Summary
DNA-gordijn, een high-throughput single-molecule beeldvormingstechniek, biedt een platform voor real-time visualisatie van diverse eiwit-DNA-interacties. Het huidige protocol maakt gebruik van de DNA-gordijntechniek om de biologische rol en het moleculaire mechanisme van Abo1 te onderzoeken, een Schizosaccharomyces pombe bromodomein-bevattend AAA+ ATPase.
Abstract
Chromatine is een structuur van hogere orde die eukaryotisch DNA verpakt. Chromatine ondergaat dynamische veranderingen afhankelijk van de fase van de celcyclus en als reactie op prikkels uit de omgeving. Deze veranderingen zijn essentieel voor genomische integriteit, epigenetische regulatie en DNA-metabole reacties zoals replicatie, transcriptie en reparatie. Chromatine-assemblage is cruciaal voor de chromatinedynamiek en wordt gekatalyseerd door histon-chaperonnes. Ondanks uitgebreide studies blijven de mechanismen waarmee histon-chaperonnes chromatine-assemblage mogelijk maken, ongrijpbaar. Bovendien worden de globale kenmerken van nucleosomen georganiseerd door histon-chaperonnes slecht begrepen. Om deze problemen aan te pakken, beschrijft dit werk een unieke beeldvormingstechniek met één molecuul, DNA-gordijn genaamd, die het onderzoek van de moleculaire details van nucleosoomassemblage door histon-chaperonnes vergemakkelijkt. DNA-gordijn is een hybride techniek die lipidevloeibaarheid, microfluïdica en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM) combineert om een universeel platform te bieden voor real-time beeldvorming van diverse eiwit-DNA-interacties. Met behulp van DNA-gordijn wordt de histon-chaperonnefunctie van Abo1, het Schizosaccharomyces pombe bromodomein-bevattende AAA+ ATPase, onderzocht en wordt het moleculaire mechanisme dat ten grondslag ligt aan histonassemblage van Abo1 onthuld. DNA-gordijn biedt een unieke benadering voor het bestuderen van chromatinedynamiek.
Introduction
Eukaryotisch DNA is verpakt in een structuur van hogere orde die bekend staat als chromatine 1,2. Nucleosoom is de fundamentele eenheid van chromatine, die bestaat uit ongeveer 147 bp DNA gewikkeld rond de octamere kernhistonen 3,4. Chromatine speelt een cruciale rol in eukaryote cellen; de compacte structuur beschermt bijvoorbeeld DNA tegen endogene factoren en exogene bedreigingen5. De chromatinestructuur verandert dynamisch afhankelijk van de fase van de celcyclus en omgevingsstimuli, en deze veranderingen regelen de toegang tot eiwitten tijdens DNA-transacties zoals replicatie, transcriptie en reparatie6. Chromatinedynamiek is ook belangrijk voor genomische stabiliteit en epigenetische informatie.
Chromatine wordt dynamisch gereguleerd door verschillende factoren, waaronder histonstaartmodificaties en chromatine-organisatoren zoals chromatine-remodelers, polycomb-groepeiwitten en histon-chaperonnes7. Histon-chaperonnes coördineren de assemblage en demontage van nucleosomen via afzetting of onthechting van kernhistonen 8,9. Defecten in histon-chaperonnes veroorzaken genoominstabiliteit en veroorzaken ontwikkelingsstoornissen en kanker 9,10. Verschillende histonchaperonnes hebben geen chemisch energieverbruik zoals ATP-hydrolyse nodig om nucleosomen te assembleren of te demonteren 9,11,12,13. Onlangs meldden onderzoekers dat broomdomein-bevattende AAA+ (ATPase geassocieerd met diverse cellulaire activiteiten) ATPases een rol spelen in de chromatinedynamiek als histonchaperonnes 14,15,16,17. Humaan ATAD2 (ATPase-familie AAA-domeinbevattend eiwit 2) bevordert de toegankelijkheid van chromatine om de genexpressie te verbeteren18. Als transcriptionele co-regulator reguleert ATAD2 het chromatine van oncogene transcriptionele factoren14, en de overexpressie van ATAD2 is gerelateerd aan een slechte prognose bij veel soorten kanker19. Yta7, de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) homoloog van ATAD2, verlaagt de nucleosoomdichtheid in chromatine15. Abo1 daarentegen, de Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) homoloog van ATAD2, verhoogt de nucleosoomdichtheid16. Met behulp van een unieke beeldvormingstechniek met één molecuul, DNA-gordijn, wordt nagegaan of Abo1 bijdraagt aan nucleosoomassemblage of -demontage17,20.
Traditioneel worden de biochemische eigenschappen van biomoleculen onderzocht door middel van bulkexperimenten zoals de elektroforetische mobiliteitsverschuivingstest (EMSA) of co-immunoprecipitatie (co-IP), waarbij een groot aantal moleculen wordt onderzocht en hun gemiddelde eigenschappen worden gekarakteriseerd21,22. In bulkexperimenten worden moleculaire subtoestanden versluierd door het ensemble-gemiddelde effect en zijn het onderzoeken van biomoleculaire interacties beperkt. Daarentegen omzeilen technieken met één molecuul de beperkingen van bulkexperimenten en maken ze de gedetailleerde karakterisering van biomoleculaire interacties mogelijk. In het bijzonder zijn beeldvormingstechnieken met één molecuul op grote schaal gebruikt om DNA-eiwit en eiwit-eiwitinteracties te bestuderen23. Een van die technieken is DNA-gordijn, een unieke beeldvormingstechniek met één molecuul op basis van microfluïdica en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM)24,25. In een DNA-gordijn zijn honderden individuele DNA-moleculen verankerd aan de lipidedubbellaag, die de tweedimensionale beweging van DNA-moleculen mogelijk maakt als gevolg van lipidevloeibaarheid. Wanneer hydrodynamische stroming wordt toegepast, bewegen DNA-moleculen langs de stroom op de dubbellaag en komen vast te zitten bij een diffusiebarrière, waar ze worden uitgelijnd en uitgerekt. Terwijl DNA wordt gekleurd met intercalerende middelen, worden fluorescerend gelabelde eiwitten geïnjecteerd en wordt TIRFM gebruikt om eiwit-DNA-interacties in realtime te visualiseren op een niveau van één molecuul23. Het DNA-gordijnplatform vergemakkelijkt de observatie van eiwitbewegingen zoals diffusie, translocatie en botsing 26,27,28. Bovendien kan DNA-gordijn worden gebruikt voor het in kaart brengen van eiwitten op DNA met gedefinieerde posities, oriëntaties en topologieën of worden toegepast op de studie van fasescheiding van eiwitten en nucleïnezuren 29,30,31.
In dit werk wordt de DNA-gordijntechniek gebruikt om bewijs te leveren voor de functie van chaperonnes door middel van directe visualisatie van specifieke eiwitten. Omdat DNA-gordijn een high-throughput-platform is, vergemakkelijkt het bovendien een mate van gegevensverzameling die voldoende is voor statistische betrouwbaarheid. Hier wordt beschreven hoe de DNA-gordijntest in detail kan worden uitgevoerd om de moleculaire rol van S. pombe bromodomein-bevattend AAA+ ATPase Abo1 te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de flowcel
- Bereid een gereinigd gesmolten silicaglaasje voor met nano-greppelpatronen volgens eerder gepubliceerd rapport25.
- Boor twee gaten met een diameter van 1 mm in een gereinigd gesmolten silicaglaasje (Figuur 1A) met behulp van een diamantboor (zie Tabel met materialen).
- Breng 250 nm dik aluminium (Al) aan op het objectglaasje met behulp van DC-sputter32 (zie Materiaaltabel) met 10 mTorr argongas.
- Spin-coat een 310 nm dikke laag van 4% 950K poly(methylmethacrylaat) (PMMA) (zie Materiaaltabel) bij 4.000 tpm gedurende 1 minuut en bak op een hete plaat bij 180 °C gedurende 3 min.
- Teken de nano-loopgraafpatronen op de PMMA-laag tussen de twee gaten met behulp van elektronenbundel (ebeam) lithografie33 met 0,724 nA stroom bij 80 kV.
OPMERKING: De architectuur en de afmetingen van de nano-loopgraafpatronen zijn weergegeven in figuur 1A. - Verwijder de aan de ebeam blootgestelde PMMA door de objectglaasjes gedurende 2 minuten in de ontwikkeloplossing te laten weken (1:3 verhouding van methylisobutylketon en isopropanol, zie Materiaaltabel).
- Ets Al-lagen met inductief gekoppelde plasmareactieve ionenets (ICP-RIE) met behulp van chloor (Cl2) en boortrichloride (BCl 3) gassen.
NOTITIE: Deze twee gassen kunnen de Al verwijderen uit gebieden die aan de straling zijn blootgesteld. - Snijd nano-sleuven op de objectglaasjes met behulp van zwaveltetrafluoride (SF4), tetrafluormethaan (CF4) en zuurstof (O2) gassen (zie Tabel met materialen).
- Verwijder de resterende Al-laag door de objectglaasjes gedurende 10 minuten in Al etsmiddel (AZ 300 MIF-ontwikkelaar, zie Materiaaltabel) te laten weken.
- Spoel de objectglaasjes na fabricage af met gedeïoniseerd water en sonificeer ze gedurende 30 minuten in aceton met behulp van een sonicator van het badtype.
- Reinig de objectglaasjes in 2% Hellmanex III-oplossing (zie Materiaaltabel) gedurende minimaal 1 dag met magnetisch roeren.
- Sonificeer de glaasjes achtereenvolgens in aceton gedurende 30 minuten en 1 M NaOH gedurende 30 minuten.
- Spoel de glaasjes af met gedeïoniseerd water en droog ze af met een stikstofgas (N2).
- Leg een schoon papier (5 mm x 35 mm) op het midden van dubbelzijdig plakband. Bevestig de tape over de dia om de twee gaatjes en de nanopatronen met het papier te bedekken.
- Snijd het papier weg met een schoon mes (Figuur 1A).
- Leg een glazen dekglaasje op de dubbelzijdige tape en wrijf met een pipetpunt over het dekglaasje om een microfluïdische kamer te vormen (Figuur 1A).
- Plaats de geassembleerde stroomcel tussen twee objectglaasjes en klem ze vast.
- Bak de flowcel 45 minuten in een vacuümoven van 120 °C.
- Bevestig de vloeistofconnector (Nanoport) voor de op chips gebaseerde analyses (zie Materiaaltabel) met een heet lijmpistool aan elk open gat en verbind de twee lijnen van Luer lock-slangen.
- Sluit een Luerlock-spuit met 3 ml gedeïoniseerd water aan en was de kamer.
- Was de kamer met 3 ml lipidenbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 en 100 mM NaCl) via de druppel-voor-druppel-aansluiting.
OPMERKING: Druppel-voor-druppel verbinding verbindt alle spuiten met de stroomcel om te voorkomen dat er luchtbellen in de kamer worden geïnjecteerd. - Injecteer 1 ml 0,04x gebiotinyleerd lipide in lipidenbuffer in de kamer in twee injecties met 5 minuten incubatie per injectie.
OPMERKING: De bereiding van 1x gebiotinyleerde lipidenvoorraad wordt beschreven in een eerder gepubliceerd rapport34. - Was de kamer met 3 ml lipidenbuffer en incubeer gedurende 20 minuten om de lipidedubbellaag op het objectglaasje te laten rijpen.
- Voeg 1 ml BSA-buffer toe (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2 en 0,2 mg/ml BSA) en incubeer gedurende 5 minuten om het objectglaasje te passiveren.
OPMERKING: Deze stap kan de niet-specifieke binding van eiwitten aan het objectglaasje verminderen. - Injecteer 0,025 mg/ml streptavidine in 1 ml BSA-buffer met twee injecties en 10 minuten incubatie per injectie.
- Spoel de resterende streptavidine uit met 3 ml BSA-buffer.
- Injecteer ~300 pM (30 μL) gebiotinyleerd lambdafaag-DNA in 1 ml BSA-buffer in de kamer met twee injecties en 10 minuten incubatie per opname.
OPMERKING: De bereiding van gebiotinyleerd lambda-DNA wordt beschreven in een eerder gepubliceerd rapport34.
2. Stroomcel aansluiten op het microfluïdische systeem en op de microscoop laden
- Bereid Abo1-beeldvormingsbuffer voor (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1,6% glucose en 0,1x gloxy, zie Tabel met materialen).
OPMERKING: Gloxy is een zuurstofopvangsysteem dat het fotobleken van fluorescerende kleurstoffen vermindert. De bereiding van 100x gloxy bouillon met glucoseoxidase en catalase wordt beschreven in referentie35. - Sluit een spuit met 10 ml beeldvormingsbuffer aan op een spuitpomp en verwijder luchtbellen in alle slangleidingen in het microfluïdische systeem.
- Koppel de voorbereide flowcel aan het microfluïdische systeem via een drop-to-drop-verbinding om te voorkomen dat er bellen in de flowcel worden geïnjecteerd (Figuur 1B).
- Monteer de flowcel en flowcelhouders en monteer het geheel op een op maat gemaakte TIRF-microscoop (Figuur 1C).
LET OP: Wanneer de flowcel onder de microscoop wordt geplaatst, stelt u zorgvuldig de hoogte van de objectieflens in. De stroomcel mag de objectieflens niet raken. Dit kan de lens beschadigen. - Druppelindex bijpassende olie op het midden van de stroomcel en plaats een op maat gemaakt duifprisma (zie Materiaaltabel) op de oliedruppel.
3. Histon-assemblage door Abo1 met behulp van DNA-gordijn
- Meng 5 nM Abo1 en 12,5 nM Cy5-gelabeld H3-H4-histondimeer (Cy5-H3-H4) (zie Materiaaltabel) in 150 μL beeldbuffer. Alle eiwitten werden bereid volgens eerder gepubliceerd rapport17.
- Incubeer het mengsel 15 minuten op ijs.
OPMERKING: Om fotobleken van Cy5 te voorkomen, moet de incubatie in het donker gebeuren. - Injecteer ~20 pM (2 μL) YOYO-1-kleurstof in beeldvormingsbuffer door een monsterlus van 100 μL om lambda-DNA-moleculen te kleuren.
- Voer beeldvormingssoftware uit (zie Tabel met materialen) en zet de 488 nm-laser aan om te controleren of DNA-gordijnen goed gevormd zijn.
OPMERKING: Als DNA-gordijnen goed gevormd zijn, worden de DNA-moleculen, die zijn gekleurd met YOYO-1, weergegeven als uitgelijnde lijnen bij een barrière in aanwezigheid van stroming. De uitgerekte lijnen deinzen terug en diffunderen weg van de barrière wanneer de stroom wordt uitgeschakeld. - Injecteer 2 ml buffer met een hoog zoutgehalte (200 mM NaCl en 40 mM MgCl2) om de kleurstof YOYO-1 uit het DNA te verwijderen.
- Nadat de kleurstof YOYO-1 is verwijderd, injecteert u het vooraf geïncubeerde eiwitmonster.
- Wanneer de eiwitten het DNA-gordijn bereiken, zet u de spuitpomp uit, schakelt u de afsluiter uit en incubeert u 15 minuten voor het laden van histon door Abo1.
- Spoel de ongebonden Abo1- en histon-eiwitten gedurende 5 minuten uit.
- Schakel de afsluiter in en hervat de stroominjectie.
- Schakel de 637 nm-laser in en breng de fluorescerende eiwitten in beeld terwijl de bufferstroom is ingeschakeld.
- Schakel tijdelijk de bufferstroom uit om te controleren of histon-eiwitten op DNA zijn geladen (Figuur 2C).
- Verzamel DNA-gordijnbeelden met een beeldacquisitieprogramma (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Wanneer de bufferstroom tijdelijk stopt, deinst DNA terug uit het vluchtige veld van totale interne reflectie en verdwijnen fluorescerend gelabelde eiwitten die aan DNA zijn gebonden.
4. Data-analyse
- Zet de foto's die door het beeldacquisitieprogramma zijn gemaakt om in TIFF-formaat als beeldsequenties.
OPMERKING: Alle gegevens zijn geanalyseerd met behulp van afbeelding J (NIH) zoals beschreven in referentie20. - Kies een enkel DNA-molecuul uit de beeldsequenties en teken een kymograaf.
OPMERKING: De kymograaf kan de verandering in fluorescentie-intensiteit van elk histon-eiwit dat aan een enkel DNA-molecuul is gebonden, laten zien als functie van de tijd. - Maak het fluorescentie-intensiteitsprofiel van de kymograaf en pas het aan met meerdere Gaussiaanse functies.
- Verzamel de middelste coördinaten van pieken uit het fluorescentie-intensiteitsprofiel. In deze stap kan de minimale intensiteit van histonfluorescentie worden verkregen.
- Deel alle piekintensiteiten die uit de profielen zijn verzameld door de minimale intensiteit. Het aantal H3-H4-dimeren dat aan DNA is gebonden, wordt in deze stap geschat.
- Voer stap 4.2-4.5 uit voor andere DNA-moleculen.
- Maak een histogram voor de bindingsverdeling van H3-H4-dimeren met een opslaglocatiegrootte van 1 kbp. Het aantal geanalyseerde moleculen is minimaal 300.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit werk beschrijft de procedure voor de voorbereiding van flowcellen voor de DNA-gordijntest (Figuur 1A). De DNA-gordijntest vergemakkelijkte de studie van histon H3-H4-dimeerassemblage op DNA door Abo1. Eerst werd de vorming van DNA-gordijnen gecontroleerd door DNA-moleculen te kleuren met YOYO-1, een intercalerende kleurstof. Groene lijnen werden getoond in parallelle arrays, wat aangeeft dat YOYO-1 intercaleerde in DNA-moleculen, die goed uitgelijnd waren en uitgerekt waren bij een diffusiebarrière onder hydrodynamische stroming (Figuur 2A). Om uit te sluiten dat YOYO-1 de interactie van DNA en histon-eiwitten belemmert, werd YOYO-1 verwijderd uit DNA met een hoge zoutbuffer voordat histon-eiwitten werden toegevoegd. Wanneer Cy5-H3-H4-dimeren in het DNA-gordijn werden geïnjecteerd in afwezigheid van Abo1, bindde Cy5-H3-H4 niet aan DNA, wat wijst op een gebrek aan spontane binding van H3-H4-dimeren aan DNA (Figuur 2B). Toen Cy5-H3-H4 werd geïnjecteerd met Abo1, werden rode fluorescerende puncta gezien op DNA-moleculen, wat suggereert dat Abo1 H3-H4-dimeren op DNA laadt (Figuur 2C). De bufferstroom werd tijdelijk uitgeschakeld om ervoor te zorgen dat Cy5-H3-H4-dimeren zich niet aan het objectglaasje binden terwijl ze aan DNA binden. Toen de stroom werd uitgeschakeld, verdwenen fluorescerend gelabelde eiwitten die aan DNA waren gebonden omdat DNA-moleculen terugdeinsden voor het vergankelijke veld. Daarentegen bleven de eiwitten die aan het oppervlak werden geadsorbeerd hetzelfde. De fluorescerende signalen verdwenen bij afwezigheid van stroming en verschenen weer toen de stroom werd hervat, wat suggereert dat H3-H4-dimeren binden aan DNA (Figuur 2C). De binding van H3-H4-dimeren aan DNA werd ook bevestigd door de kymograaf, waarbij de fluorescentiesignalen verdwenen wanneer de stroom werd uitgeschakeld (Figuur 2D). Omdat Abo1 een AAA+ ATPase is, werd het effect van ATP-hydrolyse op de histonbelastingsactiviteit van Abo1 onderzocht16. Er verschenen weinig fluorescerende puncta in het DNA-gordijn, hetzij in afwezigheid van nucleotide (Apo) of in aanwezigheid van ADP (Figuur 2E), wat aangeeft dat H3-H4-dimeren zelden binden aan DNA, noch in de Apo-toestand, noch in aanwezigheid van ADP. Figuur 2F toont kwantitatieve analyses van figuur 2B,C en figuur 2E, waaruit blijkt dat het aantal H3-H4-dimeren gebonden aan DNA toeneemt in aanwezigheid van ATP. De resultaten suggereren dat ATP-hydrolyse essentieel is voor H3-H4-lading op DNA door Abo1 (Figuur 2E,F).
Vervolgens werd getest of Abo1 histonen bij voorkeur laadt met de Widom 601-sequentie, die een tien keer hogere bindingsaffiniteit heeft met histonen dan willekeurige sequenties in vitro, ook al hebben nucleosomen geen specificiteit voor de Widom 601-sequentie in vivo 36,37,38,39,40. Het DNA-gordijn is gevormd met lambda-DNA dat Widom 601-herhalingen aan één uiteinde of inwendig bevat (Figuur 3A,B). Het bindingslandschap van H3-H4-dimeren op elk DNA-construct werd verkregen (Figuur 3C,D). De bindingslocatie van Cy5-H3-H4 werd geschat op basis van de middenpositie van de 2D Gaussiaanse fitting voor elk fluorescerend punctum17,41. Als de H3-H4-laadactiviteit van Abo1 afhangt van de DNA-sequentie, dan zou de bindingsverdeling scheef zijn in de richting van de Widom 601-sequentie. Figuur 3C,D toont de histogrammen van de bindingsverdeling van H3-H4-dimeren door Abo1 op lambda-DNA dat Widom 601-herhalingen bevat, respectievelijk aan het einde (tien herhalingen) en intern (vijf herhalingen). Er was geen preferentiële binding aan de meervoudige Widom 601-herhalingen, en de bindingsverdeling was willekeurig, wat suggereert dat Abo1 geen voorkeur heeft voor de Widom 601-sequentie, maar in plaats daarvan H3-H4 op een sequentie-onafhankelijke manier op DNA laadt (Figuur 3C,D).
Figuur 1: Voorbereiding van de flowcel. (A) Schema's van de assemblage van flowcellen en het DNA-gordijnsysteem. De microfluïdische kamer kan worden gevormd tussen een gesmolten silicaglaasje en een glazen dekglaasje dat met dubbelzijdige tape aan elkaar is geplakt. Onder de hydrodynamische stroming in de kamer wordt een grote hoeveelheid lambda-DNA-moleculen uitgelijnd op een diffusiebarrière (hier een nano-greppel) vanwege de vloeibaarheid van de lipidedubbellaag en uitgerekt als een gordijn. In de vergrote weergave van de diffusiebarrière heeft de nano-greppel zaagtandpatronen met een pitch van 1,5 μm, een breedte van 350 nm en een diepte van 1,4 μm. (B) Foto van het microfluïdische systeem bestaande uit een spuitpomp, een afsluiter en een 6-weg monsterinjectieklep met een monsterlus. (C) Foto's van de onderdelen van de objectglaasjeshouder (links), de montage van de houders en de flowcel (midden) en de volledig geassembleerde flowcel gemonteerd op een op maat gemaakte TIRF-microscoop (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Visualisatie van histonbelasting door Abo1 met behulp van een DNA-gordijn met één molecuul. (A) Afbeelding van DNA-gordijn, waar DNA-moleculen gekleurd met YOYO-1 (groen) goed zijn uitgelijnd bij een diffusiebarrière. (B) Afbeeldingen van Cy5-H3-H4 (rood) zonder Abo1. (C) Beelden van Cy5-H3-H4 (rood) geladen door Abo1 in aanwezigheid (boven) en afwezigheid (onder) van bufferstroom. (D) Kymograaf geëxtraheerd uit een enkel DNA-molecuul uit (C). Wanneer de stroom tijdelijk wordt uitgeschakeld, verdwijnen de Cy5-fluorescentiesignalen, wat aangeeft dat Cy5-H3-H4 zich bindt aan DNA, maar niet aan het objectglaasje. (E) Afbeelding van Cy5-H3-H4 geladen door Abo1 zonder nucleotide (Apo) (boven). Afbeelding van Cy5-H3-H4 geladen door Abo1 in aanwezigheid van ADP (onder). (F) Kwantificering van Cy5-H3-H4 geladen door Abo1 volgens nucleotiden. Foutbalken geven de standaarddeviatie in drievoud weer. Elk experiment omvatte de analyse van 100-200 moleculen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Sequentie-onafhankelijk laden van H3-H4 door Abo1. (A) Het ene uiteinde van het lambda-DNA is verankerd aan gebiotinyleerd lipide via streptavidine, en het andere uiteinde bevat tien herhalingen van de Widom 601-sequentie (boven). Het andere lambda-DNA bevat vijf herhalingen van de Widom 601-sequentie in lambda-DNA (onder). (B) Schema van de DNA-gordijntest met lambda-DNA dat Widom 601-herhalingen bevat. (C,D) Bindingsverdelingshistogrammen van Cy5-H3-H4 op lambda-DNA dat Widom 601 bevat, herhaalt zich aan het einde (C) en inwendig (D). Er is geen sequentiespecificiteit voor DNA wanneer H3-H4 wordt geassembleerd door Abo1. Foutbalken worden verkregen door42 op te starten met een betrouwbaarheidsinterval van 70%. Het totale aantal gebeurtenissen is respectievelijk 312 en 252 voor (C) en (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Als beeldvormingstechniek met één molecuul is DNA-gordijn op grote schaal gebruikt om DNA-metabolische reacties te onderzoeken43. DNA-gordijn is een hybride systeem dat lipidevloeibaarheid, microfluïdica en TIRFM samenvoegt. In tegenstelling tot andere technieken met één molecuul, maakt DNA-gordijn real-time visualisatie van eiwit-DNA-interacties met hoge doorvoer mogelijk. Daarom is de DNA-gordijntechniek geschikt voor het onderzoeken van het mechanisme achter moleculaire interacties, waaronder sequentiespecifieke associatie, eiwitbeweging samen met DNA en eiwit-eiwitbotsing op DNA 17,20,26. Bovendien maakt het hoge doorvoerkarakter van het DNA-gordijn het mogelijk om voldoende gegevens te verzamelen om statistische betrouwbaarheid te garanderen. DNA-gordijn vergemakkelijkt het onderzoek naar de biofysisch-chemische eigenschappen van eiwitten, inclusief kinetische parameters, diffusiecoëfficiënt, snelheid en procesiviteit 17,26,27,30. Belangrijk is dat DNA-gordijn kan worden gebruikt om het bindingslandschap van nucleosoomafzetting te bepalen, wat de intrinsieke sequentievoorkeur van nucleosomen aangeeft30.
Er moet met verschillende punten rekening worden gehouden om gegevens van hoge kwaliteit uit de DNA-gordijntest te verkrijgen. Eerst moet de lipide dubbellaag op de juiste manier op het glijbaanoppervlak worden gevormd. De vloeibaarheid van de lipidedubbellaag zorgt ervoor dat DNA-moleculen op het glaasje kunnen bewegen en worden uitgelijnd op een diffusiebarrière in aanwezigheid van hydrodynamische stroming. De lipide dubbellaag passiveert ook het oppervlak van de microfluïdische kamer om niet-specifieke adsorptie van eiwitten aan het oppervlak te voorkomen. Omdat de passivering door de lipide dubbellaag niet volledig is, worden fluorescerend gelabelde eiwitten niet-specifiek aan het oppervlak geadsorbeerd, wat leidt tot een onjuiste interpretatie van de resultaten. De aan het oppervlak vastzittende eiwitten kunnen echter worden onderscheiden van DNA-gebonden eiwitten door de voorbijgaande stroom aan en uit te zetten, omdat DNA-gebonden eiwitten verdwijnen wanneer de stroom stopt. Ten tweede moet het fotobleken van fluoroforen worden onderdrukt. Veel fluorescentiebeeldvormingsmethoden met één molecuul maken gebruik van een zuurstofopvangsysteem om fotobleken te verminderen. Er zijn verschillende zuurstofopvangsystemen ontwikkeld, waarvan gloxy de meest populaire is. Gloxy, bestaande uit glucose-oxidase en catalase, vermindert enzymatisch de moleculaire zuurstof in oplossing, maar verlaagt de pH 44,45,46. Een lage pH is niet verenigbaar met fysiologische omstandigheden en vermindert de vloeibaarheid van lipiden. Om de daling van de pH te vertragen, (1) moet de beeldvormingsbuffer worden voorbereid met ontgast gedeïoniseerd water, (2) moet de buffer onmiddellijk worden gebruikt en (3) moet de buffer worden verzegeld en op ijs worden opgeslagen tot gebruik.
Er werd een uniek platform ontwikkeld om het DNA-gordijnsysteem te verbeteren, waarbij uitgehouwen nano-greppels dienen als diffusiebarrières in plaats van chroom-nanopatronen25. Omdat deze nano-greppels robuuster zijn onder zware reinigingsomstandigheden met sterke oplosmiddelen, maken ze herhaalbare, duidelijkere beeldvorming mogelijk. De DNA-gordijntechniek heeft echter verschillende beperkingen. Onder continue laserverlichting worden de fluoroforen die eiwitten labelen fotogebleekt, waardoor langdurige metingen een uitdaging worden. DNA-gordijn werkt niet bij een lage pH (lager dan ~6) omdat de lipidedubbellaag niet vloeibaar is. Bovendien verstoren de fluorescentieachtergrond en de niet-specifieke binding van eiwitten aan het diaoppervlak de beeldvorming van één molecuul wanneer de eiwitconcentratie hoog is. Een ander nadeel van het DNA-gordijn is dat de ruimtelijke resolutie van het DNA-gordijn ~1 kbp/pixel is, waardoor de beweging van eiwitten met minder dan 1 kbp niet kan worden waargenomen. Bovendien oefent het DNA-gordijn continu hydrodynamische kracht uit op eiwitten op DNA. Maar de kracht door stroming is zwak (minder dan 1 pN), en daarom is het een uitdaging dat histonen of nucleosomen langs DNA in het gordijn bewegen. Er werd ook gemeld dat nucleosomen zelden langs DNA glijden zonder chromatine-remodelers47. Als histonen of nucleosomen langs DNA schuiven, blijven de meeste van hen aan het einde van het DNA in het gordijn. We zagen echter niet de bevooroordeelde verdeling. Aan de andere kant, als histonen of nucleosomen van het DNA-uiteinde wegvloeien, zouden ze aan het einde van het DNA uitgeput raken. Ook dit hebben wij niet waargenomen.
Dit werk toont aan dat de DNA-gordijntest een beeldvormingsplatform met één molecuul is, ideaal voor het onderzoeken van chromatinedynamiek. DNA-gordijn kan worden toegepast om het proces te bestuderen waarmee histonchaperonnes zoals broomdomeinbevattende AAA+ ATPases chromatine assembleren. De biologische functie van broomdomein-bevattende AAA+ ATPases is controversieel. Gebrek aan humaan ATAD2 of S. cerevisiae Yta7 verlaagt de genexpressie via chromatinecondensatie18. Daarentegen verhoogt S. pombe Abo1 de nucleosoomdichtheid16. De studies met één molecuul tonen aan dat Abo1 histon H3-H4 katalyseert die op DNA wordt geladen. Er wordt aangetoond dat de histonbelastingsactiviteit van Abo1 afhankelijk is van ATP-hydrolyse (Figuur 2C,E,F). Bovendien laat de bindingsverdeling van H3-H4-dimeren zien dat H3-H4-dimeren door Abo1 op een sequentie-onafhankelijke manier op DNA worden geladen (Figuur 3). Kortom, het DNA-gordijn kan worden gebruikt om de biologische rol van Abo1 als histonchaperonne in histonassemblage te ontrafelen. Met behulp van de DNA-gordijntechniek zal in de toekomst de vorming van nucleosomen door Abo1 en andere histon-chaperonnes zoals CAF-1 en FACT worden bestudeerd.
Op basis van dit protocol kan DNA-gordijntest worden gebruikt om chromatinereorganisatie te observeren door complexen te remodelleren die nucleosomen verplaatsen en herschikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs waarderen de vriendelijke steun voor Abo1 en Cy5-H3-H4 door professor Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., en Juwon Jang, Ph.D., in KAIST, Zuid-Korea. Dit werk wordt ondersteund door de National Research Foundation Grant (NRF-2020R1A2B5B01001792), het intramurale onderzoeksfonds (1.210115.01) van het Ulsan National Institute of Science and Technology en het Institute for Basic Science (IBS-R022-D1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
| 10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
| Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
| AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
| Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
| Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
| Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
| Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
| Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
| Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
| LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
| Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
| Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
| Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
| Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
| Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
| Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
| β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
References
- Woodcock, C. L., Ghosh, R. P.
- Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- McGhee, J. D., Felsenfeld, G.
- Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622 (2013).
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658 (2013).
- Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
- Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
- Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
- Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
- Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
- De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
- Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
- Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Genetics. 199 (1), 105-116 (2015).
- Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
- Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764 (2019).
- Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
- Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
- Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
- Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
- Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
- Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
- Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
- Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
- Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
- Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
- Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
- Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
- Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001 (2009).
- Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320 (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols.
- Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13 (2010).
- Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
- Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the '601' sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
- Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001 (2011).
