sig från narkos.
- Efter generell anestesi, behandla geten med gentamicin (4 mg/kg, IM) och ceftiofur natrium (en cefalosporin, 2 mg/kg, IM) för att förhindra infektion.
- FVEP-mätning och kvantitativ analys
OBS: Som visas i figur 1A betecknas de första positiva och negativa topparna i FVEP-vågformen som P1 och N1 och den andra positiva toppen som P2. Den typiska implicita tiden för P1, N1 och P2 är cirka 40, 60 respektive 120 ms. P1- och P2-amplituder mäts från tråget av N1 vågform till topparna p1 respektive P2 vågformer.- Vid monokulär skada, använd interocular jämförelse av amplitud och implicit tid för att minska variationen mellan sessionen och öka känsligheten17.
2. PVEP i rhesus makaker
OBS: Mönster VEPs kan framkallas i rhesus makaker9 och är stabilare än Flash VEP i amplitud och implicit tid17. Pvep användes därför för att upptäcka integriteten hos retino-geniculo-när det gäller icke-mänskliga primater.
- Beredning av djur
- Bedöva apan med isofluran (1,5%-2%) efter induktion med Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, tiletamin/zolazepam).
- Placera den steriliserade jordelektroden vid örsnibben. För in de steriliserade aktiva elektroderna och referenselektroderna subkutant längs mittlinjen vid front- respektive occipitalbenet.
- Applicera ögonlocksspekulum för att exponera bulbarkonjunktiva.
- Använd självhäftande ogenomskinlig svart tejp för att lappa det kontralaterala ögat.
- PVEP-inspelning
- Tryck på impedansknappen för att kontrollera elektrod-vävnadskontaktimpedansen och impedansvärdena kommer att visas i varje kanal. se till att den är under 10k Ω. Om inte, återanslut eller byt ut elektroden.
- Kontrollera impedansvärdena i Impedans testfönster och se till att impedansen skiljer sig med mindre än 1 kΩ mellan de aktiva elektroderna och referenselektroderna för att minska elektrisk interferens17.
- Tryck på oscillografknappen för att kontrollera baslinjeljudet utan stimulering.
OBS: Om det finns ett stort baslinjeljud kopplar du ur alla andra elektriska enheter i samma rum och stänger av mobiltelefonerna. Om baslinjeproblemet kvarstår gör du om PVEP-testet en annan dag. - Registrera PVEP-svar från det opatcherade ögat genom att välja ljusintensiteten på 0,5 respektive 1,0 cykel/grad i den vita bakgrundsrutan i det övre högra hörnet och tryck sedan på undersökningsknappen .
OBS: För varje inspelning är 64 spår genomsnittliga för att ge en vågform. För varje frekvens förvärvas minst två inspelningar för att verifiera reproducerbarheten av PVEP-signaler. - Upprepa proceduren för det kontralaterala ögat.
- När du är klar, upphör isoflurantillförseln för att väcka apan.
- Efter generell anestesi, behandla apan med gentamicin (4 mg/kg IM) och ceftiofur natrium (2 mg/kg IM) för att förhindra infektion.
- PVEP-mätning och kvantitativ analys
- Som visas i figur 1B betecknades de första negativa och positiva topparna i PVEP-vågformen som N1 och P1, som vanligtvis förekommer vid cirka 50 och 90 ms. P1-amplituden mäts från Tråget på N1 till toppen av P1.
- Vid monokulär skada, använd interocular jämförelse av amplitud och implicit tid för att minska variationen mellan session och öka känsligheten17.
3. Mönster ERG (PERG) hos get
OBS: I den tidigare studien observerades ingen interocular crosstalk av PERG-signal hos getter, så PERG-svar kan registreras samtidigt från båda ögonen9.
- Beredning av undersökning
- Bedöva geten med xylazin (3 mg/kg, IM) och placera på ett undersökningsbord.
- Placera en temperatursensor under getens tunga.
- Anslut pulsoximetern till den proximala änden av getörat.
- Knyt blodtrycksmanschetten till låret.
- Kläm fast EKG-klämmorna på benen i enlighet därmed.
- För att minska elektrodimpedansen, placera en steriliserad skallskruv på frontbenet och anslut till jordelektroden med en alligatorklämma.
- Placera två steriliserade nålreferenselektroder subkutant 1 cm bakom den laterala canthi på båda sidor.
- Använd ögonlocksspekulumet för att exponera bulbarkonjunktiva.
- Placera två desinficerade ERG-Jet inspelning elektroder i mitten av bilaterala hornhinnan efter aktuell applicering av konstgjorda tår.
- Placera två 47,6 cm x 26,8 cm LED-skärmar framför båda ögonen med ett visningsavstånd på 50 cm.
- Justera varje bildskärm så att den är parallell med pupillplanet på samma sida och rikta bildskärmens mitt till pupillplanet.
- Se till att kontrollbrädan för kontraståtervändning (tidsfrekvens, 2,4 Hz) visas på båda bildskärmarna och har ett maximalt bildförhållande på 4:3, som ställs in av utrustningens inställningar.
- Se till att kontrasten mellan vita och svarta brickor förblir 96%, och den genomsnittliga luminansen är 200 cd/m2 (Candela per kvadratmeter), vilket kontrolleras av luminansmätaren.
OBS: Enligt ISCEV krävs en genomsnittlig fotopic luminans på 40-60 cd/m2 hos människor17. I en annan studie med mössmodell låg mönstret kvar på en genomsnittlig luminans på 800 cd/m2,18. En fältstorlek på minst 15° i sin smalaste dimension behövs för ett standard PERG-test hos människor17. Justera hornhinnans elektrods position om den inte är i mitten av hornhinnans yta.
- PERG-inspelning
- Dämpa omgivningsljuset och tryck på impedansknappen för att kontrollera elektrod-vävnadskontaktimpedansen. Impedansvärdena visas i varje kanal.
- Kontrollera impedansvärdena i Impedans testfönster och se till att impedansen är under 10 kΩ. Om inte, återanslut eller byt ut elektroden.
- Tryck på oscillografknappen för att kontrollera baslinjeljudet utan ljusstimulering.
OBS: Var uppmärksam på att skydda de ömtåliga ERG-Jet-inspelningselektroderna. Baslinjebullret i PERG är vanligtvis mindre än i FVEP hos get. - Starta PERG-inspelning från båda ögonen samtidigt vid de rumsliga frekvenserna 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 och 12,6 cykler/grad i följd. För varje rumslig frekvens beräknas 64 spår ge en avläsning.
- Stäng slutligen av bildskärmen för att spela in PERG utan visuell stimulans som en negativ kontroll.
OBS: PERG-signaler är vanligtvis stabila och behöver inte upprepas. - Ta bort den främre skallskruven och väck geten genom att injicera Idzoxan (1,5 mg/kg), som är en xylazinantagonist.
- Efter generell anestesi, behandla geten med gentamicin (4 mg/kg IM) och ceftiofur natrium (2 mg/kg IM) för att förhindra infektion.
- PERG-mätning och kvantitativ analys
- Ställ in bandpassfiltret på mellan 1 och 75 Hz. För 3,0 cpd PERG är bandpassfiltret inställt på att vara från 1 till 50 Hz för att jämna ut spårningen utan att dess amplitud påverkas.
- Som visas i figur 1C betecknas de första positiva och negativa topparna i vågformen som P1 (vanligtvis cirka 25 ms) och N1 (vanligtvis cirka 55 ms). AMPLITUDEN PERG mäts från N1 till P1.
- Vid monokulär skada använder vi interocular jämförelse av amplitud och implicit tid för att minska intersession variation och minska känslighet17.
4. PERG i rhesus makaker
OBS: Det är oklart om det finns interocular crosstalk av PERG signal i rhesus makaker, så PERG svar från båda ögonen registreras separat.
- Beredning av undersökning
- Bedöva apan med isofluran (1, 5%-2%) efter injektion av Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, tiletamin/zolazepam) och trakeal intubation.
- Placera en steriliserad markelektrod subkutant på frontbenet. Sätt in en steriliserad nålreferenselektrod subkutant, 1 cm bakom sidokanssen på samma sida.
- Placera en desinficerad ERG-Jet-inspelningselektrod på den centrala hornhinnan efter aktuell applicering av konstgjord tår.
OBS: Justera hornhinnans elektrods position, om den inte är i mitten av hornhinnans yta. - Använd ogenomskinlig svart tejp för att lappa ett öga.
- Placera en bildskärm (47,6 x 26,8 cm) på ett visningsavstånd på 50 cm.
- Se till att monitorn justeras så att den är parallell med pupillplanet. Rikta bildskärmens mittpunkt mot pupillplanet.
- Se till att den svartvita schackbrädet backar med en frekvens på 2,4 Hz och att bildförhållandet är 4:3, som ställs in av utrustningens inställningar.
- Se till att kontrasten mellan de vita och svarta brickor är 96%, och den genomsnittliga luminansen förblir 200 cd/m2, vilket kontrolleras av luminansmätare.
- PERG-inspelning
- Dämpa omgivningsljuset och kontrollera elektrod-vävnadskontaktimpedansen.
- Se till att impedansen är under 10 kΩ. Om inte, återanslut eller byt ut elektroden.
- Kontrollera baslinjeljudet utan ljusstimulering.
- Patcha ett öga och starta PERG-inspelning från det andra ögat vid rumsliga frekvenser på 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 och 12,6 cykler/grad i följd.
- Upprepa stegen 4.2.1-4.2.4 för det kontralaterala ögat.
- Upphör med isoflurantillförseln för att väcka apan.
- Efter generell anestesi, behandla apan med gentamicin (4mg/kg IM) och ceftiofur natrium (2 mg/kg IM) för att förhindra infektion.
- PERG-mätning och kvantitativ analys
- Som visas i figur 1D betecknas de första positiva och negativa topparna i vågformen som P1 (vanligtvis cirka 40 ms) och N1 (vanligtvis cirka 85 ms). AMPLITUDEN PERG mäts från N1 till P1.
- Vid monokulär skada använder vi interocular jämförelse av amplitud och implicit tid för att minska variation mellan session och öka känsligheten17.
5. OKT i get
- Beredning av djur
- Bedöva geten med xylazin (3 mg/kg, IM) och intubera sedan.
- Vidga pupillen genom aktuell administrering av mydriatic eyedrops med tropicamid (5%) och fenylefrin (5%).
- Använd ögonlocksspekulumet för att exponera pupillen helt.
- Placera getens huvud på hakstödet.
OBS: Även om gasestetisering inte utförs, intubera geten regelbundet för att skydda luftvägarna från att komprimeras av hakstödet.
- OCT-avbildning
OBS: Retinal OCT imaging utförs med oct systemet vid en våglängd av 870 nm i denna studie. OK-skannerns optiska axiella upplösning är 12 μm. Cirkulärt skanningsläge används för att skanna det optiska nervhuvudet (ONH) med högupplöst läge. 100 bildrutor är genomsnittliga för att optimera bildkvaliteten. Den detaljerade utbildningsguiden finns tillgänglig online (se Tabell över material).- Inledande OCT-skanning (baslinjeprov)
- Klicka på Start-knappen för att komma in i detektionsgränssnittet. Vänta tills maskinen har lästs in och tryck sedan på den gula Start-knappen för att initiera avbildning.
- Rikta geten mot den infraröda kameran för att centrera ONH i den konfokala scanninglaseroftalmoscopy (cSLO) bilden genom att ändra dess huvudposition.
- Justera styrspaken så att hela den infraröda bilden lyser jämnt för att förbättra bildkvaliteten.
- Flytta joysticken framåt tills en upprätt retinal OCT-bild visas på den upprättstående skärmen.
- Ändra styrspaken så att den har en jämnt tät och horisontellt placerad retinal OCT-bild.
- Tryck på knappen på joysticken för att fånga bilden automatiskt och håll joysticken för att bibehålla bildkvaliteten på livebildskärmen tills bildförvärvet är klart. Tryck sedan på Förvärva.
- Väck geten genom att injicera Idzoxan (1,5 mg/kg), som är en xylazinantagonist.
Om du centrerar ONH i baslinjeundersökningen justeras baslinjeskanningen och uppföljningsskanningen enligt vår erfarenhet.
- Uppföljande OCT-skanning
- Välj en första OCT-bild av hög kvalitet. högerklicka och välj Ange referens.
- Initiera OCT-avbildning som nämnts ovan.
- Tryck på uppföljningsknappen för att tillåta automatisk matchning av den aktuella genomsökningen till referensskanningen.
- När den har matchats (den cirkulära skanningsringen blir grön) trycker du på knappen på joysticken för att aktivera Automatisk realtidsspårning.
- Väck geten genom att injicera Idzoxan (1,5 mg/kg ), som är en xylazinantagonist.
OBS: För att underlätta matchningsprocessen,(1) flytta ONH i det levande fönstret genom att vrida huvudet i enlighet därmed eller (2) rotera ONH i det levande fönstret genom att luta huvudet för att få den aktuella cSLO-bilden att se mer lik baslinjebilden. Denna vestibulo-okulär reflex fungerar bra under xylazin anestesi19.
- Inledande OCT-skanning (baslinjeprov)
- OCT-mätning
- Klicka på knappen Mätning för att komma in i mätfönstret.
- Välj radergummiverktyget och torka av RNFL-linjen, som automatiskt märks av programmet.
- Välj linjeritningsverktyget för att manuellt beskriva gränsen mellan IPL och INL (bild 2).
OBS: GCC-tjocklek i sex peripapillaryregioner (T, TS, TI, N, NS, NI) och genomsnittlig GCC-tjocklek runt ONH (G) kan läsas på skärmen (bild 2). Studenttestet, enkelriktadE ANOVA eller tvåvägs ANOVA kan användas för att kvantifiera OCT-data vid normal distribution.
6. OKT i rhesus makaker
- Utför retinal OCT imaging i rhesus makaker med samma utrustning och förfarande som görs vid get.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A visar representativa resultat av FVEP hos getter. Även om vågformerna i samma blixtintensitet har relativ likhet, rekommenderar vi fortfarande att undersöka vågformerna två gånger. Elektromagnetiska vågor som genereras av elektroniska enheter kommer att störa de insamlade elektriska signalerna, vilket resulterar i högt baslinjebrus och dålig repeterbarhet hos vågformen. Därför rekommenderas att säkerställa att det inte finns några redundanta elektroniska enheter anslutna till den omgivande miljön under elektrofysiologisk undersökning för att undvika sådana störningar, och det rekommenderas att upprepa minst två mätningar för att bestämma stabiliteten och repeterbarheten hos experimentella resultat. När man patchar båda ögonen är vågformerna helt platta på båda ögonen, vilket visar att vågformerna verkligen genererar från vår blixtstimulans. Figur 1B visar representativa resultat av PERG hos getter. På grund av dess stabilitet och höga signal förvärvar vi tillförlitlig vågform bara vid en gång mätning vid varje rumslig frekvens. När den rumsliga frekvensen ökar kommer storleken på schackbrädet gradvis att överstiga erkännandet av getens ögon. Så vi kan se att vid 12,7 cpd har PVEP-vågformen sjunkit mycket. Analogt med FVEP försvinner vågformen när vi stänger skärmen. Figur 1C visar representativa resultat av PVEP i rhesus makaker. Vi upprepar mätningen två gånger vid varje rumslig frekvens. När den rumsliga frekvensen ökar kommer amplituden att minska. Detta beror på det faktum att den rumsliga frekvensen överstiger ögats uppfattning. Figur 1D visar representativa resultat av PERG i rhesus makaker. Anledningen till att amplituden minskar med den rumsliga frekvensen är densamma som beskrivits ovan. När du analyserar dessa data kan du välja att analysera amplituden mellan toppar och dalar eller latenstiden för topparna eller tråg som statistiken.
Figur 2 visar de representativa resultaten av ULT hos getter. Bilden längst till vänster visar ett fundus-fotografi taget av infraröd kamera. Tätt till höger är ett tomogram av näthinnan, som visar den totala tjockleken på näthinnan runt ONH och tjockleken på varje lager. Som visas på bilden kan vi tydligt se att getter har större retinala blodkärl än apor. De gröna skivorna längst till höger är en kvantitativ analys av GCC:s tjocklek runt ONH. G står för general, T står för temporal sida, N står för nasal sida, S står för överlägsen, och jag står för underlägsen. Det svarta teckensnittet representerar GCC-tjockleksmätningsvärdet i mikrometer, och det gröna är det kliniska referensmätningsvärdet för människa, inte som referens för detta experiment.
Figur 1: Representativa elektrofysiologiska vågformer i get- och rhesusmakarker. (A) RepresentativA FVEP-vågformer med olika ljusintensiteter från en enskild get inom samma bedövningssession. (B,D) Representativa PERG vågformer vid olika rumsliga frekvenser från en enskild get (B) eller rhesus makaker (D) inom samma bedövningssession. C) Representativa PVEP-vågformer vid olika rumsliga frekvenser från en enskild rhesusmakaque inom samma bedövningssession. Den typiska implicita tiden för varje vågform nämns i avsnittet Protokoll. n = 1 försöksperson för varje provning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: RESULTAT FRÅN OKTOBER. Representativa retinal OCT bilder runt optik nerv huvudet (vänster panel) och tjockleken på GCC i olika peripapillary regioner (höger panel) i get (A) och rhesus makak (B). n = 1 försöksperson för varje provning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie presenterar vi ett protokoll av VEP, PERG och OCT i get och rhesus makaker. Dessa in vivo metoder kan tillämpas i stora djur modeller av olika optik neuropathies, såsom glaukom, skandinaviska eller traumatiska optik neurotoxiskt och optisk neurit9.
PVEP är stabilare och känsligare än FVEP17; Det kan dock inte framkallas i get9. Som sådan utförs FVEP i get och PVEP utförs i rhesus makaker i vårt labb för att utvärdera integriteten hos retino-geniculo-cortical vägen. Mekanismen bakom observationen att PERG, men inte PVEP, kan induceras i get är fortfarande oklart enligt vår kunskap. Det är möjligt att den optiska nervfunktionen och strukturen från get kan skilja sig från människa.
Eftersom Amplituden av FVEP kan påverkas av pupillstorlek och omgivande ljus, utvidgar vi pupillen och placerar en svart filt över getens huvud under FVEP-inspelningen. Det bör noteras att pupill dilation inte behövs för FVEP i kliniker17. På samma sätt, även om mörk anpassning inte är nödvändigt för FVEP inspelning i kliniker, fann vi att en 5 min anpassning till omgivande ljus före FVEP inspelning kan öka intrasession repeterbarhet i amplitud.
PERG-signalen tros ha sitt ursprung i RGCs och därmed dess amplitud kan användas för att uppskatta funktionen hos RGCs13,20. Jämfört med vissa speciella flash ERG-komponenter, såsom scotopic threshold response (STR) och photopic negative response (PhNR), är PERG mer känslig för RGC dysfunktion13. Potentiella begränsningar av PERG-test i denna studie är följande. För det första rekommenderar ISCEV att använda klassisk CRT (katodstrålerör) stimulator för PERG-inspelning för att hålla genomsnittlig luminans konstant. Den klassiska CRT-stimulatorn är dock mindre tillgänglig än LCD(Liquid Crystal Display). Även om lcd-skärmen vanligtvis presenterar tillfälliga luminansförändringar under mönsteråtervändning, vilket potentiellt orsakar luminansartefakt17, bidrog den inte till amplituden av PERG hos get enligt vårt tidigare fynd: amplituden av PERG vid den rumsliga frekvensen 12,6 cpd är vanligtvis försumlig jämfört med de vid lägre rumsliga frekvenser9 . En annan begränsning är att vi inte korrigerade brytningsfel före PERG-testet för enkelhetens skull. För att kompensera för denna begränsning bör perg-amplituden för baslinjen registreras som referens.
Vår tidigare studie hade bedömt och optimerat variationen mellan VEP och PERG9 inom och mellan sessioner. Vi fann att jämfört med xylazin resulterade isofluran i mer repeterbara FVEP men mer varierande PERG vågformer hos getter9. Därför använde vi isofluran i FVEP-test och xylazin i PERG- och OCT-test hos getter. Dessutom, jämfört med PERG, är VEP-inspelning potentiellt mer variabel. Som sådan upprepar vi regelbundet VEP-inspelning vid varje ljusintensitet eller rumslig frekvens för att kontrollera intrasessionsvariationen. Å kontrasten är PERG-vågformer mycket stabilare. Därför upprepar vi i allmänhet inte PERG-inspelning. Även om upprepad inspelning på en annan dag på samma ämne i allmänhet rekommenderas, upprepar vi inte regelbundet VEP eller PERG-inspelning på samma ämne på en annan dag för enkelhetens och djuretikens skull. Ändå är FVEP- och PERG-inspelningar utan repetition mellan sessionerna tillräckligt känsliga för att upptäcka optisk nervskada enligt vår tidigare studie9.
Retinal OCT imaging är en bekväm, pålitlig och icke-invasiv teknik för att longitudinellt övervaka och kvantifiera dynamiska förändringar i näthinnan struktur. Jämfört med PERG och VEP har OCT imaging mycket bättre repeterbarhet mellan sessionerna9. Dessutom kan OCT-avbildning fånga och kvantifiera all optisk nervfiber inom några minuter utan provtagningsfel, vilket ger en mycket billigare och effektiv möjlighet att undersöka näthinnestrukturen än traditionell histologisk analys. Den rumsliga upplösningen av nuvarande OCT imaging är dock fortfarande för begränsad för att berätta enskilda RGC soma eller optisk nerv fiber. Dessutom bör det noteras att en tjockare GCC mätt med OCT inte nödvändigtvis betyder en mer intakt inre näthinna eftersom GCC förtjockning kan orsakas av näthinneödem eller blödning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie finansierades av följande bidrag: National Key R&D Program of China (2021YFA1101200); Medicinskt forskningsprojekt i Wenzhou (Y20170188), Kinas nationella nyckelforskningsprogram (2016YFC1101200); Medborgarevetenskapfundament av Kina (81770926;81800842); Viktigt R&D-program i provinsen Zhejiang (2018C03G2090634); och Key R&D Program för Wenzhou Eye Hospital (YNZD1201902). Sponsorn eller finansieringsorganisationen hade ingen roll i utformningen eller genomförandet av denna forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 47.6 x 26.8 cm monitors | DELL Inc. | E2216HV | The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens |
| 6.0 mm tracheal tube | Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd | PVC 6.0 | ensure the airway |
| alligator clip | |||
| atropine | Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd. | reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation | |
| Carbomer Eye Gel | Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb | moisten the cornea and stabilize the recording electrodes | |
| ERG-Jet recording electrodes | Roland Consult Stasche&Finger GmbH | 2300 La Chaux-De-Fonds | ERG recording |
| eye speculum | Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd | ZYD020 | open palpebral fissure |
| Heidelberg Spectralis OCT system | Heidelberg Engineering | OCT system | |
| Imaging | (https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf) | ||
| isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd | R510-22 | isoflurane anesthesia |
| male Saanen goats | Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China) | The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg | |
| needle electrode | Roland Consult Stasche&Finger GmbH | U51-426-G-D | use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes |
| periphery venous catheter intravenously | BD shanghai Medical Device Co., Ltd | 383019 | intravenous access for atropine and propofol |
| propofol | Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd. | induce Isoflurane anesthesia in goat | |
| Tropicamide Phenylephrine Eye Drops | SANTEN OY, Japan | 5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride | |
| visual electrophysiology device | Gotec Co., Ltd | GT-2008V-III | use for FVEP & PERG |
| xylazine | Huamu Animal Health Products Co., Ltd. | xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg | |
| zoletil50 | Virbac | induce Isoflurane anesthesia in monkey |
References
- Benowitz, L., Yin, Y. Rewiring the injured CNS: lessons from the optic nerve. Experimental Neurology. 209 (2), 389-398 (2008).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
- Duan, X., et al. Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling. Neuron. 85 (6), 1244-1256 (2015).
- Bei, F., et al. Restoration of visual function by enhancing conduction in regenerated axons. Cell. 164 (1-2), 219-232 (2016).
- He, Z., Jin, Y.
- Yang, S. -G., et al. Strategies to promote long-distance optic nerve regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 119 (2020).
- Foroozan, R. New treatments for nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Neurologic Clinics. 35 (1), 1-15 (2017).
- Singman, E. L., et al.
- Zhang, Y., et al. In vivo evaluation of retinal ganglion cells and optic nerve's integrity in large animals by multi-modality analysis. Experimental Eye Research. 197, 108117 (2020).
- Tolbert, W. D., et al. From Rhesus macaque to human: structural evolutionary pathways for immunoglobulin G subclasses. mAbs. 11 (4), 709-724 (2019).
- Preuss, T., et al. Specializations of the human visual system: the monkey model meets human reality. , CRC Press. Boca Raton, FL. 231-259 (2004).
- Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
- Porciatti, V. Electrophysiological assessment of retinal ganglion cell function. Experimental Eye Research. 141, 164-170 (2015).
- Smith, C. A., Vianna, J. R., Chauhan, B. C. Assessing retinal ganglion cell damage. Eye. 31 (2), 209-217 (2017).
- Schuman, J. S., et al. Optical coherence tomography and histologic measurements of nerve fiber layer thickness in normal and glaucomatous monkey eyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (8), 3645-3654 (2007).
- You, Y., et al. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Documenta Ophthalmologica. 123 (2), 109-119 (2011).
- Odom, J. V., et al. ISCEV standard for clinical visual evoked potentials: (2016 update). Documenta Ophthalmologica. 133 (1), 1-9 (2016).
- Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. eLife. 8, 45881 (2019).
- Seidman, S. H., Telford, L., Paige, G. D. Vertical, horizontal, and torsional eye movement responses to head roll in the squirrel monkey. Experimental Brain Research. 104 (2), 218-226 (1995).
- Porciatti, V.
