Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

פלטפורמה גמישה לניטור למידה אסוציאטיבית חושית תלוית מוח הקטן

Published: January 19, 2022 doi: 10.3791/63205
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Neuroscience Institute, Princeton University

Summary

פיתחנו פלטפורמה אחת למעקב אחר התנהגות בעלי חיים במהלך שתי משימות למידה אסוציאטיביות תלויות סיבים מטפסים. התכנון הזול מאפשר אינטגרציה עם ניסויים אופטוגנטיים או ניסויי הדמיה המכוונים לטיפוס על פעילות המוח הקטן הקשורה לסיבים תזונתיים.

Abstract

קלטי סיבים מטפסים לתאי Purkinje מספקים אותות מאלפים החיוניים ללמידה אסוציאטיבית תלוית המוח הקטן. חקר אותות אלה בעכברים בעלי ראש קבוע מקל על השימוש בשיטות הדמיה, אלקטרופיזיולוגיות ואופטוגנטיות. כאן פותחה פלטפורמה התנהגותית בעלות נמוכה (כ-1,000 דולר) המאפשרת מעקב אחר למידה אסוציאטיבית בעכברים מקובעי ראש שמסתובבים בחופשיות על גלגל רץ. הפלטפורמה משלבת שתי פרדיגמות למידה אסוציאטיביות נפוצות: התניית מצמוץ עיניים והתניה מושהית של מבהיל מישוש מושהה. ההתנהגות נמצאת במעקב באמצעות מצלמה ותנועת הגלגלים על ידי גלאי. אנו מתארים את הרכיבים וההתקנה ומספקים פרוטוקול מפורט להדרכה ולניתוח נתונים. פלטפורמה זו מאפשרת שילוב של גירוי אופטוגנטי והדמיה פלואורסצנטית. התכנון מאפשר למחשב מארח יחיד לשלוט בפלטפורמות מרובות לאילוף בעלי חיים מרובים בו זמנית.

Introduction

התניה פבלובית של קשר תת-שני בין גירויים כדי לעורר תגובה מותנית שימשה זה מכבר כדי לחקור למידה התלויה במוח הקטן. לדוגמה, במיזוג עפעפיים קלאסי מושהה (DEC), בעלי חיים לומדים לבצע מצמוץ מגן מתוזמן היטב בתגובה לגירוי מותנה נייטרלי (CS; למשל, הבזק של אור או צליל שמיעתי) כאשר הוא מזווג שוב ושוב עם גירוי בלתי מותנה (US; למשל, נפיחות של אוויר המופעל על הקרנית) אשר תמיד מעורר מצמוץ רפלקס, ואשר מגיע בסוף ה-CS או בסמוך לו. התגובה המלומדת מכונה תגובה מותנית (CR), בעוד שתגובת הרפלקס מכונה התגובה הבלתי מותנית (UR). בארנבים, נגעים ספציפיים למוח הקטן משבשים צורה זו של למידה 1,2,3,4. יתר על כן, קוצים מורכבים של תאי Purkinje, המונעים על ידי קלט הסיבים המטפסים שלהם5, מספקים אותהכרחי של 6,7 ומספיק 8,9 לרכישת CRs מתוזמנים כראוי.

לאחרונה פותחו פרדיגמות למידה אסוציאטיביות תלויות סיבים מטפסים עבור עכברים קבועים ראש. DEC הייתה פרדיגמת הלמידה האסוציאטיבית הראשונה שהותאמה לתצורה זו10,11. DEC בעכברים קבועים ראש שימש לזיהוי אזורים במוחהקטן 11,12,13,14,15,16,17 ורכיבי מעגל11,1 2,13,14,15,18,19 הנדרשים לצורך השגת משימות והכחדתן. גישה זו שימשה גם כדי להדגים כיצד הייצוג הפיזיולוגי ברמה התאית של פרמטרי משימה מתפתח עםלמידה של 13,15,16.

בנוסף ל-eyeblink, פרדיגמת התניית המישוש המושהה (DTSC) פותחה לאחרונה כמטלת למידה אסוציאטיבית חדשנית עבור עכברים קבועים ראש20. בדומה מבחינה רעיונית ל-DEC, DTSC כולל הצגה של CS נייטרלי עם US, הקשה על הפנים בעוצמה מספקת כדי להפעיל רפלקס מבהיל 21,22 כ-UR. בפרדיגמה של DTSC, הן ה-UR והן ה-CR נקראים כתנועה לאחור על גלגל. DTSC שימש כעת כדי לחשוף כיצד למידה אסוציאטיבית משנה את פעילות המוח הקטן ואת דפוסי הביטוי של גנים20.

בעבודה זו פותחה שיטה ליישום גמיש של DEC או DTSC בפלטפורמה אחת. תכונות הגירוי והפלטפורמה עוברות מיפוי באיור 1. העיצוב משלב את היכולת לעקוב אחר התנהגות בעלי חיים באמצעות מצלמה, כמו גם מקודד סיבובי למעקב אחר תנועת עכבר על גלגל. כל ההיבטים של רישום נתונים ומבנה הניסוי נשלטים על ידי מיקרו-בקרים מזווגים (Arduino) ומחשב בעל לוח יחיד (SBC; פטל פאי). ניתן לגשת להתקנים אלה באמצעות ממשק משתמש גרפי מסופק. כאן אנו מציגים זרימת עבודה להתקנה, הכנה וביצוע של ניסויים, וצינור ניתוח מותאם אישית להדמיית נתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקולים של בעלי החיים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בהם של אוניברסיטת פרינסטון.

1. הקמת ה-SBC

  1. חבר את כבל הממשק הטורי של המצלמה (CSI) למצלמת Raspberry NoIR V2 וליציאת המצלמה ב- SBC.
  2. הורד את מערכת ההפעלה עבור SBC למחשב המארח. כתוב את תמונת מערכת ההפעלה לכרטיס דיגיטלי מיקרו מאובטח (microSD).
    הערה: הוראות מפורטות להליכים אלה עבור Raspberry Pi SBC ניתן למצוא במקום אחר23. המערכת נבדקה באמצעות מערכות ההפעלה הבאות: סטרץ ', באסטר, בולסיי.
  3. כדי לאפשר תקשורת מעטפת מאובטחת, צור קובץ ללא סיומת בשם "ssh" במחיצת האתחול של כרטיס ה- microSD. לאחר שזה נעשה, להוציא את כרטיס microSD מהמכונה המארחת ולהכניס אותו לתוך חריץ כרטיס microSD SBC. הפעל את ה- SBC על-ידי חיבור ספק הכוח שלו.
  4. הכן את ה- SBC כדי לקבל חיבור קווי למארח.
    1. חבר צג עם כבל מתאים ל- SBC. פתח מסוף, הקלד את הפקודה ifconfig והתעד את כתובת ה- IP של ה- Ethernet של ה- SBC.
      הערה: לדגם Raspberry Pi 3B+ יש יציאת תצוגה HDMI, בעוד שלדגם 4B יש יציאת micro-HDMI.
    2. עבור אל הכרטיסיה ממשק של הגדרת התצורה Raspberry Pi והפעל את האפשרויות עבור מצלמה, פרוטוקול רשת מעטפת מאובטח (SSH) ומחשוב רשת וירטואלי (VNC).
  5. צור חיבור קווי בין המחשב המארח לבין ה- SBC.
    1. חבר כבל אתרנט ליציאת ה- Ethernet ב- SBC ובמחשב המארח. חבר את הקצה השני של כבלים אלה למתג Ethernet.
    2. השתמש בלקוח מחשוב רשת וירטואלי כגון VNC viewer24 וגש לשולחן העבודה באמצעות כתובת ה- IP של SBC ואימות ברירת המחדל (משתמש = "pi", סיסמה = "raspberry").
  6. הורד את התוכנה הנדרשת הכלולה בשלבי הפרוטוקול.
    אזהרה: שנה את שם המשתמש והסיסמה המוגדרים כברירת מחדל כדי למנוע גישה לא מורשית ל- SBC.
    1. הזן את הפקודה הבאה במסוף SBC כדי להוריד את תוכנת האסדה:
      שיבוט git --עומק =1 https://github.com/gerardjb/assocLearnRig
    2. הזן את הפקודות הבאות כדי להוריד את ספריות הפיתון הדרושות.
      cd assocLearnRig
      python3 setup.py
    3. כדי לאפשר שליטה ישירה על המיקרו-בקר, התחברו ל-SBC והורידו את סביבת הפיתוח המשולבת של המיקרו-בקר (IDE) בהתאם לשלבים 1.6.4-1.6.7.
    4. פתח את דפדפן האינטרנט בשולחן העבודה של SBC ונווט אל https://arduino.cc/en/software. הורד את הגירסה העדכנית ביותר של Linux ARM 32 סיביות של ה- IDE.
    5. פתח חלון מסוף בשולחן העבודה של SBC ונווט אל ספריית ההורדות על-ידי הקלדת הורדות תקליטורים/
    6. כדי להתקין את ה- IDE, הקלד את הפקודות הבאות במסוף:
      tar -xf arduino--linuxarm.tar.xz
      sudo mv arduino- /opt
      sudo /opt/arduino-/install.sh
      (כאן <היפוך> היא הגרסה של ה- IDE שהורדת)
    7. פתח מופע של המיקרו-בקר IDE בשולחן העבודה של SBC. בחר באפשרות תפריט כלים > ניהול ספריות. התקן את ספריית "מקודד" מאת פול סטופרג'ן.
  7. הרחב את הזיכרון המובנה של SBC באמצעות כונן אצבע מסוג USB.
    1. הכנס כונן אגודל ליציאת USB ב- SBC. השתמש ביציאת USB 3.0 אם היא זמינה.
    2. הקלד את הטרמינל ls -l /dev/disk/by-uuid/ כדי למצוא את כונן האגודל ואת הייחוס הייחודי שלו (UUID). הקלט את ה- UUID.
    3. כדי לאפשר למשתמש pi לכתוב להתקן ה- USB, הקלד את הפקודות הבאות בזו אחר זו במסוף:
      sudo mkdir /media/usb
      sudo chown -R pi:pi /media/usb
      sudo mount /dev/sda1 /media/usb -o uid=pi,gid=pi
      הערה: ניתן להוסיף את כונן האגודל כהתקן שיורכב אוטומטית כאשר ה- SBC יופעל מחדש על-ידי הוספת השורה הבאה לסוף קובץ ה- fstab ב- /etc/fstab:
      UUID= /media/usb vfat auto,nofail,noatime,users,rw,uid=pi,gid=pi 0 0

2. חומרת גירוי חיווט ובשלב ההרכבה

  1. חברו והכינו מיקרו-בקרים.
    1. חבר את ה-SBC ליציאת התכנות של המיקרו-בקר (Arduino Due) באמצעות כבל מיקרו מסוג USB2 מסוג A עד USB2.
      הערה: השתמש בכבל באיכות גבוהה כגון המוצר בטבלת החומרים כדי להבטיח פעולה תקינה.
    2. אתר את "dueAssocLearn.ino" במאגר הפרויקטים שהורדת. פתח את הסקיצה עם המיקרו-בקר IDE והעלה אותה למיקרו-בקר המחובר ל- SBC.
    3. הורד והתקן את הגירסה המתאימה של Arduino IDE במחשב המארח.
    4. חבר את המחשב המארח למיקרו-בקר (Arduino Uno) באמצעות כבל מסוג USB2 מסוג B עד USB2 מסוג A.
    5. עבור אל מאגר GitHub (https://github.com/gerardjb/assocLearnRig) והורד את הסקיצה "DTSC_US.ino" למחשב המארח.
    6. במחשב המארח, הפעל את המיקרו-בקר IDE ופתח את הסקיצה "DTSC_US.ino", ולאחר מכן העלה אותה למיקרו-בקר.
  2. חברו חוטים למיקרו-בקרים, לוח הלחם, נוריות LED, מקודד סיבובי, מנוע סטפר עם נהג ושסתום סולנואיד עם הנהג כפי שמצוין בתרשים פריצינג באיור 2.
  3. הפעל את מנוע הסטפר ואת שסתום הסולנואיד.
    1. תוחבר כראוי ערוץ אחד של ספק כוח לפיני +V ו- GND של נהג המנוע החורג.
    2. הפעל את ספק הכוח והגדר את מתח הערוץ המחובר ל- 25 V.
      הערה: אם החיבורים בין מנוע הסטפר, הנהג וספק הכוח מוגדרים כהלכה, נורית מחוון ירוקה בנהג מנוע המדרגות תופעל.
    3. תעביר כראוי את ההובלה החיובית של ספק כוח לנהג שסתום הסולנואידים להחזיק פין מתח וההובלה החיובית השנייה לפין מתח הספייק.
    4. חבר את השלילי מוביל לקרקע משותפת עם אות הבקרה.
    5. הפעל את ספק הכוח והגדר את הערוץ המחובר למתח ההחזקה לכ- 2.5 V ואת הערוץ המחובר למתח ספייק לכ- 12 V.
  4. חברו מקור אוויר המווסת ללחץ של כ-20 PSI לשסתום הסולנואיד באמצעות מתאם הלואר.
  5. בדוק שכל רכיבי הגירוי והמצלמה מתפקדים כראוי.
    1. פתח מסוף ב- SBC והקלד cd ~/assocLearnRig כדי לנווט למאגר GitHub המשובט.
    2. במסוף, הקלד python3 assocLearnRig_app.py כדי להפעיל את ממשק המשתמש הגרפי של הבקרה.
    3. הפעל את זרם המצלמה על-ידי לחיצה על לחצן זרם .
    4. בחר בלחצן רדיו DEC , העלה למיקרו-בקר והתחל הפעלה עם פרמטרים המוגדרים כברירת מחדל על-ידי לחיצה על לחצן התחל הפעלה .
      הערה: לאחר שלב זה, תדפיס של יומן הנתונים אמור להופיע במסוף, ההודעה בזרם המצלמה אמורה להיעלם, וה- LED CS והשסתום הסולנואידי US צריכים להידלק ולכבות בזמנים המתאימים במהלך כל ניסוי.
    5. לאחר סיום ההפעלה, חזור על השלבים הקודמים עם לחצן DTSC Radio שנבחר.
      הערה: ניתן להשתמש בשרטוטים במאגר GitHub ("testStepper.ino", "testRotary.ino" ו-"testSolenoid.ino") כדי לבדוק רכיבים בודדים אם השלבים לעיל אינם מספקים תוצאות משביעות רצון.
  6. הפוך את גלגל הריצה.
    1. חותכים גלגל 3 אינץ' מגלגלת קצף. קדחו חור בגודל 1/4 אינץ' במרכז הגלגל המדויק, כך שהגלגל לא יתנדנד כאשר הוא מסובב על ידי תנועת העכבר.
    2. הכנס פיר בגודל 1/4 אינץ' לתוך הגלגל וקבע אותו במקומו באמצעות רכזות הידוק הממוקמות בכל צד של הגלגל.
  7. הצמידו את המקודד הסיבובי לתעלת אלומיניום בגודל 4.5 אינץ' באמצעות בורג M3. ייצבו את תעלת האלומיניום על לוח הלחם מאלומיניום באמצעות סוגר בזווית ישרה עם בורג בגודל 1/4 אינץ', אום ומכונת כביסה כפי שמוצג.
  8. חברו את הגלגל ואת המקודד הסיבובי באמצעות שרוול צימוד פיר.
  9. ייצבו את הצד החופשי של מוט הגלגלים עם מיסב שהוכנס למהדק קצה בזווית ישרה המותקן על עמוד אופטי המותקן על לוח לחם.
    הערה: ודא שהגלגל מסתובב בחופשיות מבלי להתנדנד כאשר הוא מסתובב ביד.
  10. מקם את חומרת הגירוי, ריסון הראש, מערך האור האינפרא אדום והפיקאמרה סביב הגלגל המורכב.
    1. מקם את משענות הראש באמצעות עמודים אופטיים ומהדקי עמודים בזווית ישרה כך שעמודי הראש יהיו 1.5 ס"מ לפני סרן הגלגל ו-2 ס"מ מעל משטח הגלגל. (הערכים הם עבור עכבר של 20 גרם).
    2. מקם את שקע ה-CS LED והשסתום הסולנואידי המשמש ל-DEC US במרחק של פחות מ-1 ס"מ מהעין המשמשת ל-DEC.
    3. הרכב את מנוע הסטפר המשמש עבור DTSC US
    4. הר את הפיקמרה על עמוד אופטי ~ 10 ס"מ מהמקום בו תהיה החיה.
      הערה: העיצוב של תושבת picamera יכול להתבצע במדפסת תלת-ממד מהקובץ ב-"RaspPiCamMount1_1.stl" במאגר GitHub.
    5. מקם את מערך האור האינפרא אדום מעט מעל ופונה ישירות למיקום הפנים באותו צד כמו הפיקמרה.
    6. צרו גירוי מישושי עבור DTSC על ידי הקשת קצף לקצה של חתיכת אקריליק המותקנת על פיר בגודל 1/4 אינץ' באמצעות רכזת הידוק. חבר את גירוי המישוש לפיר המנוע החורג.
      הערה: ניתן לחתוך את העיצוב של החלק האקרילי בלייזר בעקבות התבנית ב-"TactileStimDesign.pdf" במאגר GitHub.

3. הכנה והפעלה של ניסויי התנהגות

  1. השתלת לוחית ראש של עכבר.
    1. הרדמה עכבר באמצעות 2% איזופלורן ותיקון ראש במסגרת סטריאוטקטית.
    2. החל משחה עיניים על העיניים.
    3. לגלח את הקרקפת באמצעות מי סבון ואיזמל סטרילי. להזריק לידוקאין ישירות מתחת לעור של אתר החתך ולנקות את האתר הניתוחי עם povidone.
    4. לעשות חתך עם אזמל לאורך קו האמצע של הקרקפת מהקצה האחורי של העיניים לקצה האחורי של הגולגולת, תוך זהירות לא ללחוץ חזק מדי על הגולגולת.
    5. מפזרים את החתך פתוח ומהדקים את שני הצדדים בהמוסטאטים סטריליים כדי להחזיק אותו פתוח. יש להסיר בעדינות את הפריוסטאום באמצעות צמר גפן טבול באתנול ולאפשר לפני השטח של הגולגולת החשופה להתייבש.
    6. מקם את מפלס לוחית הראש על הגולגולת, הקפד למקם את החלק הקדמי של לוחית הראש האחורית לעיניים. השתמשו בדבק ציאנואקרילט כדי לחבר את לוחית הראש לגולגולת ולאפשר לדבק להתייבש באופן מלא.
    7. מערבבים את אבקת המלט הדנטלית (כף מדידה אחת), הממס (2 טיפות) והזרז (1 טיפה) בצלחת ערבוב ומורחים על כל אזורי העצם החשופה. הוסיפו שכבות עד שהמשטח נשטף עם הקצה העליון של לוחית הראש, וודאו שהלוחית הראשית מחוברת היטב לגולגולת.
    8. לתפור את העור סגור מאחורי ומול לוחית הראש במידת הצורך.
    9. יש להזריק משכך כאבים לאחר הניתוח כגון קרפרופן בהתאם להנחיות המוסדיות תוך מתן אפשרות לבעל החיים להתאושש למשך 5 ימים לפחות.
  2. הכנה למפגשי התנהגות.
    1. אפשרו לחיות הניסוי להתרגל לרציף על ידי הרכבתן בריסון הראש במשך 30 דקות במשך 5 ימים לפני הניסויים.
      הערה: עד סוף מפגשי ההרגלה, בעלי חיים צריכים לרוץ בנוחות על ההגה.
    2. (דצמבר בלבד) לפני הפגישות, ודא ששקע שסתום הסולנואיד מרוכז בעין המטרה הממוקמת במרחק של >1 ס"מ משם.
    3. (דצמבר בלבד) הפעל באופן ידני פחזנית אוויר באמצעות לחצן הלחיצה. ודא שהעכבר מייצר מיד מצמוץ מבלי להראות סימנים גלויים של לחץ כגון אימוץ תנוחה מחובקת או אחיזת האזור הפריוקולרי הפגוע עם הפתח האיפסילטרלי.
    4. (DTSC בלבד) לפני המפגשים, יש לוודא שהגירוי המישושי מרוכז באף החיה הממוקם במרחק של כ-1.5 ס"מ.
      הערה: כאשר הפעלה התנהגותית של DTSC אינה פועלת, מנוע הצעד מומת באופן אוטומטי כדי לאפשר מיקום מחדש ידני.
    5. (DTSC בלבד) במסוף SBC, סוג python3 assocLearnRig_app.py כדי להתחיל את ממשק המשתמש הגרפי.
    6. (DTSC בלבד) הפעל הפעלת בדיקה של שלושה ניסויים עם הפרמטרים המוגדרים כברירת מחדל על-ידי לחיצה על לחצן התחל הפעלה בממשק המשתמש הגרפי.
    7. (DTSC בלבד) ודא שהנתונים הרשומים שמדפיסים במסוף מראים סטייה של יותר מ-20 אך פחות מ-100 שלבים שנרשמו על המקודד הסיבובי בעקבות ארה"ב בכל ניסוי.
      אזהרה: כדי למנוע נזק ולהפחית את הלחץ על החיה, התחילו את הגירוי רחוק יותר מבעל החיים והזיזו אותו קרוב יותר עד למילוי התנאים הנדרשים.
  3. הפעלת הפעלות התנהגותיות עם רישום נתונים.
    1. הרכיבו עכבר על משענת הראש.
    2. במסוף של SBC, סוג python3 assocLearnRig_app.py כדי להתחיל את GUI.
    3. כדי לאפשר הקלטות מצלמה במהלך הניסויים ההתנהגותיים, לחץ על לחצן זרם .
      הערה: ניתן להפעיל הפעלות ללא מצלמה. במקרה זה, נרשמים רק נתונים מהמקודד הסיבובי וחותמות הזמן להצגת גירויים.
    4. הזן מידע מזהה עבור החיה בשדה מזהה החיה ולחץ על הלחצן הגדר .
    5. בחר את ה- DEC או ה- DTSC מלחצן האפשרויות תחת הכותרת סוג הפעלה בהתאם לפרדיגמה ההתנהגותית הרצויה.
    6. הזן את פרמטרי הניסוי הרצויים לשדות שמתחת לשדה Animal ID ולחץ על לחצן העלה לארדוינו .
      הערה: פרטים על הפרמטרים של הניסוי ניתן למצוא בסעיף README של מאגר GitHub.
    7. לחץ על לחצן התחל הפעלה כדי להתחיל את ההפעלה.
    8. כאשר הפעלה מאתחלת, הנתונים יתחילו להיכנס לספרייה חדשה שנוצרה ב- "/media/usb" בנקודת ההרכבה של כונן האגודל של SBC.

4. ייצוא וניתוח נתונים

  1. כדי לייצא את כל ההפעלות המוקלטות למחשב המארח, פתח שורת פקודה והזן את הפקודה pscp -r pi@Pi_IP_address:/media/usb* host_computer_destination, ולאחר מכן אמת באמצעות סיסמת SBC.
    הערה: הפקודה לעיל מיועדת למחשב Windows. במכונות Mac ו- Linux, השתמש במסוף והחלף את "pscp" ב- "scp".
  2. התקןאת Anaconda 25 או מנהל חבילות פייתון אחר (PPM) במחשב המארח.
  3. עבור אל מאגר GitHub והורד את "analyzeSession.py", "summarizeSessions.py", "session2mp4s.py", ו"דרישותHost.txt".
  4. פתח שורת PPM והקלד התקנת conda --קובץ directory_containing_requirementsHostrequirements Host.txt כדי להבטיח שהתקנת חבילת Python כוללת את ספריות הפייתון הנדרשות.
  5. בהנחיה, הקלד תקליטור directory_containing_analyzeData כדי לנווט לספרייה המכילה "analyzeData.py" ו- "session2mp4s.py". הפעל את תוכנית הניתוח על-ידי הקלדת פייתון analyzeSession.py
    הערה: הודעת שגיאה תיווצר אם תשתמש בגרסת Python 2 כפייתון. כדי לבדוק את הגירסה, הקלד python -V בהנחיה.
  6. בחר את הספריה המכילה את הנתונים כשתתבקש. ספריות עם ספריות משנה מרובות ינותחו ברצף.
  7. עבור הפעלות DEC, עבור כל מדריך הפעלה שנותח, בחר אזור עניין (ROI) המכיל את עין העכבר מתמונה ממוצעת של ניסיון.
    הערה: קבצי נתוני ניתוח סופי וגרפים מסכמים יאוכלסו בתת-ספרייה של כל ספריית הפעלות שנותחה.
  8. הקלד python summarizeSessions.py כדי ליצור נתוני סיכום על פני הפעלות מרובות.
  9. הקלד את session2mp4s.py python ההנחיה כדי להמיר קבצי נתוני הדמיה לקבצי .mp4 הניתנים לצפייה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זרימת עבודה לניסויים וניתוחים של DEC
בחירת פרמטרים ניסיונית נכונה חשובה לאימון מוצלח של התניית לינק עין (DEC). עבור הנתונים שהוצגו כאן, ממשק המשתמש הגרפי שימש לבחירת משך CS של 350 אלפיות השנייה ומשך ארה"ב של 50 אלפיות השנייה. זיווג זה גורם למרווח בין גירויים של 300 אלפיות השנייה: ארוך מספיק כדי למנוע ייצור CR באמפליטודה נמוכה10 וקצר מספיק כדי להימנע מלהיכנס למשטר של למידה לקויה או התניית מעקב, תהליך שמערב אזורים נוספים במוח11. הזמן שבין הניסויים נקבע באמצעות השדות הנמוכים והגבוהים של ITI כדי להיבחר באופן אקראי באופן אחיד מטווח של 5-15 שניות. האקראיות של המרווחים בין הניסויים אינה מאפשרת לנבדקים בעלי חיים להשתמש ברמזי תזמון שאינם ה-CS וה-US עצמם לביצוע המשימה.

הכללת ניסויים המשמיטים את ה-CS או את ה-US מאפשרת הערכה של קינמטיקה CR ו-UR אפילו בבעלי חיים מאומנים. המשתמש יכול להגדיר את שיעור הניסויים שבהם CS ו- US מזווגים או מוצגים בבידוד. בנתונים שהוצגו כאן, הרצנו את כל המפגשים בניסויים של 10% CS בלבד עם ניסויים זוגיים המהווים את השאר וללא ניסויים בארה"ב בלבד. שים לב שהכללת מספר מופרז של ניסויים לא מזווגים עלולה להשפיע לרעה על האימונים. לדוגמה, מפגשים עם יותר מ-50% מהניסויים שלא טופלו משמשים בדרך כלל להכחדת CRs בבעלי חיים מאומנים19,26.

הכנת המצלמה ותנאי התאורה הם קריטיים גם לרכישת נתונים באיכות גבוהה. ניתן להתאים את קצב הפריימים של הרכישה בתוכנת הרכישה Picamera. בנתונים שהוצגו כאן, קבענו קצב פריימים של 120 הרץ עבור ניסויי DEC. מודול Picamera עצמו מאפשר קצבי פריימים של עד ~200 הרץ, אך אנו מוצאים שקצבים נמוכים יותר מונעים אובדן פריימים ומעניקים רזולוציה טמפורלית נאותה למעקב אחר העפעפיים. יש למקם את האור האינפרא אדום כדי להאיר את הפרווה הפריוקולרית באופן שווה מבלי ליצור השתקפות מוגזמת מהקרנית כאשר העין פתוחה. איור 3A מציג תמונה לדוגמה מסשן הקלטה עם תאורה מקובלת. תוכנת הרכישה picamera (picameraStream.py) נועדה לספק הגדרות עקביות לאורך כל ההפעלה על ידי הגדרה והחזקה של האיזון הלבן והרווח של המצלמה בהתבסס על תנאי תאורה כאשר המצלמה מאותחלת.

לאחר אתחול הפעלה התנהגותית, נתונים מהמצלמה ורכיבי חומרה אחרים בפלטפורמה יירשמו באופן אוטומטי. יומני נתונים נוצרים בספריה הנקראת על-ידי הזנת התאריך והערך לשדה מזהה החיה בממשק המשתמש הגרפי. מסגרות מצלמה וחותמות זמן עבור כל ניסוי מאוחסנות בקבצים בודדים אשר נקראים באמצעות מזהה החיה, תאריך הניסוי ומספר הניסוי. אירועי פלטפורמה עבור כל הפעלה, כולל מהירות גלגל, התחלות ניסיון, עצירות ניסיון ותזמון CS ו- US, נשמרים כקובץ .txt יחיד.

לאחר מכן ניתן לנתח נתונים המועברים למחשב המארח כמתואר בסעיף 4 של הפרוטוקול. הפעלת analyzeData.py בספריית יעד תיצור מיכל .npy למיקום העפעפיים לעומת זמן עבור כל הניסויים במערך המבוסס על ניתוח קבצי המצלמה. קובץ גורם מכיל זה נוצר בספריה המנותחת. לאחר שכל המפגשים נותחו עבור בעל חיים נתון, ניתן ליישר את כל המפגשים ולשרשר אותם באמצעות summarizeSessions.py. תוצאות של בעל חיים שאומן במשך 8 מפגשים של DEC מוצגות באיור 3B. בנוסף, ניתן לעבד גירסאות ניסיון בודדות כקבצי .mp4 הניתנים לצפייה באמצעות כלי השירות session2mp4s.py. כלי עזר זה מטביע ריבוע בפינה השמאלית העליונה של הסרט כדי לציין מתי מוחלים CS ו- US. ניסויי DEC לדוגמה שהוכנו בדרך זו מוצגים זה לצד זה כסרטון משלים 1. הפאנל השמאלי מציג ניסוי שבו החיה מצליחה לעצום את עינה בתגובה ל-LED CS. בפאנל הימני, החיה לא ממצמצת עד שארה"ב מתחילה.

בעלי חיים שאומנו ב- DEC על פי הפרוטוקולים בסעיף 3 ותועדו עם השיקולים הקודמים צריכים להראות ראיות ברורות ל- CRs מתוזמנים היטב שנרכשו בהדרגה במשך מספר ימי אימונים. דוגמאות לעקבות התנהגותיים ללא CRs בבעל חיים לא מיומן ועקבות המכילים CRs חזקים מבעל חיים מאומן מוצגים באיור 3B. כפי שמעקבות אלה מראים, בעלי חיים תמימים לא צריכים להראות שום תגובה ל-CS אלא תגובה חזקה לארה"ב. CRs צריכים לגדול בהדרגה הן בגודל והן בתדירות באמצעות מפגשים התנהגותיים המבוצעים על פני ימים (איור 3B-D). לעומת זאת, תנאי תאורה לא אופטימליים מגבילים מאוד את איכות הנתונים הנרכשים. כאשר הניגודיות בין העין לפרווה הסובבת אותה נמוכה (איור 3E), שינויים קלים בתמונה יכולים לשנות באופן משמעותי את הצורה המוקלטת של ה-UR בהפעלה אחת ולהפחית את יחס האות לרעש לאיתור מיקום העפעפיים (איור 3F-G).

כדי להבטיח הקלטות עפעפיים באיכות גבוהה, מיקום אופטימלי של מקור האור הוא קריטי. יש לאמן את נורית התאורה ישירות על העין המוקלטת. אם המיקום גורם לבוהק מוגזם על משטח הקרנית, ניתן למקם מפזר מעל מערך ה-LED כדי להפחית את האפקט הזה.

זרימת עבודה לניסויים וניתוחים של DTSC
רבים מהשיקולים לבחירת פרמטרים ניסיוניים דומים בין התניית מבהיל מישוש מושהה (DTSC) לבין DEC. כאן נצביע על אלה השונים. בנתונים לדוגמה, משך DTSC CS הוגדר ל- 250 אלפיות השנייה עם משך ארה"ב של 50 אלפיות השנייה. מרווח קצר יותר זה בין גירויים נבחר כדי ליישר קו עם משך הזמן הקצר יותר שתואר כאופטימלי עבור למידת DTSC20. פרמטרים אחרים של הפלטפורמה שהוגדרו באמצעות ממשק המשתמש הגרפי היו זהים לאלה ששימשו עבור DEC.

מיקום נכון של גירוי המישוש הוא קריטי ללמידה ב- DTSC. אנו מרכיבים את גירוי המישוש כך שקצה הקצף ממורכז מעט מעל אפו של החיה במרחק של כ-1.5 ס"מ כאשר הוא נמצא במצב נייטרלי. לאחר ההרכבה, ניתן לסובב את הגירוי ביד כאשר הפגישה אינה פועלת. במהלך הפגישות, מנוע הסטפר מחזיק את הגירוי במיקום מדויק עד להפעלת US. כדי להבטיח שהמיקום נכון, אנו מקיימים ישיבת הכנה של כשלושה ניסויים. אירועים שנרשמו במקודד הסיבובי מודפסים על מסך הטרמינל, וניתן להשתמש בתדפיס זה כדי לנטר את המשרעת של URs של בעלי חיים בזמן אמת. בעוד שהמשרעת המרבית תשתנה מניסוי לניסוי, בעלי חיים עם מקסימום ממוצע של כ-40 ספירות על המקודד לאורך ההפעלה הקצרה אמורים לתפקד היטב במשימת ה-DTSC. בהתבסס על הגדרות בקרת המקודדים הסיבוביים, ערך זה מתאים ל-24 ס"מ לשנייה, עם ערך שלילי המציין שהחיה נעה לאחור על הגלגל.

הארגון והשמות של קבצים שהופקו במהלך הפעלות DTSC זהים לאלה שהופקו ב- DEC. הפעלת analyzeSession.py תיצור מיכל .npy עבור מהירות הגלגל לעומת הזמן עבור כל הניסויים במערך מניתוח הנתונים שנרשמו בקובץ .csv. לאחר שכל המפגשים נותחו עבור בעל חיים נתון, ניתן ליישר את כל המפגשים ולשרשר אותם באמצעות summarizeSession.py. תוצאות מבעל חיים שאומן במשך 5 מפגשים של DEC מוצגות באיור 4A. באשר ל- DEC, ניתן להמיר את לכידות המצלמה מ- DTSC לקבצי .mp4 הניתנים לצפייה. ניסויי DTSC לדוגמה מוצגים זה לצד זה בסרטון משלים 2. הפאנל השמאלי מציג ניסוי שבו החיה מגבה בהצלחה את הגלגל בתגובה ל-LED CS. בלוח הימני, החיה לא מצליחה להזיז את הגלגל עד שהגירוי המישושי US מופעל.

מהלך הזמן והמשרעת ביחס ל-UR של תגובות בבעלי חיים שאומנו על פרדיגמת ה-DTSC מראים קווי דמיון איכותיים לאלה המאומנים ב-DEC. בעלי חיים תמימים לא צריכים להראות שום תגובה ל-CS, וללמוד להזיז את הגלגל לאחור בתגובה ל-CS רק לאחר חשיפות חוזרות ונשנות ל-CS ול-US הזוגיים. התדירות והמשרעת של CRs גדלות ככל שהאימון מתקדם (איור 4A,B). במקרה של DTSC, מצאנו כי משרעת UR בשלב מוקדם של האימון היא מנבא טוב להצלחת הלמידה. בקבוצה של בעלי חיים שאומנו בארה"ב והפיקו URs באמפליטודה נמוכה (<20 ס"מ לשנייה), אף בעל חיים לא למד לייצר CRs באופן עקבי לאחר 4 ימי אימונים (איור 4C,D).

הבדלים בין אימון DEC ו- DTSC
DEC ו- DTSC נבדלים זה מזה בדרכים חשובות. ראשית, למידת DTSC בפלטפורמה זו מתרחשת במהירות רבה יותר, כאשר רוב בעלי החיים משיגים רמה גבוהה של מיומנות במשימה עד היום השלישי של האימון וביצועים אסימפטומטיים עד היום החמישי. למידת DEC איטית יותר עבור רוב בעלי החיים בלפחות 3 ימים. שנית, מערכת DTSC משלבת זיהוי אוטומטי של CRs מוצלחים, המשמשים כאות משוב למנגנון להפחתת המשרעת של גירוי המישוש. הליך אימון זה מחקה את מיזוג לינק העין, שבו ביצועי CR משופרים מספקים הגנה חלקית מפני נפיחת אוויר קרנית מרתיעה. לעומת זאת, בעלי חיים קבועים בפרדיגמת ה-DTSC אינם מסוגלים להגן על עצמם מפני גירוי המישוש על ידי תגובתם המוטורית בלבד. על ידי ביסוס המשרעת האמריקאית על נוכחות של CR, לבעלי חיים יש הזדמנות להגן על עצמם מפני הגירוי המרתיע.

Figure 1
איור 1: תכונות ועיצוב פלטפורמה. (A) רכיבי פלטפורמה לתיעוד התנהגות בעלי חיים בתנאים קבועים. העכבר הותאם מתמונת Biorender. (B) תזמון וגירויים עבור מיזוג DEC ו- DTSC. מרווח בין גירויים (ISI) המוגדר על-ידי המשתמש קובע כמה זמן נמשך פרק הזמן של CS בלבד. תקופות CS וארה"ב נועדו לסיים במשותף. (C) תמונה המדגימה מיקום של רכיבי פלטפורמה מרכזיים. 1) מנוע סטפר לשליטה על DTSC US. 2) גלגל ריצה עבור החיה. 3) מקודד סיבובי למעקב אחר תנועת הגלגלים. 4) קצף מודבק על זרוע אקרילית המשמשת כגירוי המישוש DTSC. 5) LED CS. 6) שסתום סולנואיד ושקע המספק את ה- DEC US. 7) פיקמרה לתיעוד התנהגות בעלי חיים. 8) נורית אינפרא אדום להארת במה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: חיווט של רכיבי חומרה בפלטפורמה. (A) דיאגרמת חיווט פריץ של חומרת הפלטפורמה כאשר היא מורכבת במלואה. חוטים נצבעים על ידי מודולים עם כתום = מודול מצלמה; צהוב = מודול DEC US; כחול = מודול LED CS; סגול = מודול DTSC US; ירוק = מודול מקודד סיבובי. הפיקמרה אינה נכללת אך מתחברת לממשק הטורי של המצלמה הממוקם על פני השטח של ה-Raspberry Pi. סוללות מציינות ספקי כוח בזרם ישיר במתח שצוין. (ב-ו) ערכת חיווט מקבילה עבור מודולים מבודדים. חוטים נצבעו מחדש, כך שאדום ושחור תמיד מצביעים על מעקה אספקה וקרקע חיוביים, בהתאמה, בעוד שחוטים אחרים נצבעים כדי לאפשר מעקב קל אחר המעגל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: תוצאות מייצגות של אימון DEC. (A) מסגרת מצלמה לדוגמה ממפגש עם תנאי תאורה מקובלים. שימו לב לניגודיות הגבוהה בין העין לפרווה הפריוקולרית. קווים אופקיים מציינים ביצועים בכל ניסוי, עם צבעים חמים המעידים על סגירת עפעפיים רבה יותר. הקו האנכי השחור השמאלי ביותר מציין את תחילת ה- CS, בעוד שהקו המקווקו מציין את תחילתה של ארה"ב. הקו המוצק השני מצביע על הפסקת ה-CS וה-US. שים לב שמספר הניסויים עם תגובות מוצלחות במהלך מדעי המחשב גדל במהלך האימונים. (C) ביצועי בעלי חיים מ-(B) עם עקבות בודדים הנגזרים מממוצע הניסויים של הפגישה בכל יום. רוויית הגוון מציינת את מספר ההפעלה עם רוויה גבוהה יותר למפגשים מאוחרים יותר. (D) ביצועים עבור כל בעלי החיים בקבוצת DEC (n = 7). הקווים הדקים מציינים את אחוז הניסויים עם CR הניתן לזיהוי מכל מפגש עבור כל חיה. הקווים העבים מצביעים על כך שההפעלה פירושה על פני כל בעלי החיים. (E) מסגרת מצלמה לדוגמה מתוך הפעלה עם תנאי תאורה תת-אופטימליים. (ו) כימות של ניסויים בודדים שנרשמו בתאורה לקויה. כתובת ה-UR ניתנת לזיהוי אך עם ניגודיות נמוכה יותר ושונות גבוהה יותר מאשר בתנאי תאורה אופטימליים. (ז) מעקבות ממוצעים של מפגשים מניסויים שהוצגו ב-(ו). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות מייצגות של אימון DTSC. (A) ביצועים של בעל חיים יחיד במהלך מפגשים שבוצעו על פני ימים בפרדיגמה של DTSC. קווים אופקיים מציינים ביצועים בכל ניסוי, עם צבעים חמים המציינים תנועת גלגל לאחור. הקו האנכי השחור השמאלי ביותר מציין את תחילת ה- CS, בעוד שהקו המקווקו מציין את תחילתה של ארה"ב. הקו המוצק השני מצביע על הפסקת ה-CS וה-US. (B) ביצועי בעלי חיים מ-(A) עם עקבות בודדים הנגזרים מממוצע הניסויים של הפגישה בכל יום. רוויית הגוון מציינת את מספר ההפעלה עם רוויה גבוהה יותר למפגשים מאוחרים יותר. (C) ביצועים עבור כל בעלי החיים בקבוצת DTSC (n = 6). הקווים הדקים מציינים את אחוז הניסויים עם CR הניתן לזיהוי מכל מפגש עבור כל חיה. הקווים העבים מצביעים על כך שההפעלה פירושה על פני כל בעלי החיים. (D) ניסויים בודדים כמו ב-(A) מקבוצה שבה עוצמת ארה"ב עוררה URs באמפליטודה נמוכה. (E) ממוצע העקבות המוצגים כ-(B) עבור בעלי החיים הנתונים לארה"ב החלשה. (F) ביצועים עבור כל בעלי החיים ב- DTSC עם US חלש (n = 6). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

סרטון משלים 1: ניסויי פגיעה והחמצה לדוגמה של DEC. ניסויי DEC מושווים בסרטון 1. כל סרטון מציג ניסויים שבהם הנבדק מבצע (משמאל) או לא מצליח להפוך את (מימין) ל-CR היעד מסונכרן ומשחק זה לצד זה לצורך השוואה. ה-LED CS מופעל כאשר הריבוע הכחול מופיע בפינה השמאלית העליונה של כל סרטון. אות הבקרה של ארה"ב פעיל כאשר ריבוע לבן מחליף את הריבוע הכחול. אותות הבקרה של CS ו-US מסתיימים יחד כאשר הריבוע נעלם. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

סרטון משלים 2: ניסויי פגיעה והחמצה לדוגמה של DTSC. סרטון 2 מציג השוואת ניסוי DTSC. כל סרטון מציג ניסויים שבהם הנבדק מבצע (משמאל) או לא מצליח להפוך את (מימין) ל-CR היעד מסונכרן ומשחק זה לצד זה לצורך השוואה. ה-LED CS מופעל כאשר הריבוע הכחול מופיע בפינה השמאלית העליונה של כל סרטון. אות הבקרה של ארה"ב פעיל כאשר ריבוע לבן מחליף את הריבוע הכחול. אותות הבקרה של CS ו-US מסתיימים יחד כאשר הריבוע נעלם. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפלטפורמה עם הפרוטוקולים המשויכים המתוארים כאן יכולה לשמש למעקב אמין אחר התנהגות בעלי חיים בשתי משימות למידה אסוציאטיביות חושיות. כל משימה תלויה בתקשורת שלמה דרך מסלול הסיבים המטפס. בתכנון המתואר כאן, אנו משלבים אלמנטים כדי להקל על למידה ורישום / הפרעה של תגובת המוח הקטן. אלה כוללים גלגל המאפשר תנועה חופשית11,18, כמו גם קיבוע ראש. הגלגל מאפשר לעכברים לנסוע בחופשיות, מה שנצפה כקריטי לרכישת DEC18. קיבוע ראשים בעכברים מאפשר לחוקרים לנצל גישות גנטיות, אלקטרופיזיולוגיות, הדמיה ואופטוגנטיות שקשה יותר להשתמש בהן במיני מודל אחרים או בתנאים הנעים בחופשיות12. השתמשנו בעיצוב שלנו עבור כל אחד מהיישומים הללו. ניתן להתאים את התוכנה הפועלת על המיקרו-בקרים בקלות לשליטה באותות תזמון לרכישה של מולטיפוטונים או לסנכרון עם גירוי אופטוגנטי, שניהם בדיוק של תת-אלפיות השנייה. יש להקפיד למזער את התפיסה של בעלי חיים של אופטוגנטיקה וציוד הדמיה כאשר אלה משולבים עם ניסויים התנהגותיים. לדוגמה, מערכות מולטי-פוטון רבות פולטות צליל נשמע מהסורקים הגלוונומטריים או מהתריסים שלהן כאשר רכישות ההדמיה מתחילות. אם הרכישות מופעלות על ידי תחילת הניסוי, צלילים כאלה יכולים לשמש רמז לא מכוון לנבדקים בעלי חיים כי גירוי צפוי לבוא.

השליטה במנגנון ההתנהגותי בנויה סביב SBC, המשמש ליצירת ממשק משתמש גרפי לניהול הניסוי, המצלמה וייצוא הנתונים. ה-SBC גם שולח פקודות לשני מיקרו-בקרים המטפלים בתזמון הניסויים ושולטים ישירות ברכיבי חומרה כגון הצגת גירויים והמקודד הסיבובי. הפרוטוקולים המפורטים כאן נבדקו באמצעות Raspberry Pi 3B+ או 4B המחוברים ל-Arduino עקב תזמון ניסוי בקרה ו-Arduino Uno כדי לשלוט בהצגת ה-DTSC US. יישומי תכנון חומרה אחרים אפשריים אך לא נבדקו עם התוכנה שסופקה.

כדי להקל על השימוש במספר אסדות במקביל, אנו ממליצים להפעיל את ה- SBC במצב "ללא ראש". בתצורה זו, מחשב מארח משמש לקיום אינטראקציה עם SBC. מתג אתרנט מאפשר קישוריות אינטרנט סימולטנית הן למחשב המארח והן ל- SBC. המתג מאפשר גם תקשורת ישירה בין המארח ל- SBC עם העברת נתונים מהירה. כתוצאה מכך, המתג מאפשר העברת נתונים קלה ותחזוקת חבילת SBC.

עבור הפעלת מספר אסדות במקביל, כל אסדה צריכה להיות ממוקמת במארז מיוחד משלה. מתחמים אלה חייבים לכלול בידוד אקוסטי אם הם ממוקמים בסמיכות זה לזה. דיכוי קול בין אסדות סמוכות יכול לסייע במניעת רמזים שמיעתיים לא מכוונים מגירויים המופקים במכלאות שכנות.

השימוש בפלטפורמה אחת עבור DEC ו-DTSC מאפשר לחוקרים לנווט באופן גמיש בחוזקות ובחולשות של כל פרדיגמה. DEC נהנית מתובנות הנגזרות מעשרות שנים של מחקר על אילו אזורים במוח ואלמנטים ספציפיים של מעגל המוח הקטן מעורבים בלמידה ובביצוע של משימות 1,4,11,13,14,15,19. עם זאת, בעכברים, האזור של קליפת המוח הצרבלרית הקשור לרוב להתניה של מצמוץ עיניים11,12 ממוקם עמוק בתוך הסדק המוחי הראשוני (אם כי ראו 15,17,27 המדגימים אזור הקשור ל-DEC של אובלה שטחית VI). מוקד עמוק ללמידה מסבך את הגישה לניסויים אופטיים, במיוחד הדמיה מרובת פוטונים של פעילות תאים וניסויי הפרעה אופטוגנטיים. לעומת זאת, המצעים המוחיים של DTSC ממוקמים בחלקם בהיבט השטחי של אונות IV/V20. לפיכך, DTSC מציג גישה אופטית דומה לזו של הניאוקורטקס הגבי, אתר פופולרי לחקר מערכות במדעי המוח.

בתכנון שלנו, התנהגות בעלי חיים נמצאת במעקב באמצעות מקודד סיבובי המחובר לגלגל ומצלמה. בחרנו בשיטות אלה בעלות נמוכה ובקלות היישום. במקרים מסוימים, שיטות מעקב אחרות עשויות לספק דיוק מרחבי וטמפורלי יותר. לדוגמה, מיקום העפעפיים ב- DEC היה בדרך כלל במעקב באמצעות חיישני אפקט הול28,29 או הקלטות אלקטרומיוגרמה של האזור הפריאורביטלי של השלד אורביקולריס אוקולי30,31. באופן דומה, מעקב אחר תנועה על ידי זיהוי תנועת הגלגלים נותן תמונה פחות מפורטת של התנהגות בעלי חיים מאשר אלגוריתמים מבוססי תמונה למעקב אחר תנוחות כגון SLEAP32 ו- DeepLabCut33. הקלטות מבוססות מצלמה מאפשרות תוספת של גישות כאלה.

כאן, הצגנו פלטפורמה למעקב אחר התנהגות בעלי חיים במהלך שתי פרדיגמות למידה אסוציאטיביות תלויות סיבים מטפסים. הפלטפורמה שלנו נועדה להגדיל את הנגישות של שיטות אלה הן מבחינת העלות והן מבחינת קלות היישום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות הנפש NRSA F32 MH120887-03 (ל- G.J.B.) ו- R01 NS045193 ו- R01 MH115750 (ל- S.S-H.W.). אנו מודים לד"ר באס קוקקוק והנק-יאן בולה על דיונים מועילים לאופטימיזציה של הגדרת ה- DEC ולד"ר יו וואנג ושיאואינג צ'ן על דיונים מועילים לאופטימיזציה של הגדרת ה- DTSC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
"B" Quick Base For C&B METABOND - 10 mL bottle Parkell S398 Dental cement solvent
"C" Universal TBB Catalyst - 0.7 mL Parkell S371 Catalyst
#8 Washers Thorlabs W8S038 Washers
0.250" (1/4") x 8.00" Stainless Steel Precision Shafting Servocity 634172 1/4" shaft
0.250” (0.770") Clamping Hub Servocity 545588 Clamping hub
1/4" to 6 mm Set Screw Shaft Coupler- 5 pack Actobotics 625106 Shaft-coupling sleeve
1/4"-20 Cap Screws, 3/4" Long Thorlabs SH25S075 1/4" bolt
100 pcs 5 mm 395–400 nm UV Ultraviolet LED Light Emitting Diode Clear Round Lens 29 mm Long Lead (DC 3V) LEDs Lights +100 pcs Resistors EDGELEC ‎ED_YT05_U_100Pcs CS LEDs
2 m Micro HDMI to DVI-D Cable - M/M - 2 m Micro HDMI to DVI Cable - 19 pin HDMI (D) Male to DVI-D Male - 1920 x 1200 Video Star-tech ‎HDDDVIMM2M Raspberry Pi4B to monitor cable
256 GB Ultra Fit USB 3.1 Flash Drive SanDisk ‎SDCZ430-256G-G46 USB thumb drive
3.3 V–5 V 4 Channels Logic Level Converter Bi-Directional Shifter Module Amazon B00ZC6B8VM Logic level shifter
32 GB 95 MB/s (U1) microSDHC EVO Select Memory Card Samsung ‎MB-ME32GA/AM microSD card
4.50" Aluminum Channel Servocity 585444 4.5" aluminum channel
48-LED CCTV Ir Infrared Night Vision Illuminator Towallmark SODIAL Infrared light array
4PCS Breadboards Kit Include 2PCS 830 Point 2PCS 400 Point Solderless Breadboards for Proto Shield Distribution Connecting Blocks REXQualis B07DL13RZH Breadboard
5 Port Gigabit Unmanaged Ethernet Network Switch TP-Link ‎TL-SG105 Ethernet switch
5 V 2.5 A Raspberry Pi 3 B+ Power Supply/Adapter Canakit ‎DCAR-RSP-2A5 Power supply for Raspberry Pi 3B+
5-0 ETHILON BLACK 1 x 18" C-3 Ethicon 668G Sutures
6 mm Shaft Encoder 2000 PPR Pushpull Line Driver Universal Output Line Driver Output 5-26 V dc Supply Calt  B01EWER68I Rotary encoder
Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 1", 5 Pack Thorlabs TR1-P5 Optical posts
Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack Thorlabs TR2-P5 Optical posts
Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 4", 5 Pack Thorlabs TR4-P5 Optical posts
Ø1/2" Optical Post, SS, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 6", 5 Pack Thorlabs TR6-P5 Optical posts
Ø1/2" Post Holder, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 2" Thorlabs PH2 Optical post holder
Adapter-062-M X LUER LOCK-F The Lee Co. TMRA3201950Z Solenoid valve luer adapter
Aeromat Foam Roller Size: 36" Length Aeromat B002H3CMUE Foam roller
Aluminum Breadboard 10" x 12" x 1/2", 1/4"-20 Taps Thorlabs MB1012 Aluminum breadboard
Amazon Basics HDMI to DVI Adapter Cable, Black, 6 Feet, 1-Pack Amazon HL-007347 Raspberry Pi3B+ to monitor cable
Arduino  Uno R3 Arduino A000066 Arduino Uno (microcontroller board)
Arduino Due Arduino ‎A000062 Arduino Due (microcontroller board)
Bench Power Supply, Single, Adjustable, 3 Output, 0 V, 24 V, 0 A, 2 A Tenma 72-8335A Power supply
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet, 12" x 24" x 1/8" McMaster Carr 8560K257 Acrylic sheet
CNC Stepper Motor Driver 1.0–4.2 A 20–50 V DC 1/128 Micro-Step Resolutions for Nema 17 and 23 Stepper Motor Stepper Online B06Y5VPSFN Stepper motor driver
Compact Compressed Air Regulator, Inline Relieving, Brass Housing, 1/4 NPT McMaster Carr 6763K13 Air source regulator
Cotton Swab Puritan 806-WC Cotton swab
Dell 1908FP 19" Flat Panel Monitor - 1908FPC Dell 1908FPC Computer monitor
Flex Cable for Raspberry Pi Camera Adafruit 2144 camera serial interface cable
High Torque Nema 17 Bipolar Stepper Motor 92 oz·in/65 N·cm 2.1 A Extruder Motor Stepper Online 17HS24-2104S Stepper motor
Isoflurane Henry Schein 66794001725 Isoflurane
Krazy Maximum Bond Permanent Glue, 0.18 oz. Krazy Glue KG483 Cyanoacrylate glue
Lidocaine HCl VetOne 510212 Lidocaine
Low-Strength Steel Hex Nut, Grade 2, Zinc-Plated, 1/4"-20 Thread Size McMaster Carr 90473A029 Nuts
M3 x 50 mm Partially Threaded Hex Key Socket Cap Head Screws 10 pcs Uxcell A16040100ux1380 M3 bolt
NEMA 17 Stepper Motor Mount ACTOBOTICS 555152 Stepper motor mount
Official Raspberry Pi Power Supply 5.1 V 3 A with USB C - 1.5 m long Adafruit 4298 Power supply for Raspberry Pi 4B
Optixcare Dog & Cat Eye Lube Lubricating Gel, 0.70-oz tube Optixcare 142422 Opthalimic ointment
Precision Stainless Steel Ball Bearing, Shielded, Trade No. R188-2Z, 13000 rpm Maximum Speed McMaster-Carr 3759T57 Bearing
Premium Female/Female Jumper Wires - 40 x 6" Adafruit 266 Wires
Premium Female/Male 'Extension' Jumper Wires - 40 x 6" (150 mm) Adafruit 826 Wires
Premium Male/Male Jumper Wires - 40 x 6" Adafruit 758 Wires
Radiopaque L-Powder for C&B METABOND - 5 g Parkell S396 Dental cement powder
Raspberry Pi (3B+ or 4B) Adafruit 3775 or 4295 Raspberry Pi
Raspberry Pi NoIR Camera Module V2 - 8MP 1080P30 Raspberry Pi Foundation RPI3-NOIR-V2 Raspberry NoIR V2 camera
Right-Angle Bracket, 1/4" (M6) Counterbored Slot, 8-32 Taps Thorlabs AB90E Right-angle bracket
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 3/16" Hex Thorlabs RA90 Right-angle optical post clamp
Right-Angle End Clamp for Ø1/2" Posts, 1/4"-20 Stud and 3/16" Hex Thorlabs RA180 Right-angle end clamp
RJ45 Cat-6 Ethernet Patch Internet Cable Amazon ‎CAT6-7FT-5P-BLUE Ethernet cable
Rotating Clamp for Ø1/2" Posts, 360° Continuously Adjustable, 3/16" Hex Thorlabs SWC Rotating optical post clamps
Spike & Hold Driver-0.1 TO 5 MS The Lee Co. IECX0501350A Solenoid valve driver
Swivel Base Adapter Thorlabs UPHA Post holder adapter
USB 2.0 A-Male to Micro B Cable, 6 feet Amazon ‎7T9MV4 USB2 type A to USB2 micro cable
USB 2.0 Printer Cable - A-Male to B-Male, 6 Feet (1.8 m) Amazon B072L34SZS USB2 type B to USB2 type A cable
VHS-M/SP-12 V The Lee Co. INKX0514900A Solenoid valve
Zinc-Plated Steel 1/4" washer, OD 1.000" McMaster Carr 91090A108 Washers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCormick, D. A., Lavond, D. G., Clark, G. A., Kettner, R. E., Rising, C. E., Thompson, R. F. The engram found? Role of the cerebellum in classical conditioning of nictitating membrane and eyelid responses. Bulletin of the Psychonomic Society. 18 (3), 103-105 (1981).
  2. McCormick, D. A., Clark, G. A., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Initial localization of the memory trace for a basic form of learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (8), 2731-2735 (1982).
  3. McCormick, D. A., Thompson, R. F. Cerebellum: essential involvement in the classically conditioned eyelid response. Science. 223 (4633), New York, N.Y. 296-299 (1984).
  4. Krupa, D. J., Thompson, J. K., Thompson, R. F. Localization of a memory trace in the mammalian brain. Science. 260 (5110), New York, N.Y. 989-991 (1993).
  5. Llinás, R., Sugimori, M. Electrophysiological properties of in vitro Purkinje cell dendrites in mammalian cerebellar slices. The Journal of Physiology. 305, 197-213 (1980).
  6. Mintz, M., Lavond, D. G., Zhang, A. A., Yun, Y., Thompson, R. F. Unilateral inferior olive NMDA lesion leads to unilateral deficit in acquisition and retention of eyelid classical conditioning. Behavioral and Neural Biology. 61 (3), 218-224 (1994).
  7. Welsh, J. P., Harvey, J. A. Cerebellar lesions and the nictitating membrane reflex: performance deficits of the conditioned and unconditioned response. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 9 (1), 299-311 (1989).
  8. Mauk, M. D., Steinmetz, J. E., Thompson, R. F. Classical conditioning using stimulation of the inferior olive as the unconditioned stimulus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (14), 5349-5353 (1986).
  9. Steinmetz, J. E., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Classical conditioning in rabbits using pontine nucleus stimulation as a conditioned stimulus and inferior olive stimulation as an unconditioned stimulus. Synapse. 3 (3), New York, N.Y. 225-233 (1989).
  10. Chettih, S. N., McDougle, S. D., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Adaptive timing of motor output in the mouse: The role of movement oscillations in eyelid conditioning. Frontiers in Integrative Neuroscience. 5, 72 (2011).
  11. Heiney, S. A., Wohl, M. P., Chettih, S. N., Ruffolo, L. I., Medina, J. F. Cerebellar-dependent expression of motor learning during eyeblink conditioning in head-fixed mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14845-14853 (2014).
  12. Heiney, S. A., Kim, J., Augustine, G. J., Medina, J. F. Precise control of movement kinematics by optogenetic inhibition of purkinje cell activity. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2321-2330 (2014).
  13. Ten Brinke, M. M., et al. Evolving models of pavlovian conditioning: Cerebellar cortical dynamics in awake behaving mice. Cell Reports. 13 (9), 1977-1988 (2015).
  14. Gao, Z., et al. Excitatory cerebellar nucleocortical circuit provides internal amplification during associative conditioning. Neuron. 89 (3), 645-657 (2016).
  15. Giovannucci, A., et al. Cerebellar granule cells acquire a widespread predictive feedback signal during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (5), 727-734 (2017).
  16. Ten Brinke, M. M., et al. Dynamic modulation of activity in cerebellar nuclei neurons during pavlovian eyeblink conditioning in mice. eLife. 6, 28132 (2017).
  17. Wang, X., Yu, S., Ren, Z., De Zeeuw, C. I., Gao, Z. A FN-MdV pathway and its role in cerebellar multimodular control of sensorimotor behavior. Nature Communications. 11 (1), 6050 (2020).
  18. Albergaria, C., Silva, N. T., Pritchett, D. L., Carey, M. R. Locomotor activity modulates associative learning in mouse cerebellum. Nature Neuroscience. 21 (5), 725-735 (2018).
  19. Kim, O. A., Ohmae, S., Medina, J. F. A cerebello-olivary signal for negative prediction error is sufficient to cause extinction of associative motor learning. Nature Neuroscience. 23 (12), 1550-1554 (2020).
  20. Yamada, T., et al. Sensory experience remodels genome architecture in neural circuit to drive motor learning. Nature. 569 (7758), 708-713 (2019).
  21. Horlington, M. Startle response circadian rhythm in rats: lack of correlation with motor activity. Physiology & Behavior. 5 (1), 49-53 (1970).
  22. Yeomans, J. S., Li, L., Scott, B. W., Frankland, P. W. Tactile, acoustic and vestibular systems sum to elicit the startle reflex. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 26 (1), 1-11 (2002).
  23. Raspberry Pi Operating system images. , Available from: https://www.raspberrypi.com/software/operationg-systems/ (2021).
  24. VNC Server. VNC® Connect. , Available from: https://www.realvnc.com/en/connect/download/vnc/ (2021).
  25. Anaconda: The world's most popular data science platform. , Available from: https://xddebuganaconda.xdlab.co/ (2021).
  26. De Zeeuw, C. I., Ten Brinke, M. M. Motor learning and the cerebellum. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 021683 (2015).
  27. Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
  28. Koekkoek, S. K. E., Den Ouden, W. L., Perry, G., Highstein, S. M., De Zeeuw, C. I. Monitoring kinetic and frequency-domain properties of eyelid responses in mice with magnetic distance measurement technique. Journal of Neurophysiology. 88 (4), 2124-2133 (2002).
  29. Kloth, A. D., et al. Cerebellar associative sensory learning defects in five mouse autism models. eLife. 4, 06085 (2015).
  30. Boele, H. -J., Koekkoek, S. K. E., De Zeeuw, C. I. Cerebellar and extracerebellar involvement in mouse eyeblink conditioning: the ACDC model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 3, (2010).
  31. Lin, C., Disterhoft, J., Weiss, C. Whisker-signaled eyeblink classical conditioning in head-fixed Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53310 (2016).
  32. Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
  33. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21 (9), 1281-1289 (2018).

Tags

מדעי המוח גיליון 179 המוח הקטן למידה מוטורית אסוציאטיבית התניית עיכוב בלינק העין התניית גירוי מישוש מושהה מושהה
פלטפורמה גמישה לניטור למידה אסוציאטיבית חושית תלוית מוח הקטן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Broussard, G. J., Kislin, M., Jung,… More

Broussard, G. J., Kislin, M., Jung, C., Wang, S. S. H. A Flexible Platform for Monitoring Cerebellum-Dependent Sensory Associative Learning. J. Vis. Exp. (179), e63205, doi:10.3791/63205 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter