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Das Gebiet der Strukturbiologie hat sich zu einem leistungsfähigen System entwickelt, um die Biologie durch die atomaren Details biomolekularer Strukturen zu verstehen, unser Verständnis der biochemischen Signalwege und der molekularen Grundlagen von Krankheiten zu bereichern und ein unverzichtbares Werkzeug für die translationale Forschung zu bieten.
Im Laufe der Jahre ist die Strukturbiologie weit über die Bereitstellung statischer Strukturen hinausgegangen und hat auch über molekulare Wechselwirkungen sowohl in Lösungen als auch in Zellen berichtet und Zeitskalen und Dynamik untersucht. Es können Informationen gewonnen werden, um Vorgänge auf verschiedenen Größenskalen zu erklären, nämlich von Atomen und einzelnen Molekülen bis hin zu ganzen Viruspartikeln und Zellen. Verschiedene Technologien bieten eine synergistische Reihe von experimentellen Ansätzen, einschließlich Streumethoden auf der Basis von Röntgenstrahlen, Neutronen oder Elektronen, z. B. Röntgenkristallographie (MX) oder Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS); Festkörper- und Lösungskernspinresonanz (NMR); und Einzelpartikelrekonstruktion mittels Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM). Methoden wie die Kryo-EM-Tomographie, die Kryo-Soft-Röntgentomographie und die In-Zell-NMR ergänzen dieses Arsenal an Ansätzen zur Untersuchung makromolekularer Systeme, insbesondere in Verbindung mit anderen bildgebenden Verfahren. Zusammen mit zusätzlichen biophysikalischen Methoden, die komplementäre Informationen über Affinitäten und Zeitskalen molekularer Wechselwirkungen liefern, bietet die integrative Strukturbiologie heute ein beeindruckendes Paket, um das Leben zu verstehen und Medikamente, Biologika (Antikörper, Nanobodies, Impfstoffe), Biomaterialien und andere biologische Wirkstoffe wie Enzyme zu entwickeln, die zum Abbau von Plastik und zur Unterstützung der Umwelt verwendet werden können.
Schon früh erkannte die Europäische Kommission (EK) den Nutzen, den die strukturbiologische Forschung für die Gesellschaft hat, und seit den 1980er Jahren investierte Europa stark in die kostenlose Öffnung teurer strukturbiologischer Geräte für die breitere wissenschaftliche Gemeinschaft. Diese Demokratisierung des Zugangs zu millionenschweren Einrichtungen war eine treibende Kraft und ein Eckpfeiler für die internationale Entwicklung des Bereichs der Strukturbiologie. Damit war Europa auf dem neuesten Stand der Technik, was einen starken Industriesektor ermöglichte und zur lokalen Wirtschaft beitrug.
Die EG pflegt eine lange und beeindruckende Tradition des Zugangs und der Ausbildung externer Forscher in strukturbiologischen Technologien. Nach dem erfolgreichen iNEXT-Programm (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research), das der Strukturbiologie bis Ende 2019 einen kostenlosen Zugang zu High-End-Einrichtungen und allen europäischen Forschern ermöglichte, startete im Februar 2020 das Horizon2020-Projekt iNEXT-Discovery für einen weiteren Zeitraum von vier Jahren mit vollständig finanziertem Zugang zu strukturbiologischen Infrastrukturen. Parallel dazu ist Instruct-ERIC ein Meilenstein des Europäischen Strategieforums für Forschungsinfrastrukturen und stellt eine nachhaltige Hochburg in der Strukturbiologie für die europäische und internationale wissenschaftliche Gemeinschaft dar. Gemeinsam streben sie danach, Biowissenschaftler und andere in die strukturbiologische Forschung einzubeziehen, und bieten dafür Forschern aus Wissenschaft und Industrie Zugang zu einigen der besten strukturbiologischen Fachkenntnisse, Technologien und Einrichtungen weltweit. Gemeinsam mit weiteren Partnern organisieren sie zudem Workshops und Hands-on-Trainings.
Aufgrund der Covid19-Pandemie sind die Reisen zu den Forschungseinrichtungen von iNEXT-Discovery und Instruct-ERIC weitgehend eingeschränkt, so dass praktische Schulungsmöglichkeiten im Wesentlichen ausgeschlossen sind. Um dies teilweise zu kompensieren, haben iNEXT-Discovery und Instruct-ERIC sowohl Webinar-Reihen (https://inext-discovery.eu/events/what-can-inext-discovery-do-for-us, https://instruct-eric.eu/content/instructeric-webinar-series-structure-meets-function) als auch diese Methoden-Sonderausgabe des Journal of Visuald Experiments organisiert. Hier finden Sie nicht nur detaillierte Beschreibungen für einige unserer gängigen Zugangsverfahren, sondern auch für spezialisierte Routinen, die sich im Bereich der integrativen Strukturbiologie in der Entwicklung befinden. Während unsere Methoden in dieser Ausgabe ausführlich beschrieben werden, erfordern einige Fachwissen und Ausrüstung, die vor Ort schwer zu etablieren sind. Die Instruct-ERIC- und iNEXT-Discovery-Einrichtungen stehen zur Verfügung, um diese Methoden bereitzustellen, einschließlich der Herstellung der Biomoleküle, die für Strukturstudien benötigt werden, mit Hilfe und Aufsicht von hochqualifiziertem lokalem Personal.
Verbesserte Methoden zur Bestimmung makromolekularer Strukturen
In den letzten zehn Jahren hat sich die Kryo-EM zu einer sehr populären Technologie zur Bestimmung makromolekularer komplexer Strukturen entwickelt. Das Team der Universität Leeds (UK) gibt einen Überblick über alle Schritte der Einzelpartikel-EM-Analyse und konzentriert sich dabei auf Variablen, die während des Arbeitsablaufs und der Fehlerbehebung bei häufigen Problemen optimiert werden können1. Da die Online-Bedienung des Mikroskops durch externe Benutzer zum Standard wird, sind Protokolle für eine effiziente Fernbedienung und Bildgebung erforderlich. Bei der Einzelpartikelanalyse werden verglaste Proben abgebildet, um Filme zu erzeugen, die Partikel in zufälligen Ausrichtungen zeigen. Ein Bildverarbeitungs-Workflow identifiziert die Parameter für die Rekonstruktion der zu untersuchenden Probe. Die Software Scipion von CSIC (ES) stellt alle Werkzeuge zur Erstellung dieses Workflows zur Verfügung und ermöglicht zudem eine einfache Nachvollziehbarkeit der Ergebnisse2.
Die Sammlung von Röntgenbeugungsdaten an sehr kleinen kristallinen Proben bietet sowohl große Forschungsmöglichkeiten als auch technische Herausforderungen. Das Team von Diamond (UK) stellt den Einsatz von Kryo-EM-Werkzeugen vor, um Hunderte von Mikrokristallen auf einem einzigen Gitter mit minimaler umgebender Flüssigkeit auf einem rauscharmen Träger zu präparieren, bevor Daten in einer speziellen Beamline-Umgebung gesammelt werden, die ein Vakuum im Röntgengang vor und nach der Probe umfasst3. Die serielle Erfassung von Röntgendaten in Synchrotronen ist auch ein Schlüssel für die Untersuchung anderer schwieriger kristalliner Systeme. In einem weiteren Beitrag zeigt Diamond anhand einer Reihe von Beispielen Schritt-für-Schritt-Anleitungen, Abbildungen und Videos für die Datenerfassung mit einer Vielzahl von Kristallabgabesystemen4.
Moderne integrative Strukturbiologie in der Wirkstoffforschung
Die Röntgenkristallographie ist für die fragmentbasierte Wirkstoffforschung etabliert und wird bereits häufig zur Identifizierung von Treffern eingesetzt, die sich reibungslos auf Leitkandidaten entwickeln lassen. Teams von Diamond5, Helmholtz-Zentrum Berlin (DE) und MAX IV (SE)6 sowie der EMBL-Einheit Grenoble (FR)7 beschreiben ihre neuesten Entwicklungen bei der Automatisierung von Arbeitsabläufen für eine effiziente Zielkristallisation, Fragmenteinweichung, Kristalleinbettung, kristallographisches Fragmentscreening und Strukturabscheidung. Ihre Pipelines sind weitgehend automatisiert und werden von externen Forschern weltweit genutzt. Sie wurden bereits auf mehr als 100 Targets (oft aus der Ferne) angewendet, um Treffer für das weitere Wirkstoffdesign und die strukturgestützte Leitstrukturentwicklung zu identifizieren.
NMR wird auch häufig für das Fragment-Screening in Arzneimittelentwicklungskampagnen verwendet, das entweder auf Proteine oder Polynukleotide abzielt, die entweder löslich oder membrangebunden sind. Die Goethe-Universität in Frankfurt (DE) stellt optimierte NMR-Screening-Pipelines vor, die manuelle Eingriffe bei Experimenten und Analysen reduzieren8. Ihre Probenwechsler verarbeiten Hunderte von NMR-Proben in einem einzigen Lauf während mehrerer Tage ununterbrochener Experimente und automatisierter Analysen.
Darüber hinaus ergänzen biophysikalische Methoden Röntgen und NMR. Das Team des Netherlands Cancer Institute (NL) stellt einen Arbeitsablauf vor, bei dem nanodifferentielle Scanning-Kalorimetrie für Thermoshift-Assays verwendet wird, um Änderungen der Zielschmelztemperatur nach Zugabe von Fragmentenzu messen 9. Den Voraussetzungen hinsichtlich der Proteinqualität und -konzentration folgt ein Analyseprotokoll für die Versuchsplanung, Datenerhebung und Analyse.
Auf dem Weg zur zellulären Strukturbiologie
Die Kryo-Elektronentomographie ist oft die Methode der Wahl, um makromolekulare Komplexe in Zellen zu untersuchen. Bilder von vitrifizierten Proben werden in verschiedenen Neigungswinkeln aufgenommen und ein 3D-Tomogramm rekonstruiert, aus dem Subvolumina extrahiert werden, um eine höhere Auflösung durch Sub-Tomogramm-Mittelung zu erhalten. Da Elektronen stark mit Materie wechselwirken, werden für solche Untersuchungen Proben mit einer Dicke von weniger als 200 nm benötigt. Das CEITEC-Team (CZ) stellt ein Protokoll10 zur Vorbereitung zellulärer Lamellen nach dem Einfrieren vor. Obwohl die Automatisierung in der Kryo-ET beeindruckende Fortschritte gemacht hat, sind Stunden der Datenerfassung erforderlich, bevor die Erfassung der Neigungsreihen stattfindet, und Ziele werden in der Regel immer noch durch visuelle Gitterinspektion identifiziert. Das EMBL Heidelberg (DE) erstellte ein Automatisierungsprotokoll zur Kartierung von Rastern und Rasterquadraten, zur Auswahl von Zielen und zur Einrichtung der Neigungsreihenerfassung11.
Die Synchrotrons ALBA (ES) und Diamond diskutieren gemeinsam die Tücken und Vorteile einer Alternative zur Kryo-EM-Tomographie, die die Untersuchung intakter Zellen ermöglicht, nämlich der Kryo-Soft-Röntgentomographie (Kryo-SXT)12. Die Anpassung superauflösender Techniken an kryogene Temperaturen ermöglicht eine korrelative Bildgebung mit Kryo-ET und Kryo-SXT. Darüber hinaus verdoppelt die Hochdurchsatz-Kryo-strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (Kryo-SIM) die Auflösung der herkömmlichen Fluoreszenz, was zur spezifischen Positionierung von Molekülen oder Strukturen in dicken Proben führt. Dies kann mit der Kryo-SXT korreliert werden, um spezifische Merkmale im zellulären Kontext zu lokalisieren13.
Das Team der Universität Utrecht (NL) berichtet über die Probenvorbereitung und hochempfindliche Festkörper-NMR-Experimente, die zur Untersuchung anspruchsvoller physiologischer Systeme verwendet werden können, einschließlich natürlicher Membranen und Protein-Lipid-Glykan-Systeme14. Darüber hinaus entwickelt sich die NMR in Zelllösungen rasant weiter, um funktionelle Prozesse aufzuklären. Das CERM/CIRMMP (IT)-Team beschreibt, wie Bioreaktoren zusammengebaut und betrieben werden, die die Wiederauffüllung von Nährstoffen und Sauerstoff für lebende Zellen in der NMR-Sonde im Kern eines Hochfeldmagneten15 ermöglichen. Dies ermöglicht erweiterte Messungen und zeitaufgelöste Experimente, z. B. zur Überwachung intrazellulärer Protein-Liganden-Wechselwirkungen.
Schlusswort
Diese JoVE-Ausgabe widmet sich ausschließlich den jüngsten Entwicklungen und Anwendungen der Strukturbiologie in europäischen Forschungsinfrastrukturen. Gemeinsam ermöglichen iNEXT-Discovery und Instruct-ERIC Strukturbiologie-Spezialisten, aber zunehmend auch nicht-spezialisierte Lebenswissenschaftler und andere Forscher, ihre Forschungsziele mit modernsten Dienstleistungen zu verfolgen.