Automatisierte zweidimensionale raumzeitliche Analyse mobiler Einzelmolekül-FRET-Sonden

Summary

Dieser Artikel stellt eine Methode zur raumzeitlichen Analyse von mobilen, einzelmolekularen Förster-Resonanz-Energietransfer-basierten (smFRET)-basierten Sonden mittels Weitfeldfluoreszenzmikroskopie vor. Das neu entwickelte Software-Toolkit ermöglicht die Bestimmung von smFRET-Zeitspuren bewegter Sonden, einschließlich der korrekten FRET-Effizienz und der molekularen Positionen, als Funktionen der Zeit.

Abstract

Der Einzelmolekül-Förster-Resonanz-Energietransfer (smFRET) ist eine vielseitige Technik, die Entfernungen im Sub-Nanometer- bis Nanometer-Bereich meldet. Es wurde in einer Vielzahl von biophysikalischen und molekularbiologischen Experimenten eingesetzt, einschließlich der Messung molekularer Kräfte, der Charakterisierung der Konformationsdynamik von Biomolekülen, der Beobachtung der intrazellulären Kolokalisierung von Proteinen und der Bestimmung von Rezeptor-Liganden-Interaktionszeiten. In einer Weitfeldmikroskopiekonfiguration werden Experimente typischerweise mit oberflächenimmobilisierten Sonden durchgeführt. Hier wird eine Methode vorgestellt, die Einzelmolekül-Tracking mit alternierenden Anregungsexperimenten (ALEX) smFRET-Experimenten kombiniert und die Erfassung von smFRET-Zeitspuren von oberflächengebundenen, aber mobilen Sonden in Plasmamembranen oder glasgestützten Lipiddoppelschichten ermöglicht. Für die Analyse der aufgezeichneten Daten wurde eine automatisierte Open-Source-Softwaresammlung entwickelt, die (i) die Lokalisierung von Fluoreszenzsignalen, (ii) die Verfolgung einzelner Partikel, (iii) die Bestimmung von FRET-bezogenen Größen einschließlich Korrekturfaktoren, (iv) die strenge Verifizierung von smFRET-Spuren und (v) die intuitive Darstellung der Ergebnisse unterstützt. Die generierten Daten können bequem als Input für die weitere Exploration über spezielle Software verwendet werden, z.B. zur Beurteilung des Diffusionsverhaltens von Sonden oder zur Untersuchung von FRET-Übergängen.

Introduction

Der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist ein wichtiger Treiber in der molekularbiologischen und biophysikalischen Forschung, da er die Untersuchung von Prozessen mit Sub-Nanometer-Auflösung ermöglicht. Da die Effizienz des Energietransfers zwischen Donor- und Akzeptorfluorophoren stark vom Interfarbstoffabstand im Sub-Nanometer- bis Nanometer-Bereich abhängt, wurde es effektiv als spektroskopisches Lineal zur Untersuchung der statischen und dynamischen Konformation von Biomolekülen eingesetzt1,2,3,4. Darüber hinaus wurde das FRET-Phänomen in großem Umfang für Kolokalisationsstudien von membranassoziierten und intrazellulären Proteinen auf Bulk-Ebene ^verwendet5,6. In den letzten zwei Jahrzehnten wurde die Methode für die Überwachung von smFRET-Ereignissen7 angepasst, was dazu beitrug, die zeitliche und räumliche Auflösung erheblich zu erhöhen und selbst seltene Subpopulationen in heterogenen Proben aufzulösen. Ausgestattet mit diesen Techniken wurden einzigartige Einblicke in die Dynamik molekularer Maschinen gewonnen, wie die Transkriptverarbeitungsrate der RNA-Polymerase ^II8, die Replikationsgeschwindigkeit von DNA-Polymerasen9,10, die Nukleosomen-Translokationsrate11, die Transkript-Spleiß- und Stillstandsrate von zusammengesetzten Spleißosomen12, die Aktivität von ribosomalen Subpopulationen13 und die Gehgeschwindigkeit von Kinesinmotoren14 , um nur einige zu nennen. Die Dauer der Rezeptor-Liganden-Interaktion15 und die molekularen ^Kräfte16 wurden quantifiziert.

Intensitätsbasierte smFRET-Studien stützen sich typischerweise auf sensibilisierte Emissionen, um die FRET-Effizienz zu messen: Ein Strahlteiler im Emissionspfad trennt bei Donoranregung räumlich Licht, das von Donor- und Akzeptorfluorophoren stammt, was die Quantifizierung einzelner Fluoreszenzintensitäten ermöglicht. Der Wirkungsgrad kann anschließend als Bruchteil der vom Akzeptor emittierten Photonen in Bezug auf die Gesamtphotonenzahl berechnet ^werden17. Darüber hinaus ermöglicht die Akzeptoranregung nach Donoranregung (ALEX) die Messung der Stöchiometrie der FRET-Ereignisse, was die Unterscheidung zwischen echten low FRET-Signalen von Signalen unterstützt, die z.B. von Sonden mit einem photogebleichten Akzeptor ^fluorophor18 auftreten.

Einzelmolekül-FRET-Experimente werden üblicherweise auf eine von zwei Arten durchgeführt. Zunächst wird ein kleiner Bereich im Probenvolumen mit einem konfokalen Mikroskop beleuchtet. Einzelne Sondenmoleküle in Lösung werden angeregt, wenn sie innerhalb des Brennvolumens diffundieren. Mit dieser Technik können schnelle Photonenzähldetektoren verwendet werden, die eine Zeitauflösung im Submikrosekundenbereich ermöglichen. Zweitens werden Sonden speziell auf Oberflächen immobilisiert und über die Weitfeldmikroskopie überwacht, wobei häufig eine TIR-Konfiguration (Total Internal Reflection) verwendet wird, um die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren. Die Sondenimmobilisierung ermöglicht viel längere Aufnahmezeiten als mit dem ersten Ansatz. Zudem erlaubt das größere Sichtfeld die parallele Überwachung mehrerer Sonden. Die Notwendigkeit einer Kamera macht diese Methode im Vergleich zu der oben beschriebenen langsam. Die Zeitauflösung ist auf den Millisekunden- bis Sekundenbereich beschränkt.

Werden Langzeitspuren benötigt, z.B. um dynamische Prozesse auf einer Millisekunden- bis Sekundenskala zu untersuchen, ist die erste Methode nicht anwendbar, da die Fluoreszenzausbrüche typischerweise zu kurz sind. Der zweite Ansatz scheitert immer dann, wenn eine Immobilisierung nicht möglich ist, z.B. in Lebendzellexperimenten mit Sonden, die innerhalb der Zellmembran diffundieren. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass biologische Modellsysteme ihre Reaktion in Abhängigkeit von der Mobilität der kontaktierten Oberfläche dramatisch variieren ^können16.

Während in der Vergangenheit kombinierte smFRET- und Einzelpartikel-Tracking-Experimente zur Aufzeichnung mobiler FRET-Sonden durchgeführt ^wurden19, gibt es keine öffentlich verfügbare Software für die Auswertung der Daten. Dies führte zur Entwicklung einer neuen Analyseplattform, die die Bestimmung mehrerer Eigenschaften mobiler Fluoreszenzsonden ermöglicht, einschließlich smFRET-Effizienz und Stöchiometrie, Positionen mit Subpixelgenauigkeit und Fluoreszenzintensitäten als Zeitfunktionen. Methoden zur Filterung der resultierenden Spuren durch untersuchung des schrittweisen Bleichverhaltens, der Abstände des nächsten Nachbarn, der Emissionsintensitäten und anderer Merkmale wurden etabliert, um ausschließlich korrekt synthetisierte und funktionelle Einzelsondenmoleküle auszuwählen. Die Software unterstützt auch experimentelle und analytische Techniken, die kürzlich in einer Mehrlaborstudie vereinbart wurden, um zuverlässige, quantitative smFRET-Daten zu ^{produzieren17}. Insbesondere hält sich die Implementierung an die validierten Verfahren zur Berechnung der FRET-Effizienz und Stöchiometrie. Für die Berechnung des scheinbaren FRET-Wirkungsgrades _Eapp mit Eq (1) werden Fluoreszenzintensitäten bei Donoranregung im Donoremissionskanal _IDD und Akzeptor-Emissionskanal _IDA verwendet.

(1)

Mit Hilfe der Fluoreszenzintensität im Akzeptoremissionskanal bei Akzeptoranregung IAA wird die scheinbare Stöchiometrie mit Eq (2) berechnet.

(2)

Der FRET-Wirkungsgrad E und die Stöchiometrie S können aus Eapp und Sapp unter Berücksichtigung von vier Korrekturfaktoren abgeleitet werden.

α beschreibt das Austreten der Donorfluoreszenz in den Akzeptoremissionskanal und kann unter Verwendung einer Probe, die nur Donorfluorophore enthält, oder durch Analyse von Teilen von Trajektorien, in denen der Akzeptor gebleicht wurde, bestimmt werden. δ korrigiert die direkte Anregung des Akzeptors durch die Donoranregungslichtquelle und kann mit einer Probe mit nur Akzeptorfluorophoren oder durch Analyse von Teilen von Trajektorien, in denen der Spender gebleicht wurde, gemessen werden.

.

γ Skaliert _IDD, um divergierende Detektionseffizienzen in Donor- und Akzeptoremissionskanälen und unterschiedliche Quantenwirkungsgrade der Fluorophore zu korrigieren. Der Faktor kann berechnet werden, indem die Zunahme der Donorintensität beim Akzeptorbleichen in Trajektorien mit hoher ^{FRET-Effizienz20} analysiert wird oder indem eine Probe mit mehreren diskreten FRET-Zuständen untersucht wird.

β skaliert IAA, um unterschiedliche Wirkungsgrade der Donor- und Akzeptorerregung zu korrigieren. Wenn γ mittels Akzeptorbleichanalyse bestimmt würde, könnte β aus einer Stichprobe des bekannten Donor-zu-Akzeptor-Verhältnisses berechnet ^werden21. Andernfalls liefert die Mehrzustands-FRET-Probe auch β.

Zusammen ermöglichen die Korrekturen die Berechnung des korrigierten FRET-Wirkungsgrades mit Eq (3).

(3)

und die korrigierte Stöchiometrie mit Eq (4).

(4)

Idealerweise ergibt die korrigierte Stöchiometrie für ein Donor-zu-Akzeptor-Verhältnis von 1:1 S = 0,5. In der Praxis erzeugt ein reduziertes Signal-Rausch-Verhältnis eine Streuung der Messwerte von S, was die Unterscheidung von reinen Donorsignalen (S = 1) und reinen Akzeptorsignalen (S = 0) behindert. Die resultierenden Zeitspuren können als Eingabe für eine detailliertere Analyse der Einzelmolekültrajektorien verwendet werden, um Informationen wie raumzeitliche ^{Kraftprofile16}, die Mobilität der ^{Einzelmolekülereignisse22} oder die Übergangskinetik zwischen verschiedenen ^Zuständen1 zu erhalten.

Das folgende Protokoll beschreibt experimentelle Parameter und Verfahren für smFRET-Tracking-Experimente sowie das Arbeitsprinzip der Datenanalyse mit der neu entwickelten Software-Suite. Für die Erfassung experimenteller Daten wird empfohlen, einen Mikroskopieaufbau zu verwenden, der die folgenden Anforderungen erfüllt: i) Fähigkeit, die Emission einzelner Farbstoffmoleküle nachzuweisen; ii) Weitfeldbeleuchtung: Insbesondere für Experimente mit lebenden Zellen wird die Konfiguration der inneren Totalreflexion (^TIR23,24,25) empfohlen; iii) räumliche Trennung des Emissionslichts nach Wellenlänge, so dass die Donor- und Akzeptorfluoreszenz auf verschiedene Bereiche desselben ^{Kamerachips25} oder verschiedener Kameras projiziert wird; iv) Modulation von Lichtquellen zur Donor- und Akzeptoranregung mit Millisekundengenauigkeit, z.B. mit direkt modulierbaren Lasern oder Modulation über akusto-optische Modulatoren. Dies ermöglicht eine stroboskopische Beleuchtung, um das Photobleichen von Fluorophoren sowie die abwechselnde Anregung zur Bestimmung von Stöchiometrien zu minimieren. v) Ausgabe einer Datei pro aufgezeichneter Bildsequenz in einem Format, das vom PIMS-Python-Paket ^{gelesen werden kann26}. Insbesondere werden mehrseitige TIFF-Dateien unterstützt.

Protocol

1. Softwarevoraussetzungen

1. Installieren Sie die miniconda ^{Python-Distribution27} (mindestens erforderliche Python-Version: 3.7).
2. Öffnen Sie eine Anaconda-Eingabeaufforderung im Windows-Startmenü oder öffnen Sie ein Terminal und führen Sie conda activate aus, wenn Sie Linux oder macOS verwenden.
3. Aktivieren Sie das von der Community gepflegte conda-forge-Paket ^repository28 , indem Sie die folgenden Befehle ausführen:
   conda config --add channels conda-forge
   conda config --set channel_priority strict
   conda update --all
4. Installieren Sie die erforderlichen Python-Pakete, indem Sie Folgendes ausführen:
   conda install opencv trackpy lmfit ipympl scikit-learn pyqt sdt-python jupyterlab
5. Machen Sie sich mit JupyterLab, der Benutzeroberfläche der Analysesoftware, vertraut (siehe ^{Softwaredokumentation29}).
6. Installieren Sie das Git-Versionskontrollsystem , das später zum Herunterladen und Aktualisieren der Analysesoftware verwendet wird. Wenn Sie Linux verwenden, verwenden Sie die Paketverwaltungssoftware der Distribution zum Herunterladen und Aktualisieren. Andernfalls führen Sie Folgendes aus:
   conda installieren git
7. Installieren Sie optional das Sidecar-Python-Paket, um Datensätze nach Filterschritten während der Analyse anzuzeigen:
   Conda installieren Beiwagen

2. Messung von Proben

Abbildung 1: Bilderfassung. (A) Erregungssequenz. Nach der Aufnahme eines optionalen Bildes einer farbstoffbeladenen Zelle mit dem 405-nm-Laser werden Donor und Akzeptor abwechselnd und wiederholt für die Beleuchtungszeit mit 532 nm bzw. 640 nm Lasern angeregt. Die Zeitspanne _{zwischen Spender}- und Akzeptorerregung muß lang genug sein, um die Bildauslesung durch die Kamera zu ermöglichen. Die Verzögerungszeit kann verwendet werden, um die Erfassungsbildrate und damit die Beobachtungszeitspanne vor dem Photobleichen anzupassen. Dieses Panel wurde von ¹⁶ geändert. (B) Für die Berechnung der Koordinatentransformationen zwischen den beiden Emissionskanälen werden Fiducialmarker verwendet. Passende Fiducials sind farblich gekennzeichnet. Es sollten mehrere verschobene Bilder aufgenommen werden, um sicherzustellen, dass das gesamte Sichtfeld abgedeckt ist. (C) Laserprofile zur Flachfeldkorrektur werden mit einer dicht beschrifteten Probe aufgezeichnet. Das Akzeptorprofil wird aufgezeichnet und photogebleicht, gefolgt von der Erfassung des Spenderprofils. Mehrere Bilder sollten in verschiedenen Probenbereichen aufgenommen, gemittelt und geglättet werden, um den Einfluss von Probenunvollkommenheiten (z. B. der helle Fleck in der Mitte des Bildes) zu mildern. (D) Flatfield-Korrekturkarte p(x,y), berechnet aus 20 Laserprofilen, die wie in C beschrieben aufgezeichnet wurden. Abkürzungen: FRET = Förster Resonanzenergieübertragung; ImDD = Donoremissionsbild bei Donoranregung; ImDA = Akzeptor-Emissionsbild bei Donoranregung; ImAA = Akzeptor-Emissionsbild bei Donoranregung. Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Wenn Sie eine EMCCD-Kamera (Electron-Multiplying Charge-Coupled Device) verwenden, ermöglichen Sie der EM-Verstärkung, Einzelmolekülsignale bei hohen Signal-Rausch-Verhältnissen zu beobachten (siehe Anweisungen des Herstellers).
2. Anregungssequenz (siehe Abbildung 1A für weitere Details).
   1. Zeichnen Sie optional ein Bild zur Segmentierung auf, um die Datenanalyse auf bestimmte Bereiche im Sichtfeld zu beschränken. Zum Beispiel regen Sie Fura-2-geladene Zellen mit einem 405-nm-Laser an und erfassen ihre Emission um 510 nm, um nur Sonden zu bewerten, die sich in Grenzflächen zwischen Zellen und unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs) befinden. Warten Sie daher auf die Zeit_{, um die} Kameraauslesung zuzulassen.
      HINWEIS: Bei EMCCD-Kameras hängt tr von der Anzahl der Leitungen in der gewählten Region of Interest (ROI) ab. Daher kann die Wahl eines kleinen ROI von Vorteil sein, da er die Verzögerung zwischen den Frames und der Größe der aufgezeichneten Daten reduziert. Darüber hinaus ermöglicht die Aktivierung des Frame-Transfer-Modus eine weitere Reduzierung der tr.
   2. Erregen Sie abwechselnd Spender- und Akzeptorfluorophore wiederholt.
      1. Regen Sie den Spender für eine Beleuchtungszeit an ₍5-10 ms sind in der Regel kurz genug, um Bewegungsunschärfe zu vermeiden) und lösen Sie gleichzeitig die Kamera aus.
      2. Warten Sie, _bis die Kamera ausgelesen wird.
      3. Erregen Sie den Akzeptor, während Sie die Kamera auslösen.
      4. Warten Sie auf eine Zeit _tdelay.
         HINWEIS: Dies muss länger als tr sein, um das Auslesen durch die Kamera zu ermöglichen, kann aber ansonsten beliebig gewählt werden. Er muss die Anforderungen an die Zeitauflösung und die Leiterbahnlänge ausgleichen.
      5. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2.1-2.2.2.4. Wählen Sie die Anzahl der Wiederholungen, die groß genug ist, um das Photobleichen von mindestens einem Fluorophor pro Sonde innerhalb des Sichtfelds sicherzustellen, was eine schrittweise Photobleichanalyse zur Unterscheidung von Einzelmolekülsignalen aus Aggregaten ermöglicht.
         HINWEIS: Die Auswahl geeigneter Till- und Anregungslaserintensitäten erfordert in der Regel einige Experimente: Je länger die Beleuchtungszeiten und je höher die Laserintensitäten, desto besser ist das Signal-Rausch-Verhältnis in den resultierenden Bildern, aber desto kürzer sind die resultierenden Zeitspuren.
3. Nehmen Sie eine ausreichende Anzahl von Filmen für jedes Sample auf.

3. Zusätzliche Messungen zur Bestimmung von Korrekturfaktoren

1. Zeichnen Sie eine Reihe von zufällig platzierten Fiducialmarkern auf, die in beiden Emissionskanälen für die Bildregistrierung sichtbar sind (d. H. Finden der Transformation, die die Koordinaten des Donoremissionskanals auf den Akzeptor-Emissionskanal und umgekehrt abbildet). Siehe Abbildung 1B.
   HINWEIS: Die Bildregistrierung wird von der Software durchgeführt. siehe Schritt 6.1.4.
2. Messen Sie das Intensitätsprofil für Donor- und Akzeptor-Anregungslichtquellen zur Flachfeldkorrektur (d. h. Korrektur der inhomogenen Anregung über das Sichtfeld). Zu diesem Zweck wird eine Probe mit einer hohen Dichte an FRET-Sonden vorbereitet und zunächst ein Bild bei Akzeptoranregung aufgenommen, gefolgt von einem Photobleichen des Akzeptors und anschließender Aufnahme eines Bildes bei Donoranregung. Für eine erhöhte Stabilität mehrmals in verschiedenen Probenbereichen wiederholen. Siehe Abbildung 1C,D. Alternativ können Sie eine Probe aufnehmen, die nur mit dem Donormolekül dekoriert ist, und eine zweite Probe, die nur mit den Akzeptorfluorophoren dekoriert ist.
   HINWEIS: Die Flatfield-Korrektur wird von der Analysesoftware durchgeführt. siehe Schritt 8.1.2.
3. Zeichnen Sie eine Einzelmolekülprobe (wie in Abschnitt 2) einer Sonde ohne Akzeptorfluorophor auf, um die Donoremission zu bestimmen, die in den Akzeptorkanal austritt.
   HINWEIS: Die Spenderleckage kann auch aus den tatsächlichen Zeitspuren der Sonden nach dem Bleaching des Akzeptors berechnet werden. Wenn eine ausreichende Anzahl solcher Ereignisse aufgezeichnet wird, ist keine zusätzliche Messung erforderlich. Beide Optionen werden von der Analysesoftware unterstützt; siehe Ergänzende Informationen, Abschnitt 3.15.
4. Erfassen Sie Aufzeichnungen einer Sonde ohne Donorfluorophor zur Quantifizierung der direkten Akzeptoranregung durch die Donoranregungslichtquelle.
   HINWEIS: Die direkte Akzeptoranregung kann auch aus den tatsächlichen Zeitspuren der Sonden nach dem Aufhellen des Spenders abgeleitet werden. Wenn eine ausreichende Anzahl solcher Ereignisse aufgezeichnet wird, ist keine zusätzliche Messung erforderlich. Beide Optionen werden von der Analysesoftware unterstützt; siehe Ergänzende Informationen, Abschnitt 3.15.
5. Zeichnen Sie eine Einzelmolekülprobe mit zwei unterschiedlichen FRET-Wirkungsgraden auf, um unterschiedliche Nachweiswirkungsgrade der Donor- und Akzeptoremissionskanäle und unterschiedliche Quantenausbeuten der Farbstoffe zu korrigieren.
   HINWEIS: Solche Proben könnten zum Beispiel Holliday-Verbindungen1 sein, die zwischen zwei Konformationen schwanken, oder DNA-Stäbchen, an denen FRET-Paare in verschiedenen, genau definierten Abständen befestigt sind. Wenn Sonden hohe und ausreichend konstante FRET-Wirkungsgrade aufweisen, kann die Korrektur auch aus Akzeptorbleichereignissen der Zeitspuren der Sonden berechnet werden, in diesem Fall sind keine zusätzlichen Messungen erforderlich. Beide Optionen werden von der Analysesoftware unterstützt; siehe Ergänzende Informationen, Abschnitt 3.15.

4. Einzelmolekül-Lokalisierungsalgorithmen

HINWEIS: Mehrere Analyseschritte erfordern eine Einzelmoleküllokalisierung. Wählen Sie je nach Signaldichte, Hintergrund und Signal-Rausch-Verhältnis zwischen einem Gaußschen Anpassungsalgorithmus30 und einer Massenschwerpunktberechnung31.

1. Um das Gauß-Fitting durchzuführen, wählen Sie den 3D-DAOSTORM30-Algorithmus über die jeweiligen Benutzeroberflächen.
   HINWEIS: 3D-DAOSTORM wurde entwickelt, um gleichmäßige Signale mit überlappenden Punktspreizfunktionen zu unterscheiden. Während dies im Allgemeinen ein Vorteil ist, kommt es mit einem Vorbehalt: Einzelne, helle Signale werden gelegentlich als zwei benachbarte identifiziert, was den Tracking-Algorithmus verwirren und zur Erkennung von zwei kurzen Trajektorien anstelle einer einzigen langen führen kann.
   Legen Sie die folgenden Parameter fest (weitere Informationen finden Sie in der Dokumentation der sdt-python ^library32, die die Implementierung des Algorithmus bereitstellt).
   1. radius: Legen Sie den anfänglichen σ Wert der Gaußschen Anpassungsfunktion in Pixeln fest, abhängig von der effektiven Pixelgröße.
   2. Schwellenwert: Legen Sie eine minimale Amplitude (d. h. den hellsten Pixelwert, korrigiert um den geschätzten lokalen Hintergrund) fest, damit ein Maximum der lokalen Intensität angepasst werden kann.
      HINWEIS: Der Schwellenwert ist wohl der wichtigste Parameter. Wenn es zu niedrig eingestellt ist, kann Rauschen als Fluoreszenzsignal betrachtet werden, und helle Signale können mit zwei Gaußschen Signalen versehen sein. Wenn sie zu hoch eingestellt sind, sind schwache Signale nicht geeignet.
   3. Modell: Auf 2d eingestellt, um in kreisförmige Gaußsche zu passen.
      HINWEIS: Die anderen Modelle gelten nicht für die smFRET-Daten.
   4. Filter suchen: Wenden Sie einen Filter an, bevor Sie lokale Maxima finden, um das Rauschen zu reduzieren, was in Situationen mit niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis hilfreich ist. Dies kann i) Identität: kein Filter; ii) Crocker-Grier: Bandpassfilter aus Crocker-Grier-Algorithmus31,33; oder iii) Gauß: eine Gaußsche Unschärfe mit σ, die durch den Sigma-Parameter festgelegt wird.
      HINWEIS: Für Crocker-Grier sollte der Parameter feat. size ungefähr der Radius einer Punktspreizungsfunktion in Pixeln sein.
      HINWEIS: Das Fitting erfolgt mit ungefilterten Rohdaten.
   5. Min. Entfernung: Passen Sie zwei prospektive Signale an, die durch weniger als min. Entfernungspixel durch einen einzigen Gauß getrennt sind.
      HINWEIS: Dies kann in dem oben genannten Szenario hilfreich sein, in dem ein helles Signal fälschlicherweise als zwei benachbarte Signale erkannt wird.
   6. Größenbereich: Wählen Sie minimale und maximale σ der Passungen, um Erkennungen von Störsignalen aufgrund von Rauschen zu entfernen.
2. Wählen Sie den Crocker-Grier-Algorithmus über die jeweiligen Benutzeroberflächen, um eine Berechnung des Massenschwerpunkts durchzuführen (ein verfeinerter ^{Algorithmus31} , der auf Crockers und Griers Idee ^basiert33).
   HINWEIS: Dieser Algorithmus ist selbst in Szenarien mit geringem Signal-Rauschen und im Umgang mit Signalen mit unterschiedlichen Intensitäten sehr robust, kann aber Moleküle mit überlappenden Punktspreizungsfunktionen nicht genau anpassen.
   1. radius: Legen Sie den Radius (in Pixel) einer Festplatte fest, die groß genug ist, um die gesamte Punktspreizungsfunktion aufzunehmen.
   2. signal thresh.: Stellen Sie die minimale Amplitude (hellstes Pixel über dem geschätzten Hintergrund) für ein zu analysierendes lokales Intensitätsmaximum ein.
      HINWEIS: Wenn zu niedrig eingestellt, kann das Rauschen als Fluoreszenzsignal betrachtet werden. Wenn sie zu hoch eingestellt sind, sind schwache Signale nicht geeignet.
   3. mass thresh.: Legen Sie die minimale Gesamtintensität (Summe der hintergrundkorrigierten Pixelwerte) eines zu analysierenden Signals fest.
      HINWEIS: Es gelten die gleichen Überlegungen wie oben.

5. Software-Initialisierung

1. Laden Sie Analyseskripte herunter. Navigieren Sie in einer Anaconda-Eingabeaufforderung zu einem Ordner, um die Analyse zu speichern (mit dem Befehl cd ) und auszuführen
   git clone https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git Zielordner
   1. Ersetzen Sie den Zielordner durch einen beschreibenden Namen wie 2021-06-14_Force-FRET-experiment.
      HINWEIS: Die Analysesoftware landet in diesem Ordner; Stellen Sie sicher, dass dieser Ordner vorher nicht vorhanden ist. Es wird empfohlen, für jedes Experiment eine Kopie der Analyseskripte herunterzuladen. Auf diese Weise ist es möglich, die Analyse später erneut zu überprüfen, die verwendeten Parameter abzurufen und Änderungen vorzunehmen.
2. Jupyter-Notizbücher kopieren (01. Tracking.ipynb, 02. Analyse.ipynb, 03. Plots.ipynb) in den neu erstellten Ordner (im Folgenden als Stammordner bezeichnet). Wenn Sie die Software zum ersten Mal verwenden, rufen Sie sie aus dem Unterordner notebooks des Stammordners ab.
   HINWEIS: Wenn ähnliche Datensätze bereits analysiert wurden, kann das Kopieren der Notizbücher aus einem früheren Experiment eine bequeme Option sein, da sich die Parameter möglicherweise nur geringfügig geändert haben.
3. Starten Sie den JupyterLab-Server, indem Sie den folgenden Befehl in der Anaconda-Eingabeaufforderung ausführen, um ein Webbrowserfenster zu öffnen, in dem JupyterLab angezeigt wird.
   jupyter Labor
   HINWEIS: Der Browser ist nur die Schnittstelle, während der Prozess, der in der Anaconda-Eingabeaufforderung ausgeführt wird, die eigentliche Arbeit erledigt. Infolgedessen hat das Schließen des Browserfensters nur minimale Auswirkungen; Die Sitzung kann durch Zugriff auf http://localhost:8888 wiederhergestellt werden . Wenn Sie jedoch den JupyterLab-Prozess in der Eingabeaufforderung unterbrechen oder die Eingabeaufforderung schließen, wird die Analyse beendet, was zum Verlust nicht gespeicherter Arbeit führt.
4. Navigieren Sie im JupyterLab-Browserfenster im linken Bereich zum Stammordner. Doppelklicken Sie auf 01. Tracking.ipynb , um das erste Notebook zu starten. Suchen Sie nach dem Start nach einer neuen Registerkarte, die Felder, sogenannte Zellen, von Python-Code anzeigt.
   HINWEIS: Alle Jupyter-Notizbücher enthalten Kommentare, die die Funktionalität jeder Codezelle beschreiben. Zusätzlich kann die Dokumentation für jeden Methodenaufruf angezeigt werden, indem der Textcursor unmittelbar vor dem Öffnen platziert wird ( und Umschalt+Tab drücken.
5. Eine Übersicht über den Datenanalyseprozess finden Sie in Abbildung 2 .

Abbildung 2: Übersicht über eine typische Analysepipeline. Beachten Sie, dass die Filterschritte je nach Versuchsdesign angepasst werden können. Diese Zahl wurde von ¹⁶ geändert. Abkürzung: FRET = Förster Resonanzenergieübertragung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

HINWEIS: Beispieldaten zum Ausprobieren der Software können von https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files heruntergeladen werden

6. Lokalisierung, Tracking und Fluoreszenzintensitätsanalyse einzelner Moleküle (01. Tracking.ipynb).

1. Verwenden Sie die Schaltfläche 01. Tracking.ipynb Jupyter Notebook für die zuverlässige Analyse von Fluoreszenzintensitätswerten von Einzelmolekülsignalen, die auf die präzise Quantifizierung zugeschnitten ist, insbesondere von schwachen Signalen, die häufig in FRET-Messungen auftreten (z. B. aufgrund niedriger Donorsignale bei hohen FRET-Ereignissen und umgekehrt).
   HINWEIS: Zu diesem Zweck wird eine direkte Integration der Pixelintensitäten in die Rohdaten mit Korrektur für den lokalen Hintergrund implementiert. Screenshots der einzelnen Analyseschritte und eine Beschreibung der Funktionsaufrufparameter finden Sie im Ergänzende Informationen.
   1. Geben Sie die Beleuchtungsreihenfolge an, um die Auswahl von Donor- und Akzeptoranregungsrahmen sowie von Rahmen für die Bildsegmentierung aus aufgezeichneten Bildsequenzen zu ermöglichen.
      HINWEIS: Da die Software die Verarbeitung von Daten ermöglicht, die mit beliebigen Beleuchtungsprotokollen aufgezeichnet wurden, muss angegeben werden, welcher Frame in einer Bildsequenz aufgenommen wurde, während welche Art von Fluorophor angeregt wird. siehe Ergänzende Informationen, Abschnitt 1.2, Schritt 3. Die Framenummern der ursprünglichen Bildsequenz bleiben erhalten.
   2. Beschreiben und Laden von Datasets. Analysieren Sie mehrere Datensätze gleichzeitig, vorausgesetzt, sie wurden mit denselben Beleuchtungseinstellungen aufgezeichnet. Weisen Sie jedem Datensatz einen Bezeichner und ein Muster zu, das den namen der jeweiligen Bildsequenzdatei entspricht. Definieren Sie zusätzlich spezifische Datensätze für spezielle Zwecke, z. B. Aufzeichnungen von Fiducialmarkern für die Bildregistrierung, Anregungslichtprofile für die Flachfeldkorrektur und optional nur Spender- und Akzeptorproben zur Bestimmung von Korrekturfaktoren.
   3. Wählen Sie Emissionskanäle in Rohbildern, wenn beide Kanäle mit einer einzigen Kamera aufgenommen wurden. Verwenden Sie dazu das entsprechende grafische Widget, um die geeigneten Regionen für die Spender- und Akzeptoremission auszuwählen.
   4. Lokalisieren Sie Fiducialmarker in beiden Emissionskanälen und führen Sie eine Bildregistrierung durch. Verwenden Sie die bereitgestellte Benutzeroberfläche, um die geeigneten Parameter für den Lokalisierungsalgorithmus sowohl für den Donor- als auch für den Akzeptoremissionskanal zu finden. Informationen zu unterstützten Lokalisierungsalgorithmen finden Sie in Abschnitt 4.
      HINWEIS: Zufällig verteilte Fiducialmarker können über Emissionskanäle hinweg durch die räumliche Verteilung ihrer nächsten Nachbarn identifiziert werden (Abbildung 1B). Eine benutzerdefinierte Implementierung des Algorithmus, der für die selektive ebene ^{Beleuchtungsmikroskopie34} in der sdt-python-Bibliothek vorgeschlagen wurde, gleicht automatisch die Position jedes Markers im Donoremissionskanal mit der Position im Akzeptor-Emissionskanal ab. Eine Transformation T, die die Koordinaten des Donoremissionskanals mit den Koordinaten des Akzeptor-Emissionskanals abbildet, wird über eine lineare Anpassung der kleinsten Quadrate einer affinen Transformation an die Positionen der Marker ^gefunden35. RANSAC wird verwendet, um Ausreißer zu berücksichtigen, z. B. falsch übereinstimmende Positionen aus dem vorherigen Schritt.
   5. Lokalisieren Sie FRET-Prüfpunkte unabhängig voneinander bei Donor- und Akzeptoranregung in allen Frames und führen Sie die Ergebnisse in einer Tabelle zusammen, die die ursprüngliche Framenummer, 2-dimensionale Koordinaten und einen Bezeichner enthält, der sich auf die Quellbilddatei bezieht.
      HINWEIS: Zu diesem Zweck bietet die Software Benutzeroberflächen, um geeignete Optionen für den Lokalisierungsalgorithmus zu finden.
      1. Lokalisieren Sie FRET-Sonden bei Donoranregung in der Summe der Bilder, die aus Donoremission _ImDD und Akzeptoremission ImDA gewonnen werden, die kaum von der FRET-Effizienz abhängen. Informationen zu den Optionen für den Lokalisierungsalgorithmus finden Sie in Abschnitt 4.
         HINWEIS: Jedes Summenbild wird berechnet, indem _ImDD mit der Transformation T transformiert wird, die zuvor aus der Bildregistrierung erhalten und pixelweise zu ImDA hinzugefügt wurde.
      2. Lokalisieren Sie Sonden bei Akzeptoranregung im Akzeptor-Emissionskanal ImAA (siehe Abschnitt 4 für Details zu den Lokalisierungsalgorithmen).
   6. Führen Sie Tracking- und Fluoreszenzintensitätsmessungen durch.

Abbildung 3: Einzelmolekül-Intensitätsmessung. (A) Für einen Fluorophor, der sich am orangefarbenen Pixel befindet, wird seine unkorrigierte Intensität _Iuncorr bestimmt, indem alle Pixelintensitäten innerhalb einer Scheibe (gelbe und orangefarbene Pixel) summiert werden, die groß genug ist, um alle vom Signal betroffenen Pixel abzudecken: . Der lokale Hintergrund wird als Mittelwert der Pixel in einem Ring (blaue Pixel) um die Festplatte berechnet: , wobei nring die Anzahl der Pixel im Ring ist. Die Fluoreszenzintensität I ist das Ergebnis der Subtraktion des Hintergrunds von der unkorrigierten Intensität, I = _Iuncorr - b × ndisk, wobei ndisk die Anzahl der Pixel in der Scheibe ist. Der Kreisradius wird über den parameter feat_radius der Tracking-Methode angegeben. Die Breite des Rings wird durch den Parameter bg_frame angegeben. Überlappt sich die Punktspreizfunktion eines Signals mit dem Hintergrundring eines anderen (unteres Panel), werden die betroffenen Pixel (rot) von der lokalen Hintergrundanalyse ausgeschlossen. Überlappen sich zwei Punktspreizfunktionen, können Fluoreszenzintensitäten nicht zuverlässig berechnet werden und werden daher verworfen. (B, C) Simulationen zeigen, dass die Anwendung einer Gaußschen Unschärfe mit einer Standardabweichung von 1 Pixel das Signal-Rausch-Verhältnis bis zu einem Faktor von nahe 2 bei niedrigen Fluoreszenzintensitäten (B) verbessert und kaum Fehler verursacht (leichte Unterschätzung von weniger als 1%, (C))¹⁶. Darüber hinaus ist der relative Fehler (d. h. (_Imeas - _Itruth)/_Itruth, wobei _Itruth die Ground Truth und _Imeas das Ergebnis der Analyse ist) über den gesamten Intensitätsbereich konstant und hebt sich daher für ratiometrische Größen wie FRET-Wirkungsgrade und Stöchiometrien auf. Alle Plots basieren auf bereits veröffentlichten ^Arbeiten16. Abkürzungen: SNR = Signal-Rausch-Verhältnis; FRET = Förster Resonanzenergieübertragung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Wählen Sie die entsprechenden Optionen für den ^{trackpy36algorithm} aus, der verwendet wird, um FRET-Sondenlokalisierungen mit Trajektorien zu verknüpfen. Legen Sie insbesondere den maximalen Suchabstand von einem Frame zum nächsten und die Anzahl der aufeinanderfolgenden Frames fest, bei denen ein Signal unentdeckt bleiben kann, was aufgrund von Bleichen oder verpassten Lokalisierungen auftreten kann.
   HINWEIS: Diese Lücken werden durch Interpolation zwischen vorhergehenden und nachfolgenden Positionen gefüllt. Diese interpolierten Positionen werden markiert und erst später zum Auslesen von Intensitätswerten, nicht aber zur Diffusionsanalyse verwendet. Spuren werden im Koordinatensystem des Akzeptor-Emissionskanals analysiert. Für die Fluoreszenzintensitätsanalyse (Schritt 6.1.6.2) werden die Spuren zusätzlich in das Koordinatensystem des Donoremissionskanals transformiert, wobei die inverse Transformation ^T-1 verwendet wird, die durch Bildregistrierung erhalten wurde (siehe Schritt 6.1.4).
2. Wählen Sie Optionen für den Algorithmus zur Berechnung der Fluoreszenzintensität aus (siehe Abbildung 3A für Details). Geben Sie i) den Radius einer Festplatte an, der, wenn er auf die Position eines Signals zentriert ist, alle von diesem Signal betroffenen Pixel enthält, und ii) die Breite eines Rings um jede Festplatte, die zur Bestimmung des lokalen Hintergrunds verwendet wird.
   HINWEIS: Um das Rauschen in den erhaltenen Intensitätsmessungen zu reduzieren, wird eine Gaußsche Unschärfe mit einer Standardabweichung von 1 Pixel auf die Bilder angewendet (Abbildung 3B,C).

7. Verwenden Sie die Funktionalität der Analysesoftware, um Hilfsbilddaten aus Bildsequenzen zu verarbeiten.
   1. Extrahieren Sie zusätzliche Bilder, die aufgezeichnet wurden, um die Segmentierung zu erleichtern (siehe Schritt 2.2.1, markiert durch s in der Anregungssequenz (siehe Ergänzende Informationen, Abschnitt 1.2, Schritt 3).
   2. Bestimmen Sie Donor- und Akzeptor-Anregungslichtprofile im gesamten Sichtfeld anhand von Bildern, die auf einer dicht beschrifteten Probe aufgezeichnet wurden (siehe Schritt 3.2).
      HINWEIS: Der Pixel-für-Pixel-Mittelwert wird aus den Bildern berechnet, um die Lichtprofile zu berechnen. Die Kamera-Baseline wird subtrahiert. Die Bilder werden mit einem Gaußschen Filter verschwommen, um Effekte aufgrund von Probenverunreinigungen zu reduzieren. Schließlich werden die resultierenden Bilder pixelweise durch ihren Maximalwert geteilt, um die Profil-p(x,y)-Mapping-Koordinaten auf das Intervall [0,1] zu erhalten.

7. Visualisierung von FRET-Trajektorien (optional)

1. Verwenden Sie die Inspector-Anwendung , um Einzelmolekülspuren in Rohbilddaten und die entsprechenden Fluoreszenzintensitäten und scheinbaren FRET-Wirkungsgrade und Stöchiometrien anzuzeigen.
   HINWEIS: Dies ist ein wertvolles Werkzeug, um die Gültigkeit ausgewählter Parameter zu bewerten und einzelne Zeitablaufverfolgungen manuell zu akzeptieren oder abzulehnen. Einen Screenshot und detaillierte Informationen zur Verwendung finden Sie unter Ergänzende Informationen.

8. Analyse und Filterung von Einzelmoleküldaten (02. Analyse.ipynb)

1. Verwenden Sie die Schaltfläche 02. Analysis.ipynb Jupyter Notebook zur Analyse und Filterung der über die 01. Tracking.ipynb Notizbuch. Eine typische Analysepipeline finden Sie in den folgenden Schritten.
   HINWEIS: Unterschiedliche wissenschaftliche Fragen und experimentelle Designs können Anpassungen der Einstellungen erfordern. Die Verwendung von Jupyter-Notebooks ermöglicht eine einfache Anpassung durch Weglassen, Neuanordnen und Ändern von Analyseschritten. Screenshots der einzelnen Analyseschritte und eine Beschreibung der Funktionsaufrufparameter finden Sie unter Ergänzende Informationen.
   1. Führen Sie die ersten Filterschritte aus.
      1. Discard-Signale mit überlappenden Punktspreizfunktionen, da es schwierig ist, ihre Fluoreszenzintensitäten zuverlässig zu bestimmen.
      2. Akzeptieren Sie bei inhomogener Beleuchtung nur Signale, die sich in gut beleuchteten Bereichen innerhalb des Sichtfelds befinden, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu gewährleisten.
      3. Wenn Sie intramolekulare FRET untersuchen, beschränken Sie die Analyse auf die Trajektorien, die seit Beginn der Bildsequenz vorhanden sind, um sicherzustellen, dass alle Bleichschritte aufgezeichnet werden und später während der schrittweisen Photobleichanalyse ordnungsgemäß ausgewertet werden können.
         HINWEIS: Bei der Durchführung von Experimenten mit intermolekularen FRET-Sonden, bei denen Donor- und Akzeptorfluorophore nicht Teil eines vorgeformten Komplexes sind, ist es möglicherweise nicht möglich, die Analyse auf die anfänglich vorhandenen Trajektorien zu beschränken.
   2. Führen Sie eine Flachfeldkorrektur durch, bei der die in Schritt 6.1.7.2 erhaltenen Anregungslichtquellenprofile verwendet werden, um die durch inhomogene Beleuchtung verursachten positionsabhängigen Fluoreszenzintensitätsschwankungen umzukehren.
      ANMERKUNG: Die Fluoreszenzintensität I(x,y) einer Sonde an der Position (x,y) wird korrigiert über ; siehe Abbildung 1C,D.
   3. Berechnen Sie die scheinbare FRET-Effizienz-Eapp (d. h. den Anteil der Energie, der vom Donorfluorophor zum Akzeptorfluorophor übertragen wird) und die scheinbare Stöchiometrie-Sapp (dh die Anzahl der Donorfluorophore geteilt durch die Gesamtzahl der Fluorophore innerhalb eines beugungsbegrenzten Punktes).
      HINWEIS: Durch die Darstellung von E vs. S für jeden Datenpunkt ist es möglich, Änderungen der gemessenen FRET-Wirkungsgrade aufgrund einer Änderung des Donor-Akzeptor-Abstands von Veränderungen aufgrund von Änderungen in der Stöchiometrie zu ^{unterscheiden18}. Dies ermöglicht die Unterscheidung zwischen E = 0 aufgrund der Farbstofftrennung von E = 0 aufgrund des Fehlens eines aktiven Akzeptors. E-S-Plots werden während der gesamten Analyse als Instrument zur Qualitätsbewertung verwendet. siehe Abbildung 4 als Beispiel.
   4. Führen Sie eine schrittweise Analyse des Photobleichens auf die Unterscheidung zwischen einzelmolekularen Sonden und Aggregaten durch. Wählen Sie aus, ob Sie eine der folgenden Optionen akzeptieren möchten.
      HINWEIS: Zu diesem Zweck wendet die Analysesoftware eine benutzerdefinierte ^{Implementierung32} des Changepoint-Detektionsalgorithmus ^PELT37 separat auf die Fluoreszenzintensität bei Donoranregung (_IDD + IDA) und Akzeptorerregung (IAA) an.
      1. Wählen Sie Option 1, wobei der Akzeptor Fluorophor in einem einzigen Schritt bleiicht, während der Spender keine partielle Bleiche zeigt (dh es gibt keinen Bleichschritt bis zur Intensität ungleich Null).
         HINWEIS: Diese Option lehnt Trajektorien, in denen der Spender vor dem Akzeptor in einem einzigen Schritt bleicht, weiter ab. Option 1 ist die bevorzugte Wahl bei hohen Akzeptor-Photobleichraten.
      2. Wählen Sie Option 2, wobei der Spender in einem einzigen Schritt bleicht, während es keine partielle Akzeptorbleiche gibt.
         HINWEIS: Diese Option verwirft weitere Trajektorien, in denen der Spender nach dem Akzeptor in einem einzigen Schritt ausbleicht. Option 2 ist die bevorzugte Wahl bei hohen Spender-Photobleichraten.
      3. Wählen Sie Option 3, wobei entweder Fluorophor in einem einzigen Schritt bleicht, während der andere nicht teilweise bleicht.
         HINWEIS: Option 3 bietet eine höhere Flexibilität als die Optionen 1 und 2 und wäre die vorgeschlagene Präferenz für die Datenanalyse.
      4. Wählen Sie Option 4, wobei Donor- und Akzeptorfluorophore einstufiges Photobleichen oder gar kein Photobleichen aufweisen.
         HINWEIS: Option 4 wird bei niedrigen Photobleichraten bevorzugt.
   5. Berechnen Sie die Korrekturfaktoren für die Donoremissionsleckage in den Akzeptorkanal α, die direkte akzeptorische Anregung δ, die Detektionseffizienz γ und die Anregungseffizienz β ¹⁷.
   6. Verwenden Sie die Korrekturfaktoren, um den FRET-Wirkungsgrad E aus dem scheinbaren Wirkungsgrad Eapp und die Stöchiometrie S aus der scheinbaren Stöchiometrie Sapp zu berechnen.
   7. Führen Sie weitere Filterschritte aus. Wählen Sie in jeder Leitkurve nur Datenpunkte vor dem ersten Bleichereignis aus. Akzeptieren Sie außerdem nur Trajektorien mit mindestens 75% der Datenpunkte, die 0,35 < S < 0,6 erfüllen, um die Analyse auf Einzelmolekülsonden zu beschränken (Zahlen sind einstellbar).
      HINWEIS: Die oberen und unteren Grenzen für sollten entsprechend der Streuung der interessierenden Population im Vergleich zu den populationen, die von der Analyse ausgeschlossen werden sollen (z. B. reine Spender- und Akzeptorpopulationen) gewählt werden. Erfahrungsgemäß erwiesen sich 0,35 < S < 0,6 als gute Wahl für viele experimentelle Situationen.
   8. Führen Sie eine Bildsegmentierung über globale oder adaptive ^{Schwellenwertmethoden35} für die entsprechenden Hilfsbilder durch (siehe Schritte 2.2.1 und 6.1.7), um die Analyse auf verschiedene Bereiche innerhalb des Sichtfelds zu beschränken.
      HINWEIS: Dies ermöglicht z.B. die ausschließliche Auswertung von Sonden, die sich in einer Zell-SLB-Schnittstelle oder auf einer gemusterten Struktur befinden.

9. Darstellung der Ergebnisse und weitere Analyse (03. Plot.ipynb)

HINWEIS: Screenshots des Jupyter-Notebooks und eine Beschreibung der Funktionsaufrufparameter finden Sie unter Ergänzende Informationen .

1. Erstellen Sie E-S-Diagramme , um zu überprüfen, ob Signale falscher Stöchiometrie korrekt identifiziert und entfernt wurden.
2. Zeichnen Sie Histogramme der FRET-Wirkungsgrade auf, um einen fundierten Überblick über die FRET-Effizienzverteilungen zu erhalten. Gruppieren Sie die Histogramme für einen bequemen Vergleich der Ergebnisse aus verschiedenen Experimenten.
3. Werten Sie die Daten innerhalb des Notebooks weiter aus (z. B. Diffusionsanalyse, Umwandlung von FRET-Wirkungsgraden in Kräfte in Experimente mit molekularen Kraftsensoren oder Übergangsanalyse) unter Verwendung wissenschaftlicher Python-Bibliotheken.
   HINWEIS: Daten können auch in vielen Dateiformaten als Eingabe in andere Analysesoftware exportiert werden.

Results

Eine Vielzahl von Low- und High-Level-Informationen kann aus smFRET-Tracks extrahiert werden, abhängig von der wissenschaftlichen Fragestellung des Experiments. Hier werden Beispiele für Analysepipelines mit analogen und digitalen Sonden vorgestellt: ein peptidbasierter molekularer ^{Kraftsensor16} bzw. eine DNA-Sonde mit stochastischer Umschaltung ihrer ^{Konformation38}. In Abbildung 5 sind das Design und das Funktionsprinzip dieser Sonden dargestellt.

Nachdem die Lokalisierungs- und Tracking-Algorithmen wie im Protokoll beschrieben ausgeführt wurden, bietet das Paket mehrere Datenvisualisierungswerkzeuge zur Optimierung der Anfangsparameter und nachfolgenden Filterschritte: (i) Visualisierung einzelner smFRET-Ereignisse, (ii) optionale Bildsegmentierung zur Analyse von Daten in bestimmten Interessenbereichen, (iii) Überwachung von Filterschritten über FRET-Effizienz vs. Stöchiometrie (E-S) -Diagramme. Die Visualisierung der Einzelmoleküldaten ist in Abbildung 6 dargestellt.

Schließlich werden die gefilterten FRET-Ereignisse durch ein E-S-Diagramm und ein FRET-Effizienzhistogramm dargestellt (Abbildung 4). Das E-S-Diagramm ist ein nützliches Werkzeug, um die oben genannten Filterschritte zu optimieren und das Endergebnis zu untersuchen. Teilweise gebleichte oder unvollständig gekennzeichnete FRET-Sensoren können durch ihren Stöchiometriewert ausgeschlossen werden. Mobilitätsparameter können untersucht werden, indem ein einzelner Trajektorienpfad in einem x-y-Diagramm (Abbildung 6) oder einem mittleren quadratischen Verschiebungsdiagramm (MSD) (Abbildung 4) dargestellt wird. Die erste Methode ist besonders nützlich, um mobile von immobilisierten Ereignissen zu unterscheiden, während die letztere zur Berechnung des Diffusionskoeffizienten verwendet wird.

Abbildung 4: Beispielhafte Ausgabe. (A) Die FRET-Effizienz wird im Vergleich zur Stöchiometrie (E-S-Diagramm) für eine Population des Molekularkraftsensors (linkes Feld) aufgetragen, das eine glasgestützte Lipiddoppelschicht schmückt und durch eine T-Zelle belastet wird. Nur eine Bevölkerungswolke ist sichtbar. Das jeweilige Histogramm der FRET-Wirkungsgrade veranschaulicht den Unterschied zwischen einer Kraftsensorpopulation in Anwesenheit und Abwesenheit von Zellen (mittleres Feld). Es kann keine Verschiebung zu niedrigeren FRET-Wirkungsgraden der Sensorpopulation in Gegenwart von T-Zellen beobachtet werden, was auf eine geringe bis gar keine kraftabhängige Dehnung des Sensormoduls hinweist. Das MSD-Diagramm dieser experimentellen Bedingungen bestätigt, dass sich die Kraftsensorpopulation unter einer T-Zelle erheblich langsamer bewegt als ihre ungebundenen Gegenstücke (rechtes Bild). (B) Die gleiche Analyse wurde mit einem Holliday-Junction-DNA-Sensor durchgeführt, der eine glasgestützte Flüssigelipiddoppelschicht verzierte. Das E-S-Diagramm zeigt deutlich zwei Populationen, die auch im FRET-Effizienzhistogramm ersichtlich sind. Das MSD-Diagramm zeigt das Vorhandensein einer sich schnell bewegenden Sensorpopulation an. Abkürzungen: FRET = Förster Resonanzenergieübertragung; MSD = mittlere quadratische Verschiebung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Aufbau und Funktionsprinzip intramolekularer FRET-Sonden. (A) Analoger Peptidsensor zur Quantifizierung mechanischer Molekülkräfte. Die Donor- und Akzeptorfluorophore sind kovalent an beide Enden des Peptidrückgrats gebunden. Das Sensormodul ist ortsspezifisch an einen bestimmten Liganden gebunden, der wiederum einen zellresidenten Oberflächenrezeptor von Interesse bindet (hier ein Antikörperfragment, das die Betakette des T-Zell-Rezeptors spezifisch erkennt). Bei der Rezeptor-Liganden-Bindung wird Kraft ausgeübt, und das Sensormodul dehnt sich aus und stößt schließlich nach der Bindungsspaltung zurück. Dieses Panel wurde von ¹⁶ geändert. (B) Digitaler DNA-Sensor zur Quantifizierung von FRET-Übergängen. Der FRET-Sensor besteht aus vier DNA-Strängen, die einen Holliday-Übergang bilden. Der Donor und der Akzeptorfluorophor sind kovalent an zwei Stränge gebunden. Holliday-Übergänge wechseln häufig ihre Konformation in Abhängigkeit von den umgebenden Pufferbedingungen. Das stochastische Schalten dieser Konformationen kann durch Quantifizierung der FRET-Effizienz einzelner Sonden überwacht werden. Abkürzungen: TCR = T-Zell-Rezeptor; FRET = Förster Resonanzenergieübertragung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Beispiele für die Lokalisierung und Verfolgung von FRET-Sonden. (A) Die FRET-Effizienz und Stöchiometrie einzelner Ereignisse werden berechnet, indem die Intensität des Donorfluorophors bei Donoranregung (D → D), des Akzeptorfluorophors bei Donoranregung (D → A) und des Akzeptorfluorophors bei Akzeptorerregung (A → A) quantifiziert wird. Die Filterung des nächsten Nachbarn verhindert Verzerrungen durch überlappende Punktspreizungsfunktionen von Close Emittern. Die Bildsegmentierung ermöglicht es dem Benutzer, bestimmte smFRET-Ereignisse auszuwählen, die in einem Interessengebiet lokalisiert sind (z. B. eine Zelle oder ein Mikromuster). Als Beispiel für die Bildsegmentierung wurden T-Zellen mit Fura-2 (links dargestellt) gefärbt und einem adaptiven Schwellenwert unterzogen, um die Zellränder zu identifizieren (orange gepunktete Linie). Maßstabsbalken = 5 μm. (B) smFRET-Trajektorien mit dem Molekularkraftsensor. Einzelne Trajektorien können in der x-y-Ebene dargestellt werden, wobei ihr Diffusionsverhalten und ihre Lokalisierung visualisiert werden (linkes Feld). Darüber hinaus können die Intensitäten jeder Trajektorie im Laufe der Zeit dargestellt werden, um FRET-Übergänge oder Bleichschritte zu identifizieren (das mittlere Feld zeigt die rote Trajektorie aus dem linken Bereich). Der resultierende FRET-Wirkungsgrad und die Stöchiometrie können ähnlich visualisiert werden (rechtes Feld). (C) smFRET-Trajektorien unter Verwendung des Holliday-Junction-DNA-Sensors. HBSS + 12 mM _MgCl2 wurde während der Messungen als Puffer verwendet. Abgesehen von dem scheinbaren Akzeptor-Bleichschritt in der Nähe des Sequenzendes dieser Beispiele kann die Häufigkeit der FRET-Übergänge für jeden Sensor bestimmt werden. Die Holliday-Übergänge schalten ihre Konformation mit einer hohen Frequenz, während der Molekularkraftsensor keine FRET-Übergänge aufweist. Diese Informationen ermöglichen es, die experimentellen Bedingungen, wie z.B. die Verzögerung zwischen den Frames, anzupassen, um die Anzahl der beobachteten Übergänge zu erhöhen oder zu reduzieren. Abkürzungen: FRET = Förster Resonanzenergieübertragung; smFRET = Einzelmolekül-FRET; HBSS = Hanks ausgewogene Salzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Informationen: Lokalisierung und Verfolgung einzelner Moleküle (01. Tracking.ipynb). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Dieser Artikel beschreibt eine Pipeline für die automatisierte Aufzeichnung und quantitative Analyse von smFRET-Daten, die von mobilen, aber oberflächengebundenen Sondenmolekülen stammen. Es ergänzt die beiden vorherrschenden Ansätze für smFRET-Experimente, an denen entweder oberflächenimmobilisierte Sonden oder sonden beteiligt sind, die in Lösung in ein konfokales Anregungsvolumen hinein und aus ihm heraus ^{diffundieren17}. Es liefert die richtige FRET-Effizienz und die molekularen Positionen als Funktion der Zeit. Es kann daher als Input für spezialisierte Analyseprogramme verwendet werden, z. B. zur Quantifizierung der ^{Übergangskinetik1}, der FRET-Histogramme39 oder der zweidimensionalen ^Diffusion22.

Die Software wird unter einer freien und Open-Source-Lizenz veröffentlicht, die von der Open Source Initiative genehmigt wurde und dem Benutzer das unbefristete Recht auf freie Nutzung, Änderung und Weiterverbreitung gewährt. Github wurde als Entwicklungs- und Distributionsplattform ausgewählt, um es so einfach wie möglich zu machen, die Software zu erhalten und am Entwicklungsprozess teilzunehmen, indem Fehler gemeldet oder ^Code40 beigetragen wird. In Python geschrieben, ist die Software nicht von proprietären Komponenten abhängig. Die Wahl der Jupyter Notebooks als Benutzeroberfläche erleichtert die Überprüfung der Daten bei jedem Analyseschritt und ermöglicht es, die Pipeline speziell auf das vorliegende Versuchssystem zuzuschneiden und zu erweitern. Die sdt-python ^library32 dient als Grundlage und implementiert Funktionen zur Auswertung von Fluoreszenzmikroskopiedaten, wie z. B. Einzelmoleküllokalisation, Diffusionsanalyse, Fluoreszenzintensitätsanalyse, Farbkanalregistrierung, Kolokalisierungsanalyse und ROI-Handling.

Prinzipiell kann die Einzelpartikelverfolgung in ein-, zwei- oder dreidimensionalen Systemen durchgeführt werden. Hier wurde die Einzelmolekül-Analyse-Pipeline auf die Untersuchung mobiler 2D-Systeme zugeschnitten. Diese Wahl spiegelt die Verfügbarkeit einfacher Systeme wie planar unterstützter Lipiddoppelschichten (SLBs) wider, um mobile Fluoreszenzsonden zu präsentieren. Solche Lipiddoppelschichtsysteme bestehen typischerweise aus zwei oder mehr Phospholipid-Einheiten, wobei die Bulk-Fraktion die wichtigsten physikalisch-chemischen Parameter des SLB (wie Phase und Viskosität) bestimmt und die Minor-Fraktion Anheftungsstellen für Biomoleküle bereitstellt. Diese Bindungsstellen können biotinylierte Phospholipide für Avidin- oder Streptavidin-basierte Proteinplattformen oder Nickel-NTA-konjugierte Phospholipide für Proteinplattformen mit Histidin-Tags41 sein. Die Wahl der geeigneten Plattform zur Verknüpfung von Proteinen mit dem SLB hängt von der wissenschaftlichen Fragestellung ab. Leser können sich auf die Literatur16,38,42 für Beispiele für erfolgreich eingesetzte Strategien beziehen. Die Dichte der Sonden in der Probe sollte ausreichend niedrig sein, um überlappende Punktspreizungsfunktionen zu vermeiden. Typischerweise werden weniger als 0,1 Moleküle pro ^μm2 empfohlen. Ein Beispiel für eine geeignete Sondendichte finden Sie im Abschnitt repräsentative Ergebnisse (insbesondere Abbildung 6). Die Analysemethode ist auch auf einzelne fluoreszenzmarkierte Proteinmoleküle anwendbar, die in der Plasmamembran lebender Zellen diffundieren.

Ein kritischer Aspekt der smFRET-Experimente ist die Herstellung und Charakterisierung der FRET-Sonden selbst. Bei der Auswahl von Fluorophoren für ein FRET-Paar sollte ihr Försterradius mit den erwarteten Interfarbstoffabständen ^{übereinstimmen43}. Farbstoffe, die gegen Photobleichen beständig sind, werden bevorzugt, da sie langzeitige Spuren ergeben. Für erhöhte Bleichraten kann jedoch eine Fluorophorspezies verwendet werden, um Multiemitter-Ereignisse zu erkennen, die von kolokalisierten Molekülen über eine schrittweise Photobleichanalyse ausgehen; Siehe Schritt 8.1.4 im Abschnitt Protokoll. Fluorophorpaare sollten ortsspezifisch und kovalent an die interessierenden Moleküle gebunden sein und intra- oder intermolekulare FRET-Paare bilden.

Die Kombination von smFRET mit anderen leicht verfügbaren Techniken kann seine räumliche Auflösung über die Beugungsgrenze hinaus erhöhen (über ^STED44). Der hier vorgestellte smFRET-Tracking-Algorithmus erweitert die Anwendbarkeit des Ansatzes auf neue experimentelle Settings und Modellsysteme. Dazu gehören Untersuchungen (i) kinetischer Veränderungen in der Stöchiometrie mobiler Biomoleküle, (ii) der dynamischen Assoziation mobiler Biomoleküle, (iii) der Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen frei diffundierender Reaktanten und (iv) der Kinetik von Konformationsänderungen mobiler Biomoleküle. Die ersten beiden Beispiele erfordern Modellsysteme, die eine intermolekulare FRET zeigen, d.h. Donor und Akzeptor werden zu getrennten biomolekularen Entitäten von Interesse konjugiert. Die letzteren Beispiele können Biosensoren verwenden, die Donor und Akzeptor innerhalb derselben molekularen Einheit (intramolekulare FRET) tragen.

Intramolekulare FRET-basierte Sensoren können Einblicke in intrinsische Konformationsänderungen von Biomolekülen1,2,3,4, Konformationsänderungen durch endogene oder externe Kraftbelastung (molekulare ^{Kraftsensoren16)} oder Ionenkonzentrationen in der Nanoumgebung wie ^calcium45 und ^pH46 geben . Abhängig vom Modellsystem und der bevorzugten Verankerungsplattform können solche smFRET-Ereignisse entweder in 2D oder 3D verfolgt werden: (i) Planares Tracking von smFRET-Ereignissen kann zur Quantifizierung von Rezeptor-Liganden-Interaktionszeiten innerhalb einer Plasmamembran, der Assoziation von membranverankerten Signalverstärkungskaskaden und den stöchiometrischen Veränderungen von Oberflächenrezeptoren eingesetzt werden; ii) Die Volumenverfolgung von smFRET-Ereignissen kann für alle intra- oder intermolekularen FRET-Sonden in lebenden Zellen oder in in vitro rekonstituierten Systemen verwendet werden.

Die smFRET-Tracking-Methode wurde hauptsächlich mit Blick auf intramolekulare FRET-Sonden entwickelt. Diese Sonden weisen eine feste und bekannte Anzahl von fluoreszierenden Markierungen auf, eine Tatsache, die ausgenutzt wurde, um Daten von agglomerierten und falsch synthetisierten (z. B. unvollständig markierten) Molekülen sowie von Sonden, bei denen eines der Fluorophore photogebleicht wurde, abzulehnen. Durch die Einstellung der Filterschritte kann das Verfahren jedoch auch auf intermolekulare FRET-Sonden angewendet werden. Zum Beispiel könnte man, anstatt nur Moleküle mit einem einzelnen Donor- und einem einzelnen Akzeptorfluorophor zu akzeptieren, die räumlichen Trajektorien von Donor- und Akzeptorfarbstoffen untersuchen und beispielsweise für die Co-Diffusion von Donor-Akzeptor-Trajektorien auswählen.

Da der 3D-DAOSTORM-Algorithmus die Bestimmung der Position eines Signals entlang der optischen Achse über den Astigmatismus aufgrund einer zylindrischen Linse im Emissionsstrahlpfad unterstützt, könnten 3D-Experimente problemlos in die Analysepipeline integriert werden. In diesem Fall würde das Akzeptorsignal bei Akzeptoranregung dazu dienen, die Stöchiometrie und die axiale Position zu bestimmen. Die Analysesoftware kann auch verwendet werden, um Daten aus Experimenten mit immobilisierten Sonden auszuwerten, indem sie ihren hohen Automatisierungsgrad und filternde Schemata nutzt. Tatsächlich wurden smFRET-Effizienzdatensätze von Holliday-Übergängen, die auf Gelphasendoppelschichten ^{immobilisiert wurden38} , mit einer frühen Version der Software analysiert.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (Nickelsalz) (Ni-NTA-DOGS)	Avanti Polare Lipide	790404P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC)	Avanti Polare Lipide	850375P
1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC)	Avanti Polare Lipide	850457P
α Plan-FLUAR 100x/1.45 Ölobjektiv	Zeiss	000000-1084-514
Axio Observer Mikroskopkörper	Zeiss
Bandpassfilter	Chroma Technology Corp	ET570/60m	Spenderemissionsfilter
Bandpassfilter	Chroma Technology Corp	ET675/50m	Akzeptor Emissionsfilter
Conda-Forge	Conda-Forge Community		Community-gepflegtes Python-Paket-Repository für Anaconda/miniconda
Deckgläser 60 mm x 24 mm #1.5	MENZEL
Dichroitischer Spiegel	Semrock Inc	FF640-FDi01-25&mal; 36	Trennung von Donor- und Akzeptoremission
Dichroitischer Spiegel (Quad-Band)	Semrock Inc	Di01-R405/488/532/635-25&mal; 36	Trennung von Anregungs- und Emissionslicht
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537
FCS	Sigma-Aldrich	F7524	für die bildgebende
Pufferbundanalyse	Schü tz group an der TU Wien		Python-Paket für die Analyse von smFRET-Daten; Version 3
Fura-2 AM	Thermo Fisher Scientific	11524766
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264	für die Bildgebung Puffer
iBeam Smart 405-S 405 nm Laser	Toptica Photonics AG
iXon Ultra 897 EMCCD Kamera	Andor Technology Ltd
Lab-Tek Kammern ( 8 Vertiefungen)	Thermo Fisher Scientific	177402PK	für die Probenvorbereitung und Bildgebung
Millenia Prime 532 nm Laser	Spectra Physics
miniconda	Anaconda Inc.		Python 3 Verteilung. Min. Version: 3.7
Monovalentes Streptavidin (Plasmide für die bakterielle Expression)	Addgene	20860 & 20859
OBIS 640 nm Laser	Coherent Inc	1185055
Optosplit II	Cairn Research
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5253	für die Bildgebung Puffer
Plasmareiniger	Harrick Plasma	PDC-002
sdt-python	Schü tz-Gruppe an der TU Wien		Python-Bibliothek für die Datenanalyse; Version 17
TetraSpek Bead Size Kit	Thermo Fisher Scientific	T14792	Zufällig verteilte, immobilisierte Passermarkenmarker für die Bildregistrierung
USC500TH Ultraschallbad	VWR		für die SUV-Bildung