Summary
Vi har udviklet en enkelt platform til at spore dyrs adfærd under to klatrende fiberafhængige associative læringsopgaver. Det billige design muliggør integration med optogenetiske eller billeddannende eksperimenter rettet mod klatring fiber-associeret cerebellær aktivitet.
Abstract
Klatring af fiberindgange til Purkinje-celler giver lærerige signaler, der er kritiske for cerebellum-afhængig associativ læring. At studere disse signaler i hovedfaste mus letter brugen af billeddannelse, elektrofysiologiske og optogenetiske metoder. Her blev der udviklet en billig adfærdsmæssig platform (~ $ 1000), der muliggør sporing af associativ læring hos hovedfiknede mus, der locomote frit på et løbehjul. Platformen indeholder to fælles associative læringsparadigmer: øjenblinkkonditionering og forsinket taktil forskrækkelseskonditionering. Adfærd spores ved hjælp af et kamera og hjulbevægelsen af en detektor. Vi beskriver komponenterne og opsætningen og leverer en detaljeret protokol til træning og dataanalyse. Denne platform tillader inkorporering af optogenetisk stimulering og fluorescensbilleddannelse. Designet gør det muligt for en enkelt værtscomputer at styre flere platforme til træning af flere dyr samtidigt.
Introduction
Pavlovian konditionering af sub-sekund sammenhæng mellem stimuli for at fremkalde et betinget svar har længe været brugt til at undersøge cerebellær-afhængig læring. For eksempel lærer dyr i klassisk forsinkelsesøjenblinkkonditionering (DEC) at lave et veltimet beskyttelsesblink som reaktion på en neutral betinget stimulus (CS; f.eks. Et lysglimt eller auditiv tone), når det parres gentagne gange med en ubetinget stimulus (USA; f.eks. Et pust af luft påført hornhinden), som altid fremkalder et refleksblink, og som kommer ved eller nær slutningen af CS. Det lærte respons kaldes et betinget respons (CR), mens refleksresponsen kaldes det ubetingede respons (UR). Hos kaniner forstyrrer cerebellum-specifikke læsioner denne form for læring 1,2,3,4. Endvidere giver Purkinje-cellekompleksspidser, drevet af deres klatrefiberindgange5, et nødvendigt 6,7 og tilstrækkeligt 8,9 signal til erhvervelse af korrekt timede KR'er.
For nylig er klatring af fiberafhængige associative læringsparadigmer blevet udviklet til hovedfaste mus. DEC var det første associative læringsparadigme, der blev tilpasset denne konfiguration10,11. DEC i hovedfiknede mus er blevet brugt til at identificere cerebellære regioner 11,12,13,14,15,16,17 og kredsløbselementer 11,1 2,13,14,15,18,19 der er nødvendige for opgaveerhvervelse og udryddelse. Denne tilgang er også blevet brugt til at demonstrere, hvordan den fysiologiske repræsentation af opgaveparametre på celleniveau udvikler sig med læring 13,15,16.
Ud over eyeblink blev det forsinkede forskrækkelsestaktile konditioneringsparadigme (DTSC) for nylig udviklet som en ny associativ læringsopgave for hovedfikerede mus20. Konceptuelt ligner DEC, DTSC involverer præsentationen af en neutral CS med en US, et tryk på ansigtet, der er tilstrækkeligt i intensitet til at engagere enforskrækkelsesrefleks 21,22 som UR. I DTSC-paradigmet læses både UR og CR ud som baglæns bevægelse på et hjul. DTSC er nu blevet brugt til at afdække, hvordan associativ læring ændrer cerebellær aktivitet og mønstre af genekspression20.
I dette arbejde blev der udviklet en metode til fleksibel anvendelse af DEC eller DTSC i en enkelt platform. Stimulus- og platformsattributterne er skematiseret i figur 1. Designet indeholder evnen til at spore dyreadfærd med et kamera samt en roterende encoder til at spore musens bevægelse på et hjul. Alle aspekter af datalogning og prøvestruktur styres af parrede mikrocontrollere (Arduino) og en single-board computer (SBC; Hindbær Pi). Disse enheder kan tilgås via en medfølgende grafisk brugergrænseflade. Her præsenterer vi en arbejdsgang til opsætning, forberedelse og udførelse af eksperimenter og en tilpasset analysepipeline til datavisualisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dyreprotokoller, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Animal Care and Use Committees ved Princeton University.
1. Opsætning af SBC
- Tilslut CSI-kablet (Camera Serial Interface) til Raspberry NoIR V2-kameraet og kameraporten på SBC.- (Camera Serial Interface).
- Download operativsystemet til SBC til værtscomputeren. Skriv operativsystemets billede til et mikrosikkert digitalt (microSD) kort.
BEMÆRK: Detaljerede instruktioner til disse procedurer for en Raspberry Pi SBC kan findes andetsteds23. Systemet er testet ved hjælp af følgende operativsystemer: Stretch, Buster, Bullseye. - For at aktivere sikker shell-kommunikation skal du oprette en udvidelsesløs fil kaldet "ssh" i opstartspartitionen på microSD-kortet. Når dette er gjort, skal du skubbe microSD-kortet ud af værtsmaskinen og indsætte det i SBC microSD-kortsporet. Tænd for SBC ved at tilslutte strømforsyningen.
- Forbered SBC'en til at acceptere en kabelforbindelse til værten.
- Fastgør en skærm med et passende kabel til SBC. Åbn en terminal, skriv kommandoen ifconfig og optag SBC's ethernet-IP-adresse.
BEMÆRK: Raspberry Pi model 3B + har en HDMI-skærmport, mens model 4B har en mikro-HDMI-port. - Gå til fanen Interface i Raspberry Pi-konfigurationsindstillingen, og aktiver indstillingerne for Kamera, SSH (Secure Shell Network Protocol) og Virtual Network Computing (VNC).
- Fastgør en skærm med et passende kabel til SBC. Åbn en terminal, skriv kommandoen ifconfig og optag SBC's ethernet-IP-adresse.
- Opret en kabelforbindelse mellem værtscomputeren og SBC.-
- Tilslut et Ethernet-kabel til Ethernet-porten på SBC og en værtscomputer. Fastgør den anden ende af disse kabler til en Ethernet-switch.
- Brug en virtuel netværkscomputerklient som VNC viewer24 og få adgang til skrivebordet ved hjælp af SBC IP-adressen og standardgodkendelsen (bruger = "pi", adgangskode = "hindbær").
- Download påkrævet software inkluderet i protokoltrinnene.
FORSIGTIG: Skift standardbrugernavn og adgangskode for at forhindre uautoriseret adgang til SBC.- Indtast følgende kommando i SBC-terminalen for at downloade rigsoftwaren:
git klon --dybde=1 https://github.com/gerardjb/assocLearnRig - Indtast følgende kommandoer for at downloade de nødvendige pythonbiblioteker.
cd assocLearnRig
python3 setup.py - For at tillade direkte kontrol over mikrocontrolleren skal du oprette forbindelse til SBC og downloade mikrocontrollerens integrerede udviklingsmiljø (IDE) ved at følge trin 1.6.4-1.6.7.
- Åbn webbrowseren på SBC-skrivebordet, og naviger til https://arduino.cc/en/software. Download den nyeste Linux ARM 32 bit version af IDE.
- Åbn et terminalvindue på SBC-skrivebordet, og naviger til downloads-biblioteket ved at skrive cd-downloads /
- For at installere IDE skal du skrive følgende kommandoer i terminalen:
tar -xf arduino--linuxarm.tar.xz
sudo mv arduino-/opt
sudo /opt/arduino-/install.sh
(herer versionen af den downloadede IDE) - Åbn en forekomst af mikrocontroller-IDE på SBC-skrivebordet. Vælg menupunkt Værktøjer > Administrer biblioteker. Installer biblioteket "Encoder" fra Paul Stoffregen.
- Indtast følgende kommando i SBC-terminalen for at downloade rigsoftwaren:
- Udvid SBC-indbygget hukommelse med et USB-tommelfingerdrev.
- Indsæt et tommelfingerdrev i en USB-port på SBC. Brug en USB 3.0-port, hvis den er tilgængelig.
- Indtast terminalen ls -l / dev / disk / by-uuid / for at finde tommelfingerdrevet og dets unikke reference (UUID). Optag UUID.
- For at give pi-brugeren mulighed for at skrive til USB-enheden skal du skrive følgende kommandoer en efter en i terminalen:
sudo mkdir /media/usb
sudo chown -R pi:pi /media/usb
sudo mount /dev/sda1 /media/usb -o uid=pi,gid=pi
BEMÆRK: Tommelfingerdrevet kan tilføjes som en enhed, der automatisk monteres, når SBC genstarter ved at tilføje følgende linje til slutningen af fstab-filen ved / etc / fstab:
UUID=/media/usb vfat auto,nofail,noatime,users,rw,uid=pi,gid=pi 0 0
2. Ledningsføring af stimulushardware og samlingsfase
- Tilslut og forbered mikrocontrollere.
- Tilslut SBC til programmeringsporten på mikrocontrolleren (Arduino Due) med et USB2 type A til USB2 mikrokabel.
BEMÆRK: Brug et kabel af høj kvalitet som produktet i materialetabellen for at sikre korrekt drift. - Find "dueAssocLearn.ino" i det downloadede projektlager. Åbn skitsen med mikrocontrolleren IDE, og upload den til mikrocontrolleren, der er tilsluttet SBC.
- Download og installer den relevante version af Arduino IDE på værtscomputeren.
- Tilslut værtscomputeren til mikrocontrolleren (Arduino Uno) med et USB2 type B til USB2 type A-kabel.
- Gå til GitHub-lageret (https://github.com/gerardjb/assocLearnRig) og download skitsen "DTSC_US.ino" til værtscomputeren.
- På værtscomputeren skal du køre mikrocontrolleren IDE og åbne skitsen "DTSC_US.ino" og derefter uploade den til mikrocontrolleren.
- Tilslut SBC til programmeringsporten på mikrocontrolleren (Arduino Due) med et USB2 type A til USB2 mikrokabel.
- Fastgør ledninger til mikrocontrollerne, breadboard, LED'er, roterende encoder, stepmotor med driver og magnetventil med driver som angivet i Fritzing-diagrammet i figur 2.
- Tænd for stepmotoren og magnetventilen.
- Korrekt tilslutte en kanal af en strømforsyning til +V- og GND-stifterne på steppermotordriveren.
- Tænd for strømforsyningen, og indstil den tilsluttede kanalspænding til 25 V.
BEMÆRK: Hvis forbindelserne mellem stepmotoren, føreren og strømforsyningen er korrekt konfigureret, tændes en grøn indikator-LED på stepmotordriveren. - Korrekt ledning af den positive ledning til en strømforsyning til magnetventildriveren hold spændingsstiften og den anden positive ledning til spidsspændingsstiften.
- Fastgør de negative ledninger til en jord, der deles med styresignalet.
- Tænd for strømforsyningen, og indstil den kanal, der er tilsluttet holdspændingen, til ca. 2,5 V og kanalen, der er tilsluttet spidsspænding, til ca. 12 V.
- Tilslut en luftkilde, der er reguleret til et tryk på ~20 PSI, til magnetventilen ved hjælp af lueradapteren.
- Test, at alle stimuluskomponenter og kamera fungerer korrekt.
- Åbn en terminal på SBC'en, og skriv cd ~/assocLearnRig for at navigere til det klonede GitHub-lager.
- Skriv python3 assocLearnRig_app.py i terminalen for at starte den grafiske brugergrænseflade til kontrol.
- Start kamerastrømmen ved at trykke på Stream knap.
- Vælg DEC-alternativknappen , upload til mikrocontrolleren, og start en session med standardparametre ved at trykke på knappen Start session .
BEMÆRK: Efter dette trin skal der vises en udskrift af dataloggen i terminalen, meddelelsen på kamerastrømmen skal forsvinde, og LED CS og magnetventilen US skal tænde og slukke på passende tidspunkter under hver prøveperiode. - Når sessionen er afsluttet, skal du gentage de foregående trin med DTSC-alternativknappen valgt.
BEMÆRK: Skitser i GitHub-lageret ("testStepper.ino", "testRotary.ino" og "testSolenoid.ino") kan bruges til at teste individuelle komponenter, hvis ovenstående trin ikke giver tilfredsstillende resultater.
- Lav løbehjulet.
- Skær et 3" hjul af en foam roller. Bor et 1/4" hul i det nøjagtige hjulcenter, så hjulet ikke slingrer, når det drejes af musens bevægelse.
- Indsæt en 1/4" aksel i hjulet, og fastgør den på plads ved hjælp af fastspændingsnav placeret på hver side af hjulet.
- Anbring den roterende encoder på en 4,5" aluminiumskanal ved hjælp af en M3-bolt. Stabiliser aluminiumskanalen på aluminiumsbrødbrættet ved hjælp af et retvinklet beslag med en 1/4 "bolt, møtrik og skive som vist.
- Fastgør hjulet og den roterende encoder ved hjælp af en akselkoblingsmuffe.
- Stabiliser den frie side af hjulakslen med et leje indsat i en retvinklet endeklemme installeret på en breadboard-monteret optisk stolpe.
BEMÆRK: Sørg for, at hjulet drejer frit uden at vakle, når det drejes manuelt. - Placer stimulushardware, nakkestøtte, infrarødt lysarray og picamera omkring det samlede hjul.
- Placer nakkestøtterne ved hjælp af optiske stolper og retvinklede stolpeklemmer, så hovedstolperne er 1,5 cm foran hjulakslen og 2 cm over hjuloverfladen. (Værdierne er for en 20 g mus).
- Placer CS LED- og magnetventiludløbet, der bruges til DEC US, mindre end 1 cm fra det øje, der bruges til DEC.
- Monter stepmotoren, der bruges til DTSC US
- Monter picameraen på en optisk stolpe ~ 10 cm fra, hvor dyret vil være.
BEMÆRK: Designet til picamera-holderen kan laves på en 3D-printer fra filen i "RaspPiCamMount1_1.stl" i GitHub-lageret. - Placer det infrarøde lysarray lidt over og direkte vendt mod ansigtets position på samme side som picameraen.
- Lav en taktil stimulus til DTSC ved at tape skum til kanten af et stykke akryl monteret på en 1/4" aksel ved hjælp af et fastspændingsnav. Fastgør den taktile stimulus til steppermotorakslen.
BEMÆRK: Designet til akrylstykket kan laserskæres efter mønsteret i "TactileStimDesign.pdf" i GitHub-lageret.
3. Forberedelse og kørsel af adfærdseksperimenter
- Implantering af musehovedplade.
- Anæstesi en mus ved hjælp af 2% isofluran og hovedfiksering i en stereotaktisk ramme.
- Påfør en oftalmisk salve på øjnene.
- Barber hovedbunden ved hjælp af sæbevand og en steril skalpel. Injicer lidokain direkte under huden på snitstedet og rengør det kirurgiske sted med povidon.
- Lav et snit med en skalpel langs hovedbundens midterlinje fra bagkanten af øjnene til bagkanten af kraniet, og pas på ikke at trykke for hårdt på kraniet.
- Spred snittet åbent og klem begge sider med sterile hæmostater for at holde det åbent. Fjern forsigtigt periosteum ved hjælp af en vatpind dyppet med ethanol og lad overfladen af det udsatte kranium tørre.
- Placer hovedpladens niveau på kraniet, og sørg for at placere forsiden af hovedpladen bagud til øjnene. Brug cyanoacrylatlim til at fastgøre hovedpladen til kraniet og lade limen tørre helt.
- Bland dental cementpulver (1 scoop), opløsningsmiddel (2 dråber) og katalysator (1 dråbe) i en blandeskål og påfør på alle områder af udsat knogle. Tilføj lag, indtil overfladen flugter med hovedpladens øverste kant, og sørg for, at hovedpladen er sikkert fastgjort til kraniet.
- Sutur huden lukket bag og foran hovedpladen, hvis det er nødvendigt.
- Injicer postoperativ analgesi såsom carprofen i henhold til institutionelle retningslinjer, samtidig med at dyret kan komme sig i mindst 5 dage.
- Forberedelse til adfærdssessioner.
- Lad forsøgsdyrene vænne sig til platformen ved at montere dem i nakkestøtten i 30 minutters sessioner i 5 dage forud for forsøgene.
BEMÆRK: Ved afslutningen af tilvænningssessionerne skal dyrene løbe komfortabelt på rattet. - (Kun DEC) Før sessioner skal du sikre dig, at magnetventiludløbet er centreret om måløjet placeret >1 cm væk.
- (Kun DEC) Aktiver en luftpust manuelt ved hjælp af trykknappen. Sørg for, at musen straks producerer et blink uden at vise åbenlyse tegn på stress, såsom at vedtage en bøjet kropsholdning eller gribe den berørte periokulære region med den ipsilaterale forpote.
- (Kun DTSC) Før sessioner skal du sikre dig, at den taktile stimulus er centreret om dyrets næse placeret ~ 1,5 cm væk.
BEMÆRK: Når en DTSC-adfærdssession ikke kører, inaktiveres stepmotoren automatisk for at muliggøre manuel omplacering. - (Kun DTSC) Skriv python3 assocLearnRig_app.py i SBC-terminalen for at starte GUI'en.
- (Kun DTSC) Kør en testsession med tre prøveversioner med standardparametrene ved at trykke på knappen Start session i GUI'en.
- (Kun DTSC) Sørg for, at de loggede data, der udskrives til terminalen, viser en afbøjning på mere end 20, men mindre end 100 trin, der er logget på den roterende encoder efter USA ved hver prøveversion.
FORSIGTIG: For at undgå skade og reducere stress for dyret skal du starte stimulansen længere væk fra dyret og flytte det tættere på, indtil de krævede betingelser er opfyldt.
- Lad forsøgsdyrene vænne sig til platformen ved at montere dem i nakkestøtten i 30 minutters sessioner i 5 dage forud for forsøgene.
- Kørsel af adfærdsmæssige sessioner med datalogning.
- Monter en mus på nakkestøtten.
- Skriv python3 assocLearnRig_app.py i terminalen på SBC for at starte GUI'en.
- For at tillade kameraoptagelser under adfærdsforsøgene skal du trykke på Stream knap.
BEMÆRK: Sessioner kan køres uden kamera. I dette tilfælde logges kun data fra den roterende encoder og stimuluspræsentationstidsstempler. - Indtast identificerende oplysninger for dyret i feltet Dyre-id, og tryk på knappen Indstil .
- Vælg enten DEC eller DTSC fra alternativknappen under overskriften Sessionstype , afhængigt af hvilket adfærdsparadigme der ønskes.
- Indtast de ønskede eksperimentparametre i felterne under feltet Dyre-id, og tryk på knappen Upload til Arduino .
BEMÆRK: Detaljer om eksperimentparametrene findes i afsnittet GitHub-lager readme. - Tryk på Start session knappen for at starte sessionen.
- Når en session initialiseres, begynder data at logge på en ny mappe, der er oprettet i "/media/usb" i SBC-tommelfingerens drevmonteringspunkt.
4. Eksport og analyse af data
- For at eksportere alle de optagede sessioner til værtscomputeren skal du åbne en kommandoprompt og indtaste kommandoen pscp -r pi@Pi_IP_address: / media / usb * host_computer_destination og derefter godkende med SBC-adgangskoden.
BEMÆRK: Ovenstående kommando er til en Windows-maskine. På Mac- og Linux-maskiner skal du bruge terminal og erstatte "pscp" med "scp". - Installer Anaconda25 eller en anden python-pakkehåndtering (PPM) på værtscomputeren.
- Gå til GitHub-lageret og download "analyzeSession.py", "summarizeSessions.py", "session2mp4s.py" og "requirementsHost.txt".
- Åbn en PPM-prompt, og skriv conda install --file directory_containing_requirementsHostrequirements Host.txt for at sikre, at Python-pakkeinstallationen har de nødvendige pythonbiblioteker.
- Skriv cd-directory_containing_analyzeData i prompten for at navigere til mappen, der indeholder "analyzeData.py" og "session2mp4s.py". Kør analyseprogrammet ved at skrive python analyzeSession.py
BEMÆRK: Der genereres en fejlmeddelelse, hvis du bruger en Python 2-version som python. For at kontrollere versionen skal du skrive python -V i prompten. - Vælg den mappe, der indeholder dataene, når du bliver bedt om det. Mapper med flere undermapper analyseres sekventielt.
- For DEC-sessioner skal du for hver analyseret sessionsmappe vælge et interesseområde (ROI), der indeholder musens øje, fra et gennemsnitligt prøvebillede.
BEMÆRK: Endelige analysedatafiler og oversigtsgrafer udfyldes til en undermappe for hver analyseret sessionsmappe. - Skriv python summarizeSessions.py for at generere oversigtsdata på tværs af flere sessioner.
- Indtast prompt python-session2mp4s.py for at konvertere billeddatafiler til synbare .mp4 filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Workflow til DEC-eksperimenter og -analyse
Korrekt valg af eksperimentel parameter er vigtig for vellykket forsinkelse af eyeblink conditioning (DEC) træning. For de data, der præsenteres her, blev GUI'en brugt til at vælge en CS-varighed på 350 ms og en amerikansk varighed på 50 ms. Denne parring resulterer i et interstimulansinterval på 300 ms: længe nok til at forhindre CR-produktion med lav amplitude10 og kort nok til at undgå at komme ind i regimet med dårlig læring eller sporkonditionering, en proces, der engagerer yderligere hjerneområder11. Tiden mellem forsøgene blev indstillet ved hjælp af ITI lave og høje felter til at blive tilfældigt valgt ensartet fra et område på 5-15 s. Randomiseringen af interforsøgsintervallerne gør det umuligt for dyreforsøgspersoner at bruge andre timingsignaler end CS og USA selv til opgaveudførelse.
Herunder forsøg, der udelader enten CS eller USA, tillader vurdering af CR- og UR-kinematikken selv hos uddannede dyr. Brugeren kan definere andelen af forsøg, hvor CS og USA parres eller præsenteres isoleret. I de data, der blev præsenteret her, kørte vi alle sessioner på 10% CS-only-forsøg med parrede forsøg, der udgør resten, og ingen us-only-forsøg. Bemærk, at hvis du inkluderer et for stort antal uparrede forsøg, kan det have en negativ indvirkning på træningen. For eksempel bruges sessioner med mere end 50% af forsøgene uparrede almindeligvis til at drive udryddelsen af PR'er hos trænede dyr19,26.
Kameraforberedelse og lysforhold er også afgørende for at erhverve data af høj kvalitet. Billedhastigheden for erhvervelse kan justeres i Picamera-anskaffelsessoftwaren. I de data, der præsenteres her, indstiller vi en billedhastighed på 120 Hz til DEC-eksperimenter. Picamera-modulet i sig selv tillader billedhastigheder på op til ~ 200 Hz, men vi finder ud af, at lavere hastigheder forhindrer billedtab og giver tilstrækkelig tidsmæssig opløsning til øjenlågssporing. Det infrarøde lys skal placeres for at belyse den periokulære pels jævnt uden at skabe overdreven refleksion fra hornhinden, når øjet er åbent. Figur 3A viser et eksempelbillede fra en optagelsessession med acceptabel belysning. Picamera-anskaffelsessoftwaren (picameraStream.py) er designet til at give ensartede indstillinger på tværs af en session ved at indstille og holde kameraets hvidbalance og forstærkning baseret på belysningsforholdene, når kameraet initialiseres.
Når en adfærdssession er initialiseret, logges data fra kameraet og andre hardwarekomponenter på platformen automatisk. Datalogfiler oprettes i en mappe, der er navngivet efter dato- og værdiinput til feltet Dyre-id i GUI'en. Kamerarammer og tidsstempler for hver prøveversion gemmes i individuelle filer, der navngives ved hjælp af dyre-id' et, forsøgsdatoen og forsøgsnummeret. Platformshændelser for hver session, herunder hjulhastighed, prøvestart, prøvestop og CS- og AMERIKANSK timing, gemmes som en enkelt .txt fil.
Data, der overføres til værtsmaskinen, kan derefter analyseres som beskrevet i protokollens afsnit 4. Hvis du kører analyzeData.py i en målmappe, oprettes der en .npy-container til øjenlågsposition versus tid for alle forsøg i et array baseret på analyse af kamerafilerne. Denne containerfil oprettes i den mappe, der analyseres. Når alle sessioner er blevet analyseret for et givet dyr, kan alle sessioner justeres og sammenkædes ved hjælp af summarizeSessions.py. Resultater fra et dyr, der er trænet til 8 sessioner af DEC, er vist i figur 3B. Derudover kan individuelle prøveversioner gengives som gennemtrængelige .mp4 filer ved hjælp af værktøjet session2mp4s.py. Dette værktøj aftrykker en firkant i øverste venstre hjørne af filmen for at angive, hvornår CS og USA anvendes. Prøve DEC-forsøg udarbejdet på denne måde præsenteres side om side som supplerende video 1. Det venstre panel viser et forsøg, hvor dyret med succes lukker øjet som reaktion på LED CS. I højre panel blinker dyret ikke, før USA starter.
Dyr, der er trænet i DEC i hænde efter protokollerne i afsnit 3 og registreret med de foregående overvejelser, bør vise klar dokumentation for veltimede PR'er, der er erhvervet gradvist over flere træningsdage. Eksempler på adfærdsmæssige spor uden CR'er i et utrænet dyr og spor, der indeholder robuste CR'er fra et trænet dyr, er vist i figur 3B. Som disse spor viser, bør naive dyr ikke vise noget svar på CS, men et robust svar på USA. PR'er bør stige gradvist i både størrelse og frekvens gennem adfærdsmæssige sessioner udført på tværs af dage (figur 3B-D). I modsætning hertil begrænser suboptimale lysforhold alvorligt kvaliteten af de indsamlede data. Når kontrasten mellem øjet og den omgivende pels er lav (figur 3E), kan små ændringer i billedet ændre UR'ens registrerede form betydeligt over en enkelt session og reducere signal-støj-forholdet til detektering af øjenlågsposition (figur 3F-G).
For at sikre øjenlågsoptagelser i høj nøjagtighed er optimal placering af lyskilder afgørende. Belysnings-LED'en skal trænes direkte på det optagede øje. Hvis placering resulterer i overdreven blænding på hornhindeoverfladen, en diffusor kan placeres over LED-arrayet for at reducere denne effekt.
Workflow til DTSC-eksperimenter og -analyse
Mange af overvejelserne for valg af eksperimentel parameter er ens mellem forsinkelse taktil forskrækkelseskonditionering (DTSC) og DEC. Her vil vi påpege dem, der adskiller sig. I eksempeldataene blev DTSC CS-varigheden sat til 250 ms med en amerikansk varighed på 50 ms. Dette kortere interstimulansinterval blev valgt for at være i nøje overensstemmelse med den kortere varighed, der beskrives som optimal for DTSC-læring20. Andre platformsparametre, der blev indstillet via GUI'en, var identiske med dem, der blev brugt til DEC.
Korrekt placering af den taktile stimulus er afgørende for læring i DTSC. Vi monterer den taktile stimulus således, at skumenden er centreret lidt over dyrets næse i en afstand på ca. 1,5 cm, når den er i neutral position. Når den er monteret, kan stimulussen drejes manuelt, når en session ikke kører. Under sessioner holder stepmotoren stimulansen på et præcist sted, indtil en AMERIKANSK udløses. For at sikre, at positionen er korrekt, kører vi en forberedende session på omkring tre forsøg. Hændelser, der er logget på den roterende encoder, udskrives til terminalskærmen, og denne udskrift kan bruges til at overvåge amplituden af dyre-UR'er i realtid. Mens den maksimale amplitude vil variere fra forsøg til forsøg, skal dyr med et gennemsnitligt maksimum på ~ 40 tæller på koderen på tværs af den korte session klare sig godt i DTSC-opgaven. Baseret på de roterende encoderkontrolindstillinger svarer denne værdi til 24 cm / s, med en negativ værdi, der angiver, at dyret bevæger sig baglæns på hjulet.
Organiseringen og navngivningen af filer, der produceres i løbet af DTSC-sessioner, er den samme som dem, der produceres i DEC. Running analyzeSession.py opretter en .npy-container til hjulhastighed versus tid for alle forsøg i en matrix fra analyse af de data, der er logget i .csv-filen. Når alle sessioner er blevet analyseret for et givet dyr, kan alle sessioner justeres og sammenkædes ved hjælp af summarizeSession.py. Resultater fra et dyr, der er trænet i 5 sessioner af DEC, er vist i figur 4A. Hvad angår DEC, kan kameraets optagelser fra DTSC konverteres til evisbare .mp4 filer. Eksempler på DTSC-forsøg vises side om side i Supplerende video 2. Det venstre panel viser et forsøg, hvor dyret med succes bakker hjulet som reaktion på LED CS. I højre panel undlader dyret at bevæge hjulet, før den taktile stimulus US påføres.
Tidsforløbet og amplituden i forhold til UR for reaktioner hos dyr, der er uddannet på DTSC-paradigmet, viser kvalitative ligheder med dem, der er uddannet på DEC. Naive dyr bør ikke vise noget svar på CS og lære at bevæge hjulet baglæns som reaktion på CS først efter gentagne eksponeringer for den parrede CS og USA. Frekvensen og amplituden af PR'er stiger, efterhånden som træningen fortsætter (figur 4A,B). I tilfælde af DTSC har vi fundet ud af, at UR-amplitude tidligt i træningen er en god forudsigelse for succesen med at lære. I en kohorte af dyr, der blev trænet med et USA, der producerede UR'er med lav amplitude (<20 cm / s), lærte intet dyr konsekvent at producere CR'er efter 4 dages træning (figur 4C, D).
Forskelle mellem DEC- og DTSC-træning
DEC og DTSC adskiller sig på vigtige måder. For det første sker DTSC-læring på denne platform hurtigere, hvor de fleste dyr opnår en høj grad af opgavefærdighed inden den tredje træningsdag og asymptotisk præstation på dag fem. DEC-læring er langsommere for de fleste dyr med mindst 3 dage. For det andet indeholder DTSC-systemet automatisk detektion af vellykkede CER'er, som tjener som et feedbacksignal til apparatet for at reducere amplituden af den taktile stimulus. Denne træningsprocedure efterligner øjenblinkkonditionering, hvor forbedret CR-ydeevne giver delvis beskyttelse mod en aversiv hornhindeluftpust. I modsætning hertil er hovedfiknede dyr i DTSC-paradigmet ikke i stand til at beskytte sig mod den taktile stimulus ved deres motoriske respons alene. Ved at basere amerikansk amplitude på tilstedeværelsen af en CR har dyr mulighed for at beskytte sig mod den aversive stimulus.
Figur 1: Platformsattributter og design. (A) Platformselementer til registrering af dyrs adfærd under hovedfaste forhold. Musen blev tilpasset fra et Biorender-billede. (B) Timing og stimuli til DEC og DTSC konditionering. Et brugerdefineret interstimulansinterval (ISI) bestemmer, hvor længe CS-epoken kun varer. CS og amerikanske epoker er designet til at co-opsige. (C) Billede, der viser placeringen af centrale platformselementer. 1) Stepmotor til kontrol af DTSC US. 2) Løbehjul til dyret. 3) Roterende encoder til sporing af hjulbevægelse. 4) Skum tapet over en akrylarm, der fungerer som DTSC taktil stimulus. 5) LED CS. 6) Magnetventil og udløb, der giver DEC US. 7) Picamera til registrering af dyrs adfærd. 8) Infrarød LED til scenebelysning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ledninger af platformhardwareelementer. (A) Fritzing ledningsdiagram over platformshardware, når den er fuldt monteret. Ledninger farves af moduler med orange = Kameramodul; gul = DEC US modul; blå = LED CS-modul; lilla = DTSC US modul; grøn = Roterende encodermodul. Picamera er udelukket, men fastgøres til kameraets serielle grænseflade placeret på overfladen af Raspberry Pi. Batterier angiver jævnstrømsstrømforsyninger ved den angivne spænding. (B-F) Tilsvarende ledningsskema for isolerede moduler. Ledninger er blevet omfarvet, så rød og sort altid angiver henholdsvis positiv forsyningsskinne og jord, mens andre ledninger er farvede for at muliggøre let at følge kredsløbet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative resultater af DEC-træning. (A) Eksempel på kameraramme fra et træningspas med acceptable belysningsforhold. Bemærk den høje kontrast mellem øjet og periokulær pels. (B) Ydeevne af et enkelt dyr under sessioner udført på tværs af dage i DEC-paradigmet. Vandrette linjer angiver ydeevne på hvert forsøg, med varme farver, der indikerer mere øjenlågslukning. Den venstre røde sorte lodrette linje angiver starten på CS, mens den prikkede linje angiver indledningen af USA. Den anden faste linje indikerer ophør af CS og USA. Bemærk, at antallet af forsøg med vellykkede svar under CS stiger på tværs af træningspas. (C) Dyrs præstationer fra (B) med individuelle spor afledt af forsøgsgennemsnittet for sessionen hver dag. Farvemætningen angiver sessionsnummer med højere mætning for senere sessioner. D) Ydeevne for alle dyr i DEC-gruppen (n = 7). De tynde linjer angiver procentdelen af forsøg med en påviselig CR fra hver session for hvert dyr. De tykke linjer angiver sessionsmidlerne på tværs af alle dyr. (E) Eksempel på kameraramme fra en session med suboptimale belysningsforhold. (F) Kvantificering af enkeltforsøg registreret med dårlig belysning. UR'en kan detekteres, men med lavere kontrast og højere variabilitet end under optimale lysforhold. (G) Sessionsgennemsnitsspor fra forsøg præsenteret i (F). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative resultater af DTSC-træning. (A) Udførelse af et enkelt dyr under sessioner udført på tværs af dage i DTSC-paradigmet. Vandrette linjer angiver ydeevne på hvert forsøg, med varme farver, der angiver baglæns hjulbevægelse. Den venstre sorte lodrette linje angiver starten på CS, mens den prikkede linje angiver indledningen af USA. Den anden faste linje indikerer ophør af CS og USA. (B) Dyrs præstationer fra (A) med individuelle spor afledt af forsøgsgennemsnittet for sessionen hver dag. Farvemætningen angiver sessionsnummer med højere mætning for senere sessioner. C) Ydeevne for alle dyr i DTSC-gruppen (n = 6). De tynde linjer angiver procentdelen af forsøg med en påviselig CR fra hver session for hvert dyr. De tykke linjer angiver sessionsmidlerne på tværs af alle dyr. (D) Enkeltforsøg som i (A) fra en kohorte, hvor den amerikanske intensitet fremkaldte UR'er med lav amplitude. (E) Sessionsgennemsnitsspor præsenteret som i (B) for de dyr, der udsættes for det svage USA. (F) Ydeevne for alle dyr i DTSC med svagt USA (n = 6). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende video 1: Eksempel på DEC hit and miss-forsøg. DEC-forsøg sammenlignes i video 1. Hver video viser forsøg, hvor forsøgspersonen foretager (venstre) eller undlader at gøre (højre) målet CR synkroniseret og afspillet side om side til sammenligning. LED-CS tændes, når den blå firkant vises i øverste venstre hjørne af hver video. Det amerikanske styresignal er aktivt, når en hvid firkant erstatter den blå firkant. CS og amerikanske styresignaler slutter sammen, når pladsen forsvinder. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende video 2: Prøve DTSC hit and miss forsøg. Video 2 viser DTSC-prøvesammenligning. Hver video viser forsøg, hvor forsøgspersonen foretager (venstre) eller undlader at gøre (højre) målet CR synkroniseret og afspillet side om side til sammenligning. LED-CS tændes, når den blå firkant vises i øverste venstre hjørne af hver video. Det amerikanske styresignal er aktivt, når en hvid firkant erstatter den blå firkant. CS og amerikanske styresignaler slutter sammen, når pladsen forsvinder. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Platformen med tilhørende protokoller, der er skitseret her, kan bruges til pålideligt at spore dyreadfærd i to sensoriske associative læringsopgaver. Hver opgave afhænger af intakt kommunikation gennem klatrefiberbanen. I det design, der er beskrevet her, inkorporerer vi elementer for at lette læring og optagelse / forstyrrelse af cerebellær respons. Disse omfatter et hjul, der giver mulighed for fri bevægelse 11,18 samt hovedfiksering. Hjulet gør det muligt for musemotiver at locomote frit, hvilket er blevet observeret at være kritisk for DEC-erhvervelse18. Hovedfiksering i mus gør det muligt for forskere at drage fordel af genetiske, elektrofysiologiske, billeddannende og optogenetiske tilgange, der er vanskeligere at bruge i andre modelarter eller under frit bevægelige forhold12. Vi har brugt vores design til hver af disse applikationer. Softwaren, der kører på mikrocontrollerne, kan let tilpasses til at styre timingsignaler til multifotonopsamling eller synkronisering med optogenetisk stimulering, begge med submilliumsekunders præcision. Der skal udvises omhu for at minimere dyrenes opfattelse af optogenetisk og billeddannende udstyr, når disse kombineres med adfærdsmæssige eksperimenter. For eksempel udsender mange multifotonsystemer en hørbar lyd fra deres galvanometriske scannere eller skodder, når billedindsamlinger starter. Hvis erhvervelserne udløses af forsøgsstart, kan sådanne lyde tjene som et utilsigtet signal til dyreforsøgspersoner om, at en stimulus er på vej.
Kontrol af adfærdsapparatet er bygget op omkring en SBC, som bruges til at generere en grafisk brugergrænseflade til styring af eksperimentet, kameraet og dataeksporten. SBC sender også kommandoer til to mikrocontrollere, der håndterer tidspunktet for forsøg og direkte styrer hardwarekomponenter såsom stimuluspræsentation og den roterende encoder. Protokollerne, der er beskrevet her, blev testet ved hjælp af enten en Raspberry Pi 3B + eller 4B knyttet til en Arduino På grund af kontroleksperimentets timing og en Arduino Uno til at kontrollere præsentationen af DTSC US. Andre hardwaredesignimplementeringer er mulige, men er ikke blevet testet med den medfølgende software.
For at lette brugen af flere rigge parallelt anbefaler vi at betjene SBC i "hovedløs" tilstand. I denne konfiguration bruges en værtscomputer til at interagere med SBC. En ethernet-switch tillader samtidig internetforbindelse til både en værtscomputer såvel som SBC. Kontakten giver også mulighed for direkte kommunikation mellem værten og SBC med hurtig dataoverførsel. Som et resultat giver kontakten mulighed for nem dataoverførsel og vedligeholdelse af SBC-pakken.
For at køre flere rigge parallelt skal hver rig placeres i sit eget specialiserede kabinet. Disse anlæg skal omfatte lydisolering, hvis de placeres i umiddelbar nærhed af hinanden. Undertrykkelse af lyd mellem tilstødende rigge kan hjælpe med at undgå utilsigtede auditive signaler fra stimuli produceret i naboskabe.
Brug af en enkelt platform til DEC og DTSC gør det muligt for efterforskere fleksibelt at navigere i hvert paradigmes styrker og svagheder. DEC nyder indsigt afledt af årtiers forskning i, hvilke hjerneområder og specifikke cerebellære kredsløbselementer der er involveret i opgaveindlæring og udførelse 1,4,11,13,14,15,19. I mus er regionen af den cerebellære cortex, der oftest er forbundet med øjenblinkkonditionering 11,12, imidlertid placeret dybt inde i den primære cerebellære sprække (se dog 15,17,27, som viser en DEC-associeret region af overfladisk lobule VI). Et dybt sted for læring komplicerer adgangen til optiske eksperimenter, især multifotonbilleddannelse af celleaktivitet og optogenetiske forstyrrelseseksperimenter. I modsætning hertil er de cerebellære substrater af DTSC delvist placeret i det overfladiske aspekt af lobula IV / V20. DTSC præsenterer derfor optisk adgang, der kan sammenlignes med den dorsale neocortex, et populært sted for systemneurovidenskabelige undersøgelser.
I vores design spores dyreadfærd ved hjælp af en roterende encoder fastgjort til hjulet og et kamera. Vi valgte disse metoder til lave omkostninger og nem implementering. I nogle tilfælde kan andre sporingsmetoder give mere rumlig og tidsmæssig nøjagtighed. For eksempel er øjenlågsposition i DEC almindeligvis blevet sporet ved hjælp af Hall-effektsensorer 28,29 eller elektromyogramoptagelser af periorbitalområdet i musculus orbicularis oculi 30,31. Tilsvarende giver sporing af bevægelse ved at detektere hjulbevægelse et mindre detaljeret billede af dyreadfærd end billedbaserede posesporingsalgoritmer som SLEAP32 og DeepLabCut33. Kamerabaserede optagelser tillader tilføjelse af sådanne tilgange.
Her har vi præsenteret en platform til sporing af dyreadfærd under to klatrende fiberafhængige associative læringsparadigmer. Vores platform er beregnet til at øge tilgængeligheden af disse metoder både med hensyn til omkostninger såvel som nem implementering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af tilskud fra National Institutes of Mental Health NRSA F32 MH120887-03 (til G.J.B.) og R01 NS045193 og R01 MH115750 (til S.S-H.W.). Vi takker Dr. Bas Koekkoek og Henk-Jan Boele for nyttige diskussioner til optimering af DEC-opsætningen og Dr. Yue Wang og Xiaoying Chen for nyttige diskussioner til optimering af DTSC-opsætningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "B" Quick Base For C&B METABOND - 10 mL bottle | Parkell | S398 | Dental cement solvent |
| "C" Universal TBB Catalyst - 0.7 mL | Parkell | S371 | Catalyst |
| #8 Washers | Thorlabs | W8S038 | Washers |
| 0.250" (1/4") x 8.00" Stainless Steel Precision Shafting | Servocity | 634172 | 1/4" shaft |
| 0.250” (0.770") Clamping Hub | Servocity | 545588 | Clamping hub |
| 1/4" to 6 mm Set Screw Shaft Coupler- 5 pack | Actobotics | 625106 | Shaft-coupling sleeve |
| 1/4"-20 Cap Screws, 3/4" Long | Thorlabs | SH25S075 | 1/4" bolt |
| 100 pcs 5 mm 395–400 nm UV Ultraviolet LED Light Emitting Diode Clear Round Lens 29 mm Long Lead (DC 3V) LEDs Lights +100 pcs Resistors | EDGELEC | ED_YT05_U_100Pcs | CS LEDs |
| 2 m Micro HDMI to DVI-D Cable - M/M - 2 m Micro HDMI to DVI Cable - 19 pin HDMI (D) Male to DVI-D Male - 1920 x 1200 Video | Star-tech | HDDDVIMM2M | Raspberry Pi4B to monitor cable |
| 256 GB Ultra Fit USB 3.1 Flash Drive | SanDisk | SDCZ430-256G-G46 | USB thumb drive |
| 3.3 V–5 V 4 Channels Logic Level Converter Bi-Directional Shifter Module | Amazon | B00ZC6B8VM | Logic level shifter |
| 32 GB 95 MB/s (U1) microSDHC EVO Select Memory Card | Samsung | MB-ME32GA/AM | microSD card |
| 4.50" Aluminum Channel | Servocity | 585444 | 4.5" aluminum channel |
| 48-LED CCTV Ir Infrared Night Vision Illuminator | Towallmark | SODIAL | Infrared light array |
| 4PCS Breadboards Kit Include 2PCS 830 Point 2PCS 400 Point Solderless Breadboards for Proto Shield Distribution Connecting Blocks | REXQualis | B07DL13RZH | Breadboard |
| 5 Port Gigabit Unmanaged Ethernet Network Switch | TP-Link | TL-SG105 | Ethernet switch |
| 5 V 2.5 A Raspberry Pi 3 B+ Power Supply/Adapter | Canakit | DCAR-RSP-2A5 | Power supply for Raspberry Pi 3B+ |
| 5-0 ETHILON BLACK 1 x 18" C-3 | Ethicon | 668G | Sutures |
| 6 mm Shaft Encoder 2000 PPR Pushpull Line Driver Universal Output Line Driver Output 5-26 V dc Supply | Calt | B01EWER68I | Rotary encoder |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 1", 5 Pack | Thorlabs | TR1-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | Thorlabs | TR2-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 4", 5 Pack | Thorlabs | TR4-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 6", 5 Pack | Thorlabs | TR6-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Post Holder, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 2" | Thorlabs | PH2 | Optical post holder |
| Adapter-062-M X LUER LOCK-F | The Lee Co. | TMRA3201950Z | Solenoid valve luer adapter |
| Aeromat Foam Roller Size: 36" Length | Aeromat | B002H3CMUE | Foam roller |
| Aluminum Breadboard 10" x 12" x 1/2", 1/4"-20 Taps | Thorlabs | MB1012 | Aluminum breadboard |
| Amazon Basics HDMI to DVI Adapter Cable, Black, 6 Feet, 1-Pack | Amazon | HL-007347 | Raspberry Pi3B+ to monitor cable |
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | Arduino Uno (microcontroller board) |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Arduino Due (microcontroller board) |
| Bench Power Supply, Single, Adjustable, 3 Output, 0 V, 24 V, 0 A, 2 A | Tenma | 72-8335A | Power supply |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet, 12" x 24" x 1/8" | McMaster Carr | 8560K257 | Acrylic sheet |
| CNC Stepper Motor Driver 1.0–4.2 A 20–50 V DC 1/128 Micro-Step Resolutions for Nema 17 and 23 Stepper Motor | Stepper Online | B06Y5VPSFN | Stepper motor driver |
| Compact Compressed Air Regulator, Inline Relieving, Brass Housing, 1/4 NPT | McMaster Carr | 6763K13 | Air source regulator |
| Cotton Swab | Puritan | 806-WC | Cotton swab |
| Dell 1908FP 19" Flat Panel Monitor - 1908FPC | Dell | 1908FPC | Computer monitor |
| Flex Cable for Raspberry Pi Camera | Adafruit | 2144 | camera serial interface cable |
| High Torque Nema 17 Bipolar Stepper Motor 92 oz·in/65 N·cm 2.1 A Extruder Motor | Stepper Online | 17HS24-2104S | Stepper motor |
| Isoflurane | Henry Schein | 66794001725 | Isoflurane |
| Krazy Maximum Bond Permanent Glue, 0.18 oz. | Krazy Glue | KG483 | Cyanoacrylate glue |
| Lidocaine HCl | VetOne | 510212 | Lidocaine |
| Low-Strength Steel Hex Nut, Grade 2, Zinc-Plated, 1/4"-20 Thread Size | McMaster Carr | 90473A029 | Nuts |
| M3 x 50 mm Partially Threaded Hex Key Socket Cap Head Screws 10 pcs | Uxcell | A16040100ux1380 | M3 bolt |
| NEMA 17 Stepper Motor Mount | ACTOBOTICS | 555152 | Stepper motor mount |
| Official Raspberry Pi Power Supply 5.1 V 3 A with USB C - 1.5 m long | Adafruit | 4298 | Power supply for Raspberry Pi 4B |
| Optixcare Dog & Cat Eye Lube Lubricating Gel, 0.70-oz tube | Optixcare | 142422 | Opthalimic ointment |
| Precision Stainless Steel Ball Bearing, Shielded, Trade No. R188-2Z, 13000 rpm Maximum Speed | McMaster-Carr | 3759T57 | Bearing |
| Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 6" | Adafruit | 266 | Wires |
| Premium Female/Male 'Extension' Jumper Wires - 40 x 6" (150 mm) | Adafruit | 826 | Wires |
| Premium Male/Male Jumper Wires - 40 x 6" | Adafruit | 758 | Wires |
| Radiopaque L-Powder for C&B METABOND - 5 g | Parkell | S396 | Dental cement powder |
| Raspberry Pi (3B+ or 4B) | Adafruit | 3775 or 4295 | Raspberry Pi |
| Raspberry Pi NoIR Camera Module V2 - 8MP 1080P30 | Raspberry Pi Foundation | RPI3-NOIR-V2 | Raspberry NoIR V2 camera |
| Right-Angle Bracket, 1/4" (M6) Counterbored Slot, 8-32 Taps | Thorlabs | AB90E | Right-angle bracket |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 3/16" Hex | Thorlabs | RA90 | Right-angle optical post clamp |
| Right-Angle End Clamp for Ø1/2" Posts, 1/4"-20 Stud and 3/16" Hex | Thorlabs | RA180 | Right-angle end clamp |
| RJ45 Cat-6 Ethernet Patch Internet Cable | Amazon | CAT6-7FT-5P-BLUE | Ethernet cable |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Posts, 360° Continuously Adjustable, 3/16" Hex | Thorlabs | SWC | Rotating optical post clamps |
| Spike & Hold Driver-0.1 TO 5 MS | The Lee Co. | IECX0501350A | Solenoid valve driver |
| Swivel Base Adapter | Thorlabs | UPHA | Post holder adapter |
| USB 2.0 A-Male to Micro B Cable, 6 feet | Amazon | 7T9MV4 | USB2 type A to USB2 micro cable |
| USB 2.0 Printer Cable - A-Male to B-Male, 6 Feet (1.8 m) | Amazon | B072L34SZS | USB2 type B to USB2 type A cable |
| VHS-M/SP-12 V | The Lee Co. | INKX0514900A | Solenoid valve |
| Zinc-Plated Steel 1/4" washer, OD 1.000" | McMaster Carr | 91090A108 | Washers |
References
- McCormick, D. A., Lavond, D. G., Clark, G. A., Kettner, R. E., Rising, C. E., Thompson, R. F. The engram found? Role of the cerebellum in classical conditioning of nictitating membrane and eyelid responses. Bulletin of the Psychonomic Society. 18 (3), 103-105 (1981).
- McCormick, D. A., Clark, G. A., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Initial localization of the memory trace for a basic form of learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (8), 2731-2735 (1982).
- McCormick, D. A., Thompson, R. F. Cerebellum: essential involvement in the classically conditioned eyelid response. Science. 223 (4633), New York, N.Y. 296-299 (1984).
- Krupa, D. J., Thompson, J. K., Thompson, R. F. Localization of a memory trace in the mammalian brain. Science. 260 (5110), New York, N.Y. 989-991 (1993).
- Llinás, R., Sugimori, M. Electrophysiological properties of in vitro Purkinje cell dendrites in mammalian cerebellar slices. The Journal of Physiology. 305, 197-213 (1980).
- Mintz, M., Lavond, D. G., Zhang, A. A., Yun, Y., Thompson, R. F. Unilateral inferior olive NMDA lesion leads to unilateral deficit in acquisition and retention of eyelid classical conditioning. Behavioral and Neural Biology. 61 (3), 218-224 (1994).
- Welsh, J. P., Harvey, J. A. Cerebellar lesions and the nictitating membrane reflex: performance deficits of the conditioned and unconditioned response. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 9 (1), 299-311 (1989).
- Mauk, M. D., Steinmetz, J. E., Thompson, R. F. Classical conditioning using stimulation of the inferior olive as the unconditioned stimulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (14), 5349-5353 (1986).
- Steinmetz, J. E., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Classical conditioning in rabbits using pontine nucleus stimulation as a conditioned stimulus and inferior olive stimulation as an unconditioned stimulus. Synapse. 3 (3), New York, N.Y. 225-233 (1989).
- Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Adaptive timing of motor output in the mouse: The role of movement oscillations in eyelid conditioning. Frontiers in Integrative Neuroscience. 5, 72 (2011).
- Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Cerebellar-dependent expression of motor learning during eyeblink conditioning in head-fixed mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14845-14853 (2014).
- Heiney, S. A., Kim, J., Augustine, G. J., Medina, J. F. Precise control of movement kinematics by optogenetic inhibition of purkinje cell activity. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2321-2330 (2014).
- Ten Brinke, M. M., et al. Evolving models of pavlovian conditioning: Cerebellar cortical dynamics in awake behaving mice. Cell Reports. 13 (9), 1977-1988 (2015).
- Gao, Z., et al. Excitatory cerebellar nucleocortical circuit provides internal amplification during associative conditioning. Neuron. 89 (3), 645-657 (2016).
- Giovannucci, A., et al. Cerebellar granule cells acquire a widespread predictive feedback signal during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (5), 727-734 (2017).
- Ten Brinke, M. M., et al. Dynamic modulation of activity in cerebellar nuclei neurons during pavlovian eyeblink conditioning in mice. eLife. 6, 28132 (2017).
- Wang, X., Yu, S., Ren, Z., De Zeeuw, C. I., Gao, Z. A FN-MdV pathway and its role in cerebellar multimodular control of sensorimotor behavior. Nature Communications. 11 (1), 6050 (2020).
- Albergaria, C., Silva, N. T., Pritchett, D. L., Carey, M. R. Locomotor activity modulates associative learning in mouse cerebellum. Nature Neuroscience. 21 (5), 725-735 (2018).
- Kim, O. A., Ohmae, S., Medina, J. F. A cerebello-olivary signal for negative prediction error is sufficient to cause extinction of associative motor learning. Nature Neuroscience. 23 (12), 1550-1554 (2020).
- Yamada, T., et al. Sensory experience remodels genome architecture in neural circuit to drive motor learning. Nature. 569 (7758), 708-713 (2019).
- Horlington, M. Startle response circadian rhythm in rats: lack of correlation with motor activity. Physiology & Behavior. 5 (1), 49-53 (1970).
- Yeomans, J. S., Li, L., Scott, B. W., Frankland, P. W. Tactile, acoustic and vestibular systems sum to elicit the startle reflex. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 26 (1), 1-11 (2002).
- Raspberry Pi Operating system images. , Available from: https://www.raspberrypi.com/software/operationg-systems/ (2021).
- VNC Server. VNC® Connect. , Available from: https://www.realvnc.com/en/connect/download/vnc/ (2021).
- Anaconda: The world's most popular data science platform. , Available from: https://xddebuganaconda.xdlab.co/ (2021).
- De Zeeuw, C. I., Ten Brinke, M. M.
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique. Journal of Neurophysiology. 88 (4), 2124-2133 (2002).
- Kloth, A. D., et al. Cerebellar associative sensory learning defects in five mouse autism models. eLife. 4, 06085 (2015).
- Boele, H. -J., Koekkoek, S. K. E., De Zeeuw, C. I. Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 3, (2010).
- Lin, C., Disterhoft, J., Weiss, C. Whisker-signaled eyeblink classical conditioning in head-fixed Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53310 (2016).
- Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).
