Summary
私たちは、2つの登山繊維依存連想学習タスク中の動物の行動を追跡するための単一のプラットフォームを開発しました。低コストの設計により、繊維関連小脳活動の登山に向けられた光遺伝学的またはイメージング実験との統合が可能になります。
Abstract
プルキンエ細胞への上昇線維入力は、小脳依存性連想学習に不可欠な有益なシグナルを提供する。頭部固定マウスでこれらのシグナルを研究することは、イメージング、電気生理学的、および光遺伝学的方法の使用を容易にする。ここでは、ランニングホイール上で自由に位置決めする頭部固定マウスの連想学習を追跡できる低コストの行動プラットフォーム(〜$ 1000)が開発されました。このプラットフォームには、まばたきコンディショニングと遅延触覚驚愕条件付けの2つの一般的な連想学習パラダイムが組み込まれています。動作はカメラと検出器によるホイールの動きを使用して追跡されます。コンポーネントとセットアップについて説明し、トレーニングとデータ分析のための詳細なプロトコルを提供します。このプラットフォームは、光遺伝学的刺激および蛍光イメージングの組み込みを可能にする。この設計により、単一のホストコンピュータが複数のプラットフォームを制御して、複数の動物を同時に訓練することができます。
Introduction
パブロフ的条件付けは、条件付け応答を惹起する刺激間の1秒未満の関連を、小脳依存性学習をプローブするために長い間使用されてきた。例えば、古典的な遅延アイブリンクコンディショニング(DEC)では、動物は、常に反射的なまばたきを誘発する無条件刺激(米国;例えば、角膜に適用される空気のパフ)と繰り返し対になったときに、中立的な条件刺激(CS;例えば、光の閃光または聴覚的トーン)に応答して、タイミングよく保護点滅することを学び、 CSの終わりまたはその近くに来る。学習された応答は条件付き応答 (CR) と呼ばれ、反射応答は無条件応答 (UR) と呼ばれます。ウサギでは、小脳特異的病変がこの形態の学習を混乱させる1,2,3,4。さらに、Purkinje細胞複合体スパイクは、それらのクライミングファイバー入力5によって駆動され、適切なタイミングのCRの獲得に必要な6,7および十分な8,9信号を提供する。
より最近では、登山繊維依存性連想学習パラダイムが頭部固定マウスのために開発されている。DECは、この構成10,11に適合した最初の連想学習パラダイムであった。頭部固定マウスにおけるDECは、小脳領域11、12、13、14、15、16、17および回路素子11、12、13、14、15、18、19を同定するために用いられてきた タスクの獲得と消滅に必要です。このアプローチはまた、タスクパラメータの細胞レベルの生理学的表現が学習とともにどのように進化するかを実証するためにも使用されている13,15,16。
まばたきに加えて、遅延驚愕触覚条件付け(DTSC)パラダイムは、頭部固定マウス20のための新規連想学習タスクとして最近開発された。概念的にはDECと同様に、DTSCは、米国、URとして驚愕反射21,22に従事するのに十分な強度で顔へのタップを伴う中立的なCSの提示を含む。DTSCパラダイムでは、URとCRの両方が車輪上の後方移動として読み取られます。DTSCは現在、連想学習が小脳活動と遺伝子発現のパターンをどのように変えるかを明らかにするために使用されています20。
本研究では、DECやDTSCを1つのプラットフォームで柔軟に適用する手法を開発した。刺激属性とプラットフォーム属性を図 1に図式化します。この設計には、カメラで動物の行動を追跡する機能と、ホイール上のマウスの動きを追跡するロータリーエンコーダーが組み込まれています。データロギングとトライアル構造のすべての側面は、ペアのマイクロコントローラ(Arduino)とシングルボードコンピュータ(SBC;ラズベリーパイ)。これらのデバイスは、提供されたグラフィカルユーザーインターフェイスを介してアクセスできます。ここでは、セットアップ、実験の準備と実行のためのワークフローと、データ視覚化のためのカスタマイズされた分析パイプラインを紹介します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ここで説明する動物のプロトコルは、プリンストン大学の動物ケアおよび使用委員会によって承認されています。
1. SBC のセットアップ
- カメラシリアルインターフェイス(CSI)ケーブルをラズベリーNoIR V2カメラとSBCのカメラポートに接続します。
- SBC のオペレーティング システムをホスト コンピューターにダウンロードします。オペレーティングシステムイメージをマイクロセキュアデジタル(microSD)カードに書き込みます。
注:ラズベリーパイSBCのこれらの手順の詳細な手順は、他の場所23で見つけることができます。このシステムは、ストレッチ、バスター、ブルズアイのオペレーティングシステムを使用してテストされています。 - セキュアシェル通信を有効にするには、microSDカードのブートパーティションに「ssh」という拡張子のないファイルを作成します。これが完了したら、ホストマシンからmicroSDカードを取り出し、SBC microSDカードスロットに挿入します。SBC の電源プラグを差し込んで、SBC に電力を供給します。
- ホストへの有線接続を受け入れるように SBC を準備します。
- 適切なケーブルでモニターを SBC に接続します。端末を開き、 コマンドifconfig を入力し、SBC のイーサネット IP アドレスを記録します。
メモ:ラズベリーパイモデル3B +にはHDMIディスプレイポートがあり、モデル4BにはマイクロHDMIポートがあります。 - Raspberry Pi 構成設定の [ インターフェイス ] タブに移動し、カメラ、セキュア シェル ネットワーク プロトコル (SSH)、および仮想ネットワーク コンピューティング (VNC) のオプションを有効にします。
- 適切なケーブルでモニターを SBC に接続します。端末を開き、 コマンドifconfig を入力し、SBC のイーサネット IP アドレスを記録します。
- ホスト コンピューターと SBC の間に有線接続を確立します。
- イーサネットケーブルを SBC とホストコンピューターのイーサネットポートに接続します。これらのケーブルのもう一方の端をイーサネットスイッチに接続します。
- VNCビューア24 などの仮想ネットワークコンピューティングクライアントを使用し、SBC IPアドレスとデフォルトの認証(ユーザー= "pi"、パスワード= "ラズベリー")を使用してデスクトップにアクセスします。
- プロトコル手順に含まれる必要なソフトウェアをダウンロードします。
注意: SBC への不正アクセスを防ぐために、デフォルトのユーザー名とパスワードを変更します。- SBC 端末で次のコマンドを入力して、リグソフトウェアをダウンロードします。
git クローン --depth=1 https://github.com/gerardjb/assocLearnRig - 次のコマンドを入力して、必要な Python ライブラリをダウンロードします。
cd assocLearnRig
python3 setup.py - マイクロコントローラを直接制御できるようにするには、SBCに接続し、1.6.4~1.6.7の手順に従ってマイクロコントローラ統合開発環境(IDE)をダウンロードします。
- SBC デスクトップで Web ブラウザーを開き、https://arduino.cc/en/software に移動します。最新の Linux ARM 32 ビット版の IDE をダウンロードします。
- SBC デスクトップでターミナルウィンドウを開き、cd Downloads/ と入力してダウンロードディレクトリに移動します。
- IDE をインストールするには、ターミナルで次のコマンドを入力します。
tar -xf arduino--linuxarm.tar.xz
sudo mv arduino-/opt
sudo /opt/arduino-/install.sh
(ここ<バージョン>はダウンロードしたIDEのバージョンです) - SBCデスクトップでマイクロコントローラIDEのインスタンスを開きます。メニュー オプション「ライブラリの管理>ツール」を選択します。Paul Stoffregen の "Encoder" ライブラリをインストールします。
- SBC 端末で次のコマンドを入力して、リグソフトウェアをダウンロードします。
- USB サムドライブで SBC オンボードメモリを展開します。
- サムドライブを SBC の USB ポートに挿入します。使用可能な場合は、USB 3.0 ポートを使用します。
- 端末 ls -l /dev/disk/by-uuid/ と入力して、サムドライブとその固有の参照 (UUID) を見つけます。UUID を記録します。
- pi ユーザーが USB デバイスに書き込めるようにするには、次のコマンドを端末に 1 つずつ入力します。
sudo mkdir /media/usb
sudo chown -R pi:pi /media/usb
sudo mount /dev/sda1 /media/usb -o uid=pi,gid=pi
メモ: サムドライブは、SBC の再起動時に自動マウントされるデバイスとして、fstab ファイルの末尾の /etc/fstab に次の行を追加することで追加できます。
UUID=<ステップ1.7.2からのUUID> /media/usb vfat自動,失敗なし,ノアタイム,ユーザー,rw,uid=pi,gid=pi 0 0
2. 刺激金具の配線と組立ステージ
- マイクロコントローラを接続して準備します。
- SBCをUSB2タイプAからUSB2マイクロケーブルでマイクロコントローラ(Arduino Due)のプログラミングポートに接続します。
メモ: 適切な動作を保証するために、 材料表の 製品などの高品質のケーブルを使用してください。 - ダウンロードしたプロジェクトリポジトリで "dueAssocLearn.ino" を見つけます。マイクロコントローラIDEでスケッチを開き、SBCに接続されているマイクロコントローラにアップロードします。
- 適切なバージョンのArduinoIDEをホストコンピューターにダウンロードしてインストールします。
- USB2タイプBからUSB2タイプAケーブルでホストコンピュータをマイクロコントローラ(Arduino宇野)に接続します。
- GitHubリポジトリ(https://github.com/gerardjb/assocLearnRig)に移動し、「DTSC_US.ino」スケッチをホストコンピュータにダウンロードします。
- ホストコンピュータでマイクロコントローラIDEを実行し、「DTSC_US.ino」スケッチを開き、マイクロコントローラにアップロードします。
- SBCをUSB2タイプAからUSB2マイクロケーブルでマイクロコントローラ(Arduino Due)のプログラミングポートに接続します。
- 図2のフリッツ 図に示すように、マイクロコントローラ、ブレッドボード、LED、ロータリーエンコーダ、ドライバ付きステッピングモータ、ドライバ付きソレノイドバルブにワイヤを接続します。
- ステッピングモーターとソレノイドバルブに電力を供給します。
- 電源の1チャンネルをステッピングモータドライバの+VピンとGNDピンに正しく配線します。
- 電源装置の電源を入れ、接続されているチャネル電圧を 25 V に設定します。
メモ: ステッピングモーター、ドライバ、および電源装置間の接続が正しく設定されている場合、ステッピングモータードライバーの緑色のインジケータ LED が点灯します。 - 電源装置の正リード線をソレノイドバルブドライバホールド電圧ピンに、もう一方の正リード線をスパイク電圧ピンに正しく配線します。
- 負のリード線を制御信号と共有されるグランドに接続します。
- 電源をオンにし、ホールド電圧に接続されたチャネルを約2.5V、スパイク電圧に接続されたチャネルを約12Vに設定します。
- ルアーアダプターを使用して、約20 PSIの圧力に調整された空気源をソレノイドバルブに接続します。
- すべての刺激成分とカメラが正しく機能していることをテストします。
- SBC でターミナルを開き、「 cd ~/assocLearnRig」 と入力して、複製された GitHub リポジトリに移動します。
- ターミナルで python3 assocLearnRig_app.py と入力して、コントロールのグラフィカルユーザーインターフェイスを起動します。
- [ストリーム] ボタンを押してカメラ ストリーム を開始します。
- DECラジオボタンを選択し、マイクロコントローラにアップロードし、[セッションの開始]ボタンを押してデフォルトパラメータでセッションを開始します。
メモ:この手順の後、データログの印刷が端末に表示され、カメラストリームのメッセージが消え、LED CSとソレノイドバルブUSが各試行中に適切なタイミングでオン/オフされます。 - セッションが終了したら、[ DTSC] ラジオ ボタンを選択して前の手順を繰り返します。
注: GitHub リポジトリ内のスケッチ ("testStepper.ino"、"testRotary.ino"、および "testSolenoid.ino") は、上記の手順で満足のいく結果が得られない場合、個々のコンポーネントをテストするために使用できます。
- ランニングホイールを作ります。
- フォームローラーから3インチホイールを切り取ります。マウスの移動によって回転したときにホイールがぐらつかないように、正確なホイール中央に1/4インチの穴を開けます。
- ホイールに1/4インチシャフトを挿入し、ホイールの両側に配置されたクランプハブを使用して所定の位置に固定します。
- ロータリーエンコーダをM3ボルトを使用して4.5インチのアルミニウムチャンネルに貼り付けます。図に示すように、1/4インチボルト、ナット、およびワッシャーを備えた直角括弧を使用して、アルミニウムブレッドボード上のアルミニウムチャネルを安定させます。
- ホイールとロータリーエンコーダは、シャフトカップリングスリーブを使用して取り付けます。
- ブレッドボードに取り付けられた光学ポストに取り付けられた直角エンドクランプにベアリングを挿入して、ホイールシャフトの自由側を安定させます。
メモ: 手で回転させたときにホイールがぐらつかずに自由に回転するようにしてください。 - 刺激ハードウェア、ヘッドレスト、赤外光アレイ、およびピカメラを組み立てたホイールの周りに配置します。
- 光学式支柱と直角支柱クランプを使用して、ヘッドポストが車軸の前方 1.5 cm、車輪表面から 2 cm 上になるようにヘッドレストを配置します。(値は 20 g マウスの場合です)。
- DEC USに使用したCS LEDと電磁弁出口を、DECに使用する目から1cm以内に配置します。
- DTSC USに使用されているステッピングモーターを取り付けます
- 動物がいる場所から約10cmの光学ポストにピカメラを取り付けます。
メモ: picamera マウントの設計は、GitHub リポジトリの "RaspPiCamMount1_1.stl" のファイルから 3D プリンタで作成できます。 - 赤外光アレイをピカメラと同じ側の面の位置の少し上に置き、直接向きます。
- クランプハブを使用して1/4インチシャフトに取り付けられたアクリルの端にフォームをテーピングすることにより、DTSCの触覚刺激を行います。触覚刺激をステッピングモーターシャフトに取り付けます。
注: アクリル片のデザインは、GitHub リポジトリの "TactileStimDesign.pdf" のパターンに従ってレーザーカットできます。
3. 動作実験の準備と実行
- マウスヘッドプレートの移植。
- 2%イソフルランを使用してマウスを麻酔し、定位フレームで頭部を固定する。
- 眼科用軟膏を眼に塗布する。
- 石鹸水と滅菌メスを使って頭皮を剃ります。切開部位の皮膚の真下にリドカインを注入し、ポビドンで手術部位をきれいにする。
- 頭蓋骨を強く押しすぎないように注意しながら、頭皮の正中線に沿って目の後ろの端から頭蓋骨の後ろの端までメスで切開します。
- 切開部を開き、滅菌止血剤で両側をクランプして開いたままにします。エタノールに浸した綿棒を使用して骨膜を静かに取り除き、露出した頭蓋骨の表面を乾燥させます。
- ヘッドプレートを頭蓋骨に水平に置き、ヘッドプレートの前面を目より後方に配置するようにします。シアノアクリレート接着剤を使用してヘッドプレートを頭蓋骨に取り付け、接着剤を完全に乾燥させます。
- 歯科用セメント粉末(1スクープ)、溶剤(2滴)、触媒(1滴)を混合皿に混ぜ合わせ、露出した骨のすべての領域に塗布する。表面がヘッドプレートの上端と同一平面になるまでレイヤーを追加し、ヘッドプレートが頭蓋骨にしっかりと取り付けられていることを確認します。
- 必要に応じてヘッドプレートの後ろと前に閉じた皮膚を縫合する。
- カルプロフェンなどの術後鎮痛薬を施設のガイドラインに従って注射し、動物が少なくとも5日間回復できるようにします。
- ビヘイビアセッションの準備。
- 実験前の5日間、ヘッドレストに装着して、実験動物をプラットフォームに慣れさせる。
注:慣れセッションの終わりまでに、動物は車輪の上を快適に走るべきです。 - (12 月のみ)セッションの前に、ソレノイドバルブ出口が>1cm離れたターゲットアイの中央にあることを確認してください。
- (12 月のみ)プッシュボタンを使用してエアパフを手動で作動させます。マウスが、直感した姿勢をとったり、罹患した眼周囲領域を同側前足でつかんだりするなど、ストレスの明白な兆候を示さずに、すぐにまばたきをすることを確認します。
- (DTSC のみ)セッションの前に、触覚刺激が動物の鼻の中央にあることを確認してください。
メモ: DTSC 動作セッションが実行されていない場合、ステッピングモータは自動的に非アクティブ化され、手動で再配置できます。 - (DTSC のみ)SBC ターミナルで、 python3 assocLearnRig_app.py と入力して GUI を起動します。
- (DTSC のみ)GUIの [セッションの開始] ボタンを押して、デフォルトのパラメータを使用して3回の試行のテストセッションを実行します。
- (DTSC のみ)端末に印刷されるログに記録されたデータが、各試行で米国に続いてロータリーエンコーダーに記録された20ステップ以上100ステップ未満の偏向を示していることを確認します。
注意: 危害を避け、動物へのストレスを軽減するために、刺激を動物から遠ざけ、必要な条件が満たされるまで刺激を近づけてください。
- 実験前の5日間、ヘッドレストに装着して、実験動物をプラットフォームに慣れさせる。
- データロギングによるビヘイビアセッションの実行。
- マウスをヘッドレストに取り付けます。
- SBC の端末で、 python3 assocLearnRig_app.pyを入力して GUI を起動します。
- 行動試行中にカメラの録画を許可するには、[ ストリーム] ボタンを押します。
メモ: セッションはカメラなしで実行できます。この場合、ロータリーエンコーダからのデータと刺激表示タイムスタンプのみがログに記録されます。 - 動物の識別情報を 動物ID フィールドに入力し、[ 設定] ボタンを押します。
- 望ましい動作パラダイムに応じて、「セッション・タイプ」見出しの下のラジオ・ボタンから DEC または DTSC のいずれかを選択します。
- [ 動物ID ]フィールドの下のフィールドに目的の実験パラメータを入力し、[ Arduinoにアップロード] ボタンを押します。
注: 実験パラメータの詳細については、GitHub リポジトリの README セクションを参照してください。 - [ セッションの開始]ボタンをクリックしてセッション を開始します。
- セッションが初期化されると、SBC サムドライブのマウントポイントの "/media/usb" に作成された新しいディレクトリにデータのログ記録が開始されます。
4. データのエクスポートと分析
- 記録されたすべてのセッションをホスト コンピューターにエクスポートするには、コマンド プロンプトを開き、コマンド pscp -r pi@Pi_IP_address:/media/usb* host_computer_destination を入力し、SBC パスワードで認証します。
注:上記のコマンドは、Windowsマシン用です。MacおよびLinuxマシンでは、ターミナルを使用し、 "pscp"を "scp"に置き換えてください。 - Anaconda25 または別の python パッケージマネージャ (PPM) をホストコンピュータにインストールします。
- GitHub リポジトリに移動し、"analyzeSession.py"、"summarizeSessions.py"、"session2mp4s.py"、および "requirementsHost.txt" をダウンロードします。
- PPM プロンプトを開き、 conda install --file directory_containing_requirementsHostrequirements Host.txt と入力して、Python パッケージのインストールに必要な Python ライブラリがあることを確認します。
- プロンプトで cd directory_containing_analyzeData と入力して、「analyzeData.py」と「session2mp4s.py」を含むディレクトリに移動します。python analyzeSession.py を入力して分析プログラムを実行
注: Python 2 バージョンを Python として使用している場合は、エラー メッセージが生成されます。バージョンを確認するには、プロンプトに 「python -V 」と入力します。 - プロンプトが表示されたら、データを含むディレクトリを選択します。複数のサブディレクトリを持つディレクトリは、順番に分析されます。
- DECセッションの場合、分析されたセッションディレクトリごとに、試行平均画像からマウスの目を含む関心領域(ROI)を選択します。
メモ: 最終解析データファイルとサマリーグラフは、解析された各セッションディレクトリのサブディレクトリに入力されます。 - python summarizeSessions.py と入力すると、複数のセッションにまたがるサマリー データが生成されます。
- プロンプト python session2mp4s.py を入力して、イメージングデータファイルを表示可能な.mp4ファイルに変換します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DEC実験・解析のワークフロー
適切な実験パラメータ選択は、遅延アイブリンクコンディショニング(DEC)トレーニングを成功させるために重要です。ここで示すデータでは、GUI を使用して 350 ミリ秒の CS 期間と 50 ミリ秒の US 期間を選択しました。このペアリングは、300msの刺激間間隔をもたらす:低振幅CR産生10 を防止するのに十分な長さと、不十分な学習またはトレース条件付けの体制に入ることを避けるのに十分な短い、追加の脳領域11に関与するプロセス。試行間隔は、ITIの低フィールドと高フィールドを使用して、5〜15秒の範囲から均一にランダムに選択されるように設定しました。試験間間隔のランダム化により、動物被験者はCSと米国以外のタイミングの手がかりをタスクのパフォーマンスに使用することが不可能になります。
CSまたはUSのいずれかを省略した試験を含めることで、訓練された動物においてもCRおよびUR運動学の評価が可能になる。ユーザは、CSとUSが対になっているか、または単独で提示される試験の割合を定義することができる。ここに提示されたデータでは、すべてのセッションを10%のCSのみの試験で実行し、残りの試験を構成するペアの試験と米国のみの試験は行わなかった。不対応の試行を過剰に数含むと、トレーニングに悪影響を及ぼす可能性があることに注意してください。例えば、試験の50%以上がペアになっていないセッションは、訓練された動物におけるCRの絶滅を促進するために一般的に使用されている19,26。
カメラの準備と照明条件も、高品質のデータを取得するために重要です。集録のフレームレートは、Picamera集録ソフトウェアで調整できます。ここで示すデータでは、DEC 実験のフレーム レートを 120 Hz に設定しています。Picameraモジュール自体は最大200Hzのフレームレートを可能にしますが、レートが低いとフレーム損失を防ぎ、まぶたの追跡に適切な時間分解能が得られることがわかりました。赤外光は、目が開いているときに角膜から過度の反射を引き起こすことなく、眼周囲毛皮を均等に照らすように配置する必要があります。 図3A は、許容可能な照明を有する記録セッションからのサンプル画像を示す。picamera集録ソフトウェア(picameraStream.py)は、カメラの初期化時に照明条件に基づいてカメラのホワイトバランスとゲインを設定および保持することにより、セッション全体で一貫した設定を提供するように設計されています。
ビヘイビアセッションが初期化されると、カメラやその他のプラットフォームハードウェアコンポーネントからのデータが自動的にログに記録されます。データログは、GUIの動物IDフィールドに入力された日付と値によって指定されたディレクトリに作成されます。各試験のカメラフレームとタイムスタンプは、動物ID、実験日、試験番号を使用して名前が付けられた個々のファイルに保存されます。ホイール速度、トライアル開始、トライアルストップ、CSとUSタイミングなど、各セッションのプラットフォームイベントは、単一の.txtファイルとして保存されます。
ホストマシンに転送されたデータは、プロトコルのセクション4で説明されているように分析することができます。ターゲットディレクトリで analyzeData.py を実行すると、カメラファイルの分析に基づいて、配列内のすべての試行の時間に対するまぶたの位置の.npyコンテナが作成されます。このコンテナー・ファイルは、分析されるディレクトリーに作成されます。特定の動物についてすべてのセッションが分析されると、summarizeSessions.py を使用してすべてのセッションを整列および連結できます。DECの8セッションについて訓練された動物からの結果を 図3Bに示す。さらに、個々の試行は、.mp4 ユーティリティを使用して、表示可能な session2mp4s.py ファイルとしてレンダリングできます。このユーティリティは、ムービーの左上隅に四角形をインプリントして、CS と US がいつ適用されるかを示します。このようにして作成されたサンプル DEC 試験は、 補足ビデオ 1 として並べて表示されます。左パネルは、動物がLED CSに応答して目を閉じることに成功した試験を示しています。右側のパネルでは、米国が開始するまで動物は点滅しません。
セクション3のプロトコルに従ってDECで訓練され、前述の考慮事項で記録された動物は、複数の訓練日にわたって徐々に獲得されたタイミングの良いCRの明確な証拠を示すべきである。訓練されていない動物におけるCRのない行動痕跡の例および訓練された動物からの堅牢なCRを含む痕跡を図3Bに示す。これらの痕跡が示すように、素朴な動物はCSに対して反応を示すのではなく、米国に対して堅牢な反応を示すはずです。CRは、数日間にわたって実行される行動セッションを通じて、サイズと頻度の両方で徐々に増加するはずです(図3B-D)。対照的に、最適でない照明条件は、取得されるデータの品質を著しく制限します。目と周囲の毛皮のコントラストが低い場合(図3E)、画像のわずかな変化により、1回のセッションで記録されたURの形状が大幅に変化し、まぶたの位置を検出するための信号対雑音比が低下する可能性があります(図3F-G)。
忠実度の高いまぶたの記録を確実にするには、最適な光源配置が重要です。照明LEDは、記録された目で直接訓練する必要があります。配置の結果、角膜表面に過度のグレアが生じる場合、この影響を低減するために、LEDアレイの上にディフューザーを配置することができる。
DTSCの実験と分析のワークフロー
実験パラメータ選択の考慮事項の多くは、遅延触覚驚愕条件付け(DTSC)とDECの間で類似しています。ここでは、異なる点を指摘します。サンプル データでは、DTSC CS 期間は 250 ミリ秒に設定され、US の持続時間は 50 ミリ秒に設定されています。この短い刺激間間隔は、DTSC学習20にとって最適であると記載されたより短い持続時間と密接に整合するように選択された。GUIによって設定された他のプラットフォームパラメータは、DECに使用されたものと同じでした。
触覚刺激の適切な配置は、DTSCでの学習に不可欠です。ニュートラルポジションにあるときに、フォームの端が動物の鼻の少し上の中央に約1.5cmの距離になるように触覚刺激を取り付けます。一度取り付けると、セッションが実行されていないときに刺激を手で回すことができます。セッション中、ステッピングモーターは、米国がトリガーされるまで、刺激を正確な位置に保持します。ポジショニングが正しいことを確認するために、約3つの試行の準備セッションを実行します。ロータリーエンコーダに記録されたイベントは端末画面に印刷され、このプリントアウトを使用して動物のURの振幅をリアルタイムで監視できます。最大振幅は試行ごとに異なりますが、短いセッションでエンコーダーで平均最大約40カウントの動物は、DTSCタスクでうまく機能するはずです。ロータリーエンコーダ制御の設定に基づくと、この値は 24 cm/s に相当し、負の値は動物が車輪の上を後方に移動していることを示します。
DTSCセッション中に生成されるファイルの編成と命名は、DECで生成されたものと同じです。analyzeSession.py を実行すると、.csvファイルに記録されたデータの分析から、アレイ内のすべての試行のホイール速度対時間に関する.npyコンテナが作成されます。特定の動物についてすべてのセッションが分析されると、summarizeSession.py を使用してすべてのセッションを整列および連結できます。DECの5セッションについて訓練された動物からの結果は、 図4Aに提示される。DECに関しては、DTSCからのカメラキャプチャは、表示可能な.mp4ファイルに変換できます。DTSC試験のサンプルは、 補足ビデオ2に並べて示されています。左パネルは、動物がLED CSに応答して車輪を正常に後退させる試験を示しています。右側のパネルでは、動物は触覚刺激USが適用されるまで車輪を動かすことができません。
DTSCパラダイムで訓練された動物における応答のURに対する時間経過および振幅は、DECで訓練された動物と質的類似性を示す。CRの周波数と振幅は、トレーニングが進むにつれて増加します(図4A、B)。DTSCの場合、トレーニングの早い段階でUR振幅が学習の成功の良い予測因子であることがわかりました。低振幅UR(<20cm/s)を産生する米国で訓練された動物のコホートでは、4日間の訓練後に一貫してCRを産生することを学んだ動物はいなかった(図4C、D)。
DECトレーニングとDTSCトレーニングの違い
DEC と DTSC は重要な点で異なります。まず、このプラットフォームでのDTSC学習はより迅速に行われ、ほとんどの動物はトレーニングの3日目までに高度なタスク能力を達成し、5日目までに漸近的なパフォーマンスを達成します。DEC学習は、ほとんどの動物にとって少なくとも3日間遅くなります。第2に、DTSCシステムは、触覚刺激の振幅を減少させるために装置へのフィードバック信号として機能する成功したCRの自動検出を組み込んでいる。このトレーニング手順は、改善されたCR性能が嫌悪的な角膜エアパフからの部分的な保護を提供するアイブリンクコンディショニングを模倣する。対照的に、DTSCパラダイムにおける頭部固定動物は、運動応答のみによって触覚刺激から身を守ることができない。米国の振幅をCRの存在に基づいて行うことで、動物は嫌悪的な刺激から身を守る機会を得ます。
図 1: プラットフォームの属性と設計。 (A) 頭を固定した条件下での動物の行動を記録するためのプラットフォーム要素。マウスをバイオレンダー画像から適合させた。(B)DECおよびDTSCコンディショニングのためのタイミングと刺激。ユーザー定義の刺激間間隔(ISI)は、CSのみのエポックが続く時間を決定します。CS と米国のエポックは、同時終了するように設計されている。(C) 主要なプラットフォーム要素の配置を示す画像。1)DTSC米国の制御のためのステッピングモータ。2)動物のためのランニングホイール。3)車輪の動きを追跡するためのロータリーエンコーダ。4)DTSC触覚刺激として機能するアクリルアームの上にテープで留められたフォーム。5) LED CS. 6) DEC US を提供するソレノイドバルブとコンセント。7)動物の行動を記録するためのピカメラ。8)ステージ照明用の赤外線LED。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:プラットフォームハードウェア要素の配線 (A)完全に組み立てられたときのプラットフォームハードウェアのフリッツ配線図。ワイヤはオレンジ色のモジュールで着色されています = カメラモジュール;黄色 = DEC US モジュール;青 = LED CSモジュール;紫色 = DTSC US モジュール;緑 = ロータリーエンコーダモジュール。picamera は除外されますが、Raspberry Pi の表面にあるカメラシリアルインターフェイスに接続します。バッテリは、指定された電圧での直流電源を示します。(B-F)絶縁モジュールの等価配線方式。ワイヤは再色され、赤と黒は常に正の電源レールとグランドを示し、他のワイヤは回路を簡単に追従できるように色付けされています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:DECトレーニングの代表的な結果。 (A)許容可能な照明条件のセッションからのカメラフレームの例。(B)DECパラダイムで数日間にわたって行われたセッション中の単一の動物のパフォーマンス。水平線は各試験でのパフォーマンスを示し、暖かい色はより多くのまぶたの閉鎖を示します。左端の赤い黒い縦線はCSの発症を示し、点線は米国の開始を示す。第2の実線はCS及びUSの停止を示す。CS中に成功した応答を持つ試行の数は、トレーニングセッション全体で増加することに注意してください。(C)毎日のセッションの試験平均から得られた個々の痕跡を有する(B)からの動物のパフォーマンス。色相の彩度は、後のセッションで彩度が高いセッション番号を示します。(d)DEC群の全動物に対する性能(n=7)。細い線は、各動物について各セッションから検出可能なCRを有する試験の割合を示す。太い線は、すべての動物にわたるセッション平均を示します。(E) 最適でない照明条件を持つセッションのカメラフレームの例。(F)照明不良で記録された単一試験の定量化。URは検出可能ですが、最適な光条件下よりもコントラストが低く、変動性が高いです。(G)(F)に提示された試験からのセッション平均トレース。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:DTSCトレーニングの代表的な結果。 (A)DTSCパラダイムで数日間にわたって行われたセッション中の1匹の動物のパフォーマンス。水平線は各試行でのパフォーマンスを示し、暖色はホイールの後方の動きを示します。左端の黒い縦線はCSの発症を示し、点線はUSの開始を示す。第2の実線はCS及びUSの停止を示す。(B)毎日のセッションの試験平均から得られた個々の痕跡を有する(A)からの動物のパフォーマンス。色相の彩度は、後のセッションで彩度が高いセッション番号を示します。(c)DTSC群の全動物に対する性能(n=6)。細い線は、各動物について各セッションから検出可能なCRを有する試験の割合を示す。太い線は、すべての動物にわたるセッション平均を示します。(D)米国強度が低振幅URを惹起したコホートからの(A)のような単回試験。(E)弱い米国に服従した動物について(B)のように提示されたセッション平均トレース。(F)弱い米国(n = 6)を有するDTSCにおけるすべての動物に対する性能。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ 1: DEC ヒットとミスの試行例 ビデオ1でDEC試験を比較しています。各ビデオは、被験者がターゲットCRを同期させ(左)または失敗(右)する試行を示しており、比較のために並べて再生されます。LED CSは、各ビデオの左上隅に青い四角が表示されたときに点灯します。US 制御信号は、白い四角が青い四角形に置き換わるとアクティブになります。CSと米国の制御信号は、正方形が消えると共終了します。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ 2: DTSC ヒット アンド ミスの試行例。 ビデオ 2 は、DTSC 試験の比較を示しています。各ビデオは、被験者がターゲットCRを同期させ(左)または失敗(右)する試行を示しており、比較のために並べて再生されます。LED CSは、各ビデオの左上隅に青い四角が表示されたときに点灯します。US 制御信号は、白い四角が青い四角形に置き換わるとアクティブになります。CSと米国の制御信号は、正方形が消えると共終了します。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここで概説する関連プロトコルを備えたプラットフォームは、2つの感覚連想学習タスクにおける動物の行動を確実に追跡するために使用することができる。各タスクは、クライミングファイバー経路を通る無傷の通信に依存します。ここで説明する設計では、小脳応答の学習と記録/摂動を容易にする要素を組み込んでいます。これらには、自由な移動11、18 、ならびに頭部固定を可能にするホイールが含まれる。このホイールは、マウス被験者が自由に位置決めすることを可能にし、これはDEC取得18にとって重要であることが観察されている。マウスの頭部固定により、研究者は、他のモデル種や自由に動く条件下での使用がより困難な遺伝的、電気生理学的、イメージング的、および光遺伝学的アプローチを利用することができます12。これらの各アプリケーションに設計を使用しました。マイクロコントローラ上で実行されるソフトウェアは、多光子取得または光遺伝学的刺激との同期のためのタイミング信号を、どちらもサブミリ秒の精度で制御するために容易に適合させることができます。光遺伝学的および画像装置を行動実験と組み合わせる場合、これらに対する動物の知覚を最小限に抑えるように注意する必要があります。例えば、多くの多光子システムは、イメージング取得の開始時にガルバノメトリックスキャナまたはシャッターから可聴音を発します。買収が試験開始によってトリガーされた場合、そのような音は、刺激が来ているという動物の被験者への不注意な手がかりとして役立つ可能性があります。
挙動装置の制御は、実験、カメラ、およびデータエクスポートを管理するためのグラフィカルユーザーインターフェイスを生成するために使用されるSBCを中心に構築される。SBCはまた、試行のタイミングを処理し、刺激表示やロータリーエンコーダなどのハードウェアコンポーネントを直接制御する2つのマイクロコントローラにコマンドを送信します。ここで詳述したプロトコルは、対照実験のタイミングによるArduinoに取り付けられたRaspberry Pi 3B +または4Bと、DTSC USの提示を制御するArduino Unoのいずれかを使用してテストされました。他のハードウェア設計の実装も可能ですが、提供されているソフトウェアではテストされていません。
複数のリグを並行して使用しやすくするために、SBC を「ヘッドレス」モードで操作することをお勧めします。この構成では、ホスト コンピューターを使用して SBC と対話します。イーサネットスイッチを使用すると、ホストコンピューターとSBCの両方に同時にインターネット接続できます。このスイッチは、高速データ転送でホストとSBC間の直接通信も可能にします。その結果、スイッチにより、データ転送とSBCパッケージのメンテナンスが容易になります。
複数のリグを並行して実行するには、各リグを専用のエンクロージャに配置する必要があります。これらのエンクロージャは、互いに近接して配置する場合は防音機能を備えている必要があります。隣接するリグ間の音を抑制すると、隣接するエンクロージャで生成される刺激による意図しない聴覚的合図を避けるのに役立ちます。
DECとDTSCに単一のプラットフォームを使用することで、研究者は各パラダイムの長所と短所を柔軟にナビゲートできます。DECは、タスクの学習と実行に関与している脳領域と特定の小脳回路要素に関する数十年にわたる研究から得られた洞察を享受しています1,4,11,13,14,15,19。しかしながら、マウスでは、まばたき条件付け11、12に最も頻繁に関連する小脳皮質の領域は、原発性小脳亀裂の深部に位置する(ただし、表在小葉VIのDEC関連領域を示す15、17、27を参照されたい)。学習のための深い軌跡は、光学実験、特に細胞活性の多光子イメージングおよび光遺伝学的摂動実験へのアクセスを複雑にする。対照的に、DTSCの小脳基質は、小葉IV/V20の表面的側面に部分的に位置している。したがって、DTSCは、システム神経科学研究のための一般的な部位である背側新皮質のそれに匹敵する光学的アクセスを提示する。
私たちの設計では、車輪に取り付けられたロータリーエンコーダとカメラを使用して動物の行動を追跡します。低コストで実装の容易さのためにこれらの方法を選択しました。場合によっては、他の追跡方法によって、より空間的および時間的な精度が得られる場合があります。例えば、DECにおける眼瞼位置は、一般に、ホール効果センサ28、29または筋柱状眼瞼30、31の眼窩周囲領域の筋電図記録を用いて追跡されている。同様に、車輪の動きを検出して移動運動を追跡すると、SLEAP32やDeepLabCut33などの画像ベースのポーズ追跡アルゴリズムよりも動物の行動の詳細な画像が得られます。カメラベースの録画では、このようなアプローチを追加できます。
ここでは、2つの登山繊維依存連想学習パラダイム中の動物の行動を追跡するためのプラットフォームを提示しました。私たちのプラットフォームは、コストと実装の容易さの両面でこれらのメソッドのアクセシビリティを向上させることを目的としています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、国立精神衛生研究所NRSA F32 MH120887-03(G.J.B.へ)およびR01 NS045193およびR01 MH115750(S.S-H.W.へ)からの助成金によって支援されています。DECセットアップの最適化に役立つ議論をしてくれたBas Koekkoek博士とHenk-Jan Boele博士、DTSCセットアップの最適化に役立つ議論をしてくれたYue Wang博士とXiaoying Chen博士に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| "B" Quick Base For C&B METABOND - 10 mL bottle | Parkell | S398 | Dental cement solvent |
| "C" Universal TBB Catalyst - 0.7 mL | Parkell | S371 | Catalyst |
| #8 Washers | Thorlabs | W8S038 | Washers |
| 0.250" (1/4") x 8.00" Stainless Steel Precision Shafting | Servocity | 634172 | 1/4" shaft |
| 0.250” (0.770") Clamping Hub | Servocity | 545588 | Clamping hub |
| 1/4" to 6 mm Set Screw Shaft Coupler- 5 pack | Actobotics | 625106 | Shaft-coupling sleeve |
| 1/4"-20 Cap Screws, 3/4" Long | Thorlabs | SH25S075 | 1/4" bolt |
| 100 pcs 5 mm 395–400 nm UV Ultraviolet LED Light Emitting Diode Clear Round Lens 29 mm Long Lead (DC 3V) LEDs Lights +100 pcs Resistors | EDGELEC | ED_YT05_U_100Pcs | CS LEDs |
| 2 m Micro HDMI to DVI-D Cable - M/M - 2 m Micro HDMI to DVI Cable - 19 pin HDMI (D) Male to DVI-D Male - 1920 x 1200 Video | Star-tech | HDDDVIMM2M | Raspberry Pi4B to monitor cable |
| 256 GB Ultra Fit USB 3.1 Flash Drive | SanDisk | SDCZ430-256G-G46 | USB thumb drive |
| 3.3 V–5 V 4 Channels Logic Level Converter Bi-Directional Shifter Module | Amazon | B00ZC6B8VM | Logic level shifter |
| 32 GB 95 MB/s (U1) microSDHC EVO Select Memory Card | Samsung | MB-ME32GA/AM | microSD card |
| 4.50" Aluminum Channel | Servocity | 585444 | 4.5" aluminum channel |
| 48-LED CCTV Ir Infrared Night Vision Illuminator | Towallmark | SODIAL | Infrared light array |
| 4PCS Breadboards Kit Include 2PCS 830 Point 2PCS 400 Point Solderless Breadboards for Proto Shield Distribution Connecting Blocks | REXQualis | B07DL13RZH | Breadboard |
| 5 Port Gigabit Unmanaged Ethernet Network Switch | TP-Link | TL-SG105 | Ethernet switch |
| 5 V 2.5 A Raspberry Pi 3 B+ Power Supply/Adapter | Canakit | DCAR-RSP-2A5 | Power supply for Raspberry Pi 3B+ |
| 5-0 ETHILON BLACK 1 x 18" C-3 | Ethicon | 668G | Sutures |
| 6 mm Shaft Encoder 2000 PPR Pushpull Line Driver Universal Output Line Driver Output 5-26 V dc Supply | Calt | B01EWER68I | Rotary encoder |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 1", 5 Pack | Thorlabs | TR1-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | Thorlabs | TR2-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 4", 5 Pack | Thorlabs | TR4-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 6", 5 Pack | Thorlabs | TR6-P5 | Optical posts |
| Ø1/2" Post Holder, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 2" | Thorlabs | PH2 | Optical post holder |
| Adapter-062-M X LUER LOCK-F | The Lee Co. | TMRA3201950Z | Solenoid valve luer adapter |
| Aeromat Foam Roller Size: 36" Length | Aeromat | B002H3CMUE | Foam roller |
| Aluminum Breadboard 10" x 12" x 1/2", 1/4"-20 Taps | Thorlabs | MB1012 | Aluminum breadboard |
| Amazon Basics HDMI to DVI Adapter Cable, Black, 6 Feet, 1-Pack | Amazon | HL-007347 | Raspberry Pi3B+ to monitor cable |
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | Arduino Uno (microcontroller board) |
| Arduino Due | Arduino | A000062 | Arduino Due (microcontroller board) |
| Bench Power Supply, Single, Adjustable, 3 Output, 0 V, 24 V, 0 A, 2 A | Tenma | 72-8335A | Power supply |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet, 12" x 24" x 1/8" | McMaster Carr | 8560K257 | Acrylic sheet |
| CNC Stepper Motor Driver 1.0–4.2 A 20–50 V DC 1/128 Micro-Step Resolutions for Nema 17 and 23 Stepper Motor | Stepper Online | B06Y5VPSFN | Stepper motor driver |
| Compact Compressed Air Regulator, Inline Relieving, Brass Housing, 1/4 NPT | McMaster Carr | 6763K13 | Air source regulator |
| Cotton Swab | Puritan | 806-WC | Cotton swab |
| Dell 1908FP 19" Flat Panel Monitor - 1908FPC | Dell | 1908FPC | Computer monitor |
| Flex Cable for Raspberry Pi Camera | Adafruit | 2144 | camera serial interface cable |
| High Torque Nema 17 Bipolar Stepper Motor 92 oz·in/65 N·cm 2.1 A Extruder Motor | Stepper Online | 17HS24-2104S | Stepper motor |
| Isoflurane | Henry Schein | 66794001725 | Isoflurane |
| Krazy Maximum Bond Permanent Glue, 0.18 oz. | Krazy Glue | KG483 | Cyanoacrylate glue |
| Lidocaine HCl | VetOne | 510212 | Lidocaine |
| Low-Strength Steel Hex Nut, Grade 2, Zinc-Plated, 1/4"-20 Thread Size | McMaster Carr | 90473A029 | Nuts |
| M3 x 50 mm Partially Threaded Hex Key Socket Cap Head Screws 10 pcs | Uxcell | A16040100ux1380 | M3 bolt |
| NEMA 17 Stepper Motor Mount | ACTOBOTICS | 555152 | Stepper motor mount |
| Official Raspberry Pi Power Supply 5.1 V 3 A with USB C - 1.5 m long | Adafruit | 4298 | Power supply for Raspberry Pi 4B |
| Optixcare Dog & Cat Eye Lube Lubricating Gel, 0.70-oz tube | Optixcare | 142422 | Opthalimic ointment |
| Precision Stainless Steel Ball Bearing, Shielded, Trade No. R188-2Z, 13000 rpm Maximum Speed | McMaster-Carr | 3759T57 | Bearing |
| Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 6" | Adafruit | 266 | Wires |
| Premium Female/Male 'Extension' Jumper Wires - 40 x 6" (150 mm) | Adafruit | 826 | Wires |
| Premium Male/Male Jumper Wires - 40 x 6" | Adafruit | 758 | Wires |
| Radiopaque L-Powder for C&B METABOND - 5 g | Parkell | S396 | Dental cement powder |
| Raspberry Pi (3B+ or 4B) | Adafruit | 3775 or 4295 | Raspberry Pi |
| Raspberry Pi NoIR Camera Module V2 - 8MP 1080P30 | Raspberry Pi Foundation | RPI3-NOIR-V2 | Raspberry NoIR V2 camera |
| Right-Angle Bracket, 1/4" (M6) Counterbored Slot, 8-32 Taps | Thorlabs | AB90E | Right-angle bracket |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 3/16" Hex | Thorlabs | RA90 | Right-angle optical post clamp |
| Right-Angle End Clamp for Ø1/2" Posts, 1/4"-20 Stud and 3/16" Hex | Thorlabs | RA180 | Right-angle end clamp |
| RJ45 Cat-6 Ethernet Patch Internet Cable | Amazon | CAT6-7FT-5P-BLUE | Ethernet cable |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Posts, 360° Continuously Adjustable, 3/16" Hex | Thorlabs | SWC | Rotating optical post clamps |
| Spike & Hold Driver-0.1 TO 5 MS | The Lee Co. | IECX0501350A | Solenoid valve driver |
| Swivel Base Adapter | Thorlabs | UPHA | Post holder adapter |
| USB 2.0 A-Male to Micro B Cable, 6 feet | Amazon | 7T9MV4 | USB2 type A to USB2 micro cable |
| USB 2.0 Printer Cable - A-Male to B-Male, 6 Feet (1.8 m) | Amazon | B072L34SZS | USB2 type B to USB2 type A cable |
| VHS-M/SP-12 V | The Lee Co. | INKX0514900A | Solenoid valve |
| Zinc-Plated Steel 1/4" washer, OD 1.000" | McMaster Carr | 91090A108 | Washers |
References
- McCormick, D. A., Lavond, D. G., Clark, G. A., Kettner, R. E., Rising, C. E., Thompson, R. F. The engram found? Role of the cerebellum in classical conditioning of nictitating membrane and eyelid responses. Bulletin of the Psychonomic Society. 18 (3), 103-105 (1981).
- McCormick, D. A., Clark, G. A., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Initial localization of the memory trace for a basic form of learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (8), 2731-2735 (1982).
- McCormick, D. A., Thompson, R. F. Cerebellum: essential involvement in the classically conditioned eyelid response. Science. 223 (4633), New York, N.Y. 296-299 (1984).
- Krupa, D. J., Thompson, J. K., Thompson, R. F. Localization of a memory trace in the mammalian brain. Science. 260 (5110), New York, N.Y. 989-991 (1993).
- Llinás, R., Sugimori, M. Electrophysiological properties of in vitro Purkinje cell dendrites in mammalian cerebellar slices. The Journal of Physiology. 305, 197-213 (1980).
- Mintz, M., Lavond, D. G., Zhang, A. A., Yun, Y., Thompson, R. F. Unilateral inferior olive NMDA lesion leads to unilateral deficit in acquisition and retention of eyelid classical conditioning. Behavioral and Neural Biology. 61 (3), 218-224 (1994).
- Welsh, J. P., Harvey, J. A. Cerebellar lesions and the nictitating membrane reflex: performance deficits of the conditioned and unconditioned response. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 9 (1), 299-311 (1989).
- Mauk, M. D., Steinmetz, J. E., Thompson, R. F. Classical conditioning using stimulation of the inferior olive as the unconditioned stimulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (14), 5349-5353 (1986).
- Steinmetz, J. E., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Classical conditioning in rabbits using pontine nucleus stimulation as a conditioned stimulus and inferior olive stimulation as an unconditioned stimulus. Synapse. 3 (3), New York, N.Y. 225-233 (1989).
- Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Adaptive timing of motor output in the mouse: The role of movement oscillations in eyelid conditioning. Frontiers in Integrative Neuroscience. 5, 72 (2011).
- Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Cerebellar-dependent expression of motor learning during eyeblink conditioning in head-fixed mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14845-14853 (2014).
- Heiney, S. A., Kim, J., Augustine, G. J., Medina, J. F. Precise control of movement kinematics by optogenetic inhibition of purkinje cell activity. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2321-2330 (2014).
- Ten Brinke, M. M., et al. Evolving models of pavlovian conditioning: Cerebellar cortical dynamics in awake behaving mice. Cell Reports. 13 (9), 1977-1988 (2015).
- Gao, Z., et al. Excitatory cerebellar nucleocortical circuit provides internal amplification during associative conditioning. Neuron. 89 (3), 645-657 (2016).
- Giovannucci, A., et al. Cerebellar granule cells acquire a widespread predictive feedback signal during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (5), 727-734 (2017).
- Ten Brinke, M. M., et al. Dynamic modulation of activity in cerebellar nuclei neurons during pavlovian eyeblink conditioning in mice. eLife. 6, 28132 (2017).
- Wang, X., Yu, S., Ren, Z., De Zeeuw, C. I., Gao, Z. A FN-MdV pathway and its role in cerebellar multimodular control of sensorimotor behavior. Nature Communications. 11 (1), 6050 (2020).
- Albergaria, C., Silva, N. T., Pritchett, D. L., Carey, M. R. Locomotor activity modulates associative learning in mouse cerebellum. Nature Neuroscience. 21 (5), 725-735 (2018).
- Kim, O. A., Ohmae, S., Medina, J. F. A cerebello-olivary signal for negative prediction error is sufficient to cause extinction of associative motor learning. Nature Neuroscience. 23 (12), 1550-1554 (2020).
- Yamada, T., et al. Sensory experience remodels genome architecture in neural circuit to drive motor learning. Nature. 569 (7758), 708-713 (2019).
- Horlington, M. Startle response circadian rhythm in rats: lack of correlation with motor activity. Physiology & Behavior. 5 (1), 49-53 (1970).
- Yeomans, J. S., Li, L., Scott, B. W., Frankland, P. W. Tactile, acoustic and vestibular systems sum to elicit the startle reflex. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 26 (1), 1-11 (2002).
- Raspberry Pi Operating system images. , Available from: https://www.raspberrypi.com/software/operationg-systems/ (2021).
- VNC Server. VNC® Connect. , Available from: https://www.realvnc.com/en/connect/download/vnc/ (2021).
- Anaconda: The world's most popular data science platform. , Available from: https://xddebuganaconda.xdlab.co/ (2021).
- De Zeeuw, C. I., Ten Brinke, M. M.
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique. Journal of Neurophysiology. 88 (4), 2124-2133 (2002).
- Kloth, A. D., et al. Cerebellar associative sensory learning defects in five mouse autism models. eLife. 4, 06085 (2015).
- Boele, H. -J., Koekkoek, S. K. E., De Zeeuw, C. I. Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 3, (2010).
- Lin, C., Disterhoft, J., Weiss, C. Whisker-signaled eyeblink classical conditioning in head-fixed Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53310 (2016).
- Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).
