Summary
배반포와 같은 세포를 효율적으로, 시기 적절하고, 순차적으로 생성하는 인간 블라스토이드의 형성을 요약하는 프로토콜.
Abstract
줄기 세포 (blastoid)로 형성된 인간 배반포의 모델은 과학 및 의학 발전을 지원할 것입니다. 그러나, 그것의 예측 능력은 배반포 발달 (형태 형성, 사양, 패터닝)의 서열을 효율적으로시기 적절하고 충실하게 재구성하고 배반포 단계를 반영하는 세포를 형성하는 능력에 달려 있습니다. 여기서 우리는 순진한 인간 다능성 줄기 세포를 PXGL 조건에서 배양한 다음 하마에 대해 삼중으로 억제하고, 성장 인자-β을 형질전환시키고, 세포외 신호-조절된 키나아제 경로를 효율적으로 변형시켜 모세포형성을 겪어 블라스토이드를 형성한다는 것을 보여준다(>70%). 발달 타이밍 (~ 4 일)과 일치하여, 블라스토이드는 영양 세포와 epiblast의 유사체를 생산하여 사양의 배반포 서열을 풀고 원시 내배엽과 극성 영양 세포의 유사체를 형성합니다. 이것은 배반포 (>96 %)와 전사적으로 유사한 세포의 형성과 이식 후 유사체의 소수를 초래합니다. 블라스토이드는 극성 영역(NR2F2+)의 성숙으로 표시된 배아-배아 축을 형성함으로써 효율적으로 패턴화되며, 이는 자궁에서와 같이 호르몬 자극된 자궁내막 세포에 방향적으로 부착할 수 있는 특정 전위를 획득한다. 이러한 인간 블라스토이드는 시험관 내에서 인간 발달 및 이식을 연구하기 위한 확장 가능하고 다재다능하며 윤리적인 모델이다.
Introduction
실험 모델의 부족은 초기 인간 배아 발생에 대한 이해를 제한했습니다. 배아 발달의 인간 특정 측면에 대한 현재의 지식은 연구를 위해 기증 된 잉여 체외 수정 (IVF) 배아에서 파생됩니다. 그러나 제한된 가용성, 실험 조작의 어려움 및 배아의 다양한 품질은 과학적 조사를 방해합니다. 반대로, 인간 배아의 충실한 시험관 내 모델은 복잡한 실험 조작을 허용하여 인간 배아 1,2,3,4에 대한 연구를 보완 할 수있는 윤리적 기회를 제공합니다. 이전에 개발된 마우스 배반포 모델은 마우스 배아줄기세포와 영양세포줄기세포를 결합한 5. 이러한 상세한 프로토콜에서, 원소 배반포 기준에 충실한 순진한 다능성 줄기 세포로부터 인간 배반포의 모델을 생성하는 방법이 기술되어 있다6.
인간 블라스토이드에 대한 네 가지 기준. 여기서, 인간 블라스토이드에 대한 표준화된 정의를 확립하기 위한 시도에서, 우리는 네 가지 최소한의 기준을 제안한다. 비록 철저하지는 않지만, 이러한 기준은 인간 블라스토이드의 형성을 허용하는 파라미터를 평가하는 기초가 될 수 있다(그림 1A). (1) 블라스토이드는 형태학의 관점에서, 그리고 세 계통의 유사체, 즉 에피아세포(Epi), 트로피코배엽(TE) 및 원시적 내배엽(PrE)의 생성의 측면에서 효율적으로 형성되어야 한다. 비효율은 부적절한 초기 세포 상태 또는/및 배양 조건(예를 들어, 블라스토이드 배지)을 가리킬 가능성이 있다. (2) 블라스토이드는 발달 순서 (Epi / TE 첫 번째, PrE / polarTE 마지막) 7,8 및 타이밍 (유도 ~ 3 일, 배아 5-7 일) 7,9에 따라 세 계통의 유사체를 생성해야합니다. (3) 블라스토이드는 배반포 단계의 유사체를 형성해야 하지만, 이식 후 단계(예: 이식 후 에피아세포, 트로피아세포 또는 양막세포)의 유사체는 형성하지 않아야 한다. (4) 마지막으로, 블라스토이드는 배반포 이식 및 발달의 기능적 특징을 되풀이 할 수 있어야합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 인간 배반세포는 다중 세포주를 사용하여 효율적으로 형성되고(>70%), 4일 이내에 배반포 세포 유사체를 순차적으로 생성할 수 있고, 유사체는 배반포 단계와 전사적으로 유사하다(>96% 다중 분석에 기초함)6,10,11. 마지막으로, 블라스토이드는 배아 - abembryonic 축을 견고하게 생성하여 극성 영역을 통해 호르몬 자극 된 자궁 내막 세포와 상호 작용할 수있게하고 확장 된 배양시 혈통을 견고하게 확장시킵니다 (시간 등가 : 배아 13 일째).
초기 세포 상태의 중요도입니다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 정확한 발달 단계를 포착하려고 시도하는 다른 상태에서 안정화 될 수 있습니다. 이들 상태는 여전히 최적이 아닐지라도, 이식 전(~배아 5-7일) 또는 이식 후 유사(~배아8-14일) 에피아세포 단계 12에서 세포를 제한하는 배양 조건에 의해 지속된다. 전사체 분석은 PD0325901, XAV939, Gö6983 및 백혈병 억제 인자(LIF; PXGL naïve hPSCs)13,14에서 배양된 hPSCs가 섬유아세포 성장 인자(FGF) 2 및 액티빈15(프라이밍된 hPSCs 12로 불림)에서 배양된 hPSCs와 인간 연장 다능성 줄기 세포(hEPSCs)16(참고문헌 17의 분석 참조, 18,19). 따라서, 프라이밍된 hPSCs의 전사체는 이식 후/위축 전 사이노몰거스 원숭이 에피아세포(20)와 가장 잘 일치한다. 트랜스포존 발현, DNA 메틸화 및 X 염색체 상태와 같은 추가적인 분자 기준은 나이브 상태의 변이가 프라이밍 상태17,21과 비교하여 배반포 에피모세포와 더 밀접하게 유사함을 확인하였다. 마지막으로, 순진한 hPSC의 라인은 PXGL 배양 조건22를 사용하여 배반포로부터 직접 성공적으로 유도되었다.
인간의 초기 배반포 세포는 아직 커밋되지 않았습니다. 뮤린 계통 사양은 배반포 단계23에 선행하는 모룰라 단계로부터 발생한다. 반대로, 해리 및 재응집 실험은 초기 배반포의 인간 영양 배엽 세포가 아직 투입되지 않았다는 것을 보여주었다24. 따라서, 단일 세포 RNA 시퀀싱 (scRNAseq)에 의한 인간 배반포의 세포를 분석한 결과, 배반포 공동의 형성 후에 첫 번째 계통 사양 (영양 모세포 / 에피아세포)이 발생하는 것으로 나타났습니다7. 이 지연된 인간 사양은 마우스 PSC가 에피아세포 계통에 크게 전념할 때 hPSC가 영양세포25,26,27을 형성하도록 강력하다는 관찰과 상관관계가 있다. 이러한 결합 된 관찰은 순진한 hPSC가 배반포 단계를 반영하고 세 배반포 혈통을 형성 할 가능성을 유지할 가능성을 이끌어 냈습니다. 최근에, 배아 외 유사체를 지정하는 hPSCs의 효능은 순진한 상태에서 프라이밍 상태27로 진행되는 동안 영양 배엽에서 양수로 이동하도록 제안되었다. 따라서, 순진한 hPSC는 이식 전 단계 17,18,21과 더 유사하며, 이식 후 유사체(10)를 형성하기 쉬운 프라이밍된 hPSCs(27), hEPSCs(16), 또는 중간 재프로그램된 상태(28)와 비교하여 영양세포를 형성하는 향상된 능력을 갖는다(도 1B ). 따라서 초기 세포 상태는 적절한 배아외 유사체를 형성하는 데 결정적이다. 변환된 영양 배엽 유사체에 대한 철저한 나란히 분석이 여전히 이루어져야 하지만, 초기 배반포를 반영하는 PXGL 순진한 상태는 고충실도 블라스토이드를 형성하는 데 중요한 것으로 보인다.
자극 사양 및 신호전달 경로 억제에 의한 형태형성. Hippo 신호전달 경로의 억제는 마우스, 소 및 인간9,29,30에서 영양 세포 사양을 구동하는 보존된 메커니즘이다. 또한, 2013년 이래로, NODAL(A83-01) 및 세포외 신호 조절된 키나아제(ERK; PD0325901 또는 등가물) 및 골형성 단백질(BMP) 신호전달 경로의 활성화는 프라이밍된 hPSCs를 촉발시켜 영양세포 계보 25,31,32,33,34와 관련된 전사 네트워크를 활성화시킨다. 더욱이, 최근의 몇몇 보고는 또한 NODAL 및 ERK 경로 둘 다의 억제 및 BMP의 활성화가 나이브 hPSCs 25,31,32,33,34로부터의 영양 세포 분화를 촉진한다는 것을 확인하였다. 마지막으로, 영양 세포 사양이 순진한 상태에서 촉발되면, 세포는 영양 배엽(26)의 발달 진행의 측면을 재구성합니다. 그러나, 배반포 트로피코더피를 반영하는 자가-재생 라인은 시험관내에서 안정화되지 않았다. 영양 세포 사양에 따라, HDAC 억제와 함께 표피 성장 인자 (EGF) 및 Wnt 신호 전달 경로의 유도는 영양 세포 발달 진행을 촉진 할 수 있습니다34,35 및 이식 후 세포 영양 세포 18,35를 반영하는 인간 영양 세포 줄기 세포 (hTSCs)의 라인으로 세포를 안정화시킬 수 있습니다. 이러한 라인은 배반포 및 태반 조직(35) 둘 다로부터 유래될 수 있다.
PrE라고 불리는 두 번째 배아 외 혈통은 영양 세포 이후에 지정되며 epiblast 7,9에서 유래합니다. 뮤린 PrE36과는 달리, 인간 대응물은 FGF 신호전달37,38과 무관하다고 생각된다. 배아외 내배엽(nEnd로 명명됨)을 반영하는 라인은 액티빈 A, Wnt, 및 LIF39를 사용하는 신호전달 경로의 유도에 의해 순진한 hPSCs로부터 확립되었다. 배아 억제 실험과 일치하지 않는, ERK 억제는 시험관내39에서 이러한 nEND 세포의 형성을 방지하는 것으로 나타났다. 지금까지 그러한 라인은 배반포에서 직접 파생되지 않았습니다.
최근에, 초기 배아의 모델은 hTSCs35 및 nEND 세포39에 대해 이전에 개발된 배지의 변형을 조합함으로써 형성되었고, 따라서 형질전환 성장 인자-β (TGF-β), EGF, 및 Wnt 신호전달 경로28,40의 활성화제를 이용한다. 이들 배아 모델은 낮은 효율(10%-20%)로 형성하고, 이식 후 에피아세포, 영양모세포, 양이온, 가스트룰라, 중배엽 조직(~배아 14일째) 및 세포영양세포(10)의 유사체를 포함하는 이식 전 단계(10)보다는 후-유사 세포를 형성한다. 반대로, Hippo, ERK 및 TGF-β 경로의 삼중 억제는 배반포-유사 세포(41)를 포함하는 블라스토이드의 형성을 효율적으로 안내한다. 초기 세포 상태와 함께, 우리는 삼중 경로 억제 (Hippo, ERK, TGF-β)가 고충실도 블라스토이드를 형성하는 두 번째 필수 매개 변수임을 제안합니다 (그림 1B).
scRNAseq를 사용하여 세포 상태 및 반사 단계를 평가한다. 블라스토이드를 구성하는 세포의 상태는 scRNAseq 분석을 통해 평가될 수 있다. 특정 배아 단계에 대한 전사 유사성은 블라스토이드 세포 단독을 사용하고 이식 후단계 20,35를 반영하는 프라이밍 된 hPSC 또는 hTSC와 비교하여 측정 할 수 있습니다. 서로 다른 수준의 정의를 사용하여 클러스터 분석을 수행하면 정의가 감소할 때 하위 모집단이 점진적으로 병합되는 방식이 드러나므로 클러스터의 유사성이 드러납니다. 클러스터의 수에서의 최적성이 측정될 수 있지만(42), 고분해능 클러스터링은 또한 예를 들어 이식 후 단계(10)를 반영하는 작은 비정상적 서브집단의 최종 존재에 대해 알려준다. 군집 사이에서 차별적으로 발현되는 유전자는 단계 특이적 혈통을 정의하는 참조 유전자 세트의 발현 수준을 평가함으로써 개발 과정에서 그들의 유사체에 대한 정보를 제공할 수 있다. 이것은 무감독 거리 맵 (예를 들어, 최고 농축 유전자 사용) 또는 유전자 세트 농축 분석 (GSEA)43을 통해 블라스토이드 하위 집단의 농축을 측정 할 수있게합니다. 이 블라스토이드 프로토콜을 사용하여, 세 개의 배반포 혈통을 전사적으로 반영하는 세 개의 주요 클러스터 만 형성합니다. 하나의 클러스터는 초기 순진한 hPSCs와 블라스토이드의 에피아세포 유사체를 모두 포함한다. 상이한 시점에서의 세포를 분석한 결과, 혈통 사양의 순차적 성질을 보여주었다(영양 세포들은 24시간 이내에 지정되기 시작하고, 원시적 내배엽 세포는 60시간 이내에 지정되기 시작한다). 고분해능 군집화는 위축 단계 배아 (아마도 중배엽 또는 양막)에 특이적인 유전자를 발현하는 세포의 하위 집단 (3.2 %)을 포획했다. 참고로, 초기 순진한 hPSCs는 또한 앞서 기술한 바와 같이 이식 후 유사 세포의 5%를 구성하였다(44). 두 번째 분석에서, 블라스토이드 세포는 단계 동등성을 추론하기 위해 상이한 단계45,46,47에서 concepti로부터 분리된 기준 세포와 실리코에서 병합될 수 있다. 여기서, 이식 전 개념 45,46, 시험관내 배양된 배반포(45), 및 위스트레이션-단계 배아47로부터 분리된 세포를 기준점으로 사용하였다. 이 프로토콜을 사용하여, 고분해능 클러스터링에 의해 밝혀진 미스매치된 블라스토이드 세포가 실제로 이식 후 중배엽 및 양막과 함께 클러스터링된다는 것을 정량화하였다. 향후 단계에서, 전사체 벤치마킹은 트랜스포존 발현, DNA 메틸화 및 발달 단계21의 랜드 마크를 제공하는 X 염색체 상태의 분석으로 보완되어야합니다.
인간 블라스토이드의 축 형성 및 기타 기능 평가. 성숙한 배반포는 이식을위한 영양 세포를 패터닝하는 배아 - 배아 축의 형성을 특징으로합니다. 이 블라스토이드 프로토콜을 사용하여, 축은 근위 영양 세포 (예를 들어, NR2F2+/CDX2-)의 성숙에 의해 예시되는 견고하게 형성되며, 이는 호르몬 자극을 받았을 때만 자궁 내막 오가노이드 세포에 부착하는 능력을 획득한다48,49. 에피아세포를 형성하지 않는 트로피어스와의 비교는 이들 내부 세포가 자궁내막에 대한 초기 부착을 매개하도록 상호작용하는 영양세포가 성숙하도록 유도한다는 것을 보여준다. 사이노몰거스 원숭이 배반포50을 위해 설계된 확장된 배지에서 배양될 때, 블라스토이드로부터의 세 혈통은 모두 6일 동안 지속적으로 확장되지만(13일째의 시간 상당) 그들의 조직은 그 발달 단계를 반영하지 않는다.
고효율 및 고충실도 인간 블라스토이드의 함의. 모델 유기체에서 발견 된 발달 원리의 보존은 제한된 접근과 유 전적으로 물리적으로 조작하는 기술적 어려움으로 인해 인간 개념에서 테스트하기가 본질적으로 어렵습니다. 고효율 및 고충실도 블라스토이드 모델은 과학적 및 생물 의학적 발견의 기초가되는 높은 처리량의 유전 및 약물 검사를 허용합니다. 또한, 생물학적 과정을 변경하고 기록하기 위해 복잡한 유전 적 변형을 통합하는 것은 그러한 연구를 보완 할 것입니다. 전반적으로, 우리는 순진한 PXGL hPSCs의 삼중 억제 (Hippo, TGF-β, ERK)가 네 가지 최소 기준을 준수하는 고충실도 인간 블라스토이드의 효율적인 형성을 위해 전도성임을 제안한다. 이 프로토콜의 확장 가능하고 다재다능한 특성으로 인해 인간 배반포를 사용하여 검증 할 수있는 표적 가설을 생성하는 데 적합합니다. 따라서 인간 블라스토이드는 시험관 내 연구에 대한 인간 개념의 사용을 대체하지는 않지만 과학 및 생물 의학 발견 과정의 핵심에서 이전에 접근 할 수없는 실험 접근법을 통해 연구를 퍼널 할 수있는 강력한 방법으로 작용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간 블라스토이드를 형성하는 방법과 블라스토이드 내에 포함 된 세포를 분석하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
국제 줄기 세포 연구 협회 (ISSCR)의 줄기 세포 연구 및 임상 번역 지침은 인간 블라스토이드에 대한 연구가 전문 과학 및 윤리 검토 프로세스 3,4를 통해 검토 및 승인 된 후에 만 허용 될 것을 권장합니다. 모든 실험 절차는 오스트리아 과학 아카데미 (IMBA)의 분자 생명 공학 연구소 (Institute of Molecular Biotechnology)의 인간 연구 윤리위원회의 지침에 따라 Rivron_Stellungnahme_2020-04-22의 승인하에 수행되었습니다. 이러한 지침을 준수하는 것은 과학 저널에 연구 결과를 게시하는 데 필요합니다.
1. PXGL 조건에서 인간 나이브 배아줄기세포의 배양
참고 : Naive hPSC는 관련 실험실에서 얻을 수 있습니다. 여기에 사용 된 라인은 다카시마 야스히로 (현재 일본 교토의 CiRA에 있음)와 오스틴 스미스 (현재 영국 엑서 터 (Exeter)의 Living Systems Institute)의 실험실에서 얻은 것입니다. 대안적으로, 순진한 hPSC는 이전에 설명된 바와 같이 프라이밍된 hPSC들의 라인들로부터 사내에서 리셋될 수 있다(13,14). 순진한 hPSC는 여러 구절 (> 15)에 대해 안정적으로 나타나지만 배양의 품질은 시간이 지남에 따라 달라질 수 있습니다. 순진한 hPSC의 품질이 저하되면 세포의 새로운 바이알을 해동하거나 프라이밍 된 PSC에서 de novo naïve hPSC를 생성하십시오. 모든 배지 조성물에 대해서는 보충표 1을 참조한다.
- 조사된 마우스 배아 피더(MEFs)층의 제조
- 나이브 hPSCs의 계대 전날, 하기에 기재된 단계에 따라 조사된 MEF 층이 있는 6-웰 세포 배양 플레이트를 준비한다.
- 6-웰 세포 배양 플레이트를 웰 당 PBS 중의 0.1% 젤라틴 1 mL와 코팅한다. 플레이트를 30분 동안 37°C에서 인큐베이션한다. 젤라틴 용액을 제거하십시오.
- MEF 배지를 37°C에서 준비한다.
- MEFs를 작은 얼음 덩어리만이 남을 때까지 37°C의 수조에서 해동시킨다. 바이알의 부피를 P1000 피펫을 사용하여 제조된 MEF 배지 1 mL와 함께 용해시킨다.
- 세포 현탁액을 15 mL 튜브 내로 옮긴다. 서스펜션을 200 x g 에서 4 분 동안 회전시킵니다. 상청액을 흡인하고, 신선한 MEF 배지를 첨가하여 MEF 펠릿을 재현탁시킨다(웰 당 1.5 mL에 충분함).
- 세포 계수 슬라이드를 사용하여 세포를 계수하고 웰 당 300,000 개의 세포를 추가하고 플레이트를 37 °C의 normoxy 인큐베이터로 옮깁니다.
참고: 시간이 지남에 따라 MEF가 분리되면 일상적인 미디어 변경 중에 새 MEF를 PXGL 매체에 추가할 수 있습니다.
- 인간 순진한 만능 줄기 세포의 계대노화
- hPSC를 통과하기 전에 현미경으로 형태를 확인하십시오. 식민지는 일반적으로 밝고 정의 된 경계가있는 돔 모양의 형태를 가지고 있습니다. 개별 콜로니가 평평한 형태를 나타내거나 분화 된 식민지가 나타나기 시작하면 1.2.8 단계의 지침을 따르십시오.
- 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 한 번 세척한다. 6-웰 플레이트의 웰 당 500 μL의 세포 분리 용액을 첨가한다.
- 세포를 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다. P1000 피펫과 피펫을 사용하여 세포를 여러 번 사용하여 콜로니를 단일 세포로 해리시킵니다.
- 세포를 수집하고 세척 완충액(6-웰 플레이트의 웰당 1 mL)이 들어있는 15 mL 튜브 내로 옮긴다. 세포를 4 분 동안 200 x g 에서 회전시킵니다.
- 상청액을 흡인하고, 펠렛을 신선한 PXGL 배지에 재현탁시킨다(웰 당 1.5 mL에 충분함). 일상적으로 패시징을 위해 1:3-1:6의 분할 비율을 고려하십시오.
참고: 매 3-4 계대 후 또는 세포 형태학에 따라 세포 배양의 질이 감소하는 경우 (예를 들어, 집단에서 편평한 콜로니의 출현), 10 μM Y-27632 및 성장 인자 기저막 추출물 (5 μL/웰)을 패시징 후 처음 24 h 동안 배지에 첨가한다. - hPSCs를 재도금하기 전에, MEF 배지를 흡인하고 PBS로 한 번 세포를 세척함으로써 신선한 MEF로 플레이트를 준비한다. 이어서, P1000 피펫을 사용하여 MEFs를 함유하는 6-웰 플레이트의 웰 당 1.5 mL의 hPSCs 세포 현탁액을 옮긴다.
참고: 피펫팅이 웰 영역을 가로질러 세포의 균질한 시딩으로 이어지는지 확인하십시오. 이것은 균질 한 크기와 세포의 상대적 동시성을 가진 콜로니의 성장을 보장 할 것입니다. - hPSCs를 가습된 환경에서 37°C에서 저산소 조건 하에서 배양한다. 24시간 후에는 hPSC를 부착해야 합니다. 많은 수의 비 부착성 (또는 부유하는) 세포는 생존 가능성 또는 통과 시 부착의 문제를 반영합니다.
- 매일 웰 당 1.5 mL의 PXGL 배지로 배지를 교체하십시오. hPSC를 3-4 일마다 통과하거나 블라스토이드 형성 실험에 사용하십시오.
참고 : hPSC를 해동 한 후 블라스토이드 실험을 시작하기 전에 최소 세 개의 통로를 통과하십시오.
2. 블라스토이드의 형성
- 순진한 PSC 응집체의 형성
- 실험을 시작하기 전에 PXGL 배지, N2B27 기본 배지, 세척 완충액, PBS 및 응집 배지를 준비하고 미리 가온한다. 아래에 설명된 단계에 따라 블라스토이드를 형성하기 위한 hPSCs 현탁액으로부터 MEF를 배제한다.
- MEF 배제를 위해, 6-웰 플레이트의 웰에 0.1% 젤라틴 1 mL를 첨가하고, 37°C에서 30-90분 동안 인큐베이션함으로써 젤라틴 코팅된 플레이트를 제조하였다.
- 세포를 수확하기 위해, 배지를 흡인하고 세포를 PBS 1 mL로 세척한다.
- 500 μL의 세포 분리 용액(6-웰 플레이트의 웰 당)을 첨가하고, 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
- 현미경으로 세포를 확인하여 콜로니를 단일 세포로 해리 한 다음 (몇 개의 다세포 덩어리는 나중에 부드러운 피펫팅에 의해 해리 될 수 있음).
- 세포 분리 용액을 1 mL의 세척 완충액으로 희석하십시오. 5 내지 10회 부드럽게 피펫팅하여 플레이트로부터 세포를 수집한다. 세포 현탁액을 15 mL 튜브 내로 옮긴다. 세포를 4 분 동안 200 x g 에서 회전시킵니다.
- 상청액을 흡인하고, 세포를 1.5 mL의 PXGL 배지 (6-웰 플레이트의 웰 당)에 재현탁시키고, MEF 배제를 위해 젤라틴 코팅된 플레이트 상에 세포를 시드하고, 37°C에서 60-90분 동안 인큐베이션한다.
- 일단 나이브 세포가 MEF 배제를 위해 시딩되면, 마이크로웰로부터 PBS를 제거하고, 웰을 200 μL의 기저 N2B27 배지 (1 마이크로웰 칩 당)로 평형화시키고, 37°C에서 60분 동안 인큐베이션한다.
- 부착되지 않은 나이브 세포를 함유하는 상청액을 수집하고, 이를 15 mL 튜브로 옮기고, 세포를 200 x g 에서 4분 동안 스핀다운시킨다.
- 배지를 흡인하고 세포를 1 mL의 N2B27 기저 배지에 재현탁시킨다. 셀 카운팅 슬라이드를 사용하여 셀 카운트를 계산합니다. 세포를 4 분 동안 200 x g 에서 회전시킵니다.
- 배지를 흡인하고 N2B27 배지에 포함된 10 μM Y-27632의 적량을 첨가하여 50 μL 당 30,000 세포의 세포 밀도를 얻었다.
참고: 최적의 초기 시딩 세포 수는 상이한 세포주에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 50-60 세포/마이크로웰을 시드하기 위해, 30,000개의 세포(일부 세포가 마이크로웰 외부에 떨어지는 것을 고려한 잉여 포함)는 430개의 마이크로웰을 포함하는 96웰 플레이트의 1웰에 시딩된다. 부적절한 시작 세포 수는 공동없이 작은 응집체 형성 또는 250 μm 이상에 도달하는 캐비테이션 구조의 형성을 초래할 수 있습니다. - 평형화된 마이크로웰 어레이로부터 배지를 흡인하고, 25μL의 N2B27 배지를 10μM Y-27632로 첨가한다. 50 μL의 세포 현탁액을 첨가하고, 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다(세포가 마이크로웰의 바닥으로 떨어질 때까지). 이어서, 10 μM Y-27632로 보충된 N2B27 배지 125 μL를 첨가한다.
- 블라스토이드 개발
- 24시간 이내에, 순진한 hPSC의 응집체가 마이크로웰 칩 상에서 관찰될 수 있다(제0일). 블라스토이드 형성을 시작하려면 PALLY 배지를 준비하고 아래에 설명 된 단계를 따르십시오.
- PALLY 배지를 37°C에서 30분 동안 예열한다.
참고: 1-올레오일 리소포스파티드산(LPA) 및 10μM Y-27632는 사용 직전에 첨가해야 합니다. LPA의 최적 농도는 0.5-5 μM 사이에서 변화한다. 이것은 블라스토이드에 사용되는 개별 hPSC 라인에 대해 적정되어야합니다. - 응집 배지를 흡인한다. 200 μL의 미리 가온된 PALLY 배지를 마이크로웰에 첨가한다. 세포 배양 플레이트를 다시 저산소 인큐베이터에 넣고 37°C에서 한다. 1일째에 미디어 변경을 반복합니다.
- 2일째에, PALLY 배지를 제거하고 LPA 및 10 μM Y-27632로 보충된 N2B27 배지 200 μL를 첨가한다.
참고 : 2 일째에는 대부분의 집계가 계속 증가하고 있습니다. 그러나 일부 응집체는 작은 충치를 형성합니다. 블라스토이드를 4일째까지 PALLY 또는 2일째부터 시험관내 배양 배지(IVC1)에서 지속적으로 배양한다. 그러나, 이러한 배지 변화에 따라 성숙한 블라스토이드에서 PrE의 형성이 향상된다. - 3 일째에 미디어 변경을 반복하십시오. 완전한 블라스토이드 형성은 4 일째까지 발생합니다.
참고: 블라스토이드는 7일째 인간 배반포(예를 들어, 직경 범위가 150-250 μm, 트로피코배엽 유사 세포의 상피로 둘러싸인 하나의 내부 클러스터)의 형태 측정에 기초한 완전한 형태형성을 거쳤을 때 완전히 발달한 것으로 간주되며, 극성 영양 결핍 유사 세포(NR2F2+/CDX2-) 및 PrE 유사 세포(GATA4+)를 형성하였다. 이는 면역형광 염색 또는 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 평가할 수 있다.
3. 96 웰 초저 부착 마이크로 플레이트에서 블라스토이드 형성
- 2.1.1 - 2.1.11에서 상기 기재된 단계에 따라 블라스토이드 형성을 위한 나이브 hPSCs 세포 현탁액을 제조한다.
- 배지를 흡인하고 10 μM Y-27632를 함유하는 적절한 양의 N2B27 배지를 첨가하여 배지 100 μL 당 70 세포의 세포 밀도를 얻었다.
참고: 최적의 초기 시딩 세포 수는 상이한 세포주에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 70 세포/웰은 대부분의 세포주에 대한 최적의 세포 수일 수 있다. - 플레이트를 실온에서 2분 동안 200 x g 에서 원심분리하여 웰의 바닥에 세포를 클러스터링한다.
- 플레이트를 저산소 배양 조건 하에서 37°C의 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 24 시간 이내에 순진한 hPSC의 응집체가 우물에서 관찰 될 수 있습니다 (0 일째).
- 2x PALLY 배지를 준비하십시오. 100 μL의 예열된 2x PALLY 배지를 웰에 첨가한다.
- 세포 배양 플레이트를 다시 37°C의 저산소 인큐베이터에 놓는다. 24시간 후, 배지의 절반(100 μL)을 흡인하고, 이를 100 μL의 예열된 PALLY 배지로 교체한다. 4 일째까지 단계를 반복하십시오. 골재를 흡인하지 않도록하십시오.
참고: 2일째에는 대부분의 집계가 계속 증가하고 있습니다. 그러나 일부 골재에는 작은 액체로 채워진 충치가 있습니다. 4 일째에, 캐비테이션 된 구조물의 대부분은 배반포 유사 구조를 형성하기 위해 완전한 형태 형성을 겪습니다.
4. 트로피권의 형성
- 트로피권 형성을 위해, 단계 2.1.1 (MEF 배제)으로부터 단계 2.1.12 (시딩 프로토콜의 마지막 단계)까지 블라스토이드 형성 프로토콜을 따른다.
- 일단 순진한 hPSCs의 응집체가 24시간 후에 형성되면, 응집 배지를 초기 영양 영양증을 나타내는 트로피권의 형성을 위해 3 μM SC-144로 보충된 PALY(LIF 없이)로 교환하고, 성숙한 영양 영양배를 나타내는 트로피권의 형성을 위해 2 μM XMU-MP-1로 보충된 PLI로 교환한다.
- 매일 매체를 새로 고칩니다. 완전한 트로피권 형성은 4 일째까지 발생합니다.
5. scRNAseq 를 이용한 블라스토이드 세포 상태 및 이의 반사 단계 분석
- 블라스토이드를 집어 들고 해리를 수행하려면, 진탕 인큐베이터를 37°C로 예열하고 100 rpm으로 설정한다.
- 초기 96-웰 플레이트에서 블라스토이드를 수집하고 유리 모세관이 장착된 입 피펫을 사용하여 U-bottom 96-웰 플레이트의 여러 웰로 옮깁니다.
참고: 블라스토이드(> 70%)는 비블라스토이드 구조(< 30%)로 오염되는 것을 피하기 위해 형태측정 기준(크기 = 고유한 내부 클러스터가 있는 150-250μm)에 따라 선택되어야 합니다. - P200을 사용하여 200 μL의 PBS로 한 번 세척하여 입체현미경으로 관찰하였다. 50 μL의 콜라게나제를 함유하는 웰로 옮기고, 진탕 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 블라스토이드를 10x 트립신-EDTA의 100 μL로 웰로 옮기고 잘 섞는다. 진탕 인큐베이터에서 20분 동안 인큐베이션한다.
- P200 피펫을 사용하여 블라스토이드를 단일 세포로 해리시킵니다. 세포를 FACS 완충액 (PBS 중 1% FBS)이 있는 15 mL 튜브 내로 옮긴다.
- 세 계통의 유사체의 특이적 비율을 포착하기 위해, TE 및 PrE 유사체를 각각 TROP2 및 PDGFRa 항체로 염색한다.
참고 : 인간 배반포의 PrE 세포 수는 마우스 배반포에 비해 적으며, 이는 시험관 내 수정 (IVF) 또는 종 차이를 통해 형성된 배반포의 발달 결함을 반영 할 수 있습니다. 블라스토이드에서, PrE 유사체는 TE 및 EPI 유사체보다 덜 풍부하며, 면역형광 영상화에 의한 GATA4+ 세포의 계수시 세포의 7.4%를 나타낸다. 또한, 해리 과정은 블라스토이드 해리, PDGFRa 태깅 및, FACS 분석시 세포의 1%-2%를 나타내는 PrE 유사체로서 상이한 세포 유형의 비율에서 바이어스를 유도할 수 있다. - FACS-정렬된 세포는 세 개의 계보 유사체 모두로부터 smart-seq2 분석을 위한 용해 완충액을 함유하는 384-플레이트로 분류된다. DAPI 염색으로 표시된 죽은 세포를 배제하십시오 (제조업체의 지침에 따라 수행).
- 세포 상태 (세포 유형 및 발달 단계)를 평가하기 위해, 블라스토이드로부터의 전사체 데이터를 적절한 대조군과 비교한다.
6. 블라스토이드 발달 진행을 평가하기 위한 확장된 배양
- 인간 블라스토이드를 기저막 매트릭스 코팅 플레이트 (유리 바닥)에 배양하십시오.
- 플레이트를 기저 멤브레인 매트릭스로 코팅하십시오.
- 모폴로이드를 육안으로 검사하여 형태를 평가하고 기록합니다.
참고 : 컴팩트 한 ICM을 가진 고전적인 중공 볼 배반포 형태를 보여주는 블라스토이드 만이 더 성장하고 발전 할 잠재력이 있습니다. - 96-웰 플레이트의 1웰 당 100 μL의 CMRL 배지-1을 첨가하고, 평형화를 위해 블라스토이드 이송 전에 적어도 2 h 전에 플레이트를 인큐베이터에 배치한다.
- 입체현미경을 사용하여, 양호한 형태를 갖는 블라스토이드를 시각적으로 확인하고, 선택된 블라스토이드를 100 μl의 CMRL 배지-1을 함유하는 96-웰 플레이트의 웰에 전달하여 블라스토이드 매질의 흔적을 제거하였다.
- 블라스토이드를 미리 평형화된 CMRL 매질-1을 함유하는 웰 내로 옮긴다. 플레이트를 인큐베이터에 놓고 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
참고: 최대 5개의 블라스토이드를 96웰 플레이트의 한 웰에서 배양할 수 있습니다. 단일 웰에 너무 많은 블라스토이드를 갖는 것은 다중 블라스토이드의 응집체의 형성으로 이어질 수 있다. - 다음날 현미경으로 블라스토이드를 육안으로 검사하십시오. 블라스토이드가 부착되어 있는 경우, 5% 기저막 매트릭스로 보충된 사전 평형화된 CMRL 매질-1 100μL를 첨가한다. 플레이트를 인큐베이터에 놓고 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
- 다음날 현미경으로 블라스토이드를 모니터링하십시오. 배지(100μL)의 절반을 제거하고 5% 기저막 매트릭스로 보충된 100μL의 사전 평형화된 CMRL 매질-2로 교체한다.
- 다음 날에는 배지(100μL)의 절반을 5% 기저막 매트릭스로 보충된 사전 평형화된 CMRL 매질-3로 교체한다. 플레이트를 인큐베이터에 놓고 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이션한다. 시험관 내 배양의 최대 4-6 일 동안 매일 반복하십시오.
참고: 우리는 시험관내 배양된 인간 배아의 13일째의 시간 등가물에 해당하는 연장된 배양 조건에서 최대 6일 동안 블라스토이드를 배양하였다.
7. 면역염색 블라스토이드
- 매체를 흡인하십시오. 샘플을 5분 동안 PBS로 3x 세척한다.
- PBS에 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA) 200μL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 샘플을 고정시킨다. PFA 용액을 제거하고 샘플을 10분 동안 PBS로 3x 세척하였다.
참고: 블라스토이드를 마이크로웰 칩에서 배양한 경우, 다음 단계를 위해 칩에서 96웰 U-바닥 플레이트로 블라스토이드를 옮깁니다. - 60분 동안 웰 당 100 μL의 블로킹 용액 (0.3% Triton-X 100 및 10% 정상 당나귀 혈청을 함유하는 PBS)에서 블라스토이드를 투과시키고 차단한다.
참고: 항체의 숙주 종에 따라, 그에 따라 혈청을 적응시킨다. - 차단 솔루션을 제거합니다. 신선한 블로킹 용액에 희석된 100μL 일차 항체를 첨가하고 샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
참고: 일차 항체의 농도는 제조업체의 지침에 따라 결정되어야 합니다. - 샘플을 3x PBS(세척 용액) 중 0.1% 트리톤-X 100으로 10분 동안 세척한다. 블로킹 용액에 100 μL의 이차 항체를 20 μg/mL Hoechst 핵 염색과 함께 첨가하고 샘플을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 빛으로부터 샘플을 보호하십시오.
참고: 이차 항체의 농도는 제조업체의 지침에 따라 결정되어야 합니다. - 샘플을 10 분 동안 세척액으로 3x 세척하십시오. 이미징을 위해, 샘플을 PBS의 유리 바닥 μ-슬라이드 상으로 옮긴다.
참고: 장착 매체는 이미징에 사용되는 목적에 따라 선택해야 합니다. 예를 들어, PBS 중의 80% 글리세롤은 오일 목적을 사용하는 동안 샘플을 장착하기 위해 사용할 수 있다.
Representative Results
전형적으로, PXGL에서 배양된 나이브 hPSCs(도 2A)는 PALLY 유도 후 48 내지 72 h 사이에 출현하고 96 h 내에서 150-250 μm의 직경에 도달하는 응집 및 캐비테이션 구조이다(도 2B). 최적의 (1) 시딩 세포 수, (2) N2B27을 사용한 배양 전 응집 기간 (0 내지 24 h), (3) 개별 화학 성분 (특히 LPA)의 농도 및 (4) PALLY 처리 기간을 사용하여, 유도 효율은 형태 학적 매개 변수 (전체 크기 150-250 μm, 단일 정규 공동, 단일 내부 세포 클러스터)에 따라 정의 된 바와 같이 70 % -80 %에 도달합니다. 그림 2C,D)와 세 혈통의 존재. 차선의 초기 세포 상태 및/또는 유도 조건은 덜 효율적이거나 블라스토이드 형성이 없는 결과를 초래할 것이다. 최대의 효율성을 보장하고 이식 전 유사체만을 형성하려면 순진한 PXGL hPSC의 고품질 배양물을 사용하는 것이 중요합니다. 이는 표면 마커 SUSD2 (나이브 상태) 및 CD24 (프라이밍 상태)에 대해 양성인 세포의 백분율을 FACS에 의해 측정함으로써 평가될 수 있다. 오프 타겟 배아 계통 (예를 들어, amnion, 외래 중배엽)에 특이적인 추가적인 표면 마커도 유용 할 것이지만, 우리가 아는 한, 현재 이용 가능하지 않다. 얻어진 형성 효율이 보고된 결과보다 낮은 경우, PBS로 재구성되는 블라스토이드 배지, 특히 LPA의 모든 성분을 주의 깊게 점검하는 것이 중요하며, GPCR 리간드로서, DMSO로 재구성된 합성 분자에 비해 더 불안정할 수 있다. 대부분의 경우, 수율이 최대가 아니더라도, 캐비테이션 된 구조는 여전히 세 개의 배반포 계통으로 구성됩니다. 3개의 배반포 계통의 출현 및 배아-아배아 축의 형성은 마커의 면역형광 염색에 의해 확인될 수 있다 (EPI: NANOG, OCT4, TE: GATA3, Polar-TE NR2F2, Mural-TE: CDX2, PrE: GATA4; 그림 2E, G). TE로만 구성된 영양 영역은 세포 간 통신의 역할을 더욱 해부하는 데 도움이됩니다. 트로피어스피어는 유도 후 96시간 이내에 50%-60% 효율로 형성될 수 있습니다(그림 2H,I). 블라스토이드 형성은 수제 마이크로웰 어레이에서뿐만 아니라 유도 조건의 최적화를 통해 상업적으로 이용가능한 초저 부착 96 웰 플레이트에서도 수행될 수 있다(프로토콜 및 도 2J 참조). 블라스토이드는 또한 시험관내 분화 프로토콜과 함께 13일째 배아와 동등한 시간-등가물인 추가적인 6일 동안 추가로 발달할 수 있는 능력을 갖는다(도 2K).
블라스토이드 세포의 세포 상태를 더욱 특성화하기 위해서는 단일 세포 RNA 시퀀싱 기술을 사용해야합니다. UMAP은 일반적으로 세포 상태의 분포를 시각화하기 위해 적용되며 개별 세포 상태의 근접성을 평가하기 위해 감독되지 않은 클러스터링 분석이 수행됩니다. 단일 셀 데이터 분석의 서로 다른 매개 변수는 UMAP에서 셀이 표시되는 방식에 영향을 줄 수 있으므로 공간 및 상대적 위치 및 모양이 다른 클러스터로 이어질 수 있습니다(그림 3A). 그러나, 이 분석에서, 세포는 데이터의 클러스터링 및 시각화를 수행하는 데 사용된 파라미터에 관계없이 현저하게 재현가능하게 구별되는 클러스터링 프로파일을 표시하며, 이는 세 배반포 혈통을 높은 신뢰도로 구별할 수 있게 한다. 우리는 다른 발달 단계에서 수확 된 배아의 세포를 참조로 사용했습니다. 이러한 데이터 세트의 병합은 블라스토이드로부터의 영양 결핍 유사체의 대부분이 이식 전 트로피 콕토배엽과 클러스터링되었지만 이식 후 영양 세포와는 그렇지 않다는 것을 보여줍니다 (그림 3B). 이러한 결과는 또한 독립적인 컨소시엄(10)에 의해 확인되었다.
카네기 단계 7 (CS7) 가스트레이션 배아가 참조 맵에 도입될 때, 이들 배아의 중배엽 및 양막 혈통과 함께 클러스터링된 블라스토이드 세포의 작은 집단 (3%)이 있다 (도 3C). 양이온-유사 세포가 참조 맵에 도입될 때, 블라스토이드 세포의 작은 집단(< 2%)이 이러한 양이온-유사 세포들과 함께 클러스터링된다.
전반적으로, 단일 규칙적인 공동, 단일 내부 세포 클러스터, 150-250 μm 범위의 전체 크기를 포함하는 구조물, 세 개의 배반포 계통의 전사체 유사체를 포함하고, 다른 혈통이 크게 결여된 구조물 (예를 들어, 양막, 중배엽, 배아 중배엽)만이 인간 블라스토이드로서 고려된다.
그림 1: 고충실도 블라스토이드를 생성하기 위한 네 가지 기능과 두 가지 접근 방식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Naïve hPSC의 응집체로부터 유래된 블라스토이드 및 트로피권. (a) 조사된 MEF와 공동 배양된 PXGL 배지에서 배양된 순진한 hPSCs를 보여주는 위상차 이미지. 스케일 바: 50 μm. (B) 500 nM LPA (PALLY 배지)를 갖는 비부착성 하이드로겔 마이크로웰 어레이 상에서 배양된 나이브 hPSCs 응집체의 형태학적 변화를 보여주는 위상차 이미지. 스케일 바: 200 μm. (C) 인간 블라스토이드는 96 h 후에 마이크로웰 어레이 상에 형성된다. 스케일 바: 400 μm. (D) 상이한 나이브 hPSC 라인으로부터의 최적화된 LPA 농도를 갖는 PALLY 배양 조건에 의해 유도된 인간 블라스토이드를 함유하는 마이크로웰의 백분율의 정량화(n=3 마이크로웰 어레이). (e) 에피아세포(EPI) 마커(황색) NANOG 및 OCT4를 사용한 인간 블라스토이드의 면역형광 염색; TE 마커 (시안) CDX2 및 GATA3; 및 원시적 내배엽 마커(마젠타) SOX17 및 GATA4를 포함한다. 스케일 바: 100 μm. (H-I) OCT4, GATA3 및 GATA4의 면역형광 염색에 기초하여 블라스토이드 (96 h)에서 각 혈통에 속하는 세포 수 (왼쪽) 및 세포 비율 (오른쪽)의 정량화. (g) CDX2 (시안) 및 NR2F2 (마젠타)에 대한 인간 블라스토이드의 면역형광 염색. (f) 각각 3 μM SC144 (H) 또는 2 μM XMU-MP-1 (I)의 첨가에 의해 유도된 마이크로웰 어레이 상의 초기 및 후기 단계 트로피권의 위상차 이미지. (j) 500 nM LPA (PALLY 배지)로 초저 부착 96 웰 플레이트에서 배양된 나이브 hPSCs 응집체의 형태학적 변화를 보여주는 위상차 이미지. (K) 이식 후 배양 조건에서 6일 동안 성장한 블라스토이드에서 OCT4(노란색), GATA3(시안), 및 GATA4(마젠타)에 대한 위상차 이미지(왼쪽) 및 면역형광 염색(오른쪽). 스케일 바: 100 μm. 이 수치는 6,10에서 조정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 단일 세포 시퀀싱에 의한 블라스토이드 조성의 특성화. (a) 블라스토이드 (24 h, 60 h, 96 h), 나이브 hPSCs, 프라이밍 된 hPSCs 및 hTSC (이식 후 세포 영양 세포를 나타냄)의 상이한 시점으로부터 유래 된 단일 세포의 전사체의 UMAP에 대한 상이한 매개 변수를 갖는 무감독 클러스터링 분석. (b) 블라스토이드로부터 유래된 세포의 전사체의 UMAP (96 h), 순진한 hPSCs, 및 프라이밍된 hPSCs의 인간 배아로부터의 공개된 데이터 세트와 통합된 프라이밍된 hPSCs의 사전-이식, 전후 이식 (시험관내 배양된 배반포), 및 위혈 (카네기 단계 7, 즉, E16-19 사이) 단계. 개별 세포는 인간 배아 (왼쪽), 블라스토이드 유래 세포 또는 줄기 세포 (중간) 및 감독되지 않은 군집 분석 결과 (오른쪽)에서의 기원에 따라 착색됩니다. (c) 블라스토이드, 순진한 hPSCs, 프라이밍된 hPSCs로부터 유래된 세포의 전사체의 UMAPs, 및 gastrulation (카네기 단계 7, 즉, E16-19 사이)으로부터 공개된 데이터 세트와 통합된 단계 배아. 개별 세포는 인간 배아 (왼쪽), 블라스토이드 유래 세포 또는 줄기 세포 (중간) 및 감독되지 않은 군집 분석 결과 (오른쪽)에서의 기원에 따라 착색됩니다. 이 수치는6에서 조정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 본 연구에 사용된 모든 배지 조성물. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
본 연구에서, 우리는 간단하고 강력한 프로토콜을 사용하여 높은 효율로 인간 블라스토이드를 확립하는 방법을 단계별로 보여줍니다. 순진한 PXGL hPSCs의 응집과 그들의 삼중 억제시, 블라스토이드는 효율적으로 형성되고 (> 70 %), 4 일 이내에 3 개의 배반포 유사체를 순차적으로 생성합니다. 블라스토이드의 효율 및 품질에 대한 제한(예를 들어, 오프 타겟 세포의 존재)은 초기 상태가 최적이 아닌 경우에 발생할 수 있다. 참고로, 우리는 PXGL hPSCs가 이식 후 단계를 반영하는 세포의 약 5 %를 함유하고 있음을 측정했다. 이 세포는 고품질 블라스토이드의 형성을 제한 할 수 있습니다. 배반포 상피세포를 반영하는 초기 순진한 PXGL 상태를 넘어, 또 다른 중추적 요인은 배반체 형성에 사용되는 매질이다. 배반포 유사 세포를 신속하게 형성하고 오프 타겟, 이식 후 유사 세포의 형성을 방지하기 위해, 우리는 삼중 경로 억제 (Hippo, ERK, TGF-β)가 필수적이라고 제안한다. 상이한 세포주가 ERK/TGF-β 억제(일반적으로 약 10%-20%)에 따라 블라스토이드의 상이한 수율을 제공하는 반면, LPA에 대한 노출은 엄격한 형태측정 및 계보 사양 기준을 사용하면서 모든 세포주에 걸쳐 동등하게 높은 블라스토이드 수율의 형성을 초래한다. LPA는 아마도 하마 경로의 억제에 작용하며, 이는 마우스와 인간 8,51에서 에피아세포와 트로피코데배 혈통 사이의 첫 번째 혈통 분리에 중요한 역할을 한다. LPA에 의한 블라스토이드 효율의 현저한 개선은 배반포에서 재생되는 하마 경로-매개 내부-외부 세포 사양 메커니즘이 블라스토이드 형성 동안 공동-선택된다는 것을 시사한다. 현재의 한계는 7-13 일 (배반포 / 배반체 형성 후)에 인간 배반포 또는 배반체를 배양하는 데 사용되는 프로토콜의 최적이 아니기 때문에 이식 후 개발을 적절하게 모델링 할 수있는 정도를 평가할 수 없다는 사실에 있습니다.
블라스토이드 세포의 전사 상태 분석은 scRNAseq, 적절한 참조 맵 및 생물정보학적 방법을 사용하여 용이하게 달성될 수 있다. 이전에, 전사체 분석은 PXGL에서 배양된 hPSCs가 프라이밍된 상태와 비교하여 배반포 에피아세포와 더 유사하다는 것을 보여주었다. 데이터 분석의 한계는 참조 지도가 배반포-단계 세포만을 포함하는 경우에 발생할 수 있다. 참조 맵은 잠재적인 오프 타겟 세포의 존재를 평가하기 위해 이식 후 배아로부터 기원한 세포를 포함해야 한다. 앞으로는 블라스토이드 세포를 벤치마킹하기 위해 이식 전후 인간 개념의 모든 조직을 포함하는 참조 맵이 매우 가치가있을 것입니다. 또한, 다중 오믹스 단일 세포 참조 맵, 예를 들어 전사체, 크로마틴 접근성 및 DNA 메틸화를 포함하여, 더욱 도움이 될 것이다. 마지막으로, 배아 모델과 참조 개념에서 세포 사이의 유사성을 정량적으로 평가하고 오프 타겟 세포를 긍정적으로 식별하는 표준화 된 생물 정보학 방법은 결과를 편견없이 분석하고 비교하는 데 도움이 될 것입니다.
전체적으로, 하마, TGF-β 및 ERK 경로의 삼중 억제에 의해 형성된 블라스토이드는 1) 고효율 형태 형성, 2) 계보 사양의 정확한 서열, 3) 전사체 수준에서 배반포 유사 세포의 고순도, 4) 이식 전 발달을 모델링 할 수있는 능력의 네 가지 특징을 가지고 있습니다. 블라스토이드의 이러한 특징은 배반포 발달 및 이식에 대한 가설을 세우는 것을 촉진 할 것이지만, 배아 발달의 초기 단계를 재구성하지는 않습니다. 인간 배반포의 제한된 접근성과 다양성과는 달리, 배반포는 배반포 발달 및 이식의 기능적 조사를위한 유전 및 약물 스크리닝에 복종 할 수 있습니다. 미래에 이러한 기본 지식은 IVF 배지 제형을 개선하고, 수정 후 피임약을 개발하고, 임신 초기를 더 잘 관리하는 데 기여할 수 있습니다.
Disclosures
오스트리아 과학 아카데미 분자 생명 공학 연구소는 인간 블라스토이드 형성 및 블라스토이드-자궁내막 상호작용 분석을 위한 프로토콜을 설명하는 특허 출원 EP21151455.9를 출원했습니다. HK, AJ, HHK 및 NR은 이 특허의 발명가입니다. 다른 모든 저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램 (ERC-Co 보조금 계약 번호 101002317 'BLASTOID : 초기 인간 배아 발생을위한 발견 플랫폼')에 따라 유럽 연구위원회 (ERC)로부터 자금을 지원받았습니다. H.H.K.는 오스트리아 과학 기금 (FWF), Lise Meitner Programme M3131-B의 지원을 받습니다. H9 및 H9-GFP 세포주를 공유해 주신 다카시마 야스히로와 HNES1, Shef6, niPSC 16.2b 및 cR-NCRM2 세포주를 공유해 주신 Austin Smith, Peter Andrews, Ge Guo에게 감사드립니다. 자궁내막 오가노이드를 공유해 주신 Hossein Baharvand에게 감사드립니다. PrE 분화 세포 및 nEND 세포에서 분리된 RNA를 공유해 주신 Joshua M. Brickman에게 감사드립니다. 우리는 주변 위분해 배아의 단일 세포 RNA 시퀀싱 데이터를 공유해 주신 Shankar Srinivas에게 감사드립니다. SMARTSeq2 도서관 준비에 대한 기술 지원을 해주신 Aleksand Bykov와 Luisa Cochella에게 감사드립니다. IMBA의 NGS, Biooptic 및 Stem Cell 시설에 중요한 도움을 주신 것에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | in house | ||
| DMEM/F12 | in house | ||
| 100X N2 supplemen | Gibco | 17502048 | |
| 50X B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| 100X Glutamax | Gibco | 35050038 | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360039 | |
| MEM-Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| 1 M Hepes | in house | ||
| 50 mM 2-Mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
| 100X Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| PD0325901 | Medchem express | HY-10254 | |
| XAV-939 | Medchem express | HY-15147 | |
| Gö 6983 | Medchem express | HY-13689 | |
| Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor | in house | ||
| A83-01 | Medchem express | HY-10432 | |
| 1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) | Peprotech | 2256236 | |
| Y-27632 | Medchem express | HY-10583 | |
| CMRL medium | Gibco | 21530027 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10-828-028 | |
| Accutase | Biozym | B423201 | cell detachment solution |
| Geltrex | Thermofisher | A1413302 | growth factor basement membrane extract |
| TROP2 antibody | R&D systems | MAB650 | |
| PDGFRα antibody | R&D systems | AF307 | |
| SC-144 | Axon | 2324 | |
| XMU-MP-1 | Med Chem Express | HY-100526 | |
| Matrigel | basement membrane matrix | ||
| Countess cell counting chamber slides | Thermo fisher | cell counting slides | |
| DAPI Staining Solution | Miltenyi Biotec | 130-111-570 |
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