Summary
Ein Protokoll, das die Bildung menschlicher Blastoide beschreibt, die effizient, zeitnah und sequentiell Blastozysten-ähnliche Zellen erzeugen.
Abstract
Ein Modell der menschlichen Blastozyste, die aus Stammzellen (Blastoid) gebildet wird, würde den wissenschaftlichen und medizinischen Fortschritt unterstützen. Seine Vorhersagekraft hängt jedoch von seiner Fähigkeit ab, die Sequenzen der Blastozystenentwicklung (Morphogenese, Spezifikation, Musterung) effizient, zeitnah und originalgetreu zu rekapitulieren und Zellen zu bilden, die das Blastozystenstadium widerspiegeln. Hier zeigen wir, dass naive humane pluripotente Stammzellen, die unter PXGL-Bedingungen kultiviert und dann für das Hippo dreifach gehemmt werden, Wachstumsfaktor- β und extrazelluläre signalregulierte Kinasewege effizient einer Morphogenese unterzogen werden, um Blastoide zu bilden (>70%). In Übereinstimmung mit dem Entwicklungstiming (~ 4 Tage) entrollen Blastoide die Blastozystensequenz der Spezifikation, indem sie Analoga des Trophoblasten und des Epiblasten erzeugen, gefolgt von der Bildung von Analoga des primitiven Endoderms und der polaren Trophoblasten. Dies führt zur Bildung von Zellen, die der Blastozyste ähnlich sind (>96%) und einer Minderheit von Postimplantationsanaloga. Blastoide strukturieren effizient, indem sie die embryonal-abembryonale Achse bilden, die durch die Reifung der Polarregion (NR2F2+) gekennzeichnet ist, die das spezifische Potenzial erwirbt, sich gerichtet an hormonell stimulierte Endometriumzellen zu binden, wie in utero. Ein solches menschliches Blastoid ist ein skalierbares, vielseitiges und ethisches Modell, um die menschliche Entwicklung und Implantation in vitro zu untersuchen.
Introduction
Ein Mangel an experimentellen Modellen hat das Verständnis der frühen menschlichen Embryogenese eingeschränkt. Das aktuelle Wissen über humanspezifische Aspekte der Embryonalentwicklung stammt aus überschüssigen In-vitro-Fertilisationsembryonen (IVF), die für die Forschung gespendet wurden. Die begrenzte Verfügbarkeit, die Schwierigkeiten experimenteller Manipulationen und die unterschiedliche Qualität der Embryonen behindern jedoch wissenschaftliche Untersuchungen. Im Gegenteil, ein originalgetreues In-vitro-Modell menschlicher Embryonen würde komplexe experimentelle Manipulationen ermöglichen und damit eine ethische Gelegenheit bieten, die Forschung an menschlichen Embryonenzu ergänzen 1,2,3,4. Ein zuvor entwickeltes Modell von Maus-Blastozysten kombinierte embryonale Stammzellen der Maus und Trophoblast-Stammzellen5. In diesem detaillierten Protokoll wird ein Verfahren zur Generierung eines Modells der menschlichen Blastozyste aus naiven pluripotenten Stammzellen beschrieben, das den Kriterien der elementaren Blastozyste treu ist6.
Vier Kriterien für menschliche Blastoide. In einem Versuch, eine standardisierte Definition von menschlichen Blastoiden zu etablieren, schlagen wir hier vier minimale Kriterien vor. Obwohl diese Kriterien nicht erschöpfend sind, könnten sie als Grundlage für die Bewertung der Parameter dienen, die die Bildung menschlicher Blastoide ermöglichen (Abbildung 1A). (1) Blastoide sollten sich in Bezug auf die Morphologie und die Erzeugung der Analoga der drei Linien, nämlich Epiblast (Epi), Trophektoderm (TE) und primitives Endoderm (PrE), effizient bilden. Ineffizienz weist wahrscheinlich auf einen unzureichenden Anfangszellzustand und/oder einen unzureichenden Kulturzustand hin (z. B. Blastoidmedium). (2) Blastoide sollten Analoga der drei Linien entsprechend der Entwicklungssequenz (Epi/TE zuerst, PrE/polarTE zuletzt)7,8 und Timing (Induktion ~ 3 Tage; embryonale Tage 5-7)7,9 erzeugen. (3) Blastoide sollten Analoga des Blastozystenstadiums bilden, nicht jedoch von Postimplantationsstadien (z. B. Epiblasten-, Trophoblasten- oder Amnionzellen nach der Implantation). (4) Schließlich sollten Blastoide in der Lage sein, funktionelle Merkmale der Blastozystenimplantation und -entwicklung zu rekapitulieren. Unter Verwendung dieses Protokolls bilden sich menschliche Blastoide effizient unter Verwendung mehrerer Zelllinien (>70%), sind in der Lage, die Blastozysten-Zellanaloga nacheinander und innerhalb von 4 Tagen zu erzeugen, und die Analoga sind dem Blastozystenstadium transkriptionell ähnlich (>96% basierend auf mehreren Analysen)6,10,11. Schließlich erzeugen Blastoide robust die embryonal-abembryonale Achse, die es ihnen ermöglicht, mit hormonell stimulierten Endometriumzellen durch die polare Region zu interagieren und die Linien bei längerer Kultur robust zu erweitern (Zeitäquivalent: Embryonaler Tag 13).
Die Bedeutung des anfänglichen Zellzustands. Humane pluripotente Stammzellen (hPS-Zellen) können in verschiedenen Zuständen stabilisiert werden, die versuchen, präzise Entwicklungsstadien zu erfassen. Diese Zustände werden durch Kulturbedingungen aufrechterhalten, die, obwohl sie immer noch suboptimal sind, die Zellen in einem Präimplantations- (~ embryonale Tage 5-7) oder postimplantationsähnlichen (~ embryonalen Tage 8-14) Epiblastenstadium12 einschränken. Die transkriptomische Analyse zeigte, dass hPSCs, die in PD0325901, XAV939, Gö6983 und Leukämiehemmerfaktor (LIF; als naive PXGL-hPSCs bezeichnet)13,14 kultiviert wurden, dem Blastozysten-Epiblasten ähnlicher sind als hPS-Zellen, die in Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) 2 und Activin15 (als primierte hPS-Zellen 12 bezeichnet werden) und humanen erweiterten pluripotenten Stammzellen (hEPSCs)16 (siehe Analyse in Referenzen 17), 18,19). Dementsprechend passt das Transkriptom von primierten hPSCs am besten zu einem Postimplantations-/Prägastrulations-Cynomolgus-Affen-Epiblasten20. Zusätzliche molekulare Kriterien, wie Transposonexpression, DNA-Methylierung und X-Chromosom-Zustand, bestätigten, dass Variationen des naiven Zustands dem Blastozysten-Epiblasten im Vergleich zum präparierten Zustand 17,21 ähnlicher sind. Schließlich wurden Linien naiver hPSCs erfolgreich direkt aus Blastozysten unter Verwendung von PXGL-Kulturbedingungenabgeleitet 22.
Menschliche frühe Blastozystenzellen sind noch nicht gebunden. Die Spezifikation der murinen Linie erfolgt ab dem Morula-Stadium, das dem Blastozystenstadium23 vorausgeht. Im Gegenteil, Dissoziations- und Reaggregationsexperimente haben gezeigt, dass die menschlichen Trophektodermzellen früher Blastozysten noch nicht gebunden sind24. Dementsprechend hat die Analyse der Zellen menschlicher Blastozysten durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNAseq) gezeigt, dass die erste Linienspezifikation (Trophoblast/Epiblast) nach der Bildung der Blastozystenhöhle7 erfolgt. Diese aufgeschobene menschliche Spezifikation korreliert mit Beobachtungen, dass hPS-Zellen potent sind, um Trophoblasten25,26,27 zu bilden, wenn Maus-PSCs weitgehend an die Epiblastenlinie gebunden sind. Diese kombinierten Beobachtungen führten zu der Möglichkeit, dass naive hPS-Zellen ein Blastozystenstadium widerspiegeln und das Potenzial behalten, die drei Blastozystenlinien zu bilden. In letzter Zeit wurde vorgeschlagen, dass die Potenz von hPSCs zur Spezifizierung extraembryonaler Analoga während der Progression von naivem zu primiertem Zustand von Trophektoderm zu Amnion wechselt27. Daher ähneln naive hPS-Zellen eher dem Präimplantationsstadium 17,18,21 und haben eine erhöhte Fähigkeit, Trophoblasten zu bilden, verglichen mit primierten hPSCs27, hEPSCs 16 oder intermediären umprogrammierten Zuständen 28, die dazu neigen, Postimplantationsanaloga 10 zu bilden (Abbildung 1B ). Der anfängliche Zellzustand ist daher entscheidend für die Bildung der entsprechenden extraembryonalen Analoga. Obwohl eine gründliche Side-by-Side-Analyse der konvertierten Trophektoderm-Analoga noch aussteht, scheint ein naiver PXGL-Zustand, der die frühe Blastozyste widerspiegelt, wichtig zu sein, um High-Fidelity-Blastoide zu bilden.
Prompte Spezifikation und Morphogenese durch Signalweghemmung. Die Hemmung des Hippo-Signalwegs ist ein konservierter Mechanismus, der die Trophoblastenspezifikation bei Mäusen, Kühen und Menschen antreibt 9,29,30. Seit 2013 ist auch bekannt, dass die Hemmung des NODAL (A83-01) und der extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK; PD0325901 oder gleichwertig) und die Aktivierung der Signalwege des bone morphogenetic protein (BMP) löst präparierte hPSCs aus, um das Transkriptionsnetzwerk zu aktivieren, das mit der Trophoblast-Linie 25,31,32,33,34 assoziiert ist. Darüber hinaus bestätigten kürzlich mehrere Berichte, dass die Hemmung sowohl des NODAL- als auch des ERK-Signalwegs und die Aktivierung von BMP die Trophoblastendifferenzierung von naiven hPSCs 25,31,32,33,34 erleichtern. Wenn schließlich die Trophoblastenspezifikation aus einem naiven Zustand heraus ausgelöst wird, rekapitulieren Zellen Aspekte des Entwicklungsverlaufs des Trophektoderms26. Selbsterneuernde Linien, die das Blastozystentrophektoderm widerspiegeln, wurden jedoch in vitro nicht stabilisiert. Nach der Trophoblastenspezifikation könnte die Induktion des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) und der Wnt-Signalwege zusammen mit der HDAC-Hemmung das Fortschreiten der Entwicklung der Trophoblastenerleichtern 34,35 und die Zellen in Linien menschlicher Trophoblastenstammzellen (hTSCs) stabilisieren, die die Zytotrophoblasten nach der Implantationwiderspiegeln 18,35. Solche Linien können sowohl aus Blastozysten als auch aus Plazentageweben abgeleitetwerden 35.
Die zweite extraembryonale Linie, PrE genannt, wird nach Trophoblasten spezifiziert und stammt aus dem Epiblasten 7,9. Im Gegensatz zu murinem PrE36 wird angenommen, dass das menschliche Gegenstück unabhängig von der FGF-Signalisierung37,38 ist. Linien, die das extraembryonale Endoderm (als nEnd bezeichnet) widerspiegeln, wurden aus naiven hPS-Zellen durch Induktion von Signalwegen unter Verwendung von Aktivin A, Wnt und LIF39 gebildet. Im Gegensatz zu Embryo-Inhibitionsexperimenten wurde gezeigt, dass die ERK-Hemmung die Bildung solcher nEND-Zellen in vitro39 verhindert. Bisher wurden solche Linien nicht direkt von Blastozysten abgeleitet.
In letzter Zeit wurden Modelle des frühen Embryos durch die Kombination von Variationen der zuvor für hTSCs 35 und nEND-Zellen39 entwickelten Medien gebildet, wodurch Aktivatoren des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β), EGF und Wnt-Signalwege28,40 verwendet wurden. Diese Embryomodelle bilden sich mit geringer Effizienz (10% -20%) und bilden Zellen, die eher dem Post- als dem Präimplantationsstadium 10 ähneln, einschließlich Analoga des Epiblasten nach der Implantation, des Trophoblasten, des Amnions, der Gastrula, des mesodermalen Gewebes (~ embryonaler Tag 14) und der Zytotrophoblasten10. Im Gegenteil, eine dreifache Hemmung der Hippo-, ERK- und TGF-β-Signalwege steuert effizient die Bildung von Blastoiden, die Blastozysten-ähnliche Zellenumfassen 41. Zusammen mit dem anfänglichen Zellzustand schlagen wir vor, dass die Hemmung der Dreifachwege (Hippo, ERK, TGF-β) der zweite wesentliche Parameter für die Bildung von High-Fidelity-Blastoiden ist (Abbildung 1B).
Auswertung des Zellzustandes und des reflektierten Stadiums mittels scRNAseq. Die Zustände von Zellen, aus denen Blastoide bestehen, können durch scRNAseq-Analyse bewertet werden. Ihre transkriptionelle Ähnlichkeit mit bestimmten embryonalen Stadien kann allein mit Blastoidzellen und im Vergleich zu primierten hPS-Zellen oder hTSCs, die Postimplantationsstadien widerspiegeln, gemessen werden20,35. Die Durchführung von Clusteranalysen mit verschiedenen Definitionsebenen zeigt, wie Subpopulationen progressiv verschmelzen, wenn die Definition abnimmt, und zeigt so die Ähnlichkeiten der Cluster auf. Obwohl die Optimalität in der Anzahl der Cluster gemessen werden kann42, informiert hochauflösendes Clustering auch über das eventuelle Vorhandensein kleiner abnormaler Subpopulationen, beispielsweise in den Postimplantationsstadien10. Die Gene, die zwischen Clustern unterschiedlich exprimiert werden, können Informationen über ihre Analoga im Entwicklungsprozess liefern, indem sie die Expressionsniveaus von Referenzgensätzen bewerten, die stadienspezifische Abstammungslinien definieren. Dies ermöglicht die Messung der Anreicherung von blastoiden Subpopulationen entweder durch unüberwachte Entfernungskarten (z. B. unter Verwendung von Top-angereicherten Genen) oder durch Gen-Set-Enrichment-Analyse (GSEA)43. Unter Verwendung dieses Blastoid-Protokolls bilden sich nur drei Hauptcluster, die die drei Blastozystenlinien transkriptionell widerspiegeln. Ein Cluster umfasst sowohl die anfänglich naiven hPSCs als auch das Epiblastenanalogon der Blastoide. Die Analyse von Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten zeigte die sequentielle Natur der Linienspezifikation (Trophoblasten beginnen innerhalb von 24 h und primitive Endodermzellen innerhalb von 60 h zu spezifizieren). Ein hochauflösendes Clustering erfasste eine Subpopulation von Zellen (3,2%), die Gene exprimieren, die für Embryonen im Gastrulationsstadium spezifisch sind (möglicherweise Mesoderm oder Amnion). Bemerkenswert ist, dass die anfänglichen naiven hPS-Zellen auch 5% der postimplantationsähnlichen Zellen umfassten, wie zuvor beschrieben44. In einer zweiten Analyse können blastoide Zellen in silico mit Referenzzellen verschmolzen werden, die in verschiedenen Stadien 45,46,47 aus Concepti isoliert wurden, um auf die Niveauäquivalenz zu schließen. Hier wurden Zellen aus Präimplantationskonzepten 45,46, in vitro kultivierten Blastozysten 45 und Embryonen im Gastrulationsstadium47 als Referenzpunkte verwendet. Mit diesem Protokoll wurde quantifiziert, dass die nicht übereinstimmenden blastoiden Zellen, die durch hochauflösendes Clustering aufgedeckt wurden, tatsächlich mit Postimplantationsmesoderm und Amnion gruppieren. In zukünftigen Schritten sollte das Transkriptom-Benchmarking durch die Analyse der Transposonexpression, der DNA-Methylierung und des X-Chromosom-Status ergänzt werden, die auch Orientierungspunkte der Entwicklungsstufen21 liefern.
Bewertung der Achsenbildung und anderer Funktionalitäten menschlicher Blastoide. Eine reife Blastozyste ist durch die Bildung der embryonal-abembryonalen Achsenmusterung Trophoblasten für die Implantation gekennzeichnet. Unter Verwendung dieses Blastoidprotokolls bildet sich eine Achse robust, die durch eine Reifung der proximalen Trophoblasten (z. B. NR2F2 + / CDX2-) veranschaulicht wird, die die Fähigkeit zur Bindung an Endometriumorganoidzellen nur dann erwerben, wenn sie hormonell stimuliert sind48,49. Der Vergleich mit Trophosphären, die nicht den Epiblasten bilden, zeigt, dass diese inneren Zellen angrenzende Trophoblasten zur Reife bringen, um die anfängliche Anheftung an das Endometrium zu vermitteln. Wenn sie in einem erweiterten Kulturmedium kultiviert werden, das für Cynomolgus-Affen-Blastozysten50 entwickelt wurde, dehnen sich alle drei Linien des Blastoides für sechs weitere Tage (Zeitäquivalent von Tag 13) konsequent aus, obwohl ihre Organisation dieses Entwicklungsstadium nicht widerspiegelt.
Die Implikation von hocheffizienten und hochgenauen menschlichen Blastoiden. Die Erhaltung von Entwicklungsprinzipien, die in Modellorganismen entdeckt wurden, ist aufgrund des eingeschränkten Zugangs und der technischen Schwierigkeiten bei der genetischen und physischen Manipulation im menschlichen Conceptus von Natur aus schwer zu testen. Ein hocheffizientes und hochgenaues Blastoid-Modell würde genetische und medikamentöse Hochdurchsatz-Screens ermöglichen, die die Grundlage wissenschaftlicher und biomedizinischer Entdeckungen bilden. Darüber hinaus würde die Einbeziehung komplexer genetischer Veränderungen zur Veränderung und Aufzeichnung biologischer Prozesse solche Studien ergänzen. Insgesamt schlagen wir vor, dass die dreifache Hemmung (Hippo, TGF-β, ERK) von naiven PXGL-hPSCs leitfähig für die effiziente Bildung von High-Fidelity-Humanblastoiden ist, die die vier minimalen Kriterien erfüllen. Die skalierbare und vielseitige Natur dieses Protokolls macht es geeignet, gezielte Hypothesen zu generieren, die dann mit menschlichen Blastozysten validiert werden können. Daher werden menschliche Blastoide die Verwendung von humanem Konzeptus für die In-vitro-Forschung nicht ersetzen, sondern könnten als leistungsfähige Möglichkeit dienen, die Forschung durch bisher unzugängliche experimentelle Ansätze im Herzen des wissenschaftlichen und biomedizinischen Entdeckungsprozesses zu lenken. Das Protokoll zeigt, wie man menschliche Blastoide bildet und auch, wie man die Zellen analysiert, die im Blastoid enthalten sind.
Protocol
Die Richtlinien für Stammzellforschung und klinische Translation der International Society for Stem Cell Research (ISSCR) empfehlen, dass die Forschung an menschlichen Blastoiden nur nach Überprüfung und Genehmigung durch ein spezialisiertes wissenschaftliches und ethisches Überprüfungsverfahrenzulässig ist 3,4. Alle experimentellen Verfahren wurden nach den Richtlinien der Ethikkommission Humanforschung des Instituts für Molekulare Biotechnologie der Österreichischen Akademie der Wissenschaften (IMBA) unter der Genehmigung Rivron_Stellungnahme_2020-04-22 durchgeführt. Die Einhaltung dieser Richtlinien ist für die Veröffentlichung von Forschungsergebnissen in wissenschaftlichen Zeitschriften erforderlich.
1. Kultur menschlicher naiver embryonaler Stammzellen im PXGL-Zustand
HINWEIS: Naive hPSCs können von relevanten Labors bezogen werden. Die hier verwendeten Leitungen stammen aus den Labors von Yasuhiro Takashima (derzeit am CiRA, Kyoto, Japan) und von Austin Smith (derzeit am Living Systems Institute, Exeter, Großbritannien). Alternativ können naive hPSCs intern aus Linien von grundierten hPSCs zurückgesetzt werden, wie zuvorbeschrieben 13,14. Naive hPSCs scheinen für mehrere Passagen stabil zu sein (> 15), aber die Qualität der Kultur kann im Laufe der Zeit variieren. Wenn die Qualität des naiven hPSC abnimmt, tauen Sie eine neue Durchstechflasche mit Zellen auf oder erzeugen Sie de novo naive hPSCs aus grundierten PSCs. Für alle Medienzusammensetzungen siehe Ergänzende Tabelle 1.
- Vorbereitung der bestrahlten Schicht des embryonalen Feeders (MEF) der Maus
- Bereiten Sie am Tag vor dem Passieren naiver hPSCs eine 6-Well-Zellkulturplatte mit bestrahlten MEF-Schichten vor, indem Sie die unten beschriebenen Schritte ausführen.
- Beschichten Sie eine 6-Well-Zellkulturplatte mit 1 ml 0,1% Gelatine in PBS pro Well. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 30 min. Entfernen Sie die Gelatinelösung.
- Bereiten Sie MEF-Medium bei 37 °C vor.
- Tauen Sie MEFs in einem Wasserbad bei 37 °C auf, bis nur noch ein kleiner Eisklumpen übrig ist. Lösen Sie das Volumen der Durchstechflasche mit 1 ml vorbereitetem MEF-Medium mit einer P1000-Pipette auf.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in eine 15-ml-Röhre. Drehen Sie die Aufhängung bei 200 x g für 4 min herunter. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das MEF-Pellet durch Zugabe von frischem MEF-Medium (ausreichend für 1,5 ml pro Bohrloch).
- Zählen Sie die Zellen mit Hilfe von Zellzählobjektträgern und fügen Sie 300.000 Zellen pro Bohrung hinzu und übertragen Sie die Platte bei 37 ° C in einen Normoxy-Inkubator.
HINWEIS: Wenn sich MEFs im Laufe der Zeit lösen, können dem PXGL-Medium während des routinemäßigen Medienwechsels neue MEFs hinzugefügt werden.
- Weitergabe humaner naiver pluripotenter Stammzellen
- Bevor Sie hPSCs passieren, überprüfen Sie ihre Morphologie unter dem Mikroskop. Kolonien haben typischerweise eine kuppelförmige Morphologie mit hellen, definierten Rändern. Wenn die einzelnen Kolonien eine flachere Morphologie aufweisen oder wenn sich differenzierte Kolonien abzeichnen, befolgen Sie die Anweisungen in Schritt 1.2.8.
- Saugen Sie das Medium ab und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Fügen Sie 500 μL Zellablösungslösung pro Vertiefung einer 6-Well-Platte hinzu.
- Inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei 37 °C. Verwenden Sie eine P1000-Pipette und pipettieren Sie die Zellen mehrmals, um die Kolonien in einzelne Zellen zu dissoziieren.
- Sammeln Sie die Zellen und übertragen Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen, das Waschpuffer enthält (1 ml pro Vertiefung einer 6-Well-Platte). Drehen Sie die Zellen mit 200 x g für 4 min herunter.
- Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in frischem PXGL-Medium (ausreichend für 1,5 ml pro Well). Betrachten Sie ein Splitting-Verhältnis von 1: 3-1: 6 für routinemäßiges Passaging.
HINWEIS: Nach jeweils 3-4 Passagen oder wenn die Qualität der Zellkultur aufgrund der Zellmorphologie abnimmt (z. B. das Auftreten von flachen Kolonien in der Population), fügen Sie dem Medium während der ersten 24 h nach dem Passieren 10 μM Y-27632 und Wachstumsfaktor-Basalmembranextrakt (5 μL / Well) hinzu. - Bevor Sie die hPSCs neu plattieren, bereiten Sie die Platten mit frischen MEFs vor, indem Sie das MEF-Medium absaugen und die Zellen einmal mit PBS waschen. Verwenden Sie dann eine P1000-Pipette, um 1,5 ml hPSC-Zellsuspension pro Vertiefung einer 6-Well-Platte zu übertragen, die die MEFs enthält.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Pipettieren zu einer homogenen Aussaat der Zellen über den Bohrlochbereich führt. Dies wird das Wachstum von Kolonien mit homogenen Größen und relativer Synchronität der Zellen sicherstellen. - Kultur hPS-Zellen unter hypoxischen Bedingungen bei 37 °C in einer befeuchteten Umgebung. Nach 24 h sollten hPSCs angeschlossen werden. Eine hohe Anzahl von nicht adhärenten (oder schwebenden) Zellen spiegelt ein Problem der Lebensfähigkeit oder der Bindung beim Passieren wider.
- Wechseln Sie das Medium mit 1,5 ml PXGL-Medium pro Bohrloch täglich. Passage hPSCs alle 3-4 Tage oder verwenden Sie sie für Blastoid-Formationsexperimente.
HINWEIS: Nachdem Sie hPSCs aufgetaut haben, passieren Sie sie für mindestens drei Passagen, bevor Sie ein Blastoid-Experiment starten.
2. Bildung von Blastoiden
- Bildung naiver PSC-Aggregate
- Bereiten Sie die PXGL-Medien, N2B27-Basalmedien, Waschpuffer, PBS und Aggregationsmedien vor und erwärmen Sie sie, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Schließen Sie MEFs aus der hPSCs-Suspension für die Bildung von Blastoiden aus, indem Sie die unten beschriebenen Schritte ausführen.
- Für den MEF-Ausschluss ist eine gelatinebeschichtete Platte vorzubereiten, indem 1 ml 0,1% Gelatine in die Vertiefung einer 6-Well-Platte gegeben und bei 37 °C für 30-90 min inkubiert wird.
- Um die Zellen zu ernten, saugen Sie das Medium ab und waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS.
- 500 μL Zellablösungslösung (pro Vertiefung einer 6-Well-Platte) hinzufügen und bei 37 °C für 5 min inkubieren.
- Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die Dissoziation von Kolonien in einzelne Zellen zu verfolgen (einige mehrzellige Klumpen können später durch sanftes Pipettieren dissoziiert werden).
- Verdünnen Sie die Zellablösungslösung mit 1 ml Waschpuffer. Sammeln Sie die Zellen von der Platte, indem Sie 5 bis 10 Mal vorsichtig pipettieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine 15-ml-Röhre. Drehen Sie die Zellen mit 200 x g für 4 min herunter.
- Aspirieren Sie den Überstand, suspendieren Sie die Zellen in 1,5 ml PXGL-Medium (pro Vertiefung einer 6-Well-Platte) und säen Sie die Zellen auf den gelatinebeschichteten Platten für den MEF-Ausschluss aus und inkubieren Sie bei 37 ° C für 60-90 min.
- Sobald die naiven Zellen für den MEF-Ausschluss ausgesät sind, entfernen Sie das PBS aus den Mikrotöpfen und gleichen Sie die Vertiefungen mit 200 μL basalem N2B27-Medium (pro 1 Mikrowellenchip) aus und inkubieren Sie für 60 min bei 37 ° C.
- Sammeln Sie den Überstand, der die nicht gebundenen naiven Zellen enthält, übertragen Sie ihn in eine 15-ml-Röhre und drehen Sie die Zellen mit 200 x g für 4 Minuten herunter.
- Aspirieren Sie die Medien und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml N2B27-Basalmedien. Zählen Sie die Zellen mithilfe von Objektträgern zum Zählen von Zellen. Drehen Sie die Zellen mit 200 x g für 4 min herunter.
- Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie eine geeignete Menge von 10 μM Y-27632 hinzu, die in N2B27-Medien enthalten ist, um eine Zelldichte von 30.000 Zellen pro 50 μL zu erhalten.
HINWEIS: Die optimale anfängliche Seeding-Zellnummer kann zwischen den verschiedenen Zelllinien variieren. Zum Beispiel, um 50-60 Zellen / Mikrowelle zu säen, werden 30.000 Zellen (einschließlich Überschuss, wenn man bedenkt, dass einige Zellen außerhalb der Mikrowelle fallen) in 1 Well von 96 Well Plate gesät, die 430 Microwells enthält. Eine ungeeignete Ausgangszellzahl kann dazu führen, dass die kleine Aggregatbildung ohne Hohlraum oder Bildung einer kavitierten Struktur mehr als 250 μm erreicht. - Aspirieren Sie das Medium aus äquilibrierten Mikrowell-Arrays und fügen Sie 25 μL N2B27-Medien mit 10 μM Y-27632 hinzu. Fügen Sie 50 μL Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie bei 37 ° C für 15 Minuten (bis die Zellen in den Boden der Mikrovertiefung fallen). Dann fügen Sie 125 μL N2B27-Medium hinzu, ergänzt durch 10 μM Y-27632.
- Blastoid-Entwicklung
- Innerhalb von 24 h können Aggregate naiver hPSCs (Tag 0) auf dem Mikrowellenchip beobachtet werden. Um die Blastoidbildung zu initiieren, bereiten Sie PALLY medium vor und führen Sie die unten beschriebenen Schritte aus.
- Vorgewärmtes PALLY-Medium bei 37 °C für 30 min.
HINWEIS: 1-Oleoyllysophosphatidsäure (LPA) und 10 μM Y-27632 müssen kurz vor der Anwendung hinzugefügt werden. Die optimale LPA-Konzentration variiert zwischen 0,5-5 μM. Dies muss für einzelne hPSC-Leitungen titriert werden, die für Blastoide verwendet werden. - Aspirieren Sie das Aggregationsmedium. Geben Sie 200 μL vorgewärmtes PALLY-Medium zu den Mikrowellen. Legen Sie die Zellkulturplatte wieder in einen hypoxischen Inkubator bei 37 °C. Wiederholen Sie den Medienwechsel an Tag 1.
- An Tag 2 entfernen Sie PALLY-Medium und fügen Sie 200 μL N2B27-Medium hinzu, ergänzt mit LPA und 10 μM Y-27632.
HINWEIS: An Tag 2 wächst die Mehrheit der Aggregate weiter. Einige Aggregate bilden jedoch kleine Hohlräume. Kontinuierlich Kulturblastoide in PALLY bis Tag 4 oder in in vitro Kulturmedium (IVC1) ab Tag 2. Der Medienwandel verstärkt jedoch die Bildung von PrE in reifen Blastoiden. - Wiederholen Sie den Medienwechsel an Tag 3. Die vollständige Blastoidbildung erfolgt am Tag 4.
HINWEIS: Es wird davon ausgegangen, dass Blastoide vollständig entwickelt sind, wenn sie eine vollständige Morphogenese auf der Grundlage von Morphometrien der menschlichen Blastozysten des Tages 7 (z. B. ein Durchmesserbereich von 150 -250 μm; ein innerer Cluster, umgeben von einem Epithel trophektodermähnlicher Zellen) durchlaufen haben und polare trophektodermähnliche Zellen (NR2F2 + / CDX2-) und PrE-ähnliche Zellen (GATA4 +) gebildet haben. Dies kann mittels Immunfluoreszenzfärbung oder fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) beurteilt werden.
3. Bildung von Blastoiden in 96-Well Ultra Low Attachment Microplates
- Bereiten Sie naive hPSCs-Zellsuspension für die Blastoidebildung vor, indem Sie die oben beschriebenen Schritte von 2.1.1 - 2.1.11 ausführen.
- Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie eine geeignete Menge an N2B27-Medien hinzu, die 10 μM Y-27632 enthalten, um die Zelldichte von 70 Zellen pro 100 μL des Mediums zu erhalten.
HINWEIS: Die optimale anfängliche Seeding-Zellzahl kann zwischen verschiedenen Zelllinien variieren. Zum Beispiel können 70 Zellen / gut die optimale Zellzahl für die meisten Zelllinien sein. - Zentrifen Sie die Platte bei 200 x g für 2 min bei Raumtemperatur, um Zellen am Boden der Vertiefungen zu clustern.
- Inkubieren Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 °C unter hypoxischen Kulturbedingungen. Innerhalb von 24 h können Aggregate naiver hPSCs (Tag 0) an den Bohrlöchern beobachtet werden.
- Bereiten Sie 2x PALLY medium vor. Geben Sie 100 μL vorgewärmtes 2x PALLY-Medium zu den Vertiefungen.
- Legen Sie die Zellkulturplatte wieder in einen hypoxischen Inkubator bei 37 °C. Nach 24 h die Hälfte des Mediums (100 μL) abspritzen und durch 100 μL vorgewärmtes PALLY-Medium ersetzen. Wiederholen Sie den Schritt bis Tag 4. Stellen Sie sicher, dass Sie die Aggregate nicht aspirieren.
HINWEIS: An Tag 2 wächst die Mehrheit der Aggregate weiter. Einige Aggregate haben jedoch kleine flüssigkeitsgefüllte Hohlräume. Am 4. Tag durchläuft die Mehrheit der kavitierten Strukturen eine vollständige Morphogenese, um Blastozysten-ähnliche Strukturen zu bilden.
4. Bildung von Trophosphären
- Befolgen Sie für die Trophosphärenbildung das Blastoid-Formationsprotokoll von Schritt 2.1.1 (MEF-Ausschluss) bis Schritt 2.1.12 (letzter Schritt des Seeding-Protokolls).
- Sobald sich nach 24 h Aggregate naiver hPSCs gebildet haben, tauschen Sie das Aggregationsmedium mit PALY (ohne LIF) aus, ergänzt durch 3 μM SC-144 für die Bildung von Trophosphären, die frühes Trophektoderm darstellen, und PALLY, ergänzt durch 2 μM XMU-MP-1 für die Bildung von Trophosphären, die reife Trophektoderm darstellen.
- Aktualisieren Sie das Medium täglich. Die vollständige Trophosphärenbildung erfolgt am Tag 4.
5. Analyse des Zustands der blastoiden Zellen und seines reflektierten Stadiums mittels scRNAseq
- Um Blastoide aufzunehmen und Dissoziationen durchzuführen, erwärmen Sie den Schüttelinkubator auf 37 ° C und stellen Sie ihn auf 100 U / min ein.
- Sammeln Sie Blastoide von der ursprünglichen 96-Well-Platte und übertragen Sie sie mit einer Mundpipet, die mit einer Glaskapillare ausgestattet ist, auf mehrere Vertiefungen einer U-Bodenplatte mit 96-Well-Platte.
HINWEIS: Blastoide (> 70%) sollten basierend auf den morphometrischen Kriterien (Größe = 150-250 μm mit einem eindeutigen inneren Cluster) ausgewählt werden, um eine Kontamination mit nicht-blastoiden Strukturen (< 30%) zu vermeiden. - Einmal mit 200 μL PBS mit einem P200 waschen, indem Sie es unter einem Stereomikroskop betrachten. Transfer in eine Welle, die 50 μL Kollagenase enthält, und Inkubation für 30 min im Schüttelinkubator.
- Die Blastoide in eine Vertiefung mit 100 μL 10x Trypsin-EDTA überführen und gut mischen. Inkubiere für 20 min im Schüttelinkubator.
- Dissoziieren Sie die Blastoide in eine einzelne Zelle, indem Sie P200-Pipette verwenden. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen mit FACS-Puffer (1% FBS in PBS).
- Um spezifische Verhältnisse der Analoga der drei Linien zu erfassen, färben Sie die TE- und PrE-Analoga mit TROP2- bzw. PDGFRa-Antikörpern.
HINWEIS: Die Anzahl der PrE-Zellen in menschlichen Blastozysten ist im Vergleich zu Maus-Blastozysten geringer, was Entwicklungsdefekte von Blastozysten widerspiegeln könnte, die durch In-vitro-Fertilisation (IVF) oder einen Speziesunterschied gebildet wurden. In Blastoiden sind die PrE-Analoga weniger häufig als die TE- und EPI-Analoga und repräsentieren 7,4% der Zellen beim Zählen von GATA4+-Zellen durch Immunfluoreszenzbildgebung. Außerdem könnte der Dissoziationsprozess Verzerrungen in den Anteilen der verschiedenen Zelltypen als PrE-Analoga induzieren, um 1% -2% der Zellen bei Blastoiddissoziation, PDGFRa-Tagging und FACS-Analyse darzustellen. - FACS-Sortierzellen aus allen drei Lineage-Analoga in 384-Platten, die einen Lysepuffer für die Smart-SEQ2-Analyse enthalten. Schließen Sie tote Zellen aus, die durch DAPI-Färbung gekennzeichnet sind (gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt).
- Um die Zellzustände (Zelltyp und Entwicklungsstadium) zu bewerten, vergleichen Sie die transkriptomischen Daten von Blastoid mit den entsprechenden Kontrollen.
6. Erweiterte Kultur zur Beurteilung der Blastoid-Entwicklungsprogression
- Kultur menschliche Blastoide auf Basalmembran-matrixbeschichteten Platten (Glasboden).
- Beschichten Sie die Platte mit Basalmembranmatrix.
- Untersuchen Sie die Blastoide visuell, um die Morphologie zu beurteilen und aufzuzeichnen.
HINWEIS: Nur Blastoide, die die klassische Hohlkugel-Blastozystenmorphologie mit kompaktem ICM aufweisen, haben das Potenzial, zu wachsen und sich weiterzuentwickeln. - Fügen Sie 100 μL CMRL medium-1 pro Vertiefung der 96-Well-Platte hinzu und legen Sie die Platte mindestens 2 h in den Inkubator, bevor Blastoide zur Gleichsetzung übertragen werden.
- Identifizieren Sie mit einem Stereomikroskop visuell die Blastoide mit guter Morphologie, übertragen Sie die ausgewählten Blastoide in eine Vertiefung von 96-Well-Platte, die 100 μl CMRL medium-1 enthält, um die Spuren von Blastoidmedien zu entfernen.
- Die Blastoide werden in die Vertiefung mit voräquilibriertem CMRL-Media-1 überführt. Legen Sie die Platte in den Inkubator und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 ° C.
HINWEIS: Bis zu 5 Blastoide können in einer Vertiefung von 96 Bohrplatten kultiviert werden. Zu viele Blastoide in einem einzigen Bohrloch können zur Bildung von Aggregaten mehrerer Blastoide führen. - Untersuchen Sie am nächsten Tag die Blastoide visuell unter einem Mikroskop. Wenn die Blastoide angebracht sind, fügen Sie 100 μL voräquilibriertes CMRL-Media-1 hinzu, ergänzt durch 5% Basalmembranmatrix. Legen Sie die Platte in den Inkubator und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
- Überwachen Sie am nächsten Tag die Blastoide unter einem Mikroskop. Entfernen Sie die Hälfte des Mediums (100 μL) und ersetzen Sie es durch 100 μL voräquilibrierte CMRL-Medien-2, ergänzt durch 5% Basalmembranmatrix.
- Ersetzen Sie an den folgenden Tagen die Hälfte des Mediums (100 μL) durch voräquilibrierte CMRL-Medien-3, ergänzt durch 5% Basalmembranmatrix. Legen Sie die Platte in den Inkubator und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C. Wiederholen Sie jeden Tag für bis zu 4-6 Tage In-vitro-Kultur .
HINWEIS: Wir haben kultivierte Blastoide für bis zu 6 Tage unter erweiterten Kulturbedingungen, was dem Zeitäquivalent von Tag 13 von in vitro kultivierten menschlichen Embryonen entspricht.
7. Immunfärbende Blastoide
- Aspirieren Sie das Medium. Proben 3x mit PBS für 5 min waschen.
- Fügen Sie 200 μL kaltes 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS hinzu und fixieren Sie die Proben für 30 Minuten bei Raumtemperatur. PFA-Lösung entfernen und Proben 3x mit PBS für 10 min waschen.
HINWEIS: Wenn Blastoide auf Mikrowell-Chips kultiviert wurden, übertragen Sie die Blastoide vom Chip in 96-Well-U-Bodenplatten für die folgenden Schritte. - Permeabilisieren und blockieren Sie die Blastoide in 100 μL Blockierlösung pro Vertiefung (PBS mit 0,3% Triton-X 100 und 10% normalem Eselserum) für 60 min.
HINWEIS: Je nach Wirtsspezies der Antikörper das Serum entsprechend anpassen. - Entfernen Sie die Blockierungslösung. Fügen Sie 100 μL primäre Antikörper hinzu, die in frischer Blocklösung verdünnt sind, und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 4 ° C.
HINWEIS: Die Konzentrationen der primären Antikörper müssen auf der Grundlage der Anweisungen des Herstellers bestimmt werden. - Proben 3x mit 0,1% Triton-X 100 in PBS (Waschlösung) 10 min waschen. Fügen Sie 100 μL sekundäre Antikörper in Blocklösung zusammen mit 20 μg/ml Hoechst-Kernflecken hinzu und inkubieren Sie Proben für 1 h bei Raumtemperatur. Schützen Sie Proben vor Licht.
HINWEIS: Die Konzentrationen von Sekundärantikörpern müssen auf der Grundlage der Anweisungen des Herstellers bestimmt werden. - Proben 3x mit Waschlösung für 10 min waschen. Für die Bildgebung übertragen Sie die Proben auf den Glasboden μ-Objektträger in PBS.
HINWEIS: Das Montagemedium sollte basierend auf dem für die Bildgebung verwendeten Objektiv ausgewählt werden. Zum Beispiel ist 80% Glycerin in PBS möglich, um die Proben zu montieren, während Ölobjektive verwendet werden.
Representative Results
Typischerweise sind naive hPSCs, die in PXGL kultiviert werden (Abbildung 2A), aggregierte und kavitierte Strukturen, die nach der PALLY-Induktion zwischen 48 und 72 h entstehen und innerhalb von 96 h einen Durchmesser von 150-250 μm erreichen (Abbildung 2B). Unter Verwendung optimaler (1) Seeding-Zellzahlen, (2) Dauer der Vorkulturaggregation mit N2B27 (0 bis 24 h), (3) Konzentration einzelner chemischer Komponenten (insbesondere LPA) und (4) Dauer der PALLY-Behandlung erreicht die Induktionseffizienz 70% -80%, wie basierend auf morphometrischen Parametern definiert (Gesamtgröße von 150-250 μm, einzelner regelmäßiger Hohlraum, einzelner innerer Zellcluster; Abbildung 2C,D) und das Vorhandensein der drei Abstammungslinien. Ein suboptimaler Anfangszellzustand und / oder Induktionsbedingungen führen zu einer weniger effizienten oder keiner Blastoidebildung. Um maximale Effizienz zu gewährleisten und nur Präimplantationsanaloga zu bilden, ist es entscheidend, eine hochwertige Kultur aus naiven PXGL-hPSCs zu verwenden. Dies kann beurteilt werden, indem mittels FACS der Prozentsatz der Zellen gemessen wird, die positiv auf die Oberflächenmarker SUSD2 (naiver Zustand) und CD24 (primierter Zustand) sind. Zusätzliche Oberflächenmarker, die spezifisch für die extraembryonalen Abstammungslinien außerhalb des Ziels sind (z. B. Amnion, extraembryonales Mesoderm), wären ebenfalls nützlich, sind aber nach unserem besten Wissen derzeit nicht verfügbar. Wenn die erhaltene Bildungseffizienz niedriger ist als die berichteten Ergebnisse, ist es wichtig, alle Komponenten des Blastoidmediums sorgfältig zu überprüfen, insbesondere LPA, das in PBS rekonstituiert wird und das als GPCR-Ligand im Vergleich zu synthetischen Molekülen, die in DMSO rekonstituiert werden, instabiler sein kann. In den meisten Fällen, auch wenn die Ausbeute nicht maximal ist, bestehen die kavitierten Strukturen immer noch aus den drei Blastozystenlinien. Die Entstehung von drei Blastozystenlinien und die Bildung einer embryonal-abembryonalen Achse kann durch die Immunfluoreszenzfärbung von Markern (EPI: NANOG, OCT4, TE: GATA3, Polar-TE NR2F2, Mural-TE: CDX2, PrE: GATA4; Abbildung 2E,G). Trophosphären, die nur aus TE bestehen, helfen, die Rolle der interzellulären Kommunikation weiter zu analysieren. Trophosphären können sich mit einer Effizienz von 50 % bis 60 % innerhalb von 96 h nach der Induktion bilden (Abbildung 2H,I). Die Blastoidbildung kann nicht nur in selbstgebauten Mikrotopf-Arrays, sondern auch in kommerziell erhältlichen Ultra-Low-Attachment-96-Well-Platten mit Optimierung der Induktionsbedingungen durchgeführt werden (siehe Protokoll und Abbildung 2J). Blastoide haben auch die Fähigkeit, sich für weitere 6 Tage weiterzuentwickeln, was dem Embryo des Tages 13 entspricht, mit In-vitro-Differenzierungsprotokoll (Abbildung 2K).
Um den Zellzustand von blastoiden Zellen weiter zu charakterisieren, muss die Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechnologie eingesetzt werden. UMAP wird häufig angewendet, um eine Verteilung von Zellzuständen zu visualisieren, und es wird eine unbeaufsichtigte Clustering-Analyse durchgeführt, um die Nähe einzelner Zellzustände zu bewerten. Unterschiedliche Parameter in der Einzelzelldatenanalyse können beeinflussen, wie Zellen in den UMAPs dargestellt werden, was zu Clustern mit unterschiedlichen räumlichen und relativen Positionen und Formen führt (Abbildung 3A). In dieser Analyse zeigen Zellen jedoch deutlich reproduzierbare Clustering-Profile, unabhängig von den Parametern, die für die Durchführung des Clusterings und der Visualisierung der Daten verwendet werden, was es ermöglicht, die drei Blastozystenlinien mit hoher Sicherheit zu unterscheiden. Wir verwendeten Zellen von Embryonen, die in verschiedenen Entwicklungsstadien geerntet wurden, als Referenz. Die Zusammenführung dieser Datensätze zeigt, dass der Großteil des Trophektoderm-Analogons aus dem Blastoid mit Präimplantationstrophektoderm, aber nicht mit Postimplantationstrophoblasten gruppiert ist (Abbildung 3B). Diese Ergebnisse wurden auch von einem unabhängigen Konsortiumbestätigt 10.
Wenn gastrulierende Embryonen im Carnegie-Stadium 7 (CS7) in die Referenzkarte eingeführt werden, wird eine kleine Population von blastoiden Zellen (3%) mit den Mesoderm- und Amnionlinien dieser Embryonen gruppiert (Abbildung 3C). Wenn amnionähnliche Zellen in die Referenzkarte eingeführt werden, gruppiert sich eine kleine Population von blastoiden Zellen (< 2%) mit solchen amnionähnlichen Zellen.
Insgesamt werden nur die Strukturen, die einen einzigen regelmäßigen Hohlraum, einen einzigen inneren Zellcluster, eine Gesamtgröße von 150-250 μm, transkriptomische Analoga der drei Blastozystenlinien umfassen und weitgehend frei von anderen Linien (z. B. Amnion, Mesoderm, extraembryonales Mesoderm) umfassen, als menschliche Blastoide betrachtet.
Abbildung 1: Vier Features und zwei Ansätze zur Erzeugung von High-Fidelity-Blastoiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Blastoid und Trophosphären, abgeleitet von Aggregaten naiver hPSC. (A) Phasenkontrastbilder, die naive hPSCs zeigen, die in PXGL-Medium kultiviert und mit bestrahltem MEF kokultiviert wurden. Maßstabsstab: 50 μm. (B) Phasenkontrastbilder, die die morphologische Veränderung naiver hPS-Aggregate zeigen, die auf einem nicht adhärenten Hydrogel-Mikrowell-Array mit 500 nM LPA (PALLY-Medium) kultiviert wurden. Maßstabsstab: 200 μm. (C) Menschliche Blastoide, die sich nach 96 h auf einem Mikrowell-Array gebildet haben. Maßstabsstäbe: 400 μm. (D) Quantifizierung des Prozentsatzes von Mikrowellen, die ein menschliches Blastoid enthalten, das durch die PALLY-Kulturbedingung induziert wird, mit optimierter LPA-Konzentration aus verschiedenen naiven hPSC-Linien (n = 3 Mikrowellenarrays). E) Immunfluoreszenzfärbung menschlicher Blastoide mit Epiblast (EPI)-Markern (gelb) NANOG und OCT4; die TE-Marker (Cyan) CDX2 und GATA3; und der primitive Endodermmarker (Magenta) SOX17 und GATA4. Maßstabsstab: 100 μm. (H-I) Quantifizierung der Zellzahl (links) und des Prozentsatzes der Zellen (rechts), die zu jeder Linie gehören, in Blastoid (96 h) basierend auf der Immunfluoreszenzfärbung von OCT4, GATA3 und GATA4. (G) Immunfluoreszenzfärbung von humanen Blastoiden für CDX2 (Cyan) und NR2F2 (Magenta). (F) Phasenkontrastbilder von Trophosphären im Früh- und Spätstadium auf einem Mikrowellenarray, die durch Zugabe von 3 μM SC144 (H) bzw. 2 μM XMU-MP-1 (I) induziert werden. (J) Phasenkontrastbilder, die die morphologische Veränderung von naiven hPS-Aggregaten zeigen, die in einer Ultra-Low-Attachment-96-Well-Platte mit 500 nM LPA (PALLY-Medium) kultiviert sind. (K) Phasenkontrastbild (links) und Immunfluoreszenzfärbung (rechts) für OCT4 (gelb), GATA3 (cyan) und GATA4 (magenta) in Blastoid, das 6 Tage lang im Zustand der Postimplantationskultur gezüchtet wurde. Maßstabsstab: 100 μm. Diese Zahl ist von 6,10 adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Charakterisierung der Zusammensetzung von Blastoiden durch Einzelzellsequenzierung. (A) Unüberwachte Clustering-Analyse mit verschiedenen UMAP-Parametern des Transkriptoms einzelner Zellen, die aus den verschiedenen Zeitpunkten von Blastoid (24 h, 60 h, 96 h), naiven hPSCs, primierten hPSCs und hTSC (repräsentieren den Postimplantationszytotrophoblasten) abgeleitet sind. (B) UMAP des Transkriptoms von Zellen, die aus Blastoid- (96 h), naiven hPS-Zellen und primierten hPS-Zellen stammen, die mit veröffentlichten Datensätzen aus menschlichen Embryonen der Präimplantations-, Periimplantations- (in vitro kultivierte Blastozysten) und Gastrulationsstadien (Carnegie-Stadium 7, d. h. zwischen E16-19) integriert sind. Einzelne Zellen werden basierend auf ihrer Herkunft in menschlichen Embryonen (links), blastoid-abgeleiteten Zellen oder Stammzellen (Mitte) und dem Ergebnis einer unbeaufsichtigten Clustering-Analyse (rechts) eingefärbt. (C) UMAPs des Transkriptoms von Zellen, die aus Blastoiden, naiven hPSCs, primierten hPSCs stammen und in den veröffentlichten Datensatz aus dem Gastrulationsstadium (Carnegie-Stadium 7, d. h. zwischen E16-19) integriert sind. Einzelne Zellen werden basierend auf ihrer Herkunft in menschlichen Embryonen (links), blastoid-abgeleiteten Zellen oder Stammzellen (Mitte) und dem Ergebnis einer unbeaufsichtigten Clustering-Analyse (rechts) eingefärbt. Diese Zahl ist von6 adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Tabelle 1: Alle in dieser Studie verwendeten Medienzusammensetzungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Discussion
In der vorliegenden Studie zeigen wir Schritt für Schritt, wie man menschliche Blastoide mit hoher Effizienz mit einem einfachen und robusten Protokoll etabliert. Nach der Aggregation naiver PXGL-hPSCs und ihrer dreifachen Hemmung bilden sich Blastoide effizient (> 70%) und erzeugen sequentiell die 3 Blastozystenanaloga innerhalb von 4 Tagen. Einschränkungen in der Effizienz und Qualität der Blastoide (z. B. Vorhandensein von Off-Target-Zellen) können auftreten, wenn der Anfangszustand suboptimal ist. Bemerkenswert ist, dass wir gemessen haben, dass PXGL-hPS-Zellen etwa 5% der Zellen enthalten, die die Postimplantationsstadien widerspiegeln. Diese Zellen könnten die Bildung von hochwertigen Blastoiden einschränken. Neben dem anfänglich naiven PXGL-Zustand, der den Blastozysten-Epiblasten widerspiegelt, ist ein weiterer entscheidender Faktor das Medium, das für die Blastoidebildung verwendet wird. Um schnell Blastozysten-ähnliche Zellen zu bilden und die Bildung von Off-Target-, postimplantationsähnlichen Zellen zu verhindern, schlagen wir vor, dass die Hemmung der dreifachen Signalwege (Hippo, ERK, TGF-β) unerlässlich ist. Während verschiedene Zelllinien unterschiedliche Ausbeuten an Blastoid bei ERK/TGF-β-Hemmung ergeben (im Allgemeinen etwa 10%-20%), führt die Exposition gegenüber LPA zur Bildung einer gleich hohen Blastoidausbeute über alle Zelllinien hinweg, wobei strenge morphometrische und Abstammungsspezifikationskriterien verwendet werden. LPA wirkt möglicherweise auf die Hemmung des Hippo-Signalwegs, der eine entscheidende Rolle bei der ersten Linientrennung zwischen Epiblast- und Trophektoderm-Linien bei Maus und Menschspielt 8,51. Die signifikante Verbesserung der Blastoideffizienz durch LPA deutet darauf hin, dass die Hippo-Signalweg-vermittelten inner-äußeren Zellspezifikationsmechanismen, die in der Blastozyste im Spiel sind, während der Blastoidbildung kooptiert werden. Eine aktuelle Einschränkung liegt in der Tatsache, dass wir aufgrund einer Suboptimalität der Protokolle, die zur Kultivierung menschlicher Blastozysten oder Blastoide am zeitäquivalenten Tag 7-13 (nach Blastozysten- / Blastoidebildung) verwendet werden, nicht in der Lage sind zu beurteilen, inwieweit wir die Entwicklung nach der Implantation richtig modellieren können.
Die Analyse des transkriptomischen Zustands der blastoiden Zellen kann leicht mit scRNAseq, geeigneten Referenzkarten und bioinformatischen Methoden erreicht werden. Zuvor zeigte die transkriptomische Analyse, dass in PXGL kultivierte hPSCs dem Blastozysten-Epiblasten im Vergleich zum primierten Zustand ähnlicher sind. Einschränkungen bei der Analyse der Daten können auftreten, wenn die Referenzkarte nur Zellen im Blastozystenstadium umfasst. Die Referenzkarte sollte Zellen enthalten, die aus postimplantativen Embryonen stammen, um das Vorhandensein potenzieller Off-Target-Zellen zu beurteilen. Um blastoide Zellen zu vergleichen, wäre in Zukunft eine Referenzkarte mit allen Geweben des menschlichen Konzeptus vor und nach der Implantation äußerst wertvoll. Darüber hinaus würden Multi-Omics-Einzelzellreferenzkarten, z. B. einschließlich Transkriptom, Chromatinzugänglichkeit und DNA-Methylierung, weiter helfen. Schließlich würden standardisierte bioinformatische Methoden zur quantitativen Bewertung der Ähnlichkeiten zwischen Zellen aus Embryomodellen und Referenzkonzepten und zur positiven Identifizierung von Off-Target-Zellen dazu beitragen, die Ergebnisse unvoreingenommen zu analysieren und zu vergleichen.
Insgesamt besitzen Blastoide, die durch dreifache Hemmung von Hippo-, TGF-β- und ERK-Signalwegen gebildet werden, die vier Merkmale 1) hocheffiziente Morphogenese, 2) korrekte Abfolge der Linienspezifikation, 3) hohe Reinheit von Blastozysten-ähnlichen Zellen auf Transkriptomebene, 4) Fähigkeit, die Periimplantationsentwicklung zu modellieren. Diese Eigenschaften von Blastoiden erleichtern den Aufbau von Hypothesen über die Entwicklung und Implantation von Blastozysten, rekapitulieren jedoch nicht frühere Stadien der Embryonalentwicklung. Im Gegensatz zur begrenzten Zugänglichkeit und Vielseitigkeit der menschlichen Blastozyste sind Blastoide für genetische und medikamentöse Screenings für die funktionellen Untersuchungen der Blastozystenentwicklung und -implantation zugänglich. In Zukunft könnte ein solches Grundwissen dazu beitragen, die Formulierung von IVF-Medien zu verbessern, Verhütungsmittel nach der Befruchtung zu entwickeln und die frühe Schwangerschaft besser zu bewältigen.
Disclosures
Das Institut für Molekulare Biotechnologie der Österreichischen Akademie der Wissenschaften hat eine Patentanmeldung EP21151455.9 eingereicht, in der die Protokolle für die menschliche Blastoidbildung und den Blastoid-Endometrium-Interaktionsassay beschrieben werden. HK, AJ, HHK und NR sind die Erfinder dieses Patents. Alle anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union gefördert (ERC-Co-Finanzhilfevereinbarung Nr. 101002317 "BLASTOID: a discovery platform for early human embryogenesis"). H.H.K. wird gefördert durch den Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung (FWF), Lise Meitner Programm M3131-B. Wir danken Yasuhiro Takashima für die gemeinsame Nutzung der H9- und H9-GFP-Zelllinien und Austin Smith, Peter Andrews und Ge Guo für die gemeinsame Nutzung der HNES1-, Shef6-, niPSC 16.2b- und cR-NCRM2-Zelllinien. Wir danken Hossein Baharvand für die gemeinsame Nutzung der Endometriumorganoide. Wir danken Joshua M. Brickman für die gemeinsame Nutzung der RNA, die aus PrE-differenzierten Zellen und nEND-Zellen isoliert wurde. Wir danken Shankar Srinivas für die Weitergabe der Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten des perigastrulären Embryos. Wir danken Aleksand Bykov und Luisa Cochella für die technische Unterstützung bei der Vorbereitung der SMARTSeq2-Bibliothek. Wir danken der NGS-, Biooptik- und Stammzelleinrichtung bei IMBA für die wichtige Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | in house | ||
| DMEM/F12 | in house | ||
| 100X N2 supplemen | Gibco | 17502048 | |
| 50X B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| 100X Glutamax | Gibco | 35050038 | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360039 | |
| MEM-Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| 1 M Hepes | in house | ||
| 50 mM 2-Mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
| 100X Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| PD0325901 | Medchem express | HY-10254 | |
| XAV-939 | Medchem express | HY-15147 | |
| Gö 6983 | Medchem express | HY-13689 | |
| Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor | in house | ||
| A83-01 | Medchem express | HY-10432 | |
| 1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) | Peprotech | 2256236 | |
| Y-27632 | Medchem express | HY-10583 | |
| CMRL medium | Gibco | 21530027 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10-828-028 | |
| Accutase | Biozym | B423201 | cell detachment solution |
| Geltrex | Thermofisher | A1413302 | growth factor basement membrane extract |
| TROP2 antibody | R&D systems | MAB650 | |
| PDGFRα antibody | R&D systems | AF307 | |
| SC-144 | Axon | 2324 | |
| XMU-MP-1 | Med Chem Express | HY-100526 | |
| Matrigel | basement membrane matrix | ||
| Countess cell counting chamber slides | Thermo fisher | cell counting slides | |
| DAPI Staining Solution | Miltenyi Biotec | 130-111-570 |
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