Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) ist ein gängiger Proxy für die mitochondriale Funktion und kann zur Untersuchung verschiedener Krankheitsmodelle verwendet werden. Wir haben eine neue Methode entwickelt, die einen Seahorse XF-Analysator verwendet, um die OCR in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen direkt zu messen, die physiologisch relevanter ist als andere Methoden.
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Methodenartikel
Messung des Sauerstoffverbrauchs in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle bei der zellulären ATP-Produktion, der reaktiven Regulierung der Sauerstoffspezies und der Ca2 + - Konzentrationskontrolle. Mitochondriale Dysfunktion wurde mit der Pathogenese mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht, einschließlich der Parkinson-Krankheit (PD), der Huntington-Krankheit und der Alzheimer-Krankheit. Um die Rolle der Mitochondrien in Modellen dieser Krankheiten zu untersuchen, können wir die mitochondriale Atmung über die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) als Proxy für die mitochondriale Funktion messen. OCR wurde bereits erfolgreich in Zellkulturen sowie isolierten Mitochondrien gemessen. Diese Techniken sind jedoch physiologisch weniger relevant als die Messung der OCR in akuten Hirnschnitten. Um diese Einschränkung zu überwinden, entwickelten die Autoren eine neue Methode mit einem Seahorse XF-Analysator, um die OCR in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen direkt zu messen. Die Technik ist optimiert mit einem Fokus auf das Striatum, ein Gehirnareal, das an PD und der Huntington-Krankheit beteiligt ist. Der Analysator führt einen Live-Cell-Assay mit einer 24-Well-Platte durch, der die gleichzeitige kinetische Messung von 24 Proben ermöglicht. Die Methode verwendet kreisförmig gestanzte Stücke von striatalen Hirnschnitten als Proben. Wir demonstrieren die Wirksamkeit dieser Technik, indem wir eine niedrigere basale OCR in striatalen Schnitten eines Mausmodells von PD identifizieren. Diese Methode wird für Forscher, die auf dem Gebiet der PD und der Huntington-Krankheit arbeiten, von großem Interesse sein.
Einleitung
Mitochondriale Dysfunktion wurde mit mehreren neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Parkinson-Krankheit (PD), Huntington-Krankheit und Alzheimer-Krankheit 1,2,3. PD-Modelle wie PINK1 Knockout (KO) Mäuse und Ratten zeigen eine beeinträchtigte mitochondriale Funktion 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitoc....
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Protokoll
Alle Verfahren, einschließlich der Tierarbeit, wurden nach nationalen und internationalen Richtlinien durchgeführt und vom Animal Care and Use Committee der Thomas Jefferson University genehmigt. Männliche FVB/NTac-Mäuse im Alter von 3 bis 14 Monaten wurden verwendet. Die folgenden Schritte wurden in einer nicht sterilen Umgebung durchgeführt, aber Vorsicht ist geboten, um alles so sauber wie möglich zu halten.
HINWEIS: Die hier vorgestellte Methode wurde in der von Zhi et al.24 berichteten Forschung etabliert und verwendet. Die hier beschriebenen Experimente verwendeten einen extrazellulären Flussanalysator Seahorse....
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Ergebnisse
Der erste Schritt dieser Studie bestand darin, die Schichtdicke und die Stanzgröße zu optimieren, die verwendet wurden, um einen Abschnitt des Striatums aus der Scheibe zu entfernen (Abbildung 3A). Eine Scheibe mit einer Dicke von 150 μm und einer Stanzgröße von 1,5 mm lieferte die besten Ergebnisse, die durch die Kopplungseffizienz bestimmt wurden (Abbildung 3B-C). Wie in Abbildung 3B gezeigt, ist .......
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Diskussion
Die von uns entwickelte Methode ermöglichte die Verwendung eines XF-Analysators zur Messung der OCR in striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen über einen Zeitraum von 4 h. Diese Methode bietet eine neue Möglichkeit, zelluläre Bioenergetik in Stempeln zu messen, die aus anatomisch definierten Gehirnstrukturen herausgeschnitten wurden. Da die analysierten Gewebeproben eher klein sind, können die Stoffwechselparameter bestimmter Hirnareale, die an einer Krankheit beteiligt sind, untersucht werden. Darüber hinaus ahmt di.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken Wangchen Tsering und Pamela Walter für ihre kritische Lektüre und Bearbeitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 bis C.J. L. und NS098393 bis H.Z.) und dem Department of Neuroscience der Thomas Jefferson University (Startup Funds to H.Z.) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Accumet AB150 pH-Tischmessgerät | Thermo Fisher Scientific | 13-636-AB150 | Zur Messung des pH-Werts |
| Antimycin A aus Streptomyces sp. | SIGMA | A8674 | Zur Hemmung des Komplexes III der Mitochondrien |
| Rinderserumalbumin (BSA) | SIGMA | A6003 | Zur Herstellung von modifizierter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (BSA-ACSF) |
| Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP) | SIGMA | C2920 | Zur Entkopplung der mitochondrialen |
| Atmung D-Glucose | SIGMA | G8270 | Zur Herstellung von künstlichem Liquor cerebrospinalis (ACSF) |
| DMSO | SIGMA | D8418 | Zur Dissouvle von Verbindungen |
| HEPES | SIGMA | H3375 | Zur Herstellung von künstlichem Liquor cerebrospinalis (ACSF) |
| Befeuchteter Nicht-CO2-Inkubator | Fisher Scientific | 11-683-230D | Zur Hydratisierung von Platten bei 37 & Grad; C |
| Oligomycin aus Streptomyces diastatochromogenes | SIGMA | O4876 | Zur Hemmung der mitochondrialen ATP-Synthase |
| Parafilm | SIGMA-ALDRICH | Versiegelungsfolie | |
| Rotenon | Tocris | 3616 | Zur Hemmung des Komplexes I der Mitochondrien |
| Seepferdchen XF Kalibrant Lösung 500 mL | Seepferdchen Bioscience | 103681-100 | Lösung zur Kalibrierung von Seepferdchen |
| Seahorse XF Extrazellulärer Flussmittelanalysator | Seepferdchen Bioscience-Gerät | zur Analyse der Sauerstoffverbrauchsrate, alte Generation | |
| Seahorse XFe24 Extrazelluläres Flussmessgerät | Seepferdchen Bioscience-Gerät | zur Analyse der Sauerstoffverbrauchsrate, | |
| neue Generation Seahorse XF24 FluxPaks | Seahorse Bioscience | 101174-100 | Packung mit Flux-Analysator-Sensorpatronen, Gewebekulturplatten, Capture-Bildschirmen Kalibrierlösung und Kalibrierplatten; Assay-Kit. |
| Natriumpyruvat | SIGMA | P2256 | Zur Vermeidung von substratlimitierenden Einschränkungen bei der Substratzufuhr |
| Biopsie-Stanzen aus Edelstahl | Miltex | Vorrichtung zum Stanzen von Scheiben | |
| Sterile Zellkulturschale, 35 x 10 mm | Eppendrof | 0030700102 | Zur Scheibenstanze |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Zum Schneiden von Hirngewebe |
| Wasserbad | Thermo Scientific Precision | 282-115 | Zum Erhitzen von Puffern und Lösungen |
Referenzen
- Hauser, D. N., Hastings, T. G. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism. Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).
- Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondria....
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Nachdrucke und Genehmigungen
