Summary
لقد طورنا منصة واحدة لتتبع سلوك الحيوان خلال مهمتين للتعلم الترابطي تعتمد على الألياف المتسلقة. يسمح التصميم منخفض التكلفة بالتكامل مع التجارب البصرية الجينية أو التصويرية الموجهة نحو تسلق نشاط المخيخ المرتبط بالألياف.
Abstract
يوفر تسلق مدخلات الألياف إلى خلايا Purkinje إشارات مفيدة حاسمة للتعلم الترابطي المعتمد على المخيخ. دراسة هذه الإشارات في الفئران الثابتة الرأس يسهل استخدام التصوير والفيزيولوجيا الكهربية والبصريات الوراثية. هنا ، تم تطوير منصة سلوكية منخفضة التكلفة (~ 1000 دولار) تسمح بتتبع التعلم الترابطي في الفئران الثابتة الرأس التي تقطر بحرية على عجلة الجري. تتضمن المنصة نموذجين شائعين للتعلم الترابطي: تكييف غمضة العين وتكييف الدهشة المتأخر عن طريق اللمس. يتم تتبع السلوك باستخدام كاميرا وحركة العجلة بواسطة كاشف. نحن نصف المكونات والإعداد ونقدم بروتوكولا مفصلا للتدريب وتحليل البيانات. تسمح هذه المنصة بدمج التحفيز البصري الوراثي والتصوير الفلوري. يسمح التصميم لجهاز كمبيوتر مضيف واحد بالتحكم في منصات متعددة لتدريب متعددة في وقت واحد.
Introduction
لطالما استخدم التكييف البافلوفي للارتباط دون الثاني بين المحفزات لإثارة استجابة مشروطة للتحقيق في التعلم المعتمد على المخيخ. على سبيل المثال ، في تكييف وميض العين التأخيري الكلاسيكي (DEC) ، تتعلم الحيوانات إجراء وميض وقائي في الوقت المناسب استجابة لحافز شرطي محايد (CS ؛ على سبيل المثال ، وميض من الضوء أو النغمة السمعية) عندما يتم إقرانه بشكل متكرر بحافز غير مشروط (الولايات المتحدة ؛ على سبيل المثال ، نفخة من الهواء المطبق على القرنية) والتي تثير دائما وميضا منعكسا ، والتي تأتي في أو بالقرب من نهاية CS. يشار إلى الاستجابة المستفادة باسم الاستجابة المشروطة (CR) ، بينما يشار إلى الاستجابة الانعكاسية باسم الاستجابة غير المشروطة (UR). في الأرانب ، تعطل الآفات الخاصة بالمخيخ هذا النوع من التعلم1،2،3،4. علاوة على ذلك ، توفر المسامير المعقدة لخلايا Purkinje ، مدفوعة بمدخلات الألياف المتسلقة5 ، إشارةضرورية 6,7 وإشارة 8,9 كافية للحصول على CRs في الوقت المناسب.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير نماذج التعلم الترابطي المعتمدة على الألياف للفئران الثابتة الرأس. كان DEC أول نموذج تعليمي ترابطي يتم تكييفه مع هذا التكوين10,11. تم استخدام DEC في الفئران الثابتة الرأس لتحديد مناطق المخيخ 11،12،13،14،15،16،17 وعناصر الدائرة 11،1 2،13،14،15،18،19 المطلوبة لاكتساب المهام وانقراضها. وقد استخدم هذا النهج أيضا لتوضيح كيفية تطور التمثيل الفسيولوجي على المستوى الخلوي لمعلمات المهمة مع التعلم13،15،16.
بالإضافة إلى وميض العين ، تم تطوير نموذج التكييف اللمسي المذهل المتأخر (DTSC) مؤخرا كمهمة تعليمية ترابطية جديدة للفئران20 الثابتة الرأس. يشبه DTSC من الناحية المفاهيمية DEC ، ويتضمن تقديم CS محايد مع الولايات المتحدة ، ونقرة على الوجه بما يكفي من الكثافة لإشراك منعكس مذهل21,22 مثل UR. في نموذج DTSC ، تتم قراءة كل من UR و CR كحركة خلفية على عجلة. تم استخدام DTSC الآن للكشف عن كيفية تغيير التعلم الترابطي لنشاط المخيخ وأنماط التعبير الجيني20.
في هذا العمل ، تم تطوير طريقة لتطبيق DEC أو DTSC بمرونة في منصة واحدة. يتم تخطيط سمات التحفيز والمنصة في الشكل 1. يتضمن التصميم القدرة على تتبع سلوك الحيوان باستخدام كاميرا بالإضافة إلى جهاز تشفير دوار لتتبع حركة الماوس على عجلة. يتم التحكم في جميع جوانب تسجيل البيانات وهيكل التجربة بواسطة وحدات تحكم دقيقة مقترنة (Arduino) وكمبيوتر أحادي اللوحة (SBC; التوت باي). يمكن الوصول إلى هذه الأجهزة من خلال واجهة مستخدم رسومية مقدمة. هنا ، نقدم سير عمل للإعداد وإعداد التجربة وتنفيذها ، وخط أنابيب تحليل مخصص لتصور البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على بروتوكولات الحيوانات الموصوفة هنا من قبل لجان رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة برينستون.
1. إعداد SBC
- قم بتوصيل كبل الواجهة التسلسلية للكاميرا (CSI) بكاميرا Raspberry NoIR V2 ومنفذ الكاميرا على SBC.
- قم بتنزيل نظام التشغيل الخاص ب SBC على الكمبيوتر المضيف. اكتب صورة نظام التشغيل على بطاقة رقمية صغيرة آمنة (microSD).
ملاحظة: يمكن العثور على تعليمات مفصلة لهذه الإجراءات الخاصة ب Raspberry Pi SBC في مكان آخر23. تم اختبار النظام باستخدام أنظمة التشغيل التالية: Stretch و Buster و Bullseye. - لتمكين اتصال shell الآمن ، قم بإنشاء ملف بدون امتداد يسمى "ssh" في قسم التمهيد لبطاقة microSD. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإخراج بطاقة microSD من الجهاز المضيف وأدخلها في فتحة بطاقة SBC microSD. قم بتشغيل SBC عن طريق توصيل مصدر الطاقة الخاص به.
- قم بإعداد SBC لقبول اتصال سلكي بالمضيف.
- قم بتوصيل شاشة بكبل مناسب ب SBC. افتح محطة طرفية ، واكتب الأمر ifconfig وسجل عنوان IP لشبكة إيثرنت الخاصة ب SBC.
ملاحظة: يحتوي طراز Raspberry Pi 3B + على منفذ عرض HDMI ، بينما يحتوي الطراز 4B على منفذ micro-HDMI. - انتقل إلى علامة التبويب الواجهة في إعداد تكوين Raspberry Pi وقم بتمكين خيارات الكاميرا وبروتوكول شبكة shell الآمن (SSH) وحوسبة الشبكة الافتراضية (VNC).
- قم بتوصيل شاشة بكبل مناسب ب SBC. افتح محطة طرفية ، واكتب الأمر ifconfig وسجل عنوان IP لشبكة إيثرنت الخاصة ب SBC.
- إنشاء اتصال سلكي بين الكمبيوتر المضيف وSBC.
- قم بتوصيل كبل إيثرنت بمنفذ إيثرنت على SBC والكمبيوتر المضيف. قم بتوصيل الطرف الآخر من هذه الكابلات بمحول إيثرنت.
- استخدم عميل حوسبة شبكة افتراضية مثل VNC viewer24 وقم بالوصول إلى سطح المكتب باستخدام عنوان IP SBC والمصادقة الافتراضية (المستخدم = "pi" ، كلمة المرور = "التوت").
- قم بتنزيل البرامج المطلوبة المضمنة في خطوات البروتوكول.
تنبيه: تغيير اسم المستخدم وكلمة المرور الافتراضيين لمنع الوصول غير المصرح به إلى SBC.- أدخل الأمر التالي في محطة SBC لتنزيل برنامج الحفارة:
جيت استنساخ --عمق = 1 https://github.com/gerardjb/assocLearnRig - أدخل الأوامر التالية لتنزيل مكتبات python الضرورية.
CD assocLearnRig
بايثون3 setup.py - للسماح بالتحكم المباشر في وحدة التحكم الدقيقة، اتصل ب SBC وقم بتنزيل بيئة التطوير المتكاملة للمتحكم الدقيق (IDE) باتباع الخطوات 1.6.4-1.6.7.
- افتح مستعرض الويب على سطح مكتب SBC وانتقل إلى https://arduino.cc/en/software. قم بتنزيل أحدث إصدار Linux ARM 32 بت من IDE.
- افتح نافذة طرفية على سطح مكتب SBC وانتقل إلى دليل التنزيلات عن طريق كتابة تنزيلات الأقراص المضغوطة/
- لتثبيت IDE، اكتب الأوامر التالية في المحطة الطرفية:
tar -xf arduino--linuxarm.tar.xz
سودو mv اردوينو-<الإصدار> /opt
sudo /opt/arduino-/install.sh
(هنا <الإصدار> هو إصدار IDE الذي تم تنزيله) - افتح مثيل IDE المتحكم الدقيق على سطح مكتب SBC. حدد خيار القائمة أدوات > إدارة المكتبات. قم بتثبيت مكتبة "Encoder" من Paul Stoffregen.
- أدخل الأمر التالي في محطة SBC لتنزيل برنامج الحفارة:
- قم بتوسيع ذاكرة SBC المدمجة باستخدام محرك أقراص USB الإبهام.
- أدخل محرك أقراص إبهام في منفذ USB على SBC. استخدم منفذ USB 3.0 إذا كان متوفرا.
- اكتب في المحطة الطرفية ls -l /dev/disk/by-uuid/ للعثور على محرك أقراص الإبهام ومرجعه الفريد (UUID). تسجيل UUID.
- للسماح لمستخدم pi بالكتابة إلى جهاز USB، اكتب الأوامر التالية واحدة تلو الأخرى في الجهاز الطرفي:
سودو mkdir /media/usb
سودو تشاون -R pi:pi /media/usb
سودو جبل / ديف / sda1 / وسائل الإعلام / USB -o uid = pi ، gid = pi
ملاحظة: يمكن إضافة محرك أقراص الإبهام كجهاز سيتم تحميله تلقائيا عند إعادة تشغيل SBC عن طريق إضافة السطر التالي إلى نهاية ملف fstab في /etc/fstab:
UUID = < UUID من الخطوة 1.7.2> /media/usb vfat auto,nofail,noatime,users,rw,uid =pi,gid=pi 0 0
2. أجهزة تحفيز الأسلاك ومرحلة التجميع
- قم بتوصيل وإعداد المتحكمات الدقيقة.
- قم بتوصيل SBC بمنفذ البرمجة الخاص بالمتحكم الدقيق (Arduino Due) باستخدام كابل USB2 من النوع A إلى USB2 الصغير.
ملاحظة: استخدم كبلا عالي الجودة مثل المنتج الموجود في جدول المواد لضمان التشغيل السليم. - حدد موقع "dueAssocLearn.ino" في مستودع المشروع الذي تم تنزيله. افتح الرسم باستخدام IDE المتحكم الدقيق وقم بتحميله إلى المتحكم الدقيق المتصل ب SBC.
- قم بتنزيل الإصدار المناسب من Arduino IDE وتثبيته على الكمبيوتر المضيف.
- قم بتوصيل الكمبيوتر المضيف بالمتحكم الدقيق (Arduino Uno) باستخدام كبل USB2 من النوع B إلى USB2 من النوع A.
- انتقل إلى مستودع GitHub (https://github.com/gerardjb/assocLearnRig) وقم بتنزيل الرسم "DTSC_US.ino" على الكمبيوتر المضيف.
- على الكمبيوتر المضيف ، قم بتشغيل IDE المتحكم الدقيق وافتح رسم "DTSC_US.ino" ، ثم قم بتحميله إلى المتحكم الدقيق.
- قم بتوصيل SBC بمنفذ البرمجة الخاص بالمتحكم الدقيق (Arduino Due) باستخدام كابل USB2 من النوع A إلى USB2 الصغير.
- قم بتوصيل الأسلاك بالمتحكمات الدقيقة ، ولوح الخبز ، ومصابيح LED ، والتشفير الدوار ، ومحرك السائر مع السائق ، وصمام الملف اللولبي مع برنامج التشغيل كما هو موضح في مخطط Fritzing في الشكل 2.
- قم بتشغيل محرك السائر وصمام الملف اللولبي.
- قم بتوصيل قناة واحدة من مصدر الطاقة بشكل صحيح بدبابيس +V و GND الخاصة ببرنامج تشغيل المحرك السائر.
- قم بتشغيل مصدر الطاقة واضبط جهد القناة المرفقة على 25 فولت.
ملاحظة: إذا تم تكوين الاتصالات بين محرك السائر وبرنامج التشغيل وموفر الطاقة بشكل صحيح، تشغيل مؤشر LED أخضر على مشغل محرك السائر. - قم بتوصيل الرصاص الإيجابي لمصدر الطاقة بشكل صحيح إلى برنامج تشغيل صمام الملف اللولبي الذي يحمل دبوس الجهد ويؤدي الإيجابي الآخر إلى دبوس الجهد المرتفع.
- قم بتوصيل الخيوط السلبية بأرض مشتركة مع إشارة التحكم.
- قم بتشغيل مصدر الطاقة واضبط القناة المتصلة بجهد الانتظار على حوالي 2.5 فولت والقناة المتصلة بجهد الارتفاع إلى حوالي 12 فولت.
- قم بتوصيل مصدر هواء منظم بضغط ~ 20 رطل لكل بوصة مربعة إلى صمام الملف اللولبي باستخدام محول luer.
- اختبار أن جميع مكونات التحفيز والكاميرا تعمل بشكل صحيح.
- افتح محطة طرفية على SBC واكتب cd ~/assocLearnRig للانتقال إلى مستودع GitHub المستنسخ.
- في المحطة الطرفية، اكتب python3 assocLearnRig_app.py لبدء تشغيل واجهة المستخدم الرسومية للتحكم.
- ابدأ دفق الكاميرا بالضغط على زر البث .
- حدد زر اختيار DEC ، وقم بالتحميل إلى المتحكم الدقيق ، وابدأ جلسة مع المعلمات الافتراضية عن طريق الضغط على زر بدء الجلسة .
ملاحظة: بعد هذه الخطوة، يجب أن تظهر نسخة مطبوعة من سجل البيانات في المحطة الطرفية، ويجب أن تختفي الرسالة الموجودة على دفق الكاميرا، ويجب تشغيل صمام LED CS والملف اللولبي US وإيقاف تشغيله في الأوقات المناسبة أثناء كل تجربة. - بعد انتهاء الجلسة، كرر الخطوات السابقة مع تحديد زر الاختيار DTSC .
ملاحظة: يمكن استخدام الرسومات في مستودع GitHub ("testStepper.ino" و "testRotary.ino" و "testSolenoid.ino") لاختبار المكونات الفردية إذا كانت الخطوات المذكورة أعلاه لا توفر نتائج مرضية.
- جعل عجلة الجري.
- قطع عجلة 3 "من بكرة رغوة. قم بحفر ثقب 1/4 بوصة في مركز العجلة الدقيق حتى لا تتمايل العجلة عند تشغيلها بواسطة حركة الماوس.
- أدخل عمودا مقاس 1/4 بوصة في العجلة وقم بتثبيته في مكانه باستخدام محاور تثبيت موضوعة على كل جانب من جوانب العجلة.
- قم بتثبيت جهاز التشفير الدوار على قناة ألومنيوم مقاس 4.5 بوصات باستخدام مسمار M3. قم بتثبيت قناة الألومنيوم على لوح خبز الألومنيوم باستخدام قوس قائم الزاوية مع مسمار 1/4 بوصة وصمولة وغسالة كما هو موضح.
- قم بتوصيل العجلة وجهاز التشفير الدوار باستخدام غلاف اقتران العمود.
- قم بتثبيت الجانب الحر من عمود العجلة باستخدام محمل يتم إدخاله في مشبك نهاية قائم الزاوية مثبت على عمود بصري مثبت على لوح الخبز.
ملاحظة: تأكد من أن العجلة تدور بحرية دون تذبذب عند تدويرها باليد. - ضع أجهزة التحفيز ومسند الرأس ومجموعة ضوء الأشعة تحت الحمراء و picamera حول العجلة المجمعة.
- ضع مساند الرأس باستخدام الأعمدة البصرية ومشابك الأعمدة ذات الزاوية اليمنى بحيث تكون أعمدة الرأس 1.5 سم أمام محور العجلة و 2 سم فوق سطح العجلة. (القيم هي لماوس 20 جم).
- ضع مخرج صمام CS LED والملف اللولبي المستخدم في DEC US على بعد أقل من 1 سم من العين المستخدمة في DEC.
- قم بتركيب محرك السائر المستخدم في DTSC US
- قم بتركيب picamera على عمود بصري ~ 10 سم من المكان الذي سيكون فيه الحيوان.
ملاحظة: يمكن إجراء تصميم حامل picamera على طابعة 3D من الملف الموجود في "RaspPiCamMount1_1.stl" في مستودع GitHub. - ضع صفيف ضوء الأشعة تحت الحمراء أعلى قليلا وواجه مباشرة موضع الوجه على نفس جانب البيكاميرا.
- قم بعمل حافز عن طريق اللمس ل DTSC عن طريق لصق الرغوة على حافة قطعة من الأكريليك مثبتة على عمود 1/4 بوصة باستخدام محور لقط. قم بإرفاق الحافز اللمسي بعمود محرك السائر.
ملاحظة: يمكن قطع تصميم قطعة الأكريليك بالليزر باتباع النمط الموجود في "TouchtileStimDesign.pdf" في مستودع GitHub.
3. إعداد وتشغيل التجارب السلوكية
- زرع صفيحة رأس الماوس.
- تخدير الفأر باستخدام 2٪ من الأيزوفلوران وإصلاح الرأس في إطار التجسيمي.
- ضع مرهم العيون على العينين.
- احلق فروة الرأس باستخدام الماء والصابون ومشرط معقم. حقن يدوكائين مباشرة تحت جلد موقع الشق وتنظيف الموقع الجراحي مع البوفيدون.
- قم بعمل شق باستخدام مشرط على طول خط الوسط لفروة الرأس من الحافة الخلفية للعينين إلى الحافة الخلفية للجمجمة ، مع الحرص على عدم الضغط بشدة على الجمجمة.
- انشر الشق مفتوحا وقم بتثبيت كلا الجانبين باستخدام مرقئ معقم لإبقائه مفتوحا. قم بإزالة السمحاق بلطف باستخدام قطعة قطن مغموسة بالإيثانول واترك سطح الجمجمة المكشوفة حتى يجف.
- ضع مستوى الصفيحة الأمامية على الجمجمة ، مع التأكد من وضع الجزء الأمامي من الصفيحة الأمامية الخلفية للعينين. استخدم غراء سيانوكريليت لربط صفيحة الرأس بالجمجمة والسماح للغراء بالجفاف تماما.
- امزج مسحوق أسمنت الأسنان (1 مغرفة) ، والمذيب (2 قطرة) ، والمحفز (1 قطرة) في طبق خلط وضعه على جميع مناطق العظام المكشوفة. أضف طبقات حتى يتدفق السطح مع الحافة العلوية للوح الرأس ، مع التأكد من أن لوح الرأس متصل بإحكام بالجمجمة.
- خياطة الجلد مغلقة خلف وأمام صفيحة الرأس إذا لزم الأمر.
- حقن مسكن ما بعد الجراحة مثل كاربروفين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية مع السماح للحيوان بالتعافي لمدة 5 أيام على الأقل.
- التحضير لجلسات السلوك.
- اسمح لحيوانات الاختبار بالتعود على المنصة عن طريق تركيبها في مسند الرأس لمدة 30 دقيقة لمدة 5 أيام قبل التجارب.
ملاحظة: بحلول نهاية جلسات التعود ، يجب أن تعمل الحيوانات بشكل مريح على عجلة القيادة. - (ديسمبر فقط) قبل الجلسات، تأكد من أن مخرج صمام الملف اللولبي يتمركز على العين المستهدفة الموضوعة على بعد >1 سم.
- (ديسمبر فقط) قم بتشغيل نفخة الهواء يدويا باستخدام زر الضغط. تأكد من أن الماوس ينتج وميضا على الفور دون إظهار علامات علنية على الإجهاد مثل اعتماد وضعية منحنية أو الاستيلاء على المنطقة المحيطة بالعين المصابة باستخدام المخلب الأمامي الجانبي.
- (DTSC فقط) قبل الجلسات ، تأكد من أن الحافز اللمسي يتركز على أنف الحيوان على بعد حوالي 1.5 سم.
ملاحظة: عند عدم تشغيل جلسة عمل سلوكية DTSC، يتم تعطيل المحرك السائر تلقائيا للسماح بتغيير الموضع يدويا. - (DTSC فقط) في محطة SBC، اكتب python3 assocLearnRig_app.py لبدء تشغيل واجهة المستخدم الرسومية.
- (DTSC فقط) قم بتشغيل جلسة اختبار لثلاث تجارب باستخدام المعلمات الافتراضية عن طريق الضغط على الزر بدء جلسة العمل في واجهة المستخدم الرسومية.
- (DTSC فقط) تأكد من أن البيانات المسجلة التي تطبع إلى المحطة الطرفية تظهر انحرافا أكبر من 20 خطوة ولكن أقل من 100 خطوة مسجلة على برنامج التشفير الدوار بعد الولايات المتحدة في كل تجربة.
تحذير: لتجنب الضرر وتقليل الضغط على الحيوان ، ابدأ التحفيز بعيدا عن الحيوان وحركه أقرب حتى يتم استيفاء الشروط المطلوبة.
- اسمح لحيوانات الاختبار بالتعود على المنصة عن طريق تركيبها في مسند الرأس لمدة 30 دقيقة لمدة 5 أيام قبل التجارب.
- تشغيل الجلسات السلوكية مع تسجيل البيانات.
- قم بتركيب الماوس على مسند الرأس.
- في المحطة الطرفية ل SBC، اكتب python3 assocLearnRig_app.py لبدء تشغيل واجهة المستخدم الرسومية.
- للسماح بتسجيلات الكاميرا أثناء التجارب السلوكية، اضغط على زر البث .
ملاحظة: يمكن تشغيل جلسات العمل بدون كاميرا. في هذه الحالة ، يتم تسجيل البيانات فقط من برنامج التشفير الدوار والطوابع الزمنية لعرض التحفيز. - أدخل معلومات التعريف للحيوان في حقل معرف الحيوان واضغط على الزر تعيين .
- حدد إما DEC أو DTSC من زر الاختيار أسفل عنوان نوع الجلسة اعتمادا على النموذج السلوكي المطلوب.
- أدخل معلمات التجربة المطلوبة في الحقول الموجودة أسفل حقل معرف الحيوان واضغط على الزر تحميل إلى أردوينو .
ملاحظة: يمكن العثور على تفاصيل معلمات التجربة في قسم README مستودع GitHub. - اضغط على زر بدء الجلسة لبدء الجلسة.
- عند تهيئة جلسة عمل، ستبدأ البيانات في تسجيل الدخول إلى دليل جديد تم إنشاؤه في "/media/usb" في نقطة تحميل محرك أقراص الإبهام SBC.
4. تصدير وتحليل البيانات
- لتصدير جميع الجلسات المسجلة إلى الكمبيوتر المضيف، افتح موجه الأوامر وأدخل الأمر pscp -r pi@Pi_IP_address:/media/usb* host_computer_destination، ثم قم بالمصادقة باستخدام كلمة مرور SBC.
ملاحظة: الأمر أعلاه لجهاز يعمل بنظام التشغيل Windows. على أجهزة Mac و Linux ، استخدم المحطة الطرفية واستبدل "pscp" ب "scp". - تثبيت أناكوندا25 أو مدير حزمة بايثون آخر (PPM) على الكمبيوتر المضيف.
- انتقل إلى مستودع GitHub وقم بتنزيل "analyzeSession.py" و "summarizeSessions.py" و "session2mp4s.py" و "requirementsHost.txt".
- افتح مطالبة PPM واكتب تثبيت conda --file directory_containing_requirementsHostrequirements Host.txt للتأكد من أن تثبيت حزمة Python يحتوي على مكتبات python المطلوبة.
- في المطالبة، اكتب القرص المضغوط directory_containing_analyzeData للانتقال إلى الدليل الذي يحتوي على "analyzeData.py" و "session2mp4s.py". قم بتشغيل برنامج التحليل عن طريق كتابة analyzeSession.py بايثون
ملاحظة: سيتم إنشاء رسالة خطأ في حالة استخدام إصدار Python 2 كبايثون. للتحقق من الإصدار، اكتب python -V في المطالبة. - حدد الدليل الذي يحتوي على البيانات عند مطالبتك بذلك. سيتم تحليل الدلائل التي تحتوي على أدلة فرعية متعددة بالتتابع.
- بالنسبة إلى جلسات DEC، لكل دليل جلسة يتم تحليله، حدد منطقة اهتمام (ROI) تحتوي على عين الماوس من صورة متوسطة تجريبية.
ملاحظة: سيتم تعبئة ملفات بيانات التحليل النهائي والرسوم البيانية الموجزة في دليل فرعي لكل دليل جلسة عمل تم تحليله. - اكتب python summarizeSessions.py لإنشاء بيانات موجزة عبر جلسات متعددة.
- اكتب session2mp4s.py بايثون الموجه لتحويل ملفات بيانات التصوير إلى ملفات .mp4 قابلة للعرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
سير العمل لتجارب DEC وتحليلها
يعد اختيار المعلمات التجريبية المناسبة أمرا مهما لنجاح التدريب على تكييف وميض العين (DEC). بالنسبة للبيانات المعروضة هنا ، تم استخدام واجهة المستخدم الرسومية لاختيار مدة CS تبلغ 350 مللي ثانية ومدة الولايات المتحدة 50 مللي ثانية. ينتج عن هذا الاقتران فاصل زمني بين التحفيز يبلغ 300 مللي ثانية: طويل بما يكفي لمنع إنتاج CR منخفض السعة10 وقصير بما يكفي لتجنب الدخول في نظام ضعف التعلم أو التكييف التتبعي ، وهي عملية تشرك مناطق إضافية في الدماغ11. تم تحديد الوقت بين التجارب باستخدام الحقول المنخفضة والعالية ITI ليتم اختيارها عشوائيا بشكل موحد من نطاق 5-15 ثانية. إن التوزيع العشوائي للفترات الفاصلة بين التجارب يجعل من المستحيل على الحيوانات استخدام إشارات توقيت أخرى غير CS والولايات المتحدة نفسها لأداء المهام.
بما في ذلك التجارب التي تحذف إما CS أو الولايات المتحدة يسمح بتقييم حركية CR و UR حتى في الحيوانات المدربة. يمكن للمستخدم تحديد نسبة التجارب التي يتم فيها إقران CS و US أو تقديمهما بمعزل عن بعضهما البعض. في البيانات المعروضة هنا، أجرينا جميع الجلسات بنسبة 10٪ من تجارب CS فقط، مع تجارب مقترنة تشكل الباقي ولا توجد تجارب في الولايات المتحدة فقط. لاحظ أن تضمين أعداد مفرطة من التجارب غير المقترنة يمكن أن يؤثر سلبا على التدريب. على سبيل المثال ، تستخدم الجلسات التي تحتوي على أكثر من 50٪ من التجارب غير المقترنة بشكل شائع لدفع انقراض CRs في الحيوانات المدربة19,26.
يعد إعداد الكاميرا وظروف الإضاءة أمرا بالغ الأهمية أيضا للحصول على بيانات عالية الجودة. يمكن تعديل معدل الإطارات للاستحواذ في برنامج اكتساب Picamera. في البيانات المعروضة هنا ، حددنا معدل إطارات قدره 120 هرتز لتجارب DEC. تسمح وحدة Picamera نفسها بمعدلات إطارات تصل إلى ~ 200 هرتز ، لكننا نجد أن المعدلات المنخفضة تمنع فقدان الإطار وتعطي دقة زمنية كافية لتتبع الجفن. يجب وضع ضوء الأشعة تحت الحمراء لإضاءة الفراء المحيط بالعين بالتساوي دون خلق انعكاس مفرط من القرنية عندما تكون العين مفتوحة. يوضح الشكل 3A صورة نموذجية من جلسة تسجيل ذات إضاءة مقبولة. تم تصميم برنامج اكتساب picamera (picameraStream.py) لتوفير إعدادات متسقة عبر الجلسة عن طريق ضبط توازن اللون الأبيض للكاميرا والاحتفاظ به وكسبه استنادا إلى ظروف الإضاءة عند تهيئة الكاميرا.
بمجرد تهيئة جلسة سلوكية ، سيتم تسجيل البيانات من الكاميرا ومكونات أجهزة النظام الأساسي الأخرى تلقائيا. يتم إنشاء سجلات البيانات في دليل يسمى بإدخال التاريخ والقيمة إلى حقل معرف الحيوان في واجهة المستخدم الرسومية. يتم تخزين إطارات الكاميرا والطوابع الزمنية لكل تجربة في ملفات فردية يتم تسميتها باستخدام معرف الحيوان وتاريخ التجربة ورقم التجربة. يتم حفظ أحداث النظام الأساسي لكل جلسة، بما في ذلك سرعة العجلة وبدء الفترة التجريبية والتوقف التجريبي وتوقيت CS والولايات المتحدة، كملف .txt واحد.
يمكن بعد ذلك تحليل البيانات المنقولة إلى الجهاز المضيف كما هو موضح في القسم 4 من البروتوكول. سيؤدي تشغيل analyzeData.py على دليل الهدف إلى إنشاء حاوية .npy لوضع الجفن مقابل الوقت لجميع التجارب في صفيف يعتمد على تحليل ملفات الكاميرا. يتم إنشاء ملف الحاوية هذا في الدليل الذي يتم تحليله. بمجرد تحليل جميع الجلسات لحيوان معين ، يمكن محاذاة جميع الجلسات وتسلسلها باستخدام summarizeSessions.py. تظهر نتائج تم تدريبه لمدة 8 جلسات من DEC في الشكل 3B. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تقديم الإصدارات التجريبية الفردية كملفات .mp4 قابلة للعرض باستخدام الأداة المساعدة session2mp4s.py. تطبع هذه الأداة المساعدة مربعا في الزاوية العلوية اليسرى من الفيلم للإشارة إلى وقت تطبيق CS و US. يتم عرض عينات تجارب DEC المعدة بهذه الطريقة جنبا إلى جنب كفيديو تكميلي 1. تظهر اللوحة اليسرى تجربة يغلق فيها الحيوان عينه بنجاح استجابة ل LED CS. في اللوحة اليمنى ، لا يومض الحيوان حتى تبدأ الولايات المتحدة.
يجب أن تظهر الحيوانات المدربة على DEC وفقا للبروتوكولات الواردة في القسم 3 والمسجلة مع الاعتبارات السابقة دليلا واضحا على CRs في الوقت المناسب التي تم الحصول عليها تدريجيا على مدار أيام تدريب متعددة. ويرد في الشكل 3 باء أمثلة على الآثار السلوكية التي لا تحتوي على سجلات قياسية في غير مدرب وآثار تحتوي على سجلات قياسية قوية من مدرب. وكما تظهر هذه الآثار، يجب ألا تظهر الحيوانات الساذجة أي استجابة ل CS ولكن استجابة قوية للولايات المتحدة. يجب أن تزداد السجلات التجارية تدريجيا في كل من الحجم والتواتر من خلال الجلسات السلوكية التي يتم إجراؤها عبر الأيام (الشكل 3B-D). في المقابل، تحد ظروف الإضاءة دون المستوى الأمثل بشدة من جودة البيانات المكتسبة. عندما يكون التباين بين العين والفراء المحيط منخفضا (الشكل 3E) ، يمكن للتغيرات الطفيفة في الصورة أن تغير بشكل كبير الشكل المسجل ل UR خلال جلسة واحدة وتقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء للكشف عن موضع الجفن (الشكل 3F-G).
لضمان تسجيلات الجفن عالية الدقة ، يعد وضع مصدر الضوء الأمثل أمرا بالغ الأهمية. يجب تدريب مؤشر LED للإضاءة مباشرة على العين المسجلة. إذا أدى التنسيب إلى توهج مفرط على سطح القرنية، يمكن وضع ناشر على صفيف LED لتقليل هذا التأثير.
سير العمل لتجارب DTSC وتحليلها
تتشابه العديد من اعتبارات اختيار المعلمات التجريبية بين تكييف التأخير عن طريق اللمس (DTSC) و DEC. هنا ، سنشير إلى تلك التي تختلف. في بيانات المثال ، تم تعيين مدة DTSC CS إلى 250 مللي ثانية مع مدة الولايات المتحدة من 50 مللي ثانية. تم اختيار هذا الفاصل الزمني الأقصر بين التحفيز ليتماشى بشكل وثيق مع المدة الأقصر الموصوفة بأنها مثالية لتعلم DTSC20. كانت معلمات النظام الأساسي الأخرى التي تم تعيينها من خلال واجهة المستخدم الرسومية مطابقة لتلك المستخدمة في DEC.
يعد الموضع الصحيح للحافز اللمسي أمرا بالغ الأهمية للتعلم في DTSC. نقوم بتركيب الحافز اللمسي بحيث تتمركز نهاية الرغوة فوق أنف الحيوان قليلا على مسافة حوالي 1.5 سم عندما تكون في الوضع المحايد. بمجرد تركيبه ، يمكن تشغيل الحافز باليد عندما لا تكون الجلسة قيد التشغيل. خلال الجلسات، يحتفظ المحرك السائر بالتحفيز في مكان محدد حتى يتم تشغيل الولايات المتحدة. ولضمان صحة تحديد المواقع، نعقد جلسة تحضيرية تتألف من حوالي ثلاث محاكمات. تتم طباعة الأحداث التي تم تسجيلها على برنامج التشفير الدوار على الشاشة الطرفية ، ويمكن استخدام هذه النسخة المطبوعة لمراقبة سعة URs الحيوانية في الوقت الفعلي. في حين أن الحد الأقصى للسعة سيختلف من تجربة إلى أخرى ، فإن الحيوانات التي يبلغ متوسطها الأقصى ~ 40 حسابا على برنامج التشفير عبر الجلسة القصيرة يجب أن تعمل بشكل جيد في مهمة DTSC. استنادا إلى إعدادات التحكم في جهاز التشفير الدوار ، تتوافق هذه القيمة مع 24 سم / ثانية ، مع قيمة سالبة تشير إلى أن الحيوان يتحرك للخلف على عجلة القيادة.
تنظيم وتسمية الملفات المنتجة في سياق جلسات DTSC هي نفسها التي تم إنتاجها في DEC. سيؤدي تشغيل analyzeSession.py إلى إنشاء حاوية .npy لسرعة العجلة مقابل الوقت لجميع التجارب في صفيف من تحليل البيانات المسجلة في ملف .csv. بمجرد تحليل جميع الجلسات لحيوان معين ، يمكن محاذاة جميع الجلسات وتسلسلها باستخدام summarizeSession.py. يتم عرض نتائج من تم تدريبه لمدة 5 جلسات من DEC في الشكل 4A. أما بالنسبة ل DEC ، فيمكن تحويل لقطات الكاميرا من DTSC إلى ملفات .mp4 قابلة للعرض. يتم عرض نماذج تجارب DTSC جنبا إلى جنب في الفيديو التكميلي 2. تظهر اللوحة اليسرى تجربة يقوم فيها الحيوان بدعم العجلة بنجاح استجابة ل LED CS. في اللوحة اليمنى ، يفشل الحيوان في تحريك العجلة حتى يتم تطبيق التحفيز اللمسي الأمريكي.
تظهر الدورة الزمنية والسعة بالنسبة إلى UR للاستجابات في الحيوانات المدربة على نموذج DTSC أوجه تشابه نوعية مع تلك المدربة على DEC. يجب ألا تظهر الحيوانات الساذجة أي استجابة ل CS ، وأن تتعلم تحريك العجلة إلى الوراء استجابة ل CS فقط بعد التعرض المتكرر ل CS المقترن والولايات المتحدة. ويزداد تواتر وسعة السجلات التجارية مع استمرار التدريب (الشكل 4 ألف، باء). في حالة DTSC ، وجدنا أن سعة UR في وقت مبكر من التدريب هي مؤشر جيد على نجاح التعلم. في مجموعة من الحيوانات المدربة مع الولايات المتحدة التي أنتجت URs منخفضة السعة (<20 سم / ثانية) ، لم يتعلم أي إنتاج CRs باستمرار بعد 4 أيام من التدريب (الشكل 4C ، D).
الاختلافات بين تدريب DEC و DTSC
تختلف DEC و DTSC بطرق مهمة. أولا ، يحدث تعلم DTSC على هذه المنصة بسرعة أكبر ، حيث تحقق معظم الحيوانات درجة عالية من الكفاءة في المهام بحلول اليوم الثالث من التدريب والأداء غير المتناظر بحلول اليوم الخامس. تعلم DEC أبطأ بالنسبة لمعظم الحيوانات لمدة 3 أيام على الأقل. ثانيا ، يتضمن نظام DTSC الكشف التلقائي عن CRs الناجحة ، والتي تعمل كإشارة تغذية مرتدة للجهاز لتقليل سعة التحفيز عن طريق اللمس. يحاكي إجراء التدريب هذا تكييف طرفة العين، حيث يوفر أداء CR المحسن حماية جزئية من نفخة هواء القرنية المزعجة. في المقابل ، فإن الحيوانات الثابتة الرأس في نموذج DTSC غير قادرة على حماية نفسها من التحفيز اللمسي من خلال استجابتها الحركية وحدها. من خلال بناء سعة الولايات المتحدة على وجود CR ، فإن الحيوانات لديها الفرصة لحماية نفسها من الحافز المتردد.
الشكل 1: سمات النظام الأساسي وتصميمه . (أ) عناصر النظام الأساسي لتسجيل سلوك الحيوان في ظل ظروف مثبتة الرأس. تم تكييف الماوس من صورة Bionder. (ب) التوقيت والمحفزات لتكييف DEC و DTSC. يحدد الفاصل الزمني بين التحفيز (ISI) المعرف من قبل المستخدم المدة التي يستغرقها عصر CS فقط. تم تصميم CS و US Eochs للانتهاء المشترك. (ج) صورة تبين موضع عناصر المنصة الرئيسية. 1) محرك السائر للسيطرة على DTSC الولايات المتحدة. 2) تشغيل عجلة للحيوان. 3) التشفير الدوار لتتبع حركة العجلات. 4) رغوة مسجلة على ذراع أكريليك يعمل كحافز لمسي DTSC. 5) LED CS. 6) صمام الملف اللولبي ومنفذ الذي يوفر DEC الولايات المتحدة. 7) Picamera لتسجيل سلوك الحيوان. 8) الأشعة تحت الحمراء LED لإضاءة المرحلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أسلاك عناصر أجهزة المنصة. (أ) مخطط أسلاك فريتزينغ لأجهزة المنصة عند تجميعها بالكامل. يتم تلوين الأسلاك بواسطة وحدات باللون البرتقالي = وحدة الكاميرا. الأصفر = وحدة DEC الولايات المتحدة ؛ الأزرق = وحدة CS LED ؛ الأرجواني = DTSC وحدة الولايات المتحدة; أخضر = وحدة تشفير دوارة. يتم استبعاد picamera ولكن يتم توصيله بالواجهة التسلسلية للكاميرا الموجودة على سطح Raspberry Pi. تشير البطاريات إلى مصادر الطاقة الحالية المباشرة عند الجهد المحدد. (ب-و) مخطط أسلاك مكافئ للوحدات المعزولة. تم إعادة تلوين الأسلاك ، بحيث يشير الأحمر والأسود دائما إلى سكة إمداد إيجابية وأرضية ، على التوالي ، في حين يتم تلوين الأسلاك الأخرى للسماح بسهولة متابعة الدائرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: النتائج التمثيلية لتدريب DEC . (أ) مثال على إطار الكاميرا من جلسة ذات ظروف إضاءة مقبولة. لاحظ التباين العالي بين العين والفراء المحيط بالعين. (ب) أداء واحد خلال الجلسات التي أجريت عبر الأيام في نموذج DEC. تشير الخطوط الأفقية إلى الأداء في كل تجربة، مع ألوان دافئة تشير إلى مزيد من إغلاق الجفن. يشير الخط العمودي الأسود الأحمر الموجود في أقصى اليسار إلى بداية CS ، بينما يشير الخط المنقط إلى بدء الولايات المتحدة. يشير الخط الصلب الثاني إلى توقف CS والولايات المتحدة. لاحظ أن عدد التجارب ذات الاستجابات الناجحة خلال CS يزداد عبر الدورات التدريبية. (ج) أداء الحيوانات من (ب) مع آثار فردية مستمدة من متوسط التجربة للجلسة كل يوم. يشير تشبع اللون إلى رقم الجلسة مع تشبع أعلى للجلسات اللاحقة. (د) الأداء لجميع الحيوانات في مجموعة DEC (n = 7). تشير الخطوط الرفيعة إلى النسبة المئوية للتجارب التي تحتوي على CR يمكن اكتشافه من كل جلسة لكل. تشير الخطوط السميكة إلى أن الجلسة تعني عبر جميع الحيوانات. (ه) مثال على إطار الكاميرا من جلسة ذات ظروف إضاءة دون المستوى الأمثل. (و) التحديد الكمي للتجارب الفردية المسجلة بإضاءة ضعيفة. يمكن اكتشاف UR ولكن مع تباين أقل وتباين أعلى مما هو عليه في ظل ظروف الإضاءة المثلى. (ز) متوسط آثار الدورة من التجارب المعروضة في الفقرة واو). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج التمثيلية لتدريب DTSC. (أ) أداء واحد خلال الجلسات التي يتم إجراؤها عبر الأيام في نموذج DTSC. تشير الخطوط الأفقية إلى الأداء في كل تجربة، مع ألوان دافئة تشير إلى حركة العجلات الخلفية. يشير الخط الرأسي الأسود الموجود في أقصى اليسار إلى بداية CS ، بينما يشير الخط المنقط إلى بدء الولايات المتحدة. يشير الخط الصلب الثاني إلى توقف CS والولايات المتحدة. (ب) أداء الحيوان من (أ) مع آثار فردية مستمدة من متوسط التجربة للجلسة كل يوم. يشير تشبع اللون إلى رقم الجلسة مع تشبع أعلى للجلسات اللاحقة. (ج) الأداء لجميع الحيوانات في مجموعة DTSC (n = 6). تشير الخطوط الرفيعة إلى النسبة المئوية للتجارب التي تحتوي على CR يمكن اكتشافه من كل جلسة لكل. تشير الخطوط السميكة إلى أن الجلسة تعني عبر جميع الحيوانات. (د) التجارب الفردية كما في (أ) من مجموعة حيث أثارت كثافة الولايات المتحدة URs منخفضة السعة. (ه) متوسط آثار الجلسة المعروضة كما في (ب) للحيوانات المعرضة للولايات المتحدة الضعيفة. (و) أداء جميع الحيوانات في DTSC مع ضعف الولايات المتحدة (n = 6). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيديو التكميلي 1: عينة من DEC ضربت وتفوت التجارب. تتم مقارنة تجارب DEC في الفيديو 1. يعرض كل فيديو تجارب يقوم فيها الشخص بإجراء (يسار) أو فشل في جعل (يمين) السجل التجاري المستهدف متزامنا ويتم تشغيله جنبا إلى جنب للمقارنة. يأتي LED CS عندما يظهر المربع الأزرق في الزاوية العلوية اليسرى من كل فيديو. تكون إشارة التحكم الأمريكية نشطة عندما يحل مربع أبيض محل المربع الأزرق. CS وإشارات التحكم الأمريكية تنتهي عندما يختفي المربع. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو تكميلي 2: عينة DTSC ضرب وتفوت التجارب. يعرض الفيديو 2 مقارنة تجريبية DTSC. يعرض كل فيديو تجارب يقوم فيها الشخص بإجراء (يسار) أو فشل في جعل (يمين) السجل التجاري المستهدف متزامنا ويتم تشغيله جنبا إلى جنب للمقارنة. يأتي LED CS عندما يظهر المربع الأزرق في الزاوية العلوية اليسرى من كل فيديو. تكون إشارة التحكم الأمريكية نشطة عندما يحل مربع أبيض محل المربع الأزرق. CS وإشارات التحكم الأمريكية تنتهي عندما يختفي المربع. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن استخدام النظام الأساسي مع البروتوكولات المرتبطة به الموضحة هنا لتتبع سلوك الحيوان بشكل موثوق في مهمتين تعليميتين ترابطيتين حسيتين. تعتمد كل مهمة على التواصل السليم من خلال مسار الألياف المتسلقة. في التصميم الموصوف هنا ، نقوم بدمج عناصر لتسهيل التعلم والتسجيل / اضطراب استجابة المخيخ. وتشمل هذه عجلة للسماح بحرية الحركة11,18 وكذلك تثبيت الرأس. تسمح العجلة لموضوعات الماوس بالقاطرة بحرية ، والتي لوحظ أنها ضرورية لاكتساب DEC18. يسمح تثبيت الرأس في الفئران للباحثين بالاستفادة من الأساليب الوراثية والكهروفيزيولوجية والتصوير والبصريات الجينية التي يصعب استخدامها في الأنواع النموذجية الأخرى أو في ظل ظروف تتحرك بحرية12. لقد استخدمنا تصميمنا لكل من هذه التطبيقات. يمكن بسهولة تكييف البرنامج الذي يعمل على المتحكمات الدقيقة للتحكم في إشارات التوقيت للحصول على الفوتونات المتعددة أو مزامنتها مع التحفيز البصري الجيني ، وكلاهما بدقة دون المللي ثانية. يجب توخي الحذر لتقليل إدراك الحيوان للمعدات البصرية الوراثية والتصوير عندما يتم دمجها مع التجارب السلوكية. على سبيل المثال ، تصدر العديد من أنظمة الفوتونات المتعددة صوتا مسموعا من الماسحات الضوئية أو المصاريع الجلفانومترية عند بدء عمليات الاستحواذ على التصوير. إذا تم تشغيل عمليات الاستحواذ من خلال بدء التجربة ، فإن مثل هذه الأصوات يمكن أن تكون بمثابة إشارة غير مقصودة إلى الأشخاص الذين يخضعون للحيوانات بأن الحافز قادم.
يتم بناء التحكم في الجهاز السلوكي حول SBC ، والذي يستخدم لإنشاء واجهة مستخدم رسومية لإدارة التجربة والكاميرا وتصدير البيانات. يرسل SBC أيضا أوامر إلى اثنين من المتحكمات الدقيقة التي تتعامل مع توقيت التجارب وتتحكم مباشرة في مكونات الأجهزة مثل عرض التحفيز وجهاز التشفير الدوار. تم اختبار البروتوكولات المفصلة هنا إما باستخدام Raspberry Pi 3B + أو 4B المرفقة ب Arduino بسبب توقيت تجربة التحكم و Arduino Uno للتحكم في عرض DTSC US. تطبيقات تصميم الأجهزة الأخرى ممكنة ولكن لم يتم اختبارها مع البرامج المقدمة.
لتسهيل استخدام منصات متعددة بالتوازي ، نوصي بتشغيل SBC في وضع "بلا رأس". في هذا التكوين، يتم استخدام كمبيوتر مضيف للتفاعل مع SBC. يسمح محول إيثرنت بالاتصال بالإنترنت في وقت واحد لكل من الكمبيوتر المضيف وكذلك SBC. يسمح المفتاح أيضا بالاتصال المباشر بين المضيف و SBC مع نقل البيانات بسرعة. ونتيجة لذلك ، يسمح المحول بسهولة نقل البيانات وصيانة حزمة SBC.
لتشغيل منصات متعددة بالتوازي ، يجب وضع كل جهاز في حاوية متخصصة خاصة به. يجب أن تتضمن هذه العبوات عازلا للصوت إذا وضعت على مقربة من بعضها البعض. يمكن أن يساعد قمع الصوت بين الحفارات المجاورة على تجنب الإشارات السمعية غير المقصودة من المحفزات المنتجة في العبوات المجاورة.
إن استخدام منصة واحدة ل DEC و DTSC يمكن الباحثين من التنقل بمرونة في نقاط القوة والضعف في كل نموذج. تتمتع DEC برؤية مستمدة من عقود من البحث حول مناطق الدماغ وعناصر الدائرة المخيخية المحددة التي تشارك في تعلم المهام وتنفيذها1،4،11،13،14،15،19. ومع ذلك ، في الفئران ، تقع منطقة قشرة المخيخ المرتبطة غالبا بتكييف غمضة العين 11,12 في عمق الشق المخيخي الأولي (على الرغم من رؤية 15,17,27 التي تظهر منطقة مرتبطة ب DEC من الفصيص السطحي السادس). إن الموضع العميق للتعلم يعقد الوصول إلى التجارب البصرية، وخاصة التصوير متعدد الفوتونات لنشاط الخلايا وتجارب الاضطراب البصري الوراثي. في المقابل ، تقع ركائز المخيخ من DTSC جزئيا في الجانب السطحي من الفصيصات IV / V20. لذلك يقدم DTSC وصولا بصريا مشابها لتلك الموجودة في القشرة المخية الجديدة الظهرية ، وهو موقع شائع لتحقيقات علم الأعصاب في الأنظمة.
في تصميمنا ، يتم تتبع سلوك الحيوان باستخدام جهاز تشفير دوار متصل بالعجلة وكاميرا. لقد اخترنا هذه الطرق لانخفاض التكلفة وسهولة التنفيذ. وفي بعض الحالات، قد توفر طرق تتبع أخرى مزيدا من الدقة المكانية والزمانية. على سبيل المثال ، تم تتبع موضع الجفن في DEC عادة باستخدام مستشعرات تأثير هول 28,29 أو تسجيلات مخطط كهربية العضل للمنطقة المحيطة بالحجاج من العضلات orbicularis oculi 30,31. وبالمثل ، فإن تتبع الحركة عن طريق اكتشاف حركة العجلات يعطي صورة أقل تفصيلا لسلوك الحيوان من خوارزميات تتبع الوضع القائمة على الصور مثل SLEAP32 و DeepLabCut33. تسمح التسجيلات القائمة على الكاميرا بإضافة مثل هذه النهج.
هنا ، قدمنا منصة لتتبع سلوك الحيوان خلال نموذجين للتعلم الترابطي يعتمد على الألياف المتسلقة. تهدف منصتنا إلى زيادة إمكانية الوصول إلى هذه الأساليب من حيث التكلفة وكذلك سهولة التنفيذ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
يتم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة العقلية NRSA F32 MH120887-03 (إلى G.J.B.) و R01 NS045193 و R01 MH115750 (إلى S.S-H.W). نشكر الدكتورين باس كويكويك وهينك جان بويل على المناقشات المفيدة لتحسين إعداد DEC والدكتورين يو وانغ وشياو يينغ تشن على المناقشات المفيدة لتحسين إعداد DTSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "B" Quick Base For C&B METABOND - 10 mL bottle | Parkell | S398 | Dental cement solvent |
| "C" Universal TBB Catalyst - 0.7 mL | Parkell | S371 | Catalyst |
| #8 Washers | Thorlabs | W8S038 | Washers |
| 0.250" (1/4") x 8.00" Stainless Steel Precision Shafting | Servocity | 634172 | 1/4" shaft |
| 0.250” (0.770") Clamping Hub | Servocity | 545588 | Clamping hub |
| 1/4" to 6 mm Set Screw Shaft Coupler- 5 pack | Actobotics | 625106 | Shaft-coupling sleeve |
| 1/4"-20 Cap Screws, 3/4" Long | Thorlabs | SH25S075 | 1/4" bolt |
| 100 pcs 5 mm 395–400 nm UV Ultraviolet LED Light Emitting Diode Clear Round Lens 29 mm Long Lead (DC 3V) LEDs Lights +100 pcs Resistors | EDGELEC | ED_YT05_U_100Pcs | CS LEDs |
| 2 m Micro HDMI to DVI-D Cable - M/M - 2 m Micro HDMI to DVI Cable - 19 pin HDMI (D) Male to DVI-D Male - 1920 x 1200 Video | Star-tech | HDDDVIMM2M | Raspberry Pi4B to monitor cable |
| 256 GB Ultra Fit USB 3.1 Flash Drive | SanDisk | SDCZ430-256G-G46 | USB thumb drive |
| 3.3 V–5 V 4 Channels Logic Level Converter Bi-Directional Shifter Module | Amazon | B00ZC6B8VM | Logic level shifter |
| 32 GB 95 MB/s (U1) microSDHC EVO Select Memory Card | Samsung | MB-ME32GA/AM | microSD card |
| 4.50" Aluminum Channel | Servocity | 585444 | 4.5" aluminum channel |
| 48-LED CCTV Ir Infrared Night Vision Illuminator | Towallmark | SODIAL | Infrared light array |
| 4PCS Breadboards Kit Include 2PCS 830 Point 2PCS 400 Point Solderless Breadboards for Proto Shield Distribution Connecting Blocks | REXQualis | B07DL13RZH | Breadboard |
| 5 Port Gigabit Unmanaged Ethernet Network Switch | TP-Link | TL-SG105 | Ethernet switch |
| 5 V 2.5 A Raspberry Pi 3 B+ Power Supply/Adapter | Canakit | DCAR-RSP-2A5 | Power supply for Raspberry Pi 3B+ |
| 5-0 ETHILON BLACK 1 x 18" C-3 | Ethicon | 668G | Sutures |
| 6 mm Shaft Encoder 2000 PPR Pushpull Line Driver Universal Output Line Driver Output 5-26 V dc Supply | Calt | B01EWER68I | Rotary encoder |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 1", 5 Pack | Thorlabs | TR1-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | Thorlabs | TR2-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 4", 5 Pack | Thorlabs | TR4-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 6", 5 Pack | Thorlabs | TR6-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Post Holder, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 2" | Thorlabs | PH2 | Optical post holder |
| Adapter-062-M X LUER LOCK-F | The Lee Co. | TMRA3201950Z | Solenoid valve luer adapter |
| Aeromat Foam Roller Size: 36" Length | Aeromat | B002H3CMUE | Foam roller |
| Aluminum Breadboard 10" x 12" x 1/2", 1/4"-20 Taps | Thorlabs | MB1012 | Aluminum breadboard |
| Amazon Basics HDMI to DVI Adapter Cable, Black, 6 Feet, 1-Pack | Amazon | HL-007347 | Raspberry Pi3B+ to monitor cable |
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | Arduino Uno (microcontroller board) |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Arduino Due (microcontroller board) |
| Bench Power Supply, Single, Adjustable, 3 Output, 0 V, 24 V, 0 A, 2 A | Tenma | 72-8335A | Power supply |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet, 12" x 24" x 1/8" | McMaster Carr | 8560K257 | Acrylic sheet |
| CNC Stepper Motor Driver 1.0–4.2 A 20–50 V DC 1/128 Micro-Step Resolutions for Nema 17 and 23 Stepper Motor | Stepper Online | B06Y5VPSFN | Stepper motor driver |
| Compact Compressed Air Regulator, Inline Relieving, Brass Housing, 1/4 NPT | McMaster Carr | 6763K13 | Air source regulator |
| Cotton Swab | Puritan | 806-WC | Cotton swab |
| Dell 1908FP 19" Flat Panel Monitor - 1908FPC | Dell | 1908FPC | Computer monitor |
| Flex Cable for Raspberry Pi Camera | Adafruit | 2144 | camera serial interface cable |
| High Torque Nema 17 Bipolar Stepper Motor 92 oz·in/65 N·cm 2.1 A Extruder Motor | Stepper Online | 17HS24-2104S | Stepper motor |
| Isoflurane | Henry Schein | 66794001725 | Isoflurane |
| Krazy Maximum Bond Permanent Glue, 0.18 oz. | Krazy Glue | KG483 | Cyanoacrylate glue |
| Lidocaine HCl | VetOne | 510212 | Lidocaine |
| Low-Strength Steel Hex Nut, Grade 2, Zinc-Plated, 1/4"-20 Thread Size | McMaster Carr | 90473A029 | Nuts |
| M3 x 50 mm Partially Threaded Hex Key Socket Cap Head Screws 10 pcs | Uxcell | A16040100ux1380 | M3 bolt |
| NEMA 17 Stepper Motor Mount | ACTOBOTICS | 555152 | Stepper motor mount |
| Official Raspberry Pi Power Supply 5.1 V 3 A with USB C - 1.5 m long | Adafruit | 4298 | Power supply for Raspberry Pi 4B |
| Optixcare Dog & Cat Eye Lube Lubricating Gel, 0.70-oz tube | Optixcare | 142422 | Opthalimic ointment |
| Precision Stainless Steel Ball Bearing, Shielded, Trade No. R188-2Z, 13000 rpm Maximum Speed | McMaster-Carr | 3759T57 | Bearing |
| Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 6" | Adafruit | 266 | Wires |
| Premium Female/Male 'Extension' Jumper Wires - 40 x 6" (150 mm) | Adafruit | 826 | Wires |
| Premium Male/Male Jumper Wires - 40 x 6" | Adafruit | 758 | Wires |
| Radiopaque L-Powder for C&B METABOND - 5 g | Parkell | S396 | Dental cement powder |
| Raspberry Pi (3B+ or 4B) | Adafruit | 3775 or 4295 | Raspberry Pi |
| Raspberry Pi NoIR Camera Module V2 - 8MP 1080P30 | Raspberry Pi Foundation | RPI3-NOIR-V2 | Raspberry NoIR V2 camera |
| Right-Angle Bracket, 1/4" (M6) Counterbored Slot, 8-32 Taps | Thorlabs | AB90E | Right-angle bracket |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 3/16" Hex | Thorlabs | RA90 | Right-angle optical post clamp |
| Right-Angle End Clamp for Ø1/2" Posts, 1/4"-20 Stud and 3/16" Hex | Thorlabs | RA180 | Right-angle end clamp |
| RJ45 Cat-6 Ethernet Patch Internet Cable | Amazon | CAT6-7FT-5P-BLUE | Ethernet cable |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Posts, 360° Continuously Adjustable, 3/16" Hex | Thorlabs | SWC | Rotating optical post clamps |
| Spike & Hold Driver-0.1 TO 5 MS | The Lee Co. | IECX0501350A | Solenoid valve driver |
| Swivel Base Adapter | Thorlabs | UPHA | Post holder adapter |
| USB 2.0 A-Male to Micro B Cable, 6 feet | Amazon | 7T9MV4 | USB2 type A to USB2 micro cable |
| USB 2.0 Printer Cable - A-Male to B-Male, 6 Feet (1.8 m) | Amazon | B072L34SZS | USB2 type B to USB2 type A cable |
| VHS-M/SP-12 V | The Lee Co. | INKX0514900A | Solenoid valve |
| Zinc-Plated Steel 1/4" washer, OD 1.000" | McMaster Carr | 91090A108 | Washers |
References
- McCormick, D. A., Lavond, D. G., Clark, G. A., Kettner, R. E., Rising, C. E., Thompson, R. F. The engram found? Role of the cerebellum in classical conditioning of nictitating membrane and eyelid responses. Bulletin of the Psychonomic Society. 18 (3), 103-105 (1981).
- McCormick, D. A., Clark, G. A., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Initial localization of the memory trace for a basic form of learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (8), 2731-2735 (1982).
- McCormick, D. A., Thompson, R. F. Cerebellum: essential involvement in the classically conditioned eyelid response. Science. 223 (4633), New York, N.Y. 296-299 (1984).
- Krupa, D. J., Thompson, J. K., Thompson, R. F. Localization of a memory trace in the mammalian brain. Science. 260 (5110), New York, N.Y. 989-991 (1993).
- Llinás, R., Sugimori, M. Electrophysiological properties of in vitro Purkinje cell dendrites in mammalian cerebellar slices. The Journal of Physiology. 305, 197-213 (1980).
- Mintz, M., Lavond, D. G., Zhang, A. A., Yun, Y., Thompson, R. F. Unilateral inferior olive NMDA lesion leads to unilateral deficit in acquisition and retention of eyelid classical conditioning. Behavioral and Neural Biology. 61 (3), 218-224 (1994).
- Welsh, J. P., Harvey, J. A. Cerebellar lesions and the nictitating membrane reflex: performance deficits of the conditioned and unconditioned response. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 9 (1), 299-311 (1989).
- Mauk, M. D., Steinmetz, J. E., Thompson, R. F. Classical conditioning using stimulation of the inferior olive as the unconditioned stimulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (14), 5349-5353 (1986).
- Steinmetz, J. E., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Classical conditioning in rabbits using pontine nucleus stimulation as a conditioned stimulus and inferior olive stimulation as an unconditioned stimulus. Synapse. 3 (3), New York, N.Y. 225-233 (1989).
- Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Adaptive timing of motor output in the mouse: The role of movement oscillations in eyelid conditioning. Frontiers in Integrative Neuroscience. 5, 72 (2011).
- Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Cerebellar-dependent expression of motor learning during eyeblink conditioning in head-fixed mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14845-14853 (2014).
- Heiney, S. A., Kim, J., Augustine, G. J., Medina, J. F. Precise control of movement kinematics by optogenetic inhibition of purkinje cell activity. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2321-2330 (2014).
- Ten Brinke, M. M., et al. Evolving models of pavlovian conditioning: Cerebellar cortical dynamics in awake behaving mice. Cell Reports. 13 (9), 1977-1988 (2015).
- Gao, Z., et al. Excitatory cerebellar nucleocortical circuit provides internal amplification during associative conditioning. Neuron. 89 (3), 645-657 (2016).
- Giovannucci, A., et al. Cerebellar granule cells acquire a widespread predictive feedback signal during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (5), 727-734 (2017).
- Ten Brinke, M. M., et al. Dynamic modulation of activity in cerebellar nuclei neurons during pavlovian eyeblink conditioning in mice. eLife. 6, 28132 (2017).
- Wang, X., Yu, S., Ren, Z., De Zeeuw, C. I., Gao, Z. A FN-MdV pathway and its role in cerebellar multimodular control of sensorimotor behavior. Nature Communications. 11 (1), 6050 (2020).
- Albergaria, C., Silva, N. T., Pritchett, D. L., Carey, M. R. Locomotor activity modulates associative learning in mouse cerebellum. Nature Neuroscience. 21 (5), 725-735 (2018).
- Kim, O. A., Ohmae, S., Medina, J. F. A cerebello-olivary signal for negative prediction error is sufficient to cause extinction of associative motor learning. Nature Neuroscience. 23 (12), 1550-1554 (2020).
- Yamada, T., et al. Sensory experience remodels genome architecture in neural circuit to drive motor learning. Nature. 569 (7758), 708-713 (2019).
- Horlington, M. Startle response circadian rhythm in rats: lack of correlation with motor activity. Physiology & Behavior. 5 (1), 49-53 (1970).
- Yeomans, J. S., Li, L., Scott, B. W., Frankland, P. W. Tactile, acoustic and vestibular systems sum to elicit the startle reflex. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 26 (1), 1-11 (2002).
- Raspberry Pi Operating system images. , Available from: https://www.raspberrypi.com/software/operationg-systems/ (2021).
- VNC Server. VNC® Connect. , Available from: https://www.realvnc.com/en/connect/download/vnc/ (2021).
- Anaconda: The world's most popular data science platform. , Available from: https://xddebuganaconda.xdlab.co/ (2021).
- De Zeeuw, C. I., Ten Brinke, M. M.
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique. Journal of Neurophysiology. 88 (4), 2124-2133 (2002).
- Kloth, A. D., et al. Cerebellar associative sensory learning defects in five mouse autism models. eLife. 4, 06085 (2015).
- Boele, H. -J., Koekkoek, S. K. E., De Zeeuw, C. I. Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 3, (2010).
- Lin, C., Disterhoft, J., Weiss, C. Whisker-signaled eyeblink classical conditioning in head-fixed Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53310 (2016).
- Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).
