Summary
פרוטוקול מפורט ושלושה סקריפטים של פייתון מסופקים להפעלת מערכת טיפול בנוזל רובוטי בקוד פתוח לביצוע הכנת דגימת חלבון אוטומטית למחצה לניסויי ספקטרומטריית מסה, המכסים הסרת חומרי ניקוי, עיכול חלבונים ושלבי התפלת פפטידים.
Abstract
ניסויי פרוטאומיקה של רובה ציד מבוססי ספקטרומטריה המונית דורשים מספר שלבי הכנה מדגם, כולל עיכול חלבון אנזימטי וניקוי, אשר יכול לקחת שעות אדם משמעותיות של עבודת ספסל ולהציג מקור של שונות אצווה לאצווה. אוטומציה של מעבדה עם רובוטים מקטרים יכולה להפחית את העבודה הידנית, למקסם את התפוקה ולהגדיל את יכולת הרבייה המחקרית. עם זאת, המחירים ההתחלתיים התלולים של תחנות אוטומציה סטנדרטיות הופכים אותם לבלתי ניתנים להפרדה עבור מעבדות אקדמיות רבות. מאמר זה מתאר זרימת עבודה של הכנת מדגם פרוטאומיקה באמצעות מערכת אוטומציה של קוד פתוח במחיר סביר (The Opentrons OT-2), כולל הוראות להגדרת הפחתת חלבון אוטומטית למחצה, אלקילציה, עיכול וניקוי; כמו גם נלווה סקריפטים Python קוד פתוח לתכנת את מערכת OT-2 באמצעות ממשק תכנות היישומים שלה.
Introduction
פרוטאומיקה של רובה ציד מבוסס ספקטרומטריית מסה היא כלי רב עוצמה למדידת השפע של חלבונים רבים בדגימות ביולוגיות בו זמנית. ניסויי פרוטאומיקה בניתוח ביואינפורמטיקה משמשים באופן שגרתי לזיהוי סמנים ביולוגיים ולגלות מתחמים ביולוגיים ומסלולים הקשורים העומדים בבסיס מנגנונים פתולוגיים. עם הספציפיות האנליטית הגבוהה שלה ודיוק כמותי פוטנציאלי, פרוטאומיקה רובה ציד יש גם פוטנציאל מצוין להיות מאומץ על ידי מתקני מחקר ומעבדות אבחון לניתוח מדגם קליני ללא צורך להסתמך על נוגדנים1,2.
כדי להכין דגימות חלבון לניתוח פרוטאומיקה של רובה ציד, חלבונים המופקים מדגימות ביולוגיות (למשל, תאים ורקמות) בדרך כלל צריכים להיות מעובדים תחילה באמצעות פרוטוקולים ארוכים, כולל מדידת ריכוז החלבון לדוגמה, הפחתת חלבון ואלקלציה, ועיכול אנזימטי לפפטידים. יתר על כן, חלבונים המופקים במאגרי תמוגה נפוצים המכילים חומרי ניקוי דורשים לעתים קרובות שלבים נוספים של חילופי חוצץ או הסרת חומרי ניקוי לפני הניתוח מכיוון שדטרגנט יכול להפריע לעיכול טריפסין ולפגוע באופן משמעותי בביצועים של ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה נוזלית במורד הזרם (ניתוח LC-MS /MS)3. פפטידים הם בדרך כלל מותפלים עוד יותר, מיובשים, ומחודשים בממסים תואמי LC-MS / MS בעקבות עיכול אנזימטי. הליכי ביוכימיה חלבונים אלה יכולים להיות עתירי עבודה וגוזלים זמן רב. לכן, הם ממשיכים להגביל את התפוקה של זרימות עבודה של פרוטאומיקה ולתרום לשונות של נתונים שנרכשו4,5. טעויות אנוש והטיות הוכרו כגורמים מכריעים המשפיעים על שונות הנתונים ועל רבייה6,7. כדי למזער טעויות אנוש בתהליכי עבודה של הכנת דגימת ספקטרומטריית מסה, נעשה שימוש במערכות רובוטיות אוטומטיות של צינורות כדי לשפר את התפוקה והשחזור של זיהוי חלבונים וכימות מפרוטאומיקה של רובה ציד וניתוח ספקטרומטריית מסה ממוקדת, שם התפתחויות כאלה הוכרזו כמסייעות להמשך הדחיפה לאימוץ נרחב של טכנולוגיות פרוטאומיקה במחקר קריטי ובהגדרות קליניות8, 9,10,11,12,13. עם זאת, רוב הפרוטוקולים הקיימים משתמשים בפלטפורמות רובוטיות לטיפול בנוזלים הדורשים השקעה והכשרה משמעותיות, ומגבילים את התועלת שלהם במעבדות רבות בסביבה האקדמית או בכל דרך אחרת עם תקציב מוגבל.
מאמר זה מתאר פרוטוקול המשתמש במערכת טיפול בנוזל רובוטי רובוטי בקוד פתוח בעלות נמוכה, OT-2, כדי להפוך חצי אוטומטית זרימת עבודה טיפוסית להכנת מדגם רובה ציד פרוטאומיקה. ל-OT-2 יש עלות נמוכה יותר ממערכות רבות אחרות לטיפול בנוזלים רובוטיים, ובזמן הכתיבה, הוא עולה כ-5,000 דולר אמריקאי. כאשר לוקחים בחשבון את המחירים של מודולים שונים ותוכנות מעבדה, העלות הכוללת להגדרת ניסויים בפרוטוקול זה בזמן הכתיבה היא סביב $10,000, מה שהופך אותו זול יותר לקבוצה רחבה בהרבה של מעבדות על פני אפשרויות יקרות יותר. ה- OT-2 תואם לתכנות קוד פתוח באמצעות סקריפטים של Python ומציע גמישות רבה בעיצוב פרוטוקול עשה זאת בעצמך המוגדר על-ידי המשתמש. באמצעות שלושה סקריפטים שפותחו בתוך הבית, הפרוטוקולים להלן מכסים ביצוע זרימת עבודה טיפוסית של הכנת דגימת פרוטאומיקה של רובה ציד בתחנת OT-2 עם תקן חלבון ארכיטיפי (אלבומין סרום בקר; BSA) ודגימת חלבון מורכבת של ליסט לב אנושי רגיל (איור 1). ההליכים לעיבוד (1) דגימת BSA ו-(2) דגימת ליסט לב מורכבת מפורטים בפרוטוקול סעיפים 1, 2, 5, 6 ו-3, 4, 5, 6, 6, בהתאמה. חרוזים מגנטיים שעברו שינוי קרבוקסילציה Sera-Mag מנוצלים בהכנת מדגם משופרת של שלב מוצק בסיר אחד (SP3) להסרת חומרי ניקוי ומלחים בדגימות החלבון והפפטיד. תקצירים טריפטיים מאלבומין בסרום בקר וחלבוני לב אנושיים מנוקים עוד יותר על ידי חרוזי SP3 ומוגשים לניתוח LC-MS/MS. ספקטרום המסה מנותח לאחר מכן באמצעות תוכנת MaxQuant לזיהוי פפטיד וחלבון. תוצאות מייצגות המבוצעות על ידינו מראות כי הפרוטוקול משיג מקדמים טכניים מצוינים של וריאציה (CV) תוך חיסכון בזמן הספסל ואינו נחות לעיכול ידני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
תסריטי פייתון המפותחים הופקדו ב- GitHub בכתובת: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. עותק של קבצי ה- Script ניתן בקובץ משלים 1. נא עיין במאגר GitHub עבור הגירסאות העדכניות ביותר.
1. הכנות ניסיוניות
- בדוק את החומרה הדרושה לפני הפעלת הפרוטוקול.
הערה: רכיבי החומרה הבאים נדרשים: פיפטות OT-2, טיפים פיפטה, ערכת ארון תקשורת צינור 4 ב-1, ערכת בלוק אלומיניום, מודול מגנטי, מודול טמפרטורה, לוחות באר עמוקים 96-well 2 מ"ל (ראה טבלת חומרים).
2. הכנת דגימת ספקטרומטריית מסה (MS) עם אלבומין סרום בקר חלבון יחיד (BSA)
- פתח את קובץ ה- Script NoSP3_digestion.py בעורך טקסט וציין את המשתנים הספציפיים לניסוי לפי הצורך בסעיף התאמה אישית כאן בלבד.
הערה: המשתנים הספציפיים לניסוי כוללים את מספר הדגימות ומשוכפלים; ריכוז המדגם; הנפח של ריאגנטים dithiothreitol - DTT, iodoacetamide - IAA, ו טריפסין; זמן הדגירה של DTT ו- IAA, והקצה ההתחלתי לפיפטה P20/P50 ו- P300).- פתח את אפליקציית Opentrons והעלה את קובץ ה- Script לכרטיסיה פרוטוקול באפליקציית Opentrons.
הערה: ניתן להוריד את אפליקציית Opentrons מ-Reference14 למחשב מקומי. בזמן הכתיבה, פיפטה אלקטרונית Opentrons P50 אינה זמינה לרכישה בחנות Opentrons. הוא הוחלף בפיפטה האלקטרונית P20 בערוץ יחיד התואמת לאמצעי האחסון שצוינו בפרוטוקול. הערות והוראות נעשו בתסריט כדי להחליף את פיפטת P50 עם פיפטה P20. ייתכן שהמשתמשים יצטרכו לבדוק ולאמת את תאימות ה- pipette הספציפית לפרוטוקול זה בהתאם להוראת ה- API של Opentrons.
- פתח את אפליקציית Opentrons והעלה את קובץ ה- Script לכרטיסיה פרוטוקול באפליקציית Opentrons.
- פתח את הכרטיסייה ROBOT ובצע כיול כיול סיפון רובוט בלשונית ROBOT בהתאם להוראות שלב אחר שלב על המסך באפליקציית Opentrons.
הערה: שלב זה נדרש רק אם הוא לא יושם בעבר או שהרובוט עבר לאחרונה הקצאה. - לחץ על כפתור ניהול PIPETTES כדי לבצע כיול אורך קצה, ואחריו כיול היסט פיפטה לכיול ברירת המחדל של הקצה ומיקום שילוב פיפטה.
הערה: שלב זה נדרש אם נעשה שימוש ב- pipette בפעם הראשונה. - מקם את תוכנות המעבדה והפיפטות הנדרשות במיקום המתאים בחפיסת OT-2 שצוינה בתסריט של פייתון (איור 2).
הערה: ודא שמודול הטמפרטורה מחובר ומופעל, ובלוק האלומיניום ממוקם על גבי מודול הטמפרטורה. - פתח את הכרטיסיה CALIBRATE ובצע כיול עבור השילוב של תוכנות מעבדה ופיפטות הנדרשות בקובץ Script זה של פיתון.
הערה: אפליקציית Opentrons תתעד את פרמטרי הכיול, שאינם נחוצים ליישומים עתידיים עם אותן תוכנות מעבדה ופיפטות. - הכן 5 מ"ל של 100 מ"מ אמוניום ביקרבונט (ABC) (pH ~ 8.0) פתרון על ידי המסת 39.53 מ"ג של ABC במים בדרגת ספקטרומטריה מסה לנפח כולל של 5 מ"ל בצינור חרוטי 15 מ"ל. מניחים חיץ אמוניום ביקרבונט בבאר A1 של מתלה צינור 4 ב -1 עם 15 מ"ל + 50 מ"ל מחזיק צינור העליון.
- הכינו 1 מ"ל של חלבון אלבומין בסרום בקר (BSA) בצינור חלבון בעל 2.0 מ"ל עם קשירה נמוכה (ראו טבלת חומרים). מניחים את הדגימה בבאר A1 של מתלה הצינור 4 ב-1 עם מחזיק צינור 2 מ"ל עליון.
- באופן ידני למקם 2.0 מ"ל חלבון נמוך לאגד צינורות בבארות של A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2, וכו 'בבלוק האלומיניום על גבי מודול הטמפרטורה.
הערה: הפיפטה הרובוטית תחלק דוגמאות בסדר האנכי החל מ- A1 (המדגם הראשון) ועד לדגימה האחרונה כברירת מחדל. ניתן לציין חלוקה אופקית. עיין ב- 15 לקבלת פרטים. המספר הכולל של צינורות שיש להכין צריך להיות שווה למספר הכולל של דגימות (כלומר, מספר הדגימות הביולוגיות כפול מספר השכפולים הטכניים לכל מדגם). - הכן 1 מ"ל של 60 mM DTT על ידי המסת 9.26 מ"ג של מוצקי DTT במים בדרגת ספקטרומטריית מסה לנפח כולל של 1 מ"ל. מקם את ה- DTT בבאר A6 של מתלה הצינורות 4 ב-1 עם למעלה של מחזיק צינור 2 מ"ל.
אזהרה: DTT מזיק לעיניים אנושיות, לעור ולמערכת הנשימה. ללבוש PPE ולטפל בו תחת מכסה המנוע הכימי. עיין בגליון נתוני הבטיחות של היצרן לקבלת נהלים מתאימים. - שימו לב בזמן שהרובוט מעביר נפח מתאים של חיץ ABC לצינורות הדגימה בבלוק האלומיניום.
הערה: הנפח הכולל של ABC ותערובת חלבונים בכל צינור הוא 100 μL, ואת הנפח של מאגר ABC מחושב בתסריט (V = 100 μL פחות נפח של 100 מיקרוגרם של דגימת חלבון). - ודא כי הרובוט מעביר 100 מיקרוגרם של חלבון BSA לכל צינור עם חיץ ABC.
הערה: ניסוי טיפוסי עשוי להשתמש עד 100 מיקרוגרם של חלבונים לעיכול חלבון, כלומר, 50 μL של 2.0 מיקרוגרם / μL עבור מדגם BSA זה. - ודא באופן ידני שתוכנית הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: ודא ש- DTT נטען ל- A6 מתוך ארון הצינורות של 2 מ"ל הממוקם בחריץ 4 לפני חידוש הפרוטוקול. ודא שפופרת DTT ממוקמת בבאר A6 ופותחת את המכסה שלה. לחץ על לחצן חידוש הפעולה באפליקציית Opentrons כדי להמשיך. ודא כי הרובוט מעביר 10 μL של פתרון DTT לכל מדגם היטב, ואחריו חמישה סיבובי ערבוב.
- ודא שתוכנית הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: הקפד לסגור מכסים בצינורות לדוגמה. סגור ידנית את המכסות של הצינורות ולחץ על קורות חיים כדי להמשיך. המתן עד שמודול הטמפרטורה של הרובוט יתחיל לחמם את בלוק האלומיניום עד שהטמפרטורה תגיע ל -55 מעלות צלזיוס, ואחריו דגירה של 5 דקות כדי לאפשר לדגימות להגיע ל -55 מעלות צלזיוס.
הערה: הרובוט יחזיק את הטמפרטורה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר הפחתת חלבון על ידי DTT במהלך הדגירה. - במהלך 30 דקות של דגירה DTT, להכין 1 מ"ל של 187.5 mM Iodoacetamide (IAA) על ידי המסת 34.68 מ"ג של IAA במאגר ABC לנפח כולל של 1 מ"ל. עטפו ידנית את פתרון רשות העתיקות בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור.
אזהרה: רשות העתיקות עלולה לגרום לגירוי חמור בעין ובנשימה. להתמודד עם זה תחת מכסה המנוע הכימי לובש PPE תקין. - ודא שמודול הטמפרטורה של הרובוט מתקרר עם השלמת שלב הדגירה של 30 דקות DTT.
הערה: לאחר שטמפרטורת המודול מגיעה ל-22 מעלות צלזיוס, המודול שומר על הטמפרטורה למשך 5 דקות כדי לאפשר לדגימות להתקרר באופן מלא. - בטל את הניקוי של צינורות הדגימה כאשר התוכנית של הרובוט מושהית והצג את הודעת האזהרה: הקפד לפתוח כובעים בצינורות מדגם. לחץ על חדש כדי להמשיך.
- ודא באופן ידני שהתוכנית של הרובוט מושהית עם הודעת אזהרה: ודא שרשות העתיקות נטענה ל- B6 של ארון צינור 2 מ"ל הממוקם בחריץ 4 לפני חידוש הפרוטוקול. אשר את מיקום המדף של צינור רשות העתיקות ופתח את מכסה הצינור. לחץ על חדש כדי להמשיך. ודא כי הרובוט מעביר 10 μL של IAA לכל צינור מדגם ואחריו חמישה סיבובי ערבוב.
- מכסים את צינורות הדגימה כאשר התוכנית של הרובוט מושהית ומציגים את ההודעה: סגור כובעים על צינורות מדגם וכסה צינורות מדגם בנייר כסף. לכסות את כל בלוק האלומיניום עם חתיכת נייר אלומיניום נקייה. לחץ על חדש כדי להמשיך. חכה עד הדגימות הם דגירה ב 22 °C (50 °F) במשך 30 דקות. ודא שמודול הטמפרטורה של הרובוט מתבטל עם השלמת הדגירה של רשות העתיקות.
- הכן תערובת של פתרון טריפסין במהלך דגירה IAA (שלב 2.19) בריכוז הסופי של 0.2 מיקרוגרם / μL: להמיס 20 מיקרוגרם של ספקטרומטריית מסה / טריפסין רצף כיתה ב 100 μL של מים בדרגת MS.
- מקם את פתרון הטריפסין בבאר C6 של מתלה צינור 2 מ"ל עם מכסה הצינור פתוח כאשר התוכנית של הרובוט מושהית ומציג את הודעת האזהרה: ודא טריפסין נטען לתוך C6 של ארון צינור 2 מ"ל הממוקם בחריץ 4 לפני חידוש הפרוטוקול. לחץ על חדש כדי להמשיך.
- ודאו שתוכנית הרובוט מושהית ומציגה את הודעת האזהרה: פתחו מכסים בצינורות מדגם במודול הטמפרטורה. נקה את צינורות הדגימה ולחץ על חדש כדי להמשיך. היכונו בזמן שהרובוט מעביר 10 μL של טריפסין לכל צינור מדגם ואחריו חמישה סיבובי ערבוב.
- עוטפים את כובעי צינור הדגימה בסרט פרפין, מעבירים את כל הדגימות למיקסר מבוקר טמפרטורה ודגורים ב-37 מעלות צלזיוס ל-16-20 שעות עם רעידות של 600 סל"ד.
הערה: עיכול טריפסין עשוי להתבצע גם ישירות על מודול הטמפרטורה ב 37 °C (50 °F).
3. ניקוי פפטיד באמצעות חרוזים פרמגנטיים SP3
- למחרת לאחר עיכול טריפסין בן לילה, לסובב בקצרה את הדגימות באמצעות microcentrifuge ספסל (≤2,000 x g) (ראה טבלת חומרים) ולהניח את הדגימות על מתלה צינור מגנטי. תן את הדגימות לעמוד במשך 2 דקות.
- מעבירים את הסופר-נרטיב בזהירות עם פיפטה לקבוצה חדשה של צינורות מיקרו-צנטריפוגות עתירות חלבון. שמור את הדגימות במקרר ולהמשיך לשלבים 3.2-3.9.
הערה: לאחסון לטווח ארוך, אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 °C (80 °F).
- מעבירים את הסופר-נרטיב בזהירות עם פיפטה לקבוצה חדשה של צינורות מיקרו-צנטריפוגות עתירות חלבון. שמור את הדגימות במקרר ולהמשיך לשלבים 3.2-3.9.
- פתח את קובץ ה- Script של SP3_peptide_cleanup.py Python בעורך טקסט וציין לפי הצורך בסעיף התאמה אישית כאן בלבד.
הערה: המשתנים הספציפיים לניסוי כוללים את מספר הדגימות והשכפולים, את נפח הפפטידים שיש להעביר, את נפח הריאגנטים (חרוזים, אצטוניטריל, DMSO), את הקצה ההתחלתי של פיפטות P20/P50 ו- P300, ולהתחיל היטב בלוח העמוק במודול המגנטי. כל מדגם תקציר BSA מכיל כ 120 μL של נפח העיכול, אשר יהיה aliquoted לשני משוכפלים טכניים עם 55 μL בכל שכפול. כדי לנקות חצי מהתקציר בלבד, שנה את משתנה המספר המשוכפל ל- 1. - העלה את קובץ ה- Script לכרטיסיה פרוטוקול ביישום Opentrons .
- מקם את תוכנות המעבדה והפיפטות הנדרשות במיקום המתאים בחפיסת OT-2 שצוינה בתסריט של פייתון (איור 3). ודא שהמודול המגנטי מופעל ומחובר לרובוט. מניחים צלחת באר חדשה בעומק 96 מ"ל (ראו טבלת חומרים) על החלק העליון של המודול המגנטי.
- פתח את הכרטיסיה CALIBRATE ובצע כיול עבור השילוב של תוכנות מעבדה ופיפטות הנדרשות בקובץ Script זה של Python.
הערה: כיול עבור אותם שילובי תוכנות מעבדה ופיפטה צריך להתבצע פעם אחת בלבד, ואפליקציית Opentrons תתעד את פרמטרי הכיול. - מקם את הדגימות המעוכלות (supernatant שנאסף בשלב 3.1) למתלה צינור 2.0 מ"ל בסדר האנכי בבארות A1, B1....
- הכן 15 מ"ל של אצטוניטריל תואם LC-MS / MS בצינור חרוטי 50 מ"ל ומקם את הצינור בבאר A3 בארון הצינורות 4 ב-1 עם מחזיק צינור 15 מ"ל + 50 מ"ל.
- הכן 5 מ"ל של 2% DMSO על ידי הוספת 100 μL DMSO עם 4.9 מ"ל מסה ספקטרומטרית כיתה מים בצינור חרוטי 15 מ"ל. מניחים את הצינור בבאר A1 במתלה צינור 15mL + 50mL.
- לתייג צינור חרוטי ריק 50 מ"ל כמו פסולת ולהניח אותו בבאר B3 בארון צינור 15mL + 50mL.
- הכן את חרוזי SP3 בעקבות Reference16.
- הכן כמות מתאימה של חרוזים מעורבים בצינור מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"ל.
הערה: כל תגובת ניקוי פפטיד דורשת 10 μL של חרוזים מעורבים. לדוגמה, להכין מינימום של 40 μL של חרוזים מעורבים עבור ארבע תגובות ניקוי. - תן לתערובת החרוזים לשבת על העמדה המגנטית במשך 2 דקות. הסר את supernatant בזהירות עם פיפטה ולמדוד את הנפח של supernatant עם פיפטה.
- חשב את הנפח הנותר של חרוזים ולהוסיף 5-10 פעמים את המים כיתה ספקטרומטר המסה (למשל, 100-200 μL מים עבור 20 μL של חרוזים) ומערבולת (מהירות 10) עבור 10 s. שב את החרוזים על הדוכן המגנטי במשך 2 דקות.
- חזור על מדרגות שטיפת מים במשך שלוש שטיפות בסך הכל.
- הזן מחדש את החרוזים הסופיים במים בדרגת MS לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם/ μL. הנח את החרוזים המגנטיים שנשטפו בבאר A6 במתלה הצינורות של 2.0 מ"ל.
הערה: החרוזים מומלץ resuspend בריכוז של 10 מיקרוגרם / μL16. במאמץ האופטימיזציה הנוכחי, הריכוז הסופי שונה ל 50 מיקרוגרם / μL כדי למזער את הנפח הכולל של תערובת חרוז-פפטיד-אצטוניטריל.
- הכן כמות מתאימה של חרוזים מעורבים בצינור מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"ל.
- ודא כי הרובוט מעביר 55 μL של דגימות מעוכלות לבארות בלוחות עמוק היטב על המודול המגנטי.
- ודא שפרוטוקול הרובוט מושהה ומציג את ההודעה: ודא שחרוזים מוכנים נטענו לתוך A6 מתוך ארון הצינורות של 2 מ"ל הממוקם בחריץ 4 לפני חידוש הפרוטוקול. מערבולת את החרוזים, ולאחר מכן בקצרה לסובב למטה במשך 5 s על צנטריפוגה ספסל מיני ומניחים את החרוזים בבאר A6 של מתלה צינור 2 מ"ל עם הכובע פתוח. היכונו בזמן שהרובוט מערבב את החרוזים 10 פעמים במשך חמישה סיבובים על ידי צנרת למעלה ולמטה.
הערה: הרובוט מעביר 10 μL של חרוזים לכל מדגם מתעכל בלוחות עמוקים היטב ואחריו חמש פעמים של ערבוב. - ודא כי הרובוט מעביר 1,292 μL של אצטוניטריל לכל באר ומיד מתערבב 10 פעמים על ידי צנרת למעלה ולמטה כדי להקל על פפטידים וחרוזים מחייבים.
הערה: כל העברה הושלמה על פני מספר סיבובים מכיוון שפיפטת P300 יכולה להעביר רק עד 300 μL בכל פעם. - ודא כי הרובוט מערבב את כל הדגימות חמש פעמים על ידי צנרת למעלה ולמטה בלוח עמוק היטב.
- חכה עד המודול המגנטי עוסק ודגימות הם דגירה על המודול במשך 2 דקות.
- היכונו בזמן שאיפה צינור ולחלק מהירויות מוגדרים להאט ב 25 μL /s מברירת המחדל של 150 μL / s.
הערה: הרובוט מסיר באיטיות את הסופר-נרטיב מכל באר ומשליך אותו בצינור הפסולת בזמן שהמודול המגנטי עוסק. - המתן עד שהשאיפה לצינורות ומהירויות החלוקה יוחזרו להגדרת ברירת המחדל. שימו לב שהמודול המגנטי מתנתק.
- ודא שהתוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: ודא שמכסה הצינור ACN כבוי. באופן ידני לפתוח את צינור האצטוניטריל ולהחזיר אותו למתלה הצינור. לחץ על חדש כדי להמשיך. ודא כי הרובוט מעביר 1 מ"ל של אצטוניטריל לשטוף כל מדגם ומיד מתערבב 10 פעמים.
- ודא כי הרובוט מערבב את כל הדגימות 10 פעמים כדי לשטוף את הדגימות.
- היכונו בזמן שהמודול המגנטי עוסק ודגר את הדגימות במשך 2 דקות.
- חכה עד שהרובוט ישנה את מהירות השאיפה לצינורות כדי להאט ולאט לאט מסיר את העל-טבעי ומחלק אותו בצינור הפסולת.
- שימו לב בזמן שהרובוט מדגיר את הדגימות במודול המגנטי למשך 60 שניות כדי לאפשר לאצטוניטריל שיורית להתאדות, ואז משנה את מהירויות השאיפה של השאיפה חזרה לברירת המחדל. שימו לב שהמודול המגנטי מתנתק.
- ודא שתוכנית הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: מערבולת DMSO שוב ופתיחת אותיות רישיות. מערבולת ידנית את 2% DMSO עבור 10 s ולהניח אותו בחזרה בבאר A1 במתלה צינור 15 מ"ל-50 מ"ל. לחץ על חדש כדי להמשיך.
- ודא כי הרובוט מעביר 80 μL של 2% DMSO לכל באר ומיד מתערבב 10 פעמים.
- ודא כי הרובוט מערבב את כל הדגימות 10 פעמים עבור חמישה סיבובים נוספים.
- היכונו בזמן שהמודול המגנטי עוסק ודגר את הדגימות במשך 2 דקות.
- שימו לב בזמן שהרובוט משנה את מהירות השאיפה של הפיפטה לאיטית (25 μL/s) ומעביר לאט לאט את הסופר-נרטיב לבארות ריקות בלוח העמוק.
- המתינו עד שהרובוט ידגר דגימות על המודול המגנטי למשך 2 דקות כדי להסיר חרוזים שיורית בדגימות.
- ודא שהתוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: מקם צינורות חדשים של 2 מ"ל בארון הצינורות של 2 מ"ל וודא שמספר הצינורות תואם למספר הכולל של הדגימות.
- מניחים את צינור המיקרו-צנטריפוגה הראשון של 2 מ"ל בבאר מיד לאחר דגימת התקציר הסופית של BSA. לחץ על חדש כדי להמשיך.
הערה: לדוגמה, שש דגימות התקציר של BSA שנבדקו בפרוטוקול זה נמצאות בבארות A1, B1, C1, D1, A2 ו- B2. לכן, הסט החדש של צינורות 2.0 מ"ל ממוקם בארות B3, C3, D3, ... וכן הלאה. - שימו לב בזמן שהרובוט מעביר 88 μL של דגימות מהבארות בצלחת העמוקה לסט החדש של צינורות 2.0 מ"ל.
הערה: אמצעי האחסון המועבר (1.1 x 80 μL) בפרוטוקול ממוטב כדי להבטיח שכל נפח הדגימה נשאף לטיפים. - היכונו בזמן שהרובוט משנה את מהירות השאיפה של פיפטה לברירת מחדל ומנתק את המודול המגנטי.
- ייבשו ידנית את הפפטידים המנוקים באידוי ואקום (ראו טבלת חומרים) והמשיכו לסעיף 5 או אחסנו דגימות מיובשות בטמפרטורה של -20 °C (60 °F).
4. הכנת דגימת טרשת נפוצה עם ליסאט חלבון של הלב האנושי (5 מ"ג / מ"ל) עם חרוזים פרמגנטיים SP3
- פתח את קובץ ה- Script של SP3_digestion.py Python וציין ערכים של משתנים במקטע התאמה אישית כאן בלבד.
הערה: המשתנים כוללים את מספר הדגימות ואת לשכפל, ריכוז המדגם, את נפח ריאגנטים (DTT, IAA, טריפסין, חרוזים, 100% ו 80% אתנול), DTT וזמן הדגירה IAA, קצה מתחיל עבור pipettes P20 /P50 ו P300, ומתחיל היטב בלוח עמוק היטב על המודול המגנטי. - בצע את השלבים 2.2-2.23 בסעיף 2 להכנת דגימת MS עם אלבומין סרום בקר חלבון יחיד לדגירה של DTT ו- IAA. עיינו באיור 1 להגדרת סיפון הרובוט בשלבים אלה.
- הכינו תערובת חרוזי SP3 טרייה (20 חרוזי μL לכל תגובת ניקוי) לניקוי חלבונים (כפי שצוין בשלב 3.10) במהלך שלבי הדגירה של DTT ו- IAA (שלבים 2.15 ו-2.19). מניחים את החרוזים בבאר D6 על מתלה צינור 2 מ"ל.
- ודא שהתוכנית של הרובוט מושהית עם ההודעה: פתח את כובעי הצינור. בטל באופן ידני את צינורות הדגימה בבלוק האלומיניום מעל מודול הטמפרטורה ולחץ על המשך כדי להמשיך.
- ודא כי הרובוט מעביר את כל הדגימות מצינורות 2.0 מ"ל ללוח חדש עמוק היטב על גבי המודול המגנטי.
- ודאו שהתוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: ודאו שחרוזים מוכנים נטענו ל-D6 של ארון הצינורות של 2 מ"ל הממוקם בחריץ 4 לפני חידוש הפרוטוקול. פתח את מכסה צינור החרוזים ולחץ על קורות חיים כדי להמשיך.
- שימו לב בזמן שהרובוט מעביר 20 μL של חרוזים לכל באר בצלחת העמוקה עם חמישה סיבובים של ערבוב של החרוזים וחמישה סיבובים של ערבוב של תערובת חרוזים מדגם.
- ודאו שהתוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: ודאו ש-100 אחוז אתנול נטען ל-A3 מתוך ארון הצינורות של 15 מ"ל-50 מ"ל הממוקם בחריץ 5 לפני חידוש הפרוטוקול. הכן 10-20 מ"ל של 100% אתנול (כלומר, 200 אתנול הוכחה, ראה טבלת חומרים) בצינור חרוטי 50 מ"ל ומניחים אותו בבאר A3 של המתלה. לחץ על חדש כדי להמשיך.
- היכונו בזמן שהרובוט מעביר 140 μL של 100% אתנול לכל באר בצלחת מיד ואחריו 10 סיבובים של ערבוב כדי להקל על כריכת הפפטידים לחרוזים.
- ודא כי הרובוט מערבב כל מדגם על ידי צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים בכל סיבוב עבור סך של חמישה סיבובים של ערבוב.
- היכונו בזמן שהמודול המגנטי עוסק ודגר את הדגימות במודול במשך 2 דקות.
- שימו לב בזמן שהרובוט משנה את מהירות הצנרת להאטה (25 μL/s) ושואף את הסופר-נרטיב מכל באר ומחלק אותו לצינור הפסולת.
- המתן עד שהרובוט ישנה את מהירות הצנרת בחזרה לברירת המחדל וינתק את המודול המגנטי.
- ודאו שהתוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: ודאו ש-80 אחוז אתנול נטען לתוך A4 מתוך ארון הצינורות של 15 מ"ל-50 מ"ל הממוקם בחריץ 5 לפני חידוש הפרוטוקול. הכן ידנית 20 מ"ל של 80% אתנול על ידי ערבוב 4 מ"ל של מים בדרגת MS עם 16 מ"ל של 100% אתנול (כלומר, 200 הוכחה). מניחים את האתנול 80% בבאר A4 בארון הצינורות. לחץ על חדש כדי להמשיך. ודא כי הרובוט מעביר 1 מ"ל של 80% אתנול לכל באר ומיד מתערבב 10 פעמים.
- שימו לב בזמן שהרובוט משנה את מהירות הצנרת לאיטית (25 μL/s), שואף את הסופר-נרטיב מכל באר, ומחלק לצינור הפסולת. המתן עד שהרובוט ישנה את מהירות הצנרת בחזרה לברירת המחדל וינתק את המודול המגנטי.
- פתח את המכסה של פתרון ABC כאשר התוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: פתח את המכסה בצינור ABC. לחץ על חדש כדי להמשיך. היכונו בזמן שהרובוט מנתק את המודול המגנטי, מעביר 250 μL של ABC לכל באר, ומיד מתערבב במשך 10 פעמים.
הערה: שלב זה הוא לשטוף את הדגימות עם ABC. - ודא כי הרובוט עוסק המודול המגנטי ודגר דגימות על המודול במשך 2 דקות.
- שימו לב בזמן שהרובוט משנה את מהירות הצנרת לאיטית (25 μL/s) ומעביר את הסופר-נרטיב מכל באר לצינור הפסולת. המתן עד הרובוט מעביר 100 μL של חיץ ABC לכל באר ומיד מתערבב במשך 10 פעמים.
- ודאו שתוכנית הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: ודאו שצינורות איסוף חדשים הוצבו בבלוק אלומיניום של 2.0 מ"ל לפני חידוש הפרוטוקול. מקם קבוצה חדשה של צינורות מיקרוצנטריפוגה דלת חלבון בבלוק האלומיניום מיד לאחר צינור הדגימה האחרון בתחילה בבלוק. לחץ על חדש כדי להמשיך. היכונו בזמן שהרובוט מעביר כל דגימה במאגר ABC לצינורות 2.0 מ"ל החדשים.
הערה: בדוק את הבארות והעבר ידנית כל דגימה שיורית לצינורות במידת הצורך. - הכן כמות מתאימה של טריפסין בדרגת MS (10 μL לכל מדגם) על ידי המסת 20 מיקרוגרם של טריפסין בדרגת MS במים בדרגת MS לריכוז סופי של 0.2 מיקרוגרם / μL כאשר תוכנית הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה: ודא שטריפסין (0.2 מיקרוגרם / μL) נטען ל- C6 של מתלה צינור 2 מ"ל הממוקם בחריץ 4 לפני חידוש הפרוטוקול. ודא כי הרובוט מעביר 10 μL של טריפסין לכל צינור מדגם, ואחריו חמישה סיבובים של ערבוב.
- עוטפים את כובעי צינור הדגימה בסרט פרפין, מעבירים את כל הדגימות למיקסר מבוקר טמפרטורה, ודוללים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 16-20 שעות עם רעידות של 1,000 סל"ד.
הערה: מומלץ לבצע את העיכול עם רעד של 1,000 סל"ד כדי למזער את המשקעים של החרוזים במהלך הדגירה הלילית.
5. ניקוי פפטיד באמצעות חרוזים פרמגנטיים SP3
- בצע את ההוראות בשלב 2, ניקוי פפטיד באמצעות חרוזים פרמגנטיים SP3.
6. כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה
- Resuspend BSA (שלבים 2-3) ו lysate הלב (שלב 4) פפטידים ב 0.1% חומצה פורמית על ידי הוספת 1 מ"ל LC-MS כיתה 99% חומצה פורמית במי MS לנפח כולל של 1 L.
זהירות: חומצה פורמית היא חומצה חזקה. זה מאכל מאוד לעיניים, לעור ולמערכת הנשימה. לטפל בזהירות תחת מכסה המנוע הכימי לובש PPE. - לכמת את ריכוז הפפטיד לאחר העיכול באמצעות ערכת בדיקת פפטיד כמותית17 ולהזריק 0.5 מיקרוגרם של תקציר BSA ו 1.5 מיקרוגרם של עיכול לב לניתוח LC-MS / MS.
- הגדר את תוכנית הכרומטוגרפיה הנוזלית לניתוח LC-MS/MS.
הערה: בהגדרה טיפוסית, ניתן לטעון תקצירי פפטיד בעמודת C18 הפוכה (חלקיק 3 מיקרומטר; 100 נקבוביות Å; 75 מיקרומטר x 150 מ"מ; ראה טבלת חומרים) באמצעות הפרמטרים המפורטים בקובץ משלים 2. - לרכוש נתוני פרוטאומיקה רובה ציד באמצעות ספקטרומטר מסה (ראה טבלת חומרים) באמצעות הפרמטרים המסופקים קובץ משלים 3.
- חפש במאגר החלבון זיהוי חלבונים.
- הורד והתקן את התוכנה הנדרשת, MaxQuant.
הערה: תוכנת MaxQuant (v.1.6.10.43) שימשה כאן לשלבים הבאים (ראה טבלת חומרים). - הורד את מסד הנתונים של פרוטאום אנושי שנאצר ממסד נתונים של רצף חלבונים באיכות גבוהה (UniProt/SwissProt) (ראה טבלת חומרים). לחץ על לחצן ההורדה ובחר FASTA (קנוני).
הערה: לחלופין, הורד FASTA (לא קנוני) כדי לכלול איזופורמים של חלבון של כל גן במסד הנתונים, אם תרצה. - בממשק התוכנה MaxQuant, ציין את קובץ FASTA שישמש כמסד נתונים של חלבונים על-ידי ניווט לחלונית Global Parameters ולחץ על הכרטיסיה רצפים ; לאחר מכן, לחץ על לחצן הוסף כדי לציין את נתיב הקובץ לקובץ FASTA.
- בממשק התוכנה של MaxQuant, ציין את קבצי ספקטרום המסה הגולמית שנרכשו שיש לנתח על-ידי מעבר ללוח Raw Data ולחיצה על לחצן טען ובחר את הקבצים הגולמיים.
- כוונן פרמטרי חיפוש כפי שמוצג בטבלה 1. אפשר כימות ללא תוויות (LFQ) במידת הצורך.
- המתן להשלמת החיפוש ואתר את מספר ההתאמות בספקטרום הפפטיד (PSMs) העוברות את סף ה- FDR של 1% בקובץ msms.txt בתיקיה /combined/txt.
הערה: בהשוואות שבוצעו כאן עבור סעיף התוצאות הייצוגיות, PSMs מופו לחלבונים מרובים סוננו החוצה, ו- PSMs הממופים לחלבון ייחודי אחד נשמרו כדי לספור את מספר ה- PSMs, הפפטידים והחלבונים (איור 4 ואיור 5).
- הורד והתקן את התוכנה הנדרשת, MaxQuant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שלושה סקריפטים Python מסופקים כאן התואמים לרובוט OT-2, ומבצעים הכנה מדגמית עבור פרוטאומיקה ספקטרומטרית מסה עם אלבומין סרום בקר סטנדרטי חלבון יחיד (טכני משכפל n = 5 עיכולים) ודגימת ליסט לב אנושי המכילה חומר ניקוי (n = 5 עיכולים). כל מוצר תקציר מחולק לשתי תגובות ניקוי פפטיד. מספר ההתאמות המזוהות בספקטרום הפפטיד (PSMs), הפפטידים והחלבונים בכל ריצה של דגימות ה-BSA והלב מוצג באיור 4 ובאיור 5. חציון של 728 PSMs ו 65 פפטידים זוהו עם מדגם BSA, עם 5.2% ו 3.2% מקדמי וריאציה (CV), בהתאמה. עם דגימת הלב המורכבת, זוהה חציון של 9,526 PSMs, 7,558 פפטידים ו-1,336 חלבונים ב-10 ריצות עם 7.6%, 5.9% ומקדם וריאציה של 3.6%. בסך הכל זוהו 1,935 חלבונים מ-10 ריצות של דגימת הלב, ובין אלה זוהו 1,677 חלבונים בשתי ריצות או יותר. כדי לקבוע את השונות בכימות פפטיד, קורות החיים של עוצמות כרומטוגרמה היון המופקת (XIC) חושבו עבור 10 פפטידים הממופים לחלבון ייחודי (טבלה 2). השונות של האדם (ביד pipetted) לעומת תוצאות ניסיוניות רובוט על מדידת ריכוז חלבון הושוו עוד יותר באמצעות שלוש דגימות חלבון סטנדרטיות עם בדיקת BCA. קורות החיים הממוצעים (7.57%) של בדיקת BCA רובוט נמצא נמוך יותר מאשר בדיקת BCA הידנית האנושית (9.22%) (טבלה משלימה 1).
הפרוטוקול המתואר הראה ביצועים עקביים לאורך זמן כאשר פרוטוקול העיכול BSA בוצע בהפרש של חודשיים והפיק תוצאות דומות. המספר החציוני של PSMs ופפטידים ייחודיים באיור 2 הוא 728 ו-65, בהתאמה. אותם ניסויים שבוצעו במערכת OT-2 חודשיים לפני כן יצרו בממוצע 647 PSMs ו-54 פפטידים (n = 2) (טבלה משלימה 2). ניתן להעריך את היציבות לטווח ארוך באופן דומה.
זמן עיבוד הספסל הידני (זמן הדגירה אינו כלול) מחושב בין פרוטוקול הרובוט לעיבוד אנושי18 לכל הכנת מדגם. עם פרוטוקול העיכול ללא הסרת חומר ניקוי ואחריו התפלת פפטיד, זמן העיבוד הידני הוא 41 דקות עם המערכת הרובוטית לעומת 61 דקות ביד. עם הסרת חומרי ניקוי, עיכול ופרוטוקול התפלת פפטיד, זמן העיבוד הידני הוא 54 דקות עם המערכת הרובוטית לעומת 79 דקות ביד. לכן, הפרוטוקול האוטומטי למחצה מפחית כ 20-25 דקות של זמן עיבוד ספסל מעשי לכל מדגם. הפחתת זמן זו הופכת ניכרת כאשר דגימות רבות מעובדות ועשויות להשתפר עוד יותר כאשר נעשה שימוש ברובוטי OT-2 מרובים במקביל.
איור 1: זרימת עבודה סכמטית. חלבונים המופקים בסיוע דטרגנט ידרשו עיבוד עם שלב נוסף של הסרת חומרי ניקוי לפני העיכול. דגימות חלבון מתעכלות, ופפטידים מותפלים במערכת הרובוטית OT-2. תקצירי הפפטיד מוזרקים לספקטרומטר מסה Q-Exactive HF בשילוב עם ננו-LC. ספקטרום טרשת נפוצה נערך חיפוש מול מסד נתונים של חלבונים לזיהוי חלבונים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סיפון רובוטים המיועד לעיכול חלבונים. המיקומים שצוינו של מתלים קצה, דוגמאות, אשפה, מודול טמפרטורה, מודול טמפרטורה, מודול מגנטי מוצגים. כוכביות מציינות תוכנות מעבדה ורגנטים הנדרשים רק לפרוטוקול העיכול עם שלבי הסרת חומרי ניקוי. תיבות עם מספרים מציינות עמדות סיפון לא תפוסות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סיפון רובוטים מוכן לתסריט לניקוי פפטיד. המיקומים שצוינו של מתלים, דגימות, אשפה ומודול מגנטי מוצגים. תיבות עם מספרים מציינות עמדות סיפון לא תפוסות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מספר ההתאמות בספקטרום הפפטיד (PSMs) ופפטידים שזוהו בעיכול של חלבון BSA (n = 5). כל תקציר חולק לשניים לניקוי פפטיד טכני (R1 ו- R2). מקדם וריאציות: 5.2% עבור PSMs; 3.2% לפפטידים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מספר ה-PSMs, הפפטידים והחלבונים שזוהו מליסט לב אנושי. חמישה עיכולים בוצעו עם הסרת אבקת SP3. כל תקציר חולק לשניים לניקוי פפטיד (R1 ו- R2). מקדמי וריאציה: 7.6% עבור PSMs; 5.9% לפפטידים; 3.6% לחלבונים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| אנזים עיכול | טריפסין/P |
| מחשוף מקסימאלי החמיץ | 2 |
| שינוי קבוע | קרבמידומומתילציה של ציסטאין |
| שינוי משתנה | אצטילציה חלבון N-מסוף; חמצון מתיונין |
| טווח אורך פפטיד | 7 – 25 aa |
| הקדמת סובלנות המונית | ± 4.5 עמודים לדקה |
| עמידות המונית של יונים טרשת נפוצה/טרשת נפוצה | ± 20 עמודים לדקה |
| כימות ללא תוויות | LFQ |
| שיעור גילוי כוזב (FDR) להתאמת ספקטרום פפטיד (PSM) | 0.01 |
טבלה 1: פרמטרי החיפוש של מסד הנתונים של פפטיד (MaxQuant).
| פפטיד | מזהה חלבון | פפ | עוצמת XIC חציונית | CV | |
| LSTSQIPQSQIR | רבעון 92523 | 7.72E-08 | 1.96E+07 | 6.70% | |
| SEDFSLPAYMDR | P13073 | 9.64E-17 | 8.05E+08 | 7.30% | |
| YLQEIYNSNNQK | P02679 | 2.76E-23 | 9.69E+08 | 7.60% | |
| TDDCHPWVLPVVK | P17174 | 4.51E-14 | 4.60E+08 | 8.60% | |
| VIVVGNPANTNCLTASK | P40925 | 7.90E-29 | 1.17E+09 | 8.70% | |
| DYIWNTLNSGR | O75390 | 1.63E-15 | 1.38E+08 | 8.80% | |
| VSVPTHPEAVGDASLTVVK | P13611 | 1.86E-09 | 6.77E+07 | 9.10% | |
| QVAEQFLNMR | עמ' 22695 | 3.25E-08 | 1.09E+08 | 9.30% | |
| NTFWDVDGSMVPPEWHR | Q9UI09 | 2.05E-11 | 4.00E+07 | 9.60% | |
| SASDLTWDNLK | P02787 | 5.29E-11 | 1.92E+09 | 9.80% | |
טבלה 2: כימות עוצמת כרומטוגרמה יונים (XIC) שחולצו של 10 פפטידים.
טבלה משלימה 1: השוואה של בדיקות BCA ידניות ואוטומטיות. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה משלימה 2: עיכול BSA בוצע בהפרש של חודשיים מהדגימות המעובדות באיור 4. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
קובץ משלים 1: עותק של סקריפטים פייתון שפותחו. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: פרמטרי שיטה עבור תוכנית הכרומטוגרפיה הנוזלית לניתוח LC-MS / MS. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 3: פרמטרי שיטה עבור acquiring רובה פרוטאומיקס נתונים באמצעות ספקטרומטר מסה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול
לקבלת הביצועים הטובים ביותר, יש להשתמש בתוכנות מעבדה מאומתות של Opentrons, מודולים וחומרים מתכלים התואמים ל- OT-2. תוכנות מעבדה מותאמות אישית ניתן ליצור בעקבות ההוראה של Opentrons ב Reference14. הקפד לכייל את סיפון OT-2, פיפטות, ו labware בעת שימוש בפעם הראשונה. זה גם קריטי לעקוב אחר הנחיות מיצרן חרוזי SP3 כדי להכין חרוזים לניקוי פפטיד וחלבון. ראוי לציין, במהלך תגובת מחייב חרוז ופפטיד, נפח האצטוניטריל בתגובה המחייבת צריך להיות ≥95%, וריכוז החרוזים צריך להיות ≥0.1 מיקרוגרם / μL. שמור על ריכוז הפפטיד בטווח של 10 מיקרוגרם / מ"ל - 5 מ"ג / מ"ל. עם הפרמטרים הממוטבים בתסריט ניקוי הפפטיד כאן, יחס נפח האצטוניטריל הוא 95%, ריכוז החרוזים הוא 0.37 מיקרוגרם / μL, וריכוז הפפטיד הוא בטווח של 14-37 מיקרוגרם / מ"ל. מסת הפפטידים מוערכת להיות 40-100 מיקרוגרם ב 100 μL של תגובת עיכול מהניסיון שלנו. לניקוי חלבון SP3, 5-10 מיקרוגרם של חרוזים ל 1 מיקרוגרם של חלבון שימש והבטיח כי ריכוז החרוזים המינימלי הוא 0.5 מיקרוגרם / μL במהלך חלבון מחייב. ריכוז החלבון המומלץ הוא בטווח של 10 מיקרוגרם / מ"ל -5 מ"ג / מ"ל. עם פרמטר ברירת המחדל בתסריט שסופק, 1 מ"ג של חרוזים משמש עבור 100 חלבון מיקרוגרם, ואת ריכוז החרוזים במהלך כריכה הוא 3.75 מיקרוגרם / μL, ואילו ריכוז החלבון הוא 0.35 מ"ג / מ"ל.
שינויים ופתרון בעיות
משתני ברירת המחדל בסקריפטים של Python ממוטבים לזרימות עבודה סטנדרטיות במעבדה שלנו. משתמשים צריכים להתאים את המשתנים כדי להפוך את קבצי ה- Script לתואמים ליישומים שלהם במידת הצורך. אם נצפתה עוצמת טרשת נפוצה נמוכה, בדוק אם יש חלבון או אובדן פפטיד לאחר כל מקטע פרוטוקול משמעותי עם בדיקת חלבון BCA ובדיקת פפטיד כמותית. בעת שימוש בפרוטוקול על OT-2 בפעם הראשונה, לבחון טיפול רובוט עבור כל שלב כדי להבטיח הרובוט מבצע נהלים כצפוי. בזמן הכתיבה, פיפטה אלקטרונית P50 כבר לא זמין בחנות Opentrons. קובץ ה- Script הנוכחי שונה כדי לציין היכן ניתן להשתמש בפיפטה P20 במקומה. משתמשים עשויים לעיין ב- API של Opentrons כדי לשנות את קבצי ה- Script לשימוש בפיפטות אחרות, במידת הצורך.
מגבלות הטכניקה
למרות היתרונות של שימוש במערכת טיפול בנוזל רובוטי, יש לנקוט זהירות בביצועים של העברת נוזלים בין משוכפלים טכניים. ניטור הרובוט במהלך ההתקנה הראשונית ושלבי הטיפול בנוזל מומלץ מאוד. לאחר העברת הנוזל הרובוטי, התאוששות ידנית של כמויות שיורית עשוי להידרש כדי למנוע אובדן מדגם ולהפחית את השונות.
משמעות ביחס לשיטות קיימות
פרוטוקול זה מתאר שיטת הכנת מדגם מבוססת ספקטרומטריית מסה אוטומטית למחצה באמצעות רובוט טיפול בנוזל OT-2 בעלות נמוכה וקוד פתוח. לאחרונה, עבודות אחרות החלו גם להשתמש OT-2 כלפי יישומי פרוטאומיקה11. בהשוואה לשיטות הקיימות, מאפיינים ייחודיים של פרוטוקול זה כוללים שימוש ברובוט זול יחסית, הניתן לתכנות פייתון; שילוב של חרוזי SP3 אוטומטיים למחצה בשני שלבים בפרוטוקולי הכנת המדגם, כלומר, שלב הסרת חומרי הניקוי מדגם החלבון וצעד התפלה / ניקוי פפטיד; כמו גם הזמינות של סקריפטים פייתון קוד פתוח כדי לתמוך בפיתוח נוסף. חרוזים פרמגנטיים SP3 קושרים חלבונים ופפטידים ביעילות ושולבו עם מערכות טיפול אוטומטיות בנוזלים לקראת יישומים בהסרת חלבון ניקוי/דטרגנט לפני עיכול אנזימטי בהכנת דגימת טרשת נפוצה1,13.
שלושה תסריטי פייתון בקוד פתוח מסופקים יחד עם פרוטוקול זה לחוקרים. הסקריפטים ניתנים להתאמה אישית עבור תנאי ניסוי בודדים (למשל, מספר מדגם, מספר משוכפל, טמפרטורת הדגירה וזמן וכו ') ומאפשרים פיתוח נוסף עבור זרימות עבודה שהשתנו. הפרוטוקולים העניקו קורות חיים טכניים מצוינים של 3%-6% במספר הפפטידים ו/או זיהוי החלבון בין פועלי טרשת נפוצה במעבדה שלנו, בדומה לעבודה קודמת על מערכות טיפול בנוזלים אחרות (<20%)9,11.
יישומים עתידיים
פרוטוקול זה מדגים את התועלת של מערכת טיפול בנוזלים הניתנת לתכנות בעלות נמוכה בשילוב עם חרוזי SP3 להכנת מדגם פרוטאומיקה אוטומטית למחצה, אשר יכול להיות ישים באופן פוטנציאלי למעבדות ספקטרומטריית מסה ומתקני ליבה כדי לשפר את היעילות של עיבוד מדגם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין קונפליקטים להצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי פרסי NIH F32-HL14919191 ל- YH; R00-HL144829 לאל על; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 ל- MPL. איור 1, איור 2, איור 3 נוצרים בעזרת כלי איור מדעי מבוסס אינטרנט, BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
References
- Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
- Yeung, Y. -G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
- Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
- Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
- Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
- van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
- Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).
- Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
- Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
- Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
- Web URL. , Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021).
- Web URL. , Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021).
- Web URL. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021).
- Web URL. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021).
- Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).
