Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

मानव ब्लास्टोइड मॉडलिंग ब्लास्टोसिस्ट विकास और आरोपण के लिए प्रोटोकॉल

Published: August 10, 2022 doi: 10.3791/63388
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,3, 1,3, 2, 1, 1
1Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA), Vienna Biocenter (VBC), 2Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna Biocenter (VBC), 3Vienna BioCenter PhD Program, Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna
* These authors contributed equally

Summary

मानव ब्लास्टोइड्स के गठन को रेखांकित करने वाला एक प्रोटोकॉल जो कुशलतापूर्वक, समय पर और क्रमिक रूप से ब्लास्टोसिस्ट जैसी कोशिकाओं को उत्पन्न करता है।

Abstract

स्टेम कोशिकाओं (ब्लास्टोइड) से गठित मानव ब्लास्टोसिस्ट का एक मॉडल वैज्ञानिक और चिकित्सा प्रगति का समर्थन करेगा। हालांकि, इसकी भविष्य कहनेवाला शक्ति ब्लास्टोसिस्ट विकास (मॉर्फोजेनेसिस, विनिर्देश, पैटर्निंग) के अनुक्रमों को कुशलतापूर्वक, समय पर और ईमानदारी से पुनरावृत्ति करने और ब्लास्टोसिस्ट चरण को प्रतिबिंबित करने वाली कोशिकाओं को बनाने की क्षमता पर निर्भर करेगी। यहां हम दिखाते हैं कि भोले मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को पीएक्सजीएल स्थितियों में सुसंस्कृत किया जाता है और फिर हिप्पो के लिए त्रिकोणीय रूप से बाधित होता है, विकास कारक-β को बदलता है, और बाह्य सिग्नल-विनियमित किनेज मार्ग कुशलतापूर्वक ब्लास्टोइड्स (>70%) बनाने के लिए मॉर्फोजेनेसिस से गुजरते हैं। विकास ता्मक समय (~ 4 दिन) के साथ मिलान करते हुए, ब्लास्टोइड्स ट्रोफोब्लास्ट और एपिब्लास्ट के एनालॉग्स का उत्पादन करके विनिर्देश के ब्लास्टोसिस्ट अनुक्रम को अनरोल करते हैं, इसके बाद आदिम एंडोडर्म और ध्रुवीय ट्रोफोब्लास्ट्स के एनालॉग्स का गठन होता है। इसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं का गठन ट्रांसक्रिप्शनल रूप से ब्लास्टोसिस्ट (>96%) के समान होता है और पोस्ट-इम्प्लांटेशन एनालॉग्स का अल्पसंख्यक होता है। ध्रुवीय क्षेत्र (एनआर 2 एफ 2 +) की परिपक्वता द्वारा चिह्नित भ्रूण-एबेम्ब्रायोनिक अक्ष बनाकर ब्लास्टोइड्स कुशलतापूर्वक पैटर्न करते हैं, जो गर्भाशय के रूप में हार्मोनल रूप से उत्तेजित एंडोमेट्रियल कोशिकाओं को दिशात्मक रूप से संलग्न करने की विशिष्ट क्षमता प्राप्त करता है। इस तरह के एक मानव ब्लास्टोइड इन विट्रो में मानव विकास और आरोपण का अध्ययन करने के लिए एक स्केलेबल, बहुमुखी और नैतिक मॉडल है।

Introduction

प्रयोगात्मक मॉडल की कमी ने प्रारंभिक मानव भ्रूणजनन की समझ को सीमित कर दिया है। भ्रूण विकास के मानव-विशिष्ट पहलुओं का वर्तमान ज्ञान अनुसंधान के लिए दान किए गए इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) भ्रूण में अधिशेष से लिया गया है। हालांकि, सीमित उपलब्धता, प्रयोगात्मक जोड़तोड़ की कठिनाइयों, और भ्रूण की चर गुणवत्ता वैज्ञानिक जांच में बाधा डालती है। इसके विपरीत, मानव भ्रूण के इन विट्रो मॉडल में एक वफादार जटिल प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए अनुमति देगा, इस प्रकार मानव भ्रूण 1,2,3,4 पर अनुसंधान के पूरक के लिए एक नैतिक अवसर प्रदान करेगा। माउस ब्लास्टोसिस्ट के पहले से विकसित मॉडल ने माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और ट्रोफोब्लास्ट स्टेम कोशिकाओंको संयुक्त किया 5. इस विस्तृत प्रोटोकॉल में, भोले प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से मानव ब्लास्टोसिस्ट का एक मॉडल उत्पन्न करने की एक विधि जो मौलिक ब्लास्टोसिस्ट मानदंडों के प्रति वफादार है, 6 का वर्णन किया गया है।

मानव ब्लास्टोइड्स के लिए चार मानदंड। यहां, मानव ब्लास्टोइड्स की एक मानकीकृत परिभाषा स्थापित करने के प्रयास में, हम चार न्यूनतम मानदंडों का प्रस्ताव करते हैं। यद्यपि संपूर्ण नहीं है, ये मानदंड उन मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए एक आधार के रूप में काम कर सकते हैं जो मानव ब्लास्टोइड्स (चित्रा 1 ए) के गठन की अनुमति देते हैं। (1) ब्लास्टोइड्स को आकृति विज्ञान के संदर्भ में और तीन वंशों के एनालॉग्स की पीढ़ी के संदर्भ में कुशलतापूर्वक बनना चाहिए, अर्थात्, एपिब्लास्ट (एपि), ट्रॉफेक्टोडर्म (टीई), और आदिम एंडोडर्म (पीआरई)। अक्षमता एक अपर्याप्त प्रारंभिक सेल राज्य या / और संस्कृति की स्थिति (जैसे, ब्लास्टॉइड माध्यम) को इंगित करने की संभावना है। (2) ब्लास्टोइड्स को विकासात्मक अनुक्रम (एपीआई / टीई पहले, पीआरई / पोलरटीई अंतिम) 7,8 और समय (प्रेरण ~ 3 दिन; भ्रूण के दिन 5-7) 7,9) के अनुसार तीन वंशों के एनालॉग उत्पन्न करना चाहिए। (3) ब्लास्टोइड्स को ब्लास्टोसिस्ट चरण के एनालॉग बनाना चाहिए, लेकिन आरोपण के बाद के चरणों (उदाहरण के लिए, पोस्ट-इम्प्लांटेशन एपिब्लास्ट, ट्रोफोब्लास्ट, या एमनियन कोशिकाओं) का नहीं। (4) अंत में, ब्लास्टोइड्स को ब्लास्टोसिस्ट प्रत्यारोपण और विकास की कार्यात्मक विशेषताओं को फिर से तैयार करने में सक्षम होना चाहिए। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, मानव ब्लास्टोइड्स कई सेल लाइनों (>70%) का उपयोग करके कुशलतापूर्वक बनते हैं, ब्लास्टोसिस्ट सेलुलर एनालॉग्स को क्रमिक रूप से और 4 दिनों के भीतर उत्पन्न करने में सक्षम होते हैं, और एनालॉग्स ब्लास्टोसिस्ट चरण (>96% कई विश्लेषण के आधार पर) 6,10,11 के समान होते हैं। अंत में, ब्लास्टोइड्स भ्रूण-एबेम्ब्रायोनिक अक्ष को मजबूती से उत्पन्न करते हैं, जो उन्हें ध्रुवीय क्षेत्र के माध्यम से हार्मोनल रूप से उत्तेजित एंडोमेट्रियल कोशिकाओं के साथ बातचीत करने की अनुमति देता है, और विस्तारित संस्कृति (समय-समतुल्य: भ्रूण दिवस 13) पर वंशावली का मजबूती से विस्तार करता है।

प्रारंभिक सेल राज्य का महत्व। मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (एचपीएससी) को विभिन्न राज्यों में स्थिर किया जा सकता है जो सटीक विकास ता्मक चरणों को पकड़ने का प्रयास करते हैं। इन राज्यों को संस्कृति की स्थिति द्वारा बनाए रखा जाता है, हालांकि अभी भी सबऑप्टिमल, कोशिकाओं को पूर्व-आरोपण- (~ भ्रूण के दिन 5-7) या पोस्ट-इम्प्लांटेशन-जैसे (~ भ्रूण के दिन 8-14) एपिब्लास्ट चरण12 में बाधित करते हैं। ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण से पता चला है कि पीडी0325901, एक्सएवी 9 3 9, गो 6 9 83, और ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारक (एलआईएफ; जिसे पीएक्सजीएल भोले एचपीएससी कहा जाता है) 13,14 में सुसंस्कृत एचपीएससी फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (एफजीएफ) 2 और एक्टिविन 15 (प्राइमेड एचपीएससी 12 कहा जाता है) में सुसंस्कृत एचपीएससी की तुलना में ब्लास्टोसिस्ट एपिब्लास्ट के समान हैं। 18,19)। तदनुसार, प्राइमेड एचपीएससी का ट्रांसक्रिप्टोम पोस्ट-इम्प्लांटेशन / प्री-गैस्ट्रुलेशन सिनोमोलगस बंदर एपिब्लास्ट20 के साथ सबसे अच्छा मेल खाता है। ट्रांसपोसन अभिव्यक्ति, डीएनए मिथाइलेशन और एक्स गुणसूत्र राज्य जैसे अतिरिक्त आणविक मानदंडों ने पुष्टि की कि भोले राज्य की विविधताएं प्राइमेड राज्य17,21 की तुलना में ब्लास्टोसिस्ट एपिब्लास्ट से अधिक निकटता से मिलती-जुलती हैं। अंत में, भोले एचपीएससी की लाइनों को पीएक्सजीएल संस्कृति स्थितियों22 का उपयोग करके ब्लास्टोसिस्ट से सीधे सीधे प्राप्त किया गया है।

मानव प्रारंभिक ब्लास्टोसिस्ट कोशिकाएं अभी तक प्रतिबद्ध नहीं हैं। मुरिन वंश विनिर्देश मोरुला चरण से होता है जो ब्लास्टोसिस्ट चरण23 से पहले होता है। इसके विपरीत, पृथक्करण और पुन: एकत्रीकरण प्रयोगों से पता चला है कि प्रारंभिक ब्लास्टोसिस्ट की मानव ट्रोफेक्टोडर्म कोशिकाएं अभी तक प्रतिबद्ध नहीं हैं। तदनुसार, एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (एससीआरएनएएसईक्यू) द्वारा मानव ब्लास्टोसिस्ट की कोशिकाओं के विश्लेषण से पता चला है कि ब्लास्टोसिस्ट गुहा7 के गठन के बाद पहला वंश विनिर्देश (ट्रोफोब्लास्ट / यह आस्थगित मानव विनिर्देश टिप्पणियों से संबंधित है कि एचपीएससी ट्रोफोब्लास्ट्स 25,26,27 बनाने के लिए शक्तिशाली हैं जब माउस पीएससी काफी हद तक एपिब्लास्ट वंश के लिए प्रतिबद्ध हैं। इन संयुक्त टिप्पणियों ने इस संभावना को जन्म दिया कि भोले एचपीएससी एक ब्लास्टोसिस्ट चरण को दर्शाते हैं और तीन ब्लास्टोसिस्ट वंशों को बनाने की क्षमता को बनाए रखते हैं। हाल ही में, एक्सट्राएम्ब्रायोनिक एनालॉग्स को निर्दिष्ट करने के लिए एचपीएससी की शक्ति को भोले से प्राइमेड राज्य27 में प्रगति के दौरान ट्रॉफेक्टोडर्म से एमनियन में स्थानांतरित करने का प्रस्ताव दिया गया है। इस प्रकार, भोले एचपीएससी पूर्व-आरोपण चरण17,18,21 के समान हैं और प्राइमेड एचपीएससी 27, एचईपीएससी16, या मध्यवर्ती पुन: प्रोग्राम किए गए राज्यों28 की तुलना में ट्रोफोब्लास्ट बनाने की बढ़ी हुई क्षमता है, जो पोस्ट-इम्प्लांटेशन एनालॉग10 (चित्रा 1 बी) बनाने के लिए प्रवण हैं ). प्रारंभिक सेल राज्य इस प्रकार उपयुक्त एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक एनालॉग बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। यद्यपि परिवर्तित ट्रोफेक्टोडर्म एनालॉग्स का पूरी तरह से साइड-बाय-साइड विश्लेषण किया जाना बाकी है, प्रारंभिक ब्लास्टोसिस्ट को दर्शाने वाला एक पीएक्सजीएल भोली स्थिति उच्च-निष्ठा वाले ब्लास्टोइड बनाने के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होती है।

सिग्नलिंग मार्ग निषेध द्वारा विनिर्देश और मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करना। हिप्पो सिग्नलिंग मार्ग का निषेध चूहों, गायों और मनुष्यों 9,29,30 में ट्रोफोब्लास्ट विनिर्देश को चलाने वाला एक संरक्षित तंत्र है। इसके अलावा, 2013 के बाद से, यह ज्ञात है कि नोडल (ए 83-01) और बाह्य संकेत-विनियमित किनेज (ईआरके; पीडी0325901 या समकक्ष) और हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) सिग्नलिंग मार्गों की सक्रियता ट्रोफोब्लास्ट वंश 25,31,32,33,34 से जुड़े ट्रांसक्रिप्शनल नेटवर्क को सक्रिय करने के लिए प्राइमेड एचपीएससी को ट्रिगर करती है। इसके अलावा, हाल ही में कई रिपोर्टों ने यह भी पुष्टि की कि नोडल और ईआरके मार्ग दोनों का निषेध और बीएमपी की सक्रियता भोले एचपीएससी 25,31,32,33,34 से ट्रोफोब्लास्ट भेदभाव की सुविधा प्रदान करती है। अंत में, यदि ट्रोफोब्लास्ट विनिर्देश एक भोली अवस्था से ट्रिगर होता है, तो कोशिकाएं ट्रोफेक्टोडर्म26 की विकासात्मक प्रगति के पहलुओं को दोहराती हैं। हालांकि, ब्लास्टोसिस्ट ट्रॉफेक्टोडर्म को दर्शाती आत्म-नवीनीकरण लाइनों को इन विट्रो में स्थिर नहीं किया गया है। ट्रोफोब्लास्ट विनिर्देश के बाद, एचडीएसी अवरोध के साथ एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) और डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्गों का प्रेरण ट्रोफोब्लास्ट विकास ता्मक प्रगति34,35 की सुविधा प्रदान कर सकता है और कोशिकाओं को मानव ट्रोफोब्लास्ट स्टेम कोशिकाओं (एचटीएससी) की लाइनों में स्थिर कर सकता है जो पोस्ट-इम्प्लांटेशन साइटोट्रोफोब्लास्ट्स18,35 को दर्शाता है। ऐसी रेखाओं को ब्लास्टोसिस्ट और प्लेसेंटल ऊतकों35 दोनों से प्राप्त किया जा सकता है।

दूसरा एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक वंश, जिसे पीआरई कहा जाता है, ट्रोफोब्लास्ट्स के बाद निर्दिष्ट किया जाता है और एपिब्लास्ट 7,9 से निकलता है। मुरिन प्रीई36 के विपरीत, मानव समकक्ष को एफजीएफ सिग्नलिंग37,38 से स्वतंत्र माना जाता है। एक्सट्राम्ब्रायोनिक एंडोडर्म (जिसे एनएंड कहा जाता है) को प्रतिबिंबित करने वाली रेखाओं को एक्टिविन ए, डब्ल्यूएनटी और एलआईएफ39 का उपयोग करके सिग्नलिंग मार्गों के प्रेरण द्वारा भोले एचपीएससी से स्थापित किया गया था। भ्रूण निषेध प्रयोगों के साथ असंगत, ईआरके अवरोध को इन विट्रो39 में ऐसी एनईएनडी कोशिकाओं के गठन को रोकने के लिए दिखाया गया है। अब तक, ऐसी पंक्तियों को सीधे ब्लास्टोसिस्ट से प्राप्त नहीं किया गया है।

हाल ही में, शुरुआती भ्रूण के मॉडल एचटीएससी35 और एनईएनडी कोशिकाओं39 के लिए पहले से विकसित मीडिया की विविधताओं के संयोजन से बनाए गए हैं, इस प्रकार परिवर्तनकारी विकास कारक-β (टीजीएफ -β), ईजीएफ, और डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्गों28,40 के सक्रियकर्ताओं का उपयोग करके। ये भ्रूण मॉडल कम दक्षता (10% -20%) पर बनते हैं और पूर्व-आरोपण चरण 10 के बजाय पोस्ट-इंप्लांटेशन स्टेज10 जैसी कोशिकाएं बनाते हैं, जिसमें पोस्ट-इम्प्लांटेशन एपिब्लास्ट, ट्रोफोब्लास्ट, एमनियन, गैस्ट्रुला, मेसोडर्मल ऊतकों (~ भ्रूण दिवस 14), और साइटोट्रॉफोब्लास्ट्स10 के एनालॉग शामिल हैं। इसके विपरीत, हिप्पो, ईआरके, और टीजीएफ-β मार्गों का एक ट्रिपल अवरोध कुशलतापूर्वक ब्लास्टोसिस्ट जैसी कोशिकाओं41 सहित ब्लास्टोइड्स के गठन का मार्गदर्शन करता है। प्रारंभिक सेल राज्य के साथ, हम प्रस्ताव करते हैं कि ट्रिपल पाथवे निषेध (हिप्पो, ईआरके, टीजीएफ -β) उच्च-निष्ठा वाले ब्लास्टोइड्स (चित्रा 1 बी) बनाने के लिए दूसरा आवश्यक पैरामीटर है।

एससीआरएनएएसईक्यू का उपयोग करके सेल राज्य और परिलक्षित चरण का मूल्यांकन करना। ब्लास्टोइड्स की रचना करने वाली कोशिकाओं की स्थिति का मूल्यांकन एससीआरएनएसेक विश्लेषण के माध्यम से किया जा सकता है। विशिष्ट भ्रूण चरणों के लिए उनकी ट्रांसक्रिप्शनल समानता को अकेले ब्लास्टोइड कोशिकाओं का उपयोग करके और प्राइमेड एचपीएससी या एचटीएससी के साथ तुलना करके मापा जा सकता है जो पोस्ट-इम्प्लांटेशन चरणों20,35 को दर्शाते हैं। परिभाषा के विभिन्न स्तरों का उपयोग करके क्लस्टर विश्लेषण करने से पता चलता है कि परिभाषा कम होने पर उप-आबादी उत्तरोत्तर विलय कैसे होती है, इस प्रकार समूहों की समानताओं का खुलासा करती है। यद्यपि समूहों की संख्या में इष्टतमताको 42 मापा जा सकता है, उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्लस्टरिंग भी छोटे असामान्य उप-आबादी की अंतिम उपस्थिति पर सूचित करता है, उदाहरण के लिए पोस्ट-इम्प्लांटेशन चरणों10 को दर्शाता है। समूहों के बीच अलग-अलग व्यक्त जीन चरण-विशिष्ट वंशों को परिभाषित करने वाले संदर्भ जीन सेटों के अभिव्यक्ति स्तरों का आकलन करके विकास प्रक्रिया में उनके एनालॉग्स पर जानकारी प्रदान कर सकते हैं। यह ब्लास्टोइड उप-आबादी के संवर्धन को मापने की अनुमति देता है या तो असुरक्षित दूरी के नक्शे (उदाहरण के लिए, शीर्ष समृद्ध जीन का उपयोग करके) या जीन सेट संवर्धन विश्लेषण (जीएसईए) 43 द्वारा। इस ब्लास्टोइड प्रोटोकॉल का उपयोग करके, केवल तीन मुख्य क्लस्टर बनते हैं जो ट्रांसक्रिप्शनल रूप से तीन ब्लास्टोसिस्ट वंशों को प्रतिबिंबित करते हैं। एक क्लस्टर में प्रारंभिक भोले एचपीएससी और ब्लास्टोइड्स के एपिब्लास्ट एनालॉग दोनों शामिल हैं। विभिन्न समय बिंदुओं पर कोशिकाओं का विश्लेषण वंशावली विनिर्देश की अनुक्रमिक प्रकृति को दर्शाता है (ट्रोफोब्लास्ट 24 घंटे के भीतर निर्दिष्ट करना शुरू करते हैं, और 60 घंटे के भीतर आदिम एंडोडर्म कोशिकाएं)। एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्लस्टरिंग ने कोशिकाओं (3.2%) की एक उप-आबादी पर कब्जा कर लिया, जो गैस्ट्रुलेशन चरण भ्रूण (संभवतः मेसोडर्म या एमनियन) के लिए विशिष्ट जीन व्यक्त करता है। ध्यान दें, प्रारंभिक भोले एचपीएससी में 5% पोस्ट-इम्प्लांटेशन जैसी कोशिकाएं भी शामिल थीं, जैसा कि पहलेवर्णित 44 था। एक दूसरे विश्लेषण में, ब्लास्टोइड कोशिकाओं को सिलिको में अलग-अलग चरणों45,46,47 पर अवधारणा से अलग संदर्भ कोशिकाओं के साथ विलय किया जा सकता है ताकि चरण तुल्यता का अनुमान लगाया जा सके। यहां, पूर्व-आरोपण अवधारणा45,46 से अलग कोशिकाओं, इन विट्रो सुसंस्कृत ब्लास्टोसिस्ट45 में, और गैस्ट्रुलेशन-चरण भ्रूण47 का उपयोग संदर्भ बिंदुओं के रूप में किया गया था। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, यह मात्रा निर्धारित की गई थी कि उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्लस्टरिंग द्वारा प्रकट बेमेल ब्लास्टोइड कोशिकाएं वास्तव में पोस्ट-इम्प्लांटेशन मेसोडर्म और एमनियन के साथ क्लस्टर करती हैं। भविष्य के चरणों में, ट्रांसक्रिप्टोम बेंचमार्किंग को ट्रांसपोसन अभिव्यक्ति, डीएनए मिथाइलेशन और एक्स गुणसूत्र स्थिति के विश्लेषण के साथ पूरक किया जाना चाहिए जो विकास ता्मक चरणों21 के स्थलों को भी प्रदान करता है।

मानव ब्लास्टोइड्स के अक्ष गठन और अन्य कार्यात्मकताओं का मूल्यांकन करना। एक परिपक्व ब्लास्टोसिस्ट को आरोपण के लिए भ्रूण-एबेम्ब्रायोनिक अक्ष पैटर्निंग ट्रोफोब्लास्ट्स के गठन की विशेषता है। इस ब्लास्टोइड प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, एक अक्ष मजबूत रूप से समीपस्थ ट्रोफोब्लास्ट्स (उदाहरण के लिए, एनआर 2 एफ 2 + / सीडीएक्स 2-) की परिपक्वता द्वारा उदाहरण दिया जाता है जो एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड कोशिकाओं से जुड़ने की क्षमता प्राप्त करते हैं जब वे हार्मोनल रूप से उत्तेजित48,49 होते हैं। ट्रोफोस्फीयर के साथ तुलना जो एपिब्लास्ट नहीं बनाती है, यह दर्शाती है कि ये आंतरिक कोशिकाएं ट्रोफोब्लास्ट्स को परिपक्व होने के लिए प्रेरित करती हैं ताकि एंडोमेट्रियम के लिए प्रारंभिक लगाव को मध्यस्थता की जा सके। जब सिनोमोलगस बंदर ब्लास्टोसिस्ट50 के लिए डिज़ाइन किए गए एक विस्तारित संस्कृति माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है, तो ब्लास्टोइड से सभी तीन वंश लगातार छह अतिरिक्त दिनों (दिन 13 के समय-समतुल्य) के लिए विस्तार करते हैं, हालांकि उनका संगठन उस विकास ता्मक चरण को प्रतिबिंबित नहीं करता है।

उच्च दक्षता और उच्च-निष्ठा वाले मानव ब्लास्टोइड्स का निहितार्थ। मॉडल जीवों में खोजे गए विकास ता्मक सिद्धांतों का संरक्षण सीमित पहुंच के कारण और आनुवंशिक रूप से और शारीरिक रूप से हेरफेर करने में तकनीकी कठिनाइयों के कारण मानव अवधारणा में परीक्षण करना स्वाभाविक रूप से मुश्किल है। एक उच्च दक्षता और उच्च-निष्ठा ब्लास्टोइड मॉडल उच्च-थ्रूपुट आनुवंशिक और दवा स्क्रीन के लिए अनुमति देगा, जो वैज्ञानिक और जैव चिकित्सा खोजों के आधार पर हैं। इसके अलावा, जैविक प्रक्रियाओं को बदलने और रिकॉर्ड करने के लिए जटिल आनुवंशिक संशोधनों का समावेश ऐसे अध्ययनों का पूरक होगा। कुल मिलाकर, हम प्रस्ताव करते हैं कि भोले पीएक्सजीएल एचपीएससी का ट्रिपल अवरोध (हिप्पो, टीजीएफ -β, ईआरके) चार न्यूनतम मानदंडों का अनुपालन करने वाले उच्च-निष्ठा वाले मानव ब्लास्टोइड्स के कुशल गठन के लिए प्रवाहकीय है। इस प्रोटोकॉल की स्केलेबल और बहुमुखी प्रकृति लक्षित परिकल्पनाओं को उत्पन्न करने के लिए उपयुक्त बनाती है जिन्हें मानव ब्लास्टोसिस्ट का उपयोग करके मान्य किया जा सकता है। जैसे, मानव ब्लास्टोइड्स इन विट्रो अनुसंधान के लिए मानव अवधारणा के उपयोग को प्रतिस्थापित नहीं करेंगे, लेकिन वैज्ञानिक और बायोमेडिकल खोज प्रक्रिया के केंद्र में पहले से दुर्गम प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों के माध्यम से अनुसंधान को फ़नल करने के लिए एक शक्तिशाली तरीके के रूप में कार्य कर सकते हैं। प्रोटोकॉल से पता चलता है कि मानव ब्लास्टोइड कैसे बनाया जाए और यह भी कि ब्लास्टोइड के भीतर निहित कोशिकाओं का विश्लेषण कैसे किया जाए।

Protocol

इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर स्टेम सेल रिसर्च (आईएसएससीआर) के स्टेम सेल रिसर्च एंड क्लीनिकल ट्रांसलेशन के लिए दिशानिर्देशों में सिफारिश की गई है कि मानव ब्लास्टोइड्स पर अनुसंधान केवल एक विशेष वैज्ञानिक और नैतिकता समीक्षा प्रक्रिया 3,4 के माध्यम से समीक्षा और अनुमोदनके बाद ही अनुमेय है। सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को अनुमोदन Rivron_Stellungnahme_2020-04-22 के तहत ऑस्ट्रियाई एकेडमी ऑफ साइंस (आईएमबीए) के आणविक जैव प्रौद्योगिकी संस्थान की मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशानिर्देशों का पालन करके आयोजित किया गया था। वैज्ञानिक पत्रिकाओं में अनुसंधान परिणामों को प्रकाशित करने के लिए इन दिशानिर्देशों का अनुपालन आवश्यक है।

1. पीएक्सजीएल स्थिति में मानव भोले भ्रूण स्टेम सेल की संस्कृति

नोट: भोले एचपीएससी प्रासंगिक प्रयोगशालाओं से प्राप्त किया जा सकता है। यहां उपयोग की जाने वाली रेखाएं यासुहिरो ताकाशिमा (वर्तमान में सीआईआरए, क्योटो, जापान में) और ऑस्टिन स्मिथ (वर्तमान में लिविंग सिस्टम्स इंस्टीट्यूट, एक्सेटर, यूके में) की प्रयोगशालाओं से प्राप्त की गई थीं। वैकल्पिक रूप से, भोले एचपीएससी को प्राइमेड एचपीएससी की लाइनों से घर में रीसेट किया जा सकता है जैसा कि पहले13,14 में वर्णित है। भोले एचपीएससी कई मार्गों (> 15) के लिए स्थिर दिखाई देते हैं लेकिन संस्कृति की गुणवत्ता समय के साथ भिन्न हो सकती है। यदि भोले एचपीएससी की गुणवत्ता कम हो जाती है, तो कोशिकाओं की एक नई शीशी को पिघलाएं या प्राइमेड पीएससी से डी नोवो भोले एचपीएससी उत्पन्न करें। सभी मीडिया रचनाओं के लिए अनुपूरक तालिका 1 देखें।

  1. विकिरणित माउस भ्रूण फीडर (एमईएफ) परत की तैयारी
    1. भोले एचपीएससी के पासिंग से एक दिन पहले, नीचे वर्णित चरणों का पालन करके विकिरणित एमईएफ परतों के साथ 6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट तैयार करें।
    2. प्रति अच्छी तरह से पीबीएस में 0.1% जिलेटिन के 1 एमएल के साथ एक 6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट को कोट करें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट सेते हैं। जिलेटिन समाधान निकालें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर एमईएफ माध्यम तैयार करें।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में एमईएफ को पिघलाएं जब तक कि केवल एक छोटा सा बर्फ झुरमुट नहीं छोड़ा जाता है। एक पी 1000 विंदुक का उपयोग कर तैयार एमईएफ माध्यम के 1 एमएल के साथ शीशी की मात्रा भंग।
    5. सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर निलंबन को स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला एस्पिरेट करें और ताजा एमईएफ माध्यम (प्रति अच्छी तरह से 1.5 एमएल के लिए पर्याप्त) जोड़कर एमईएफ गोली को फिर से निलंबित करें।
    6. सेल गिनती स्लाइड का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें और अच्छी तरह से प्रति 300,000 कोशिकाओं को जोड़ने और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक normoxy इनक्यूबेटर में प्लेट हस्तांतरण।
      नोट: यदि एमईएफ समय के साथ अलग हो जाते हैं, तो नियमित मीडिया परिवर्तन के दौरान पीएक्सजीएल माध्यम में ताजा एमईएफ को जोड़ा जा सकता है।
  2. मानव भोली प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का पासिंग
    1. एचपीएससी पास करने से पहले, माइक्रोस्कोप के तहत उनकी आकृति विज्ञान की जांच करें। कालोनियों में आमतौर पर उज्ज्वल, परिभाषित सीमाओं के साथ एक गुंबद के आकार की आकृति विज्ञान होता है। यदि व्यक्तिगत कालोनियां एक चापलूसी आकृति विज्ञान दिखाती हैं या यदि विभेदित कालोनियां उभरने लगती हैं, तो चरण 1.2.8 के निर्देशों का पालन करें।
    2. मध्यम को एस्पिरेट करें और एक बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। 6-अच्छी तरह से प्लेट के कुएं के प्रति सेल टुकड़ी समाधान के 500 μL जोड़ें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं। एक P1000 विंदुक का उपयोग करें और एकल कोशिकाओं में कालोनियों को अलग करने के लिए कई बार कोशिकाओं पिपेट।
    4. कोशिकाओं को ले लीजिए और उन्हें धोने बफर युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें (6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से 1 एमएल)। 4 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें।
    5. सतह पर तैरनेवाला एस्पिरेट करें और ताजा पीएक्सजीएल माध्यम (प्रति अच्छी तरह से 1.5 एमएल के लिए पर्याप्त) में गोली को फिर से निलंबित करें। नियमित रूप से पासिंग के लिए 1: 3-1: 6 के विभाजन अनुपात पर विचार करें।
      नोट: प्रत्येक 3-4 मार्ग के बाद या यदि सेल संस्कृति की गुणवत्ता सेल आकृति विज्ञान (उदाहरण के लिए, आबादी में फ्लैट कालोनियों के उद्भव) के आधार पर कम हो जाती है, तो पासिंग के बाद पहले 24 घंटे के दौरान माध्यम में 10 μM Y-27632 और विकास कारक तहखाने झिल्ली निकालने (5 μL /
    6. एचपीएससी को फिर से तैयार करने से पहले, एमईएफ माध्यम को एस्पिरेट करके और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार धोकर ताजा एमईएफ के साथ प्लेटें तैयार करें। फिर, एमईएफ युक्त 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से एचपीएससी सेल निलंबन के 1.5 एमएल को स्थानांतरित करने के लिए पी 1000 विंदुक का उपयोग करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि पाइपिंग अच्छी तरह से क्षेत्र में कोशिकाओं के एक सजातीय बोने की ओर जाता है। यह सजातीय आकार और कोशिकाओं के सापेक्ष सिंक्रनाइज़ेशन के साथ कालोनियों के विकास को सुनिश्चित करेगा।
    7. एक ह्यूमिडिफाइड वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत संस्कृति एचपीएससी। 24 घंटे के बाद, एचपीएससी संलग्न किया जाना चाहिए। गैर-अनुयायी (या फ़्लोटिंग) कोशिकाओं की एक उच्च संख्या व्यवहार्यता या पासिंग पर लगाव की समस्या को दर्शाती है।
    8. प्रति अच्छी तरह से दैनिक पीएक्सजीएल माध्यम के 1.5 एमएल के साथ मध्यम बदलें। हर 3-4 दिनों में एचपीएससी को पारित करें या ब्लास्टोइड गठन प्रयोगों के लिए उनका उपयोग करें।
      नोट: एचपीएससी को विगलन करने के बाद, उन्हें ब्लास्टोइड प्रयोग शुरू करने से पहले कम से कम तीन मार्गों के लिए पारित करें।

2. ब्लास्टोइड्स का गठन

  1. भोले पीएससी समुच्चय का गठन
    1. प्रयोग शुरू करने से पहले पीएक्सजीएल मीडिया, एन 2 बी 27 बेसल मीडिया, वॉशिंग बफर, पीबीएस और एकत्रीकरण मीडिया तैयार करें और पूर्व-गर्म करें। नीचे वर्णित चरणों का पालन करके ब्लास्टोइड बनाने के लिए एचपीएससी निलंबन से एमईएफ को बाहर निकालें।
    2. एमईएफ बहिष्करण के लिए, 6-अच्छी तरह से प्लेट के कुएं में 0.1% जिलेटिन के 1 एमएल जोड़कर और 30-90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके एक जिलेटिन-लेपित प्लेट तैयार करें।
    3. कोशिकाओं को काटने के लिए, माध्यम को एस्पिरेट करें और पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    4. सेल टुकड़ी समाधान (एक 6 अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से) के 500 μL जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. एकल कोशिकाओं में कालोनियों के पृथक्करण का पालन करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें (कुछ बहुकोशिकीय झुरमुटों को बाद में कोमल पाइपिंग द्वारा अलग किया जा सकता है)।
    6. धोने बफर के 1 एमएल के साथ सेल टुकड़ी समाधान पतला। धीरे-धीरे 5 से 10 बार पाइपिंग करके प्लेट से कोशिकाओं को इकट्ठा करें। सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें।
    7. सतह पर तैरनेवाला एस्पिरेट, पीएक्सजीएल माध्यम (6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से) के 1.5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और एमईएफ बहिष्करण के लिए जिलेटिन-लेपित प्लेटों पर कोशिकाओं को बीज दें और 60-90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    8. एक बार जब भोली कोशिकाओं को एमईएफ बहिष्करण के लिए वरीयता दी जाती है, तो माइक्रोवेल से पीबीएस को हटा दें और बेसल एन 2 बी 27 मध्यम (प्रति 1 माइक्रोवेल चिप) के 200 μL के साथ कुओं को संतुलित करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सेते हैं।
    9. असंबद्ध भोले कोशिकाओं युक्त सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए, इसे 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 4 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर कोशिकाओं को स्पिन करें।
    10. मीडिया को एस्पिरेट करें और एन 2 बी 27 बेसल मीडिया के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। सेल गिनती स्लाइड्स का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। 4 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें।
    11. माध्यम को एस्पिरेट करें और एन 2 बी 27 मीडिया में निहित 10 μM Y-27632 की उचित मात्रा जोड़ें ताकि प्रति 50 μL 30,000 कोशिकाओं का सेल घनत्व प्राप्त किया जा सके।
      नोट: इष्टतम प्रारंभिक बोने सेल संख्या विभिन्न सेल लाइनों के बीच भिन्न हो सकती है। माइक्रोवेल के बीज के लिए, 30,000 कोशिकाओं (कुछ कोशिकाओं को माइक्रोवेल के बाहर गिरने पर विचार करने वाले अधिशेष सहित) को 96 अच्छी तरह से प्लेट के 1 कुएं में वरीयता दी जाती है जिसमें 430 माइक्रोवेल होते हैं। एक अनुचित प्रारंभिक सेल संख्या के परिणामस्वरूप गुहा के बिना छोटे कुल गठन या 250 μm से अधिक तक पहुंचने वाली गुहाकृत संरचना का गठन हो सकता है।
    12. संतुलित माइक्रोवेल सरणियों से माध्यम को एस्पिरेट करें और 10 μM Y-27632 के साथ N2B27 मीडिया के 25 μL जोड़ें। सेल निलंबन के 50 μL जोड़ें और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं (जब तक कि कोशिकाएं माइक्रोवेल के तल में नहीं गिर जाती)। फिर, 10 μM Y-27632 के साथ पूरक N2B27 माध्यम के 125 μL जोड़ें।
  2. ब्लास्टोइड विकास
    1. 24 घंटे के भीतर, माइक्रोवेल चिप पर भोले एचपीएससी के समुच्चय (दिन 0) देखे जा सकते हैं। ब्लास्टोइड गठन शुरू करने के लिए, पल्ली माध्यम तैयार करें और नीचे उल्लिखित चरणों का पालन करें।
    2. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म पल्ली मध्यम।
      नोट: 1-ओलेओयल लाइसोफॉस्फेटिडिक एसिड (एलपीए) और 10 μM Y-27632 को उपयोग से ठीक पहले जोड़ने की आवश्यकता है। एलपीए की इष्टतम एकाग्रता 0.5-5 μM के बीच भिन्न होती है। इसे ब्लास्टोइड्स के लिए उपयोग की जाने वाली व्यक्तिगत एचपीएससी लाइनों के लिए टाइट्रेट किया जाना चाहिए।
    3. एकत्रीकरण माध्यम को एस्पिरेट करें। माइक्रोवेल में पूर्व-गर्म पल्ली माध्यम के 200 μL जोड़ें। सेल संस्कृति प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हाइपोक्सिक इनक्यूबेटर में वापस रखें। दिन 1 पर मीडिया परिवर्तन दोहराएं।
    4. दिन 2 पर, पल्ली माध्यम को हटा दें और एलपीए और 10 μM Y-27632 के साथ पूरक एन 2 बी 27 माध्यम के 200 μL जोड़ें।
      नोट: दिन 2 पर समुच्चय के बहुमत में वृद्धि जारी है। हालांकि, कुछ समुच्चय छोटे गुहाओं का निर्माण करते हैं। दिन 4 तक या दिन 2 से इन विट्रो संस्कृति माध्यम (आईवीसी 1) में पल्ली में लगातार संस्कृति ब्लास्टोइड्स। हालांकि, इस मीडिया परिवर्तन के बाद परिपक्व ब्लास्टोइड्स में पीआरई के गठन को बढ़ाता है।
    5. दिन 3 पर मीडिया परिवर्तन दोहराएं। पूर्ण ब्लास्टोइड गठन दिन 4 तक होता है।
      नोट: ब्लास्टोइड्स को पूरी तरह से विकसित माना जाता है जब वे दिन 7 मानव ब्लास्टोसिस्ट के मॉर्फोमेट्रिक्स के आधार पर पूर्ण मॉर्फोजेनेसिस से गुजरते हैं (उदाहरण के लिए, 150 -250 μm से व्यास की सीमा; ट्रॉफेक्टोडर्म जैसी कोशिकाओं के उपकला से घिरा एक आंतरिक क्लस्टर) और ध्रुवीय ट्रॉफेक्टोडर्म जैसी कोशिकाओं (एनआर 2 एफ 2 +/ सीडीएक्स 2-) और पीआरई जैसी कोशिकाओं (जीएटीए 4 +) का गठन किया है। इसका आकलन इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला या प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग करके किया जा सकता है।

3. 96-अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव माइक्रोप्लेट्स में ब्लास्टोइड्स का गठन

  1. 2.1.1 - 2.1.11 से ऊपर वर्णित चरणों का पालन करके ब्लास्टॉइड गठन के लिए भोले एचपीएससी सेल निलंबन तैयार करें।
  2. माध्यम को एस्पिरेट करें और माध्यम के प्रति 100 μL 70 कोशिकाओं के सेल घनत्व को प्राप्त करने के लिए 10 μM Y-27632 युक्त एन 2 बी 27 मीडिया की उचित मात्रा जोड़ें।
    नोट: इष्टतम प्रारंभिक बोने सेल संख्या विभिन्न सेल लाइनों के बीच भिन्न हो सकती है। उदाहरण के लिए, 70 कोशिकाओं / अच्छी तरह से अधिकांश सेल लाइनों के लिए इष्टतम सेल नंबर हो सकता है।
  3. कुओं के तल पर क्लस्टर कोशिकाओं के लिए कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर प्लेट अपकेंद्रित्र।
  4. हाइपोक्सिक संस्कृति की स्थिति के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में प्लेट को सेते हैं। 24 घंटे के भीतर भोले एचपीएससी के समुच्चय कुओं पर मनाया जा सकता है (दिन 0)।
  5. 2x पल्ली माध्यम तैयार करें। कुओं में प्रीवार्म्ड 2x पल्ली माध्यम के 100 μL जोड़ें।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हाइपोक्सिक इनक्यूबेटर में सेल संस्कृति प्लेट को वापस रखें। 24 घंटे के बाद, मीडिया के आधे हिस्से (100 μL) को एस्पिरेट करें और इसे प्रीवार्म्ड पैली माध्यम के 100 μL के साथ बदलें। चरण को 4 वें दिन तक दोहराएं। समुच्चय आकांक्षी नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें।
    नोट: दिन 2 पर, समुच्चय के बहुमत में वृद्धि जारी है। हालांकि, कुछ समुच्चय में छोटे तरल से भरे गुहा होते हैं। दिन 4 पर, अधिकांश गुहाकृत संरचनाएं ब्लास्टोसिस्ट जैसी संरचनाओं को बनाने के लिए पूर्ण मॉर्फोजेनेसिस से गुजरती हैं।

4. ट्रोफोस्फीयर का गठन

  1. ट्रोफोस्फीयर गठन के लिए, चरण 2.1.1 (एमईएफ बहिष्करण) से चरण 2.1.12 (सीडिंग प्रोटोकॉल के अंतिम चरण) तक ब्लास्टोइड गठन प्रोटोकॉल का पालन करें।
  2. एक बार जब भोले एचपीएससी के समुच्चय 24 घंटे के बाद बन जाते हैं, तो प्रारंभिक ट्रॉफेक्टोडर्म का प्रतिनिधित्व करने वाले ट्रोफोस्फेयर के गठन के लिए 3 μM एससी -144 के साथ पूरक पाली (एलआईएफ के बिना) के साथ एकत्रीकरण माध्यम का आदान-प्रदान करें और परिपक्व ट्रॉफेक्टोडर्म का प्रतिनिधित्व करने वाले ट्रोफोस्फीयर के गठन के लिए 2 μM XMU-MP-1 के साथ पूरक पाली।
  3. माध्यम को रोजाना ताज़ा करें। पूर्ण ट्रोफोस्फीयर गठन दिन 4 तक होता है।

5. ब्लास्टोइड कोशिकाओं की स्थिति और एससीआरएनएसेक का उपयोग करके इसके परावर्तित चरण का विश्लेषण

  1. ब्लास्टोइड्स को लेने और पृथक्करण करने के लिए, मिलाते हुए इनक्यूबेटर को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और इसे 100 आरपीएम पर सेट करें।
  2. प्रारंभिक 96-अच्छी तरह से प्लेट से ब्लास्टोइड्स लीजिए और उन्हें एक ग्लास केशिका से लैस मुंह पिपेट का उपयोग करके यू-बॉटम 96-वेल प्लेट के कई कुओं में स्थानांतरित करें।
    नोट: गैर-ब्लास्टोइड संरचनाओं (< 30%) के साथ संदूषण से बचने के लिए ब्लास्टोइड्स (> 70%) को मॉर्फोमेट्रिक मानदंड (आकार = एक अद्वितीय आंतरिक क्लस्टर के साथ 150-250 μm) के आधार पर चुना जाना चाहिए।
  3. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत देखकर पी 200 का उपयोग करके पीबीएस के 200 μL के साथ एक बार धो लें। कोलेजनेज के 50 μL युक्त एक अच्छी तरह से स्थानांतरण और मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. ब्लास्टोइड्स को 10x ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 100 μL के साथ एक अच्छी तरह से स्थानांतरित करें और अच्छी तरह से मिलाएं। मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. पी 200 विंदुक का उपयोग करके एकल सेल में ब्लास्टोइड्स को अलग करें। एफएसीएस बफर (पीबीएस में 1% एफबीएस) के साथ एक 15 एमएल ट्यूब में कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
  6. तीन वंशों के एनालॉग्स के विशिष्ट अनुपातों को पकड़ने के लिए, क्रमशः ट्रोप 2 और पीडीजीएफआरए एंटीबॉडी के साथ टीई और पीआरई एनालॉग्स को दाग दें।
    नोट: माउस ब्लास्टोसिस्ट की तुलना में मानव ब्लास्टोसिस्ट में पीआरई कोशिकाओं की संख्या कम है, जो इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) या प्रजातियों के अंतर के माध्यम से गठित ब्लास्टोसिस्ट के विकाससंबंधी दोषों को प्रतिबिंबित कर सकती है। ब्लास्टोइड्स में, पीआरई एनालॉग टीई और ईपीआई एनालॉग्स की तुलना में कम प्रचुर मात्रा में होते हैं और इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग द्वारा जीएटीए 4 + कोशिकाओं की गिनती पर कोशिकाओं के 7.4% का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, पृथक्करण प्रक्रिया ब्लास्टोइड पृथक्करण, पीडीजीएफआरए टैगिंग और एफएसीएस विश्लेषण पर कोशिकाओं के 1% -2% का प्रतिनिधित्व करने के लिए पीआरई एनालॉग्स के रूप में विभिन्न सेल प्रकारों के अनुपात में पूर्वाग्रहों को प्रेरित कर सकती है।
  7. सभी तीन वंश एनालॉग्स से एफएसीएस-सॉर्ट कोशिकाओं को 384-प्लेटों में स्मार्ट-सीक्यू 2 विश्लेषण के लिए एक लाइसिस बफर युक्त किया जाता है। डीएपीआई धुंधला (निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन) द्वारा चिह्नित मृत कोशिकाओं को बाहर निकालें।
  8. सेल राज्यों (सेल प्रकार और विकास ता्मक चरण) का मूल्यांकन करने के लिए, उपयुक्त नियंत्रण के साथ ब्लास्टोइड से ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा की तुलना करें।

6. ब्लास्टोइड विकास ता्मक प्रगति का आकलन करने के लिए विस्तारित संस्कृति

  1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों (ग्लास नीचे) पर संस्कृति मानव ब्लास्टोइड्स।
    1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ प्लेट कोट।
    2. आकारिकी का आकलन और रिकॉर्ड करने के लिए नेत्रहीन रूप से ब्लास्टोइड्स का निरीक्षण करें।
      नोट: कॉम्पैक्ट आईसीएम के साथ क्लासिक खोखले-बॉल ब्लास्टोसिस्ट आकृति विज्ञान को प्रदर्शित करने वाले केवल ब्लास्टोइड्स में आगे बढ़ने और विकसित करने की क्षमता है।
    3. 96-अच्छी तरह से प्लेट के प्रति एक अच्छी तरह से सीएमआरएल मध्यम -1 के 100 μL जोड़ें, और संतुलन के लिए ब्लास्टोइड स्थानांतरण से कम से कम 2 घंटे पहले इनक्यूबेटर में प्लेट रखें।
    4. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके, नेत्रहीन रूप से अच्छी आकृति विज्ञान के साथ ब्लास्टोइड्स की पहचान करें, ब्लास्टोइड मीडिया के निशान को हटाने के लिए सीएमआरएल मध्यम -1 के 100 μl युक्त 96-अच्छी तरह से प्लेट के कुएं में चयनित ब्लास्टोइड्स को स्थानांतरित करें।
    5. पूर्व संतुलित सीएमआरएल मीडिया -1 युक्त कुएं में ब्लास्टोइड्स को स्थानांतरित करें। इनक्यूबेटर में प्लेट रखें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      नोट: 5 ब्लास्टोइड्स तक 96 अच्छी तरह से प्लेटों के एक कुएं में सुसंस्कृत किया जा सकता है। एक ही कुएं में बहुत सारे ब्लास्टोइड होने से कई ब्लास्टोइड्स के समुच्चय का गठन हो सकता है।
    6. अगले दिन, नेत्रहीन एक माइक्रोस्कोप के तहत ब्लास्टोइड्स का निरीक्षण करते हैं। यदि ब्लास्टोइड्स संलग्न हैं, तो 5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ पूरक पूर्व-संतुलित सीएमआरएल मीडिया -1 के 100 μL जोड़ें। इनक्यूबेटर में प्लेट रखें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    7. अगले दिन, माइक्रोस्कोप के तहत ब्लास्टोइड्स की निगरानी करें। मीडिया के आधे हिस्से (100 μL) निकालें और इसे 5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ पूरक पूर्व-संतुलित सीएमआरएल मीडिया -2 के 100 μL के साथ बदलें।
    8. अगले दिनों में, 5% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ पूरक पूर्व-संतुलित सीएमआरएल मीडिया -3 के साथ मीडिया (100 μL) के आधे हिस्से को प्रतिस्थापित करें। इनक्यूबेटर में प्लेट रखें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। इन विट्रो संस्कृति के 4-6 दिनों तक हर दिन दोहराएं।
      नोट: हमारे पास विस्तारित संस्कृति स्थितियों में 6 दिनों तक के लिए सुसंस्कृत ब्लास्टोइड्स हैं जो इन विट्रो सुसंस्कृत मानव भ्रूण के दिन 13 के बराबर समय से मेल खाती है।

7. इम्यूनोस्टेनिंग ब्लास्टोइड्स

  1. माध्यम को एस्पिरेट करें। 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ नमूने 3x धोलें।
  2. पीबीएस में ठंड 4% पैराफॉर्मल्डेहाइड (पीएफए) के 200 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए नमूने तय करें। पीएफए समाधान निकालें और 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ नमूने 3x धो लें।
    नोट: यदि ब्लास्टोइड्स को माइक्रोवेल चिप्स पर सुसंस्कृत किया गया था, तो चिप से ब्लास्टोइड्स को निम्नलिखित चरणों के लिए 96-अच्छी तरह से यू-बॉटम प्लेटों में स्थानांतरित करें।
  3. 60 मिनट के लिए प्रति अच्छी तरह से अवरुद्ध समाधान (पीबीएस युक्त 0.3% ट्राइटन-एक्स 100 और 10% सामान्य गधा सीरम युक्त) के 100 μL में ब्लास्टोइड्स को परमीबिलाइज़ और ब्लॉक करें।
    नोट: एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियों के आधार पर, तदनुसार सीरम को अनुकूलित करें।
  4. अवरुद्ध समाधान निकालें। ताजा अवरुद्ध समाधान में पतला 100 μL प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूनों सेते हैं।
    नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी की सांद्रता निर्माता के निर्देशों के आधार पर निर्धारित की जानी चाहिए।
  5. 10 मिनट के लिए पीबीएस (धोने के समाधान) में 0.1% ट्राइटन-एक्स 100 के साथ नमूने 3 एक्स धोएं। एमएल होचस्ट परमाणु दाग के साथ एक साथ समाधान को अवरुद्ध करने में माध्यमिक एंटीबॉडी के 100 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए नमूनों को सेते हैं। प्रकाश से नमूनों की रक्षा करें।
    नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी की सांद्रता निर्माता के निर्देशों के आधार पर निर्धारित की जानी चाहिए।
  6. 10 मिनट के लिए धोने के समाधान के साथ नमूने 3x धोलें। इमेजिंग के लिए, पीबीएस में ग्लास नीचे μ-स्लाइड पर नमूनों को स्थानांतरित करें।
    नोट: बढ़ते माध्यम इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया उद्देश्य के आधार पर चुना जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, पीबीएस में 80% ग्लिसरॉल तेल उद्देश्यों का उपयोग करते समय नमूनों को माउंट करने के लिए उपयोग करना संभव है।

Representative Results

आमतौर पर, पीएक्सजीएल (चित्रा 2 ए) में सुसंस्कृत भोले एचपीएससी एकत्रित और गुहाकृत संरचनाएं होती हैं जो पाली प्रेरण के बाद 48 से 72 घंटे के बीच उभरती हैं और 96 घंटे (चित्रा 2 बी) के भीतर 150-250 μm के व्यास तक पहुंचती हैं। इष्टतम (1) सीडिंग सेल नंबर, (2) एन 2 बी 27 (0 से 24 एच) के साथ पूर्व-संस्कृति एकत्रीकरण की अवधि, (3) व्यक्तिगत रासायनिक घटकों (विशेष रूप से एलपीए) की एकाग्रता, और (4) पैली उपचार की अवधि का उपयोग करते हुए, प्रेरण दक्षता मॉर्फोमेट्रिक मापदंडों (150-250 μm, एकल नियमित गुहा, एकल आंतरिक सेल क्लस्टर का समग्र आकार) के आधार पर परिभाषित 70% -80% तक पहुंच जाती है; चित्रा 2 सी, डी) और तीन वंशों की उपस्थिति। एक उप-प्रारंभिक प्रारंभिक सेल राज्य और / या प्रेरण स्थितियों के परिणामस्वरूप कम कुशल या कोई ब्लास्टोइड गठन नहीं होगा। अधिकतम दक्षता सुनिश्चित करने के लिए और केवल पूर्व-आरोपण एनालॉग बनाने के लिए, भोले पीएक्सजीएल एचपीएससी की उच्च गुणवत्ता वाली संस्कृति का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। इसका आकलन एफएसीएस द्वारा सतह मार्करों एसयूएसडी 2 (भोले राज्य) और सीडी 24 (प्राइमेड राज्य) के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत को मापकर किया जा सकता है। ऑफ-टारगेट एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक वंशावली (जैसे, एमनियन, एक्स्ट्राएम्ब्रायोनिक मेसोडर्म) के लिए विशिष्ट अतिरिक्त सतह मार्कर भी उपयोगी होंगे, लेकिन, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, वर्तमान में उपलब्ध नहीं हैं। यदि प्राप्त गठन दक्षता रिपोर्ट किए गए परिणामों की तुलना में कम है, तो ब्लास्टोइड माध्यम के सभी घटकों की सावधानीपूर्वक जांच करना महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से एलपीए जिसे पीबीएस में पुनर्गठित किया गया है और जीपीसीआर लिगैंड के रूप में, डीएमएसओ में पुनर्गठित सिंथेटिक अणुओं की तुलना में अधिक अस्थिर हो सकता है। ज्यादातर मामलों में, भले ही उपज अधिकतम न हो, गुहाकृत संरचनाएं अभी भी तीन ब्लास्टोसिस्ट वंशों से बनी होती हैं। तीन ब्लास्टोसिस्ट वंशों के उद्भव और भ्रूण-एबेम्ब्रायोनिक अक्ष के गठन की पुष्टि मार्करों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला (ईपीआई: नैनोजी, ओसीटी 4, टीई: जीएटीए 3, ध्रुवीय-टीई एनआर 2 एफ 2, म्यूरल-टीई: सीडीएक्स 2, पीआरई: जीएटीए 4; चित्रा 2 ई, जी)। ट्रोफ़ोस्फीयर, जो केवल टीई से बने होते हैं, अंतरकोशिकीय संचार की भूमिका को और विच्छेदित करने में मदद करते हैं। ट्रोफोस्फीयर प्रेरण के 96 घंटे के भीतर 50% -60% दक्षता पर बन सकते हैं (चित्रा 2 एच, आई)। ब्लास्टोइड गठन न केवल घर का बना माइक्रोवेल सरणियों में किया जा सकता है, बल्कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 96 अच्छी तरह से प्लेटों में प्रेरण स्थितियों के अनुकूलन के साथ किया जा सकता है (प्रोटोकॉल और चित्रा 2 जे देखें)। ब्लास्टोइड्स में अतिरिक्त 6 दिनों के लिए आगे विकसित करने की क्षमता भी होती है, जो इन विट्रो भेदभाव प्रोटोकॉल (चित्रा 2 के) के साथ दिन 13 भ्रूण के समय-समतुल्य है।

ब्लास्टोइड कोशिकाओं की सेल स्थिति को और चिह्नित करने के लिए, एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए। यूएमएपी को आमतौर पर सेल राज्यों के वितरण की कल्पना करने के लिए लागू किया जाता है और व्यक्तिगत सेल राज्यों की निकटता का मूल्यांकन करने के लिए इस पर असुरक्षित क्लस्टरिंग विश्लेषण किया जाता है। एकल-सेल डेटा विश्लेषण में विभिन्न पैरामीटर प्रभावित कर सकते हैं कि यूएमएपी में कोशिकाओं को कैसे प्रदर्शित किया जाता है, इस प्रकार विभिन्न स्थानिक और सापेक्ष पदों और आकृतियों (चित्रा 3 ए) के साथ क्लस्टर की ओर अग्रसर होता है। हालांकि, इस विश्लेषण में, कोशिकाएं क्लस्टरिंग और डेटा के विज़ुअलाइज़ेशन को करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मापदंडों की परवाह किए बिना स्पष्ट रूप से अलग-अलग क्लस्टरिंग प्रोफाइल प्रदर्शित करती हैं, जो तीन ब्लास्टोसिस्ट वंशों को उच्च आत्मविश्वास के साथ भेद करने की अनुमति देती है। हमने संदर्भ के रूप में विभिन्न विकास चरणों में काटे गए भ्रूण से कोशिकाओं का उपयोग किया। इन डेटासेट के विलय से पता चलता है कि ब्लास्टोइड से ट्रॉफेक्टोडर्म एनालॉग का बहुमत पूर्व-आरोपण ट्रॉफेक्टोडर्म के साथ क्लस्टर किया गया है, लेकिन पोस्ट-इम्प्लांटेशन ट्रोफोब्लास्ट्स (चित्रा 3 बी) के साथ नहीं। इन परिणामों की पुष्टि एक स्वतंत्र कंसोर्टियम10 द्वारा भी की गई थी।

जब कार्नेगी चरण 7 (सीएस 7) गैस्ट्रुलेटिंग भ्रूण को संदर्भ मानचित्र में पेश किया जाता है, तो ब्लास्टोइड कोशिकाओं (3%) की एक छोटी आबादी इन भ्रूणों (चित्रा 3 सी) के मेसोडर्म और एमनियन वंशों के साथ क्लस्टर होती है। जब संदर्भ मानचित्र में एमनियन जैसी कोशिकाओं को पेश किया जाता है, तो ब्लास्टोइड कोशिकाओं (< 2%) की एक छोटी आबादी ऐसी एमनियन जैसी कोशिकाओं के साथ क्लस्टर होती है।

कुल मिलाकर, केवल एक एकल नियमित गुहा, एक एकल आंतरिक सेल क्लस्टर, 150-250 μm से लेकर एक समग्र आकार वाली संरचनाओं, जिसमें तीन ब्लास्टोसिस्ट वंशों के ट्रांसक्रिप्टोमिक एनालॉग शामिल हैं, और बड़े पैमाने पर अन्य वंशों से रहित (जैसे, एमनियन, मेसोडर्म, एक्स्ट्राइम्ब्रायोनिक मेसोडर्म) को मानव ब्लास्टोइड के रूप में माना जाता है।

Figure 1
चित्र 1: उच्च-निष्ठा वाले ब्लास्टोइड उत्पन्न करने के लिए चार विशेषताएं और दो दृष्टिकोण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ब्लास्टोइड और ट्रोफोस्फीयर भोले एचपीएससी के समुच्चय से व्युत्पन्न। (ए) चरण-विपरीत छवियां पीएक्सजीएल माध्यम में संवर्धित भोले एचपीएससी को विकिरणित एमईएफ के साथ सह-सुसंस्कृत दिखाती हैं। (बी) चरण-विपरीत छवियां 500 एनएम एलपीए (पल्ली माध्यम) के साथ एक गैर-पक्षपाती हाइड्रोगेल माइक्रोवेल सरणी पर सुसंस्कृत भोले एचपीएससी समुच्चय के रूपात्मक परिवर्तन को दिखाती हैं। स्केल बार: 200 μm (सी) मानव ब्लास्टोइड्स 96 घंटे के बाद एक माइक्रोवेल सरणी पर गठित। (डी) विभिन्न भोले एचपीएससी लाइनों (एन = 3 माइक्रोवेल सरणियों) से अनुकूलित एलपीए एकाग्रता के साथ पैली संस्कृति की स्थिति द्वारा प्रेरित मानव ब्लास्टोइड युक्त माइक्रोवेल के प्रतिशत का परिमाणीकरण। (ई) एपिब्लास्ट (ईपीआई) मार्करों (पीला) नैनोग और ओसीटी 4 के साथ मानव ब्लास्टोइड्स के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला; टीई मार्कर (सियान) सीडीएक्स 2 और जीएटीए 3; और आदिम एंडोडर्म मार्कर (मैजेंटा) एसओएक्स 17 और जीएटीए 4। स्केल बार: 100 μm (एच-आई) सेल संख्या (बाएं) की मात्रा का ठहराव और ओसीटी 4, जीएटीए 3 और जीएटीए 4 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के आधार पर ब्लास्टॉइड (96 एच) में प्रत्येक वंश से संबंधित कोशिकाओं (दाएं) का प्रतिशत। (जी) सीडीएक्स 2 (सियान) और एनआर 2 एफ 2 (मैजेंटा) के लिए मानव ब्लास्टोइड्स के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला। (एफ) माइक्रोवेल सरणी पर प्रारंभिक और देर से चरण ट्रोफोस्फीयर की चरण-विपरीत छवियां क्रमशः 3 μM एससी 144 (एच) या 2 μM XMU-MP-1 (I) के अलावा प्रेरित होती हैं। (जे) चरण-विपरीत छवियां 500 एनएम एलपीए (पाली माध्यम) के साथ अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 96 अच्छी तरह से प्लेट में सुसंस्कृत भोले एचपीएससी समुच्चय के रूपात्मक परिवर्तन को दिखाती हैं। (के) चरण-विपरीत छवि (बाएं) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला (दाएं) ओसीटी 4 (पीला), जीएटीए 3 (सियान), और जीएटीए 4 (मैजेंटा) के लिए 6 दिनों के लिए पोस्टइम्प्लांटेशन संस्कृति की स्थिति में उगाए गए ब्लास्टॉइड में। स्केल बार: 100 μm. यह आंकड़ा 6,10 से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एकल सेल अनुक्रमण द्वारा ब्लास्टोइड्स की संरचना की विशेषता। (ए) ब्लास्टोइड (24 घंटे, 60 एच, 96 एच), भोले एचपीएससी, प्राइमेड एचपीएससी, और एचटीएससी (पोस्ट-इम्प्लांटेशन साइटोट्रोफोब्लास्ट का प्रतिनिधित्व करते हैं) के विभिन्न समय बिंदुओं से व्युत्पन्न एकल कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्टोम के यूएमएपी पर विभिन्न मापदंडों के साथ असुरक्षित क्लस्टरिंग विश्लेषण। (बी) ब्लास्टोइड (96 एच), भोले एचपीएससी, और प्राइमेड एचपीएससी से व्युत्पन्न कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्टम का यूएमएपी पूर्व-आरोपण, पेरी-इम्प्लांटेशन (इन विट्रो सुसंस्कृत ब्लास्टोसिस्ट में), और गैस्ट्रुलेशन (कार्नेगी चरण 7, यानी, ई 16-19 के बीच) चरणों के मानव भ्रूण से प्रकाशित डेटा सेट के साथ एकीकृत है। व्यक्तिगत कोशिकाओं को मानव भ्रूण (बाएं), ब्लास्टोइड-व्युत्पन्न कोशिकाओं या स्टेम कोशिकाओं (मध्य) में उनकी उत्पत्ति के आधार पर रंग दिया जाता है, और असुरक्षित क्लस्टरिंग विश्लेषण (दाएं) के परिणाम स्वरूप। (सी) ब्लास्टोइड्स, भोले एचपीएससी, प्राइमेड एचपीएससी से व्युत्पन्न कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्टम के यूएमएपी, और गैस्ट्रुलेशन (कार्नेगी चरण 7, यानी, ई 16-19 के बीच) चरण भ्रूण से सेट प्रकाशित डेटा के साथ एकीकृत। व्यक्तिगत कोशिकाओं को मानव भ्रूण (बाएं), ब्लास्टोइड-व्युत्पन्न कोशिकाओं या स्टेम कोशिकाओं (मध्य) में उनकी उत्पत्ति के आधार पर रंग दिया जाता है, और असुरक्षित क्लस्टरिंग विश्लेषण (दाएं) के परिणाम स्वरूप। यह आंकड़ा6 से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली सभी मीडिया संरचना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

वर्तमान अध्ययन में, हम दिखाते हैं, कदम से कदम, एक सरल और मजबूत प्रोटोकॉल का उपयोग करके उच्च क्षमता के साथ मानव ब्लास्टोइड ्स को कैसे स्थापित किया जाए। भोले पीएक्सजीएल एचपीएससी और उनके ट्रिपल अवरोध के एकत्रीकरण पर, ब्लास्टोइड कुशलतापूर्वक (> 70%) बनते हैं और क्रमिक रूप से 4 दिनों के भीतर 3 ब्लास्टोसिस्ट एनालॉग उत्पन्न करते हैं। ब्लास्टोइड्स की दक्षता और गुणवत्ता में सीमाएं (उदाहरण के लिए, ऑफ-टारगेट कोशिकाओं की उपस्थिति) हो सकती हैं यदि प्रारंभिक स्थिति उप-इष्टतम है। ध्यान दें, हमने मापा है कि पीएक्सजीएल एचपीएससी में लगभग 5% कोशिकाएं होती हैं जो पोस्ट-इम्प्लांटेशन चरणों को दर्शाती हैं। ये कोशिकाएं उच्च गुणवत्ता वाले ब्लास्टोइड्स के गठन को सीमित कर सकती हैं। प्रारंभिक भोले पीएक्सजीएल राज्य से परे जो ब्लास्टोसिस्ट एपिब्लास्ट को दर्शाता है, एक और निर्णायक कारक ब्लास्टोइड गठन के लिए उपयोग किया जाने वाला माध्यम है। तेजी से ब्लास्टोसिस्ट जैसी कोशिकाओं को बनाने और ऑफ-टारगेट, पोस्ट-इम्प्लांटेशन जैसी कोशिकाओं के गठन को रोकने के लिए, हम प्रस्ताव करते हैं कि ट्रिपल पाथवे निषेध (हिप्पो, ईआरके, टीजीएफ -β) आवश्यक है। टीजीएफ-β निषेध (आमतौर पर लगभग 10% -20%) पर ब्लास्टॉइड की अलग-अलग पैदावार देते हैं, एलपीए के संपर्क में आने के परिणामस्वरूप सख्त मॉर्फोमेट्रिक और वंश विनिर्देश मानदंडों का उपयोग करते हुए सभी सेल लाइनों में समान रूप से उच्च ब्लास्टोइड उपज का गठन होता है। एलपीए संभवतः हिप्पो मार्ग के निषेध पर कार्य करता है, जो माउस और मानव 8,51 में एपिब्लास्ट और ट्रॉफेक्टोडर्म वंशावली के बीच पहले वंश अलगाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एलपीए द्वारा ब्लास्टोइड दक्षता के महत्वपूर्ण सुधार से पता चलता है कि ब्लास्टोसिस्ट में खेलने पर हिप्पो पाथवे-मध्यस्थता वाले आंतरिक-बाहरी सेल विनिर्देश तंत्र को ब्लास्टोइड गठन के दौरान सह-चुना जाता है। एक वर्तमान सीमा इस तथ्य में निहित है कि, समय-समतुल्य दिन 7-13 (ब्लास्टोसिस्ट / ब्लास्टोइड गठन के बाद) में मानव ब्लास्टोसिस्ट या ब्लास्टोइड्स को संस्कृति के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल की उप-इष्टतमता के कारण, हम यह आकलन करने में सक्षम नहीं हैं कि हम किस हद तक पोस्ट-इम्प्लांटेशन विकास को ठीक से मॉडल कर सकते हैं।

ब्लास्टोइड कोशिकाओं की ट्रांसक्रिप्टोमिक स्थिति का विश्लेषण आसानी से एससीआरएनएसेक, पर्याप्त संदर्भ मानचित्र और जैव सूचना विज्ञान विधियों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। इससे पहले, ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण से पता चला है कि पीएक्सजीएल में सुसंस्कृत एचपीएससी प्राइमेड राज्य की तुलना में ब्लास्टोसिस्ट एपिब्लास्ट के समान हैं। डेटा के विश्लेषण में सीमाएं तब हो सकती हैं जब संदर्भ मानचित्र में केवल ब्लास्टोसिस्ट-चरण कोशिकाएं शामिल हों। संदर्भ मानचित्र में संभावित ऑफ-टारगेट कोशिकाओं की उपस्थिति का आकलन करने के लिए पोस्ट-इम्प्लांटेशन भ्रूण से उत्पन्न कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए। भविष्य में, ब्लास्टोइड कोशिकाओं को बेंचमार्क करने के लिए, पूर्व और बाद के आरोपण मानव अवधारणा के सभी ऊतकों सहित एक संदर्भ मानचित्र बेहद मूल्यवान होगा। इसके अलावा, मल्टी-ओमिक्स एकल सेल संदर्भ मानचित्र, उदाहरण के लिए ट्रांसक्रिप्टोम, क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी और डीएनए मिथाइलेशन सहित, आगे मदद करेंगे। अंत में, भ्रूण मॉडल और संदर्भ अवधारणा से कोशिकाओं के बीच समानता का मात्रात्मक आकलन करने के लिए मानकीकृत जैव सूचना विज्ञान विधियों, और सकारात्मक रूप से ऑफ-टारगेट कोशिकाओं की पहचान करने के लिए आगे निष्पक्ष रूप से विश्लेषण और परिणामों की तुलना करने में मदद मिलेगी।

कुल मिलाकर, हिप्पो, टीजीएफ -β, और ईआरके मार्गों के ट्रिपल निषेध द्वारा गठित ब्लास्टोइड्स में 1) अत्यधिक कुशल मॉर्फोजेनेसिस, 2) वंश विनिर्देश का सही अनुक्रम, 3) ट्रांसक्रिप्टोम स्तर पर ब्लास्टोसिस्ट जैसी कोशिकाओं की उच्च शुद्धता, 4) पेरी-इम्प्लांटेशन विकास को मॉडल करने की क्षमता की चार विशेषताएं हैं। ब्लास्टोइड्स की ये विशेषताएं ब्लास्टोसिस्ट विकास और आरोपण पर परिकल्पनाओं के निर्माण की सुविधा प्रदान करेंगी, हालांकि, वे भ्रूण के विकास के पहले चरणों को पुन: प्राप्त नहीं करते हैं। मानव ब्लास्टोसिस्ट की सीमित पहुंच और बहुमुखी प्रतिभा के विपरीत, ब्लास्टोइड्स ब्लास्टोसिस्ट विकास और आरोपण की कार्यात्मक जांच के लिए आनुवंशिक और दवा स्क्रीन के लिए उत्तरदायी हैं। भविष्य में, इस तरह के बुनियादी ज्ञान आईवीएफ मीडिया फॉर्मूलेशन में सुधार, निषेचन के बाद गर्भ निरोधकों को विकसित करने और प्रारंभिक गर्भावस्था के बेहतर प्रबंधन में योगदान दे सकते हैं।

Disclosures

आण्विक जैव प्रौद्योगिकी संस्थान, ऑस्ट्रियाई एकेडमी ऑफ साइंसेज ने मानव ब्लास्टोइड गठन और ब्लास्टोइड-एंडोमेट्रियम इंटरैक्शन परख के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हुए एक पेटेंट आवेदन ईपी 21151455.9 दायर किया है। एचके, एजे, एचएचके और एनआर इस पेटेंट के आविष्कारक हैं। अन्य सभी लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (ईआरसी-सह अनुदान समझौते संख्या 101002317 'ब्लास्टोइड: प्रारंभिक मानव भ्रूणजनन के लिए एक खोज मंच') के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से धन प्राप्त हुआ है। एचएचके ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (एफडब्ल्यूएफ), लिसे मेटनर प्रोग्राम एम 3131-बी द्वारा समर्थित है। हम एच 9 और एच 9-जीएफपी सेल लाइनों को साझा करने के लिए यासुहिरो ताकाशिमा और एचएनईएस 1, शेफ 6, एनआईपीएससी 16.2 बी और सीआर-एनसीआरएम 2 सेल लाइनों को साझा करने के लिए ऑस्टिन स्मिथ, पीटर एंड्रयूज और जीई गुओ को धन्यवाद देते हैं। एंडोमेट्रियल ऑर्गेनोइड्स साझा करने के लिए हम हुसैन बहारवंद को धन्यवाद देते हैं। हम पीआरई विभेदित कोशिकाओं और एनईएनडी कोशिकाओं से अलग आरएनए साझा करने के लिए जोशुआ एम ब्रिकमैन को धन्यवाद देते हैं। हम पेरी-गैस्ट्रुलेशन भ्रूण के एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण डेटा को साझा करने के लिए शंकर श्रीनिवास को धन्यवाद देते हैं। हम SMARTSeq2 पुस्तकालय की तैयारी के लिए तकनीकी सहायता के लिए अलेक्सैंड बायकोव और लुइसा कोचेला को धन्यवाद देते हैं। हम महत्वपूर्ण सहायता के लिए आईएमबीए में एनजीएस, बायोऑप्टिक और स्टेम सेल सुविधा को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal media in house
DMEM/F12 in house
100X N2 supplemen Gibco 17502048
50X B27 supplement Gibco 17504044
100X Glutamax Gibco 35050038
100 mM Sodium Pyruvate Gibco 11360039
MEM-Non-essential amino acids Gibco 11140050
1 M Hepes in house
50 mM 2-Mercaptoethanol Thermofisher 31350010
100X Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P0781
Bovine Serum Albumin solution Sigma-Aldrich A7979
PD0325901 Medchem express HY-10254
XAV-939 Medchem express HY-15147
Gö 6983 Medchem express HY-13689
Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor in house
A83-01 Medchem express HY-10432
1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) Peprotech 2256236
Y-27632 Medchem express HY-10583
CMRL medium Gibco 21530027
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermofisher 10-828-028
Accutase Biozym B423201 cell detachment solution
Geltrex Thermofisher A1413302 growth factor basement membrane extract
TROP2 antibody R&D systems MAB650
PDGFRα antibody R&D systems AF307
SC-144 Axon 2324
XMU-MP-1 Med Chem Express HY-100526
Matrigel basement membrane matrix
Countess cell counting chamber slides Thermo fisher cell counting slides
DAPI Staining Solution Miltenyi Biotec 130-111-570

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rivron, N., et al. Debate ethics of embryo models from stem cells. Nature. 564 (7735), 183-185 (2018).
  2. Hyun, I., Munsie, M., Pera, M. F., Rivron, N. C., Rossant, J. Toward Guidelines for Research on Human Embryo Models Formed from Stem Cells. Stem Cell Reports. 14 (2), 169-174 (2020).
  3. Clark, A. T., et al. Human embryo research, stem cell-derived embryo models and in vitro gametogenesis: Considerations leading to the revised ISSCR guidelines. Stem Cell Reports. 16 (6), 1416-1424 (2021).
  4. Lovell-Badge, R., et al. ISSCR Guidelines for Stem Cell Research and Clinical Translation: The 2021 update. Stem Cell Reports. 16 (6), 1398-1408 (2021).
  5. Rivron, N. C., et al. Blastocyst-like structures generated solely from stem cells. Nature. 557 (7703), 106-111 (2018).
  6. Kagawa, H., et al. Human blastoids model blastocyst development and implantation. Nature. , 04267-04268 (2021).
  7. Meistermann, D., et al. Integrated pseudotime analysis of human pre-implantation embryo single-cell transcriptomes reveals the dynamics of lineage specification. Cell Stem Cell. 28 (9), 1625-1640 (2021).
  8. Gerri, C., et al. Initiation of a conserved trophectoderm program in human, cow and mouse embryos. Nature. 587 (7834), 443-447 (2020).
  9. Gerri, C., Menchero, S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. A., Niakan, K. K. Human Embryogenesis: A Comparative Perspective. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 411-440 (2020).
  10. Zhao, C., et al. Reprogrammed iBlastoids contain amnion-like cells but not trophectoderm. bioRxiv. , 2021.05.07.442980 (2021).
  11. Zijlmans, D. W. Integrated multi-omics reveal polycomb repressive complex 2 restricts human trophoblast induction. Nat. Cell Biol. 24, 858-871 (2022).
  12. Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).
  13. Guo, G., et al. Epigenetic resetting of human pluripotency. Development. 144 (15), Cambridge, England. 2748-2763 (2017).
  14. Takashima, Y., et al. Resetting transcription factor control circuitry toward ground-state pluripotency in human. Cell. 158 (6), 1254-1269 (2014).
  15. Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), New York, N.Y. 1145-1147 (1998).
  16. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  17. Stirparo, G. G., et al. Integrated analysis of single-cell embryo data yields a unified transcriptome signature for the human pre-implantation epiblast. Development. 145 (3), Cambridge, England. 158501 (2018).
  18. Castel, G., et al. Induction of Human Trophoblast Stem Cells from Somatic Cells and Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 33 (8), 108419 (2020).
  19. Posfai, E., et al. Evaluating totipotency using criteria of increasing stringency. Nature Cell Biology. 23 (1), 49-60 (2021).
  20. Nakamura, T., et al. A developmental coordinate of pluripotency among mice, monkeys and humans. Nature. 537 (7618), 57-62 (2016).
  21. Theunissen, T. W., et al. Molecular Criteria for Defining the Naive Human Pluripotent State. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
  22. Guo, G., et al. Naive Pluripotent Stem Cells Derived Directly from Isolated Cells of the Human Inner Cell Mass. Stem Cell Reports. 6 (4), 437-446 (2016).
  23. Rossant, J. Genetic Control of Early Cell Lineages in the Mammalian Embryo. Annual Review of Genetics. 52, 185-201 (2018).
  24. De Paepe, C., et al. Human trophectoderm cells are not yet committed. Human reproduction. 28 (3), 740-749 (2013).
  25. Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 1212-1221 (2013).
  26. Io, S., et al. Capturing human trophoblast development with naive pluripotent stem cells in vitro. Cell Stem Cell. 28 (6), 1023-1039 (2021).
  27. Guo, G., et al. Human naive epiblast cells possess unrestricted lineage potential. Cell Stem Cell. 28 (6), 1040-1056 (2021).
  28. Liu, X., et al. Modelling human blastocysts by reprogramming fibroblasts into iBlastoids. Nature. 591 (7851), 627-632 (2021).
  29. Hirate, Y., et al. Polarity-dependent distribution of angiomotin localizes Hippo signaling in preimplantation embryos. Current biology: CB. 23 (13), 1181-1194 (2013).
  30. Cockburn, K., Biechele, S., Garner, J., Rossant, J. The Hippo pathway member Nf2 is required for inner cell mass specification. Current Biology: CB. 23 (13), 1195-1201 (2013).
  31. Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature Biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
  32. Krendl, C., et al. GATA2/3-TFAP2A/C transcription factor network couples human pluripotent stem cell differentiation to trophectoderm with repression of pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9579-9588 (2017).
  33. Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
  34. Horii, M., Bui, T., Touma, O., Cho, H. Y., Parast, M. M. An Improved Two-Step Protocol for Trophoblast Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 96 (2019).
  35. Okae, H., et al. Derivation of Human Trophoblast Stem Cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63 (2018).
  36. Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
  37. Kuijk, E. W., et al. The roles of FGF and MAP kinase signaling in the segregation of the epiblast and hypoblast cell lineages in bovine and human embryos. Development. 139 (5), Cambridge, England. 871-882 (2012).
  38. Roode, M., et al. Human hypoblast formation is not dependent on FGF signalling. Developmental Biology. 361 (2), 358-363 (2012).
  39. Linneberg-Agerholm, M., et al. Naïve human pluripotent stem cells respond to Wnt, Nodal and LIF signalling to produce expandable naïve extra-embryonic endoderm. Development. 146 (24), Cambridge, England. (2019).
  40. Yu, L., et al. Blastocyst-like structures generated from human pluripotent stem cells. Nature. 591 (7851), 620-626 (2021).
  41. Yanagida, A., et al. Naive stem cell blastocyst model captures human embryo lineage segregation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1016-1022 (2021).
  42. Zappia, L., Oshlack, A. Clustering trees: a visualization for evaluating clusterings at multiple resolutions. GigaScience. 7 (7), (2018).
  43. Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  44. Messmer, T., et al. Transcriptional Heterogeneity in Naive and Primed Human Pluripotent Stem Cells at Single-Cell Resolution. Cell Reports. 26 (4), 815-824 (2019).
  45. Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
  46. Petropoulos, S., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Lineage and X Chromosome Dynamics in Human Preimplantation Embryos. Cell. 167 (1), 285 (2016).
  47. Tyser, R. C. V., et al. A spatially resolved single cell atlas of human gastrulation. bioRxiv. , (2020).
  48. Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  49. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), Cambridge, England. 1775-1786 (2017).
  50. Ma, H., et al. In vitro culture of cynomolgus monkey embryos beyond early gastrulation. Science. 366 (6467), New York, N.Y. (2019).
  51. Nishioka, N., et al. The Hippo signaling pathway components Lats and Yap pattern Tead4 activity to distinguish mouse trophectoderm from inner cell mass. Developmental Cell. 16 (3), 398-410 (2009).

Tags

विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 186
मानव ब्लास्टोइड मॉडलिंग ब्लास्टोसिस्ट विकास और आरोपण के लिए प्रोटोकॉल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kagawa, H., Javali, A., Heidari… More

Kagawa, H., Javali, A., Heidari Khoei, H., Sommer, T. M., Sestini, G., Novatchkova, M., Scholte op Reimer, Y., Rivron, N. Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation. J. Vis. Exp. (186), e63388, doi:10.3791/63388 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter