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Biochemistry

डीएनए पर्दा तकनीक द्वारा हिस्टोन असेंबली के आणविक तंत्र का निर्णय लेना

Published: March 9, 2022 doi: 10.3791/63501
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Biological Sciences, Ulsan National Institute of Science and Technology, 2Center for Genomic Integrity, Institute for Basic Science (IBS)

Summary

डीएनए पर्दा, एक उच्च-थ्रूपुट एकल-अणु इमेजिंग तकनीक, विविध प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन के वास्तविक समय के दृश्य के लिए एक मंच प्रदान करती है। वर्तमान प्रोटोकॉल Abo1 की जैविक भूमिका और आणविक तंत्र की जांच करने के लिए डीएनए पर्दे की तकनीक का उपयोग करता है, एक Schizosaccharomyces pombe bromodomain-युक्त AAA + ATPase।

Abstract

क्रोमैटिन एक उच्च-क्रम संरचना है जो यूकेरियोटिक डीएनए को पैकेज करती है। क्रोमैटिन कोशिका चक्र चरण के अनुसार और पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के जवाब में गतिशील परिवर्तन से गुजरता है। ये परिवर्तन जीनोमिक अखंडता, एपिजेनेटिक विनियमन और डीएनए चयापचय प्रतिक्रियाओं जैसे प्रतिकृति, प्रतिलेखन और मरम्मत के लिए आवश्यक हैं। क्रोमैटिन असेंबली क्रोमैटिन गतिशीलता के लिए महत्वपूर्ण है और हिस्टोन चैपरोन द्वारा उत्प्रेरित होती है। व्यापक अध्ययन के बावजूद, जिस तंत्र द्वारा हिस्टोन चैपरोन क्रोमैटिन असेंबली को सक्षम करते हैं, वह मायावी रहता है। इसके अलावा, हिस्टोन चैपरोन द्वारा आयोजित न्यूक्लियोसोम की वैश्विक विशेषताओं को खराब समझा जाता है। इन समस्याओं का समाधान करने के लिए, यह काम डीएनए पर्दे नामक एक अद्वितीय एकल-अणु इमेजिंग तकनीक का वर्णन करता है, जो हिस्टोन चैपरोन द्वारा न्यूक्लियोसोम असेंबली के आणविक विवरण की जांच की सुविधा प्रदान करता है। डीएनए पर्दा एक संकर तकनीक है जो लिपिड तरलता, माइक्रोफ्लुइडिक्स और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (टीआईआरएफएम) को जोड़ती है ताकि विविध प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की वास्तविक समय इमेजिंग के लिए एक सार्वभौमिक मंच प्रदान किया जा सके। डीएनए पर्दे का उपयोग करते हुए, Abo1 के हिस्टोन चैपरोन फ़ंक्शन, Schizosaccharomyces pombe bromodomain-युक्त AAA + ATPase की जांच की जाती है, और Abo1 के हिस्टोन असेंबली के अंतर्निहित आणविक तंत्र का पता चलता है। डीएनए पर्दा क्रोमैटिन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Introduction

यूकेरियोटिक डीएनए को एक उच्च-क्रम संरचना में पैक किया जाता है जिसे क्रोमैटिन 1,2 के रूप में जाना जाता है। न्यूक्लियोसोम क्रोमैटिन की मूलभूत इकाई है, जिसमें लगभग 147 बीपी डीएनए होते हैं जो ऑक्टामेरिक कोर हिस्टोन 3,4 के चारों ओर लिपटे होते हैं। क्रोमैटिन यूकेरियोटिक कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; उदाहरण के लिए, कॉम्पैक्ट संरचना अंतर्जात कारकों और बहिर्जात खतरों से डीएनए की रक्षा करती है5. क्रोमैटिन संरचना कोशिका चक्र चरण और पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के अनुसार गतिशील रूप से बदलती है, और ये परिवर्तन डीएनए लेनदेन के दौरान प्रोटीन पहुंच को नियंत्रित करते हैं जैसे प्रतिकृति, प्रतिलेखन, औरमरम्मत 6. क्रोमैटिन गतिशीलता जीनोमिक स्थिरता और एपिजेनेटिक जानकारी के लिए भी महत्वपूर्ण हैं।

क्रोमैटिन गतिशील रूप से विभिन्न कारकों द्वारा विनियमित होता है, जिसमें हिस्टोन पूंछ संशोधन और क्रोमैटिन आयोजकों जैसे क्रोमैटिन रीमॉडेलर, पॉलीकॉम्ब समूह प्रोटीन और हिस्टोन चैपरोन7 शामिल हैं। हिस्टोन चैपरोन कोर हिस्टोन 8,9 के जमाव या टुकड़ी के माध्यम से न्यूक्लियोसोम की विधानसभा और डिस्सेप्लर का समन्वय करते हैं। हिस्टोन चैपरोन में दोष जीनोम अस्थिरता को प्रेरित करते हैं और विकास संबंधी विकार और कैंसर 9,10का कारण बनते हैं। विभिन्न हिस्टोन चैपरोन को न्यूक्लियोसोम 9,11,12,13को इकट्ठा करने या अलग करने के लिए एटीपी हाइड्रोलिसिस जैसी रासायनिक ऊर्जा खपत की आवश्यकता नहीं होती है। हाल ही में, शोधकर्ताओं ने बताया कि ब्रोमोडोमेन युक्त AAA+ (विविध सेलुलर गतिविधियों से जुड़े ATPase) ATPases क्रोमैटिन डायनेमिक्स में हिस्टोन चैपरोन 14,15,16,17 के रूप में भूमिका निभाते हैं। मानव ATAD2 (ATPase परिवार AAA डोमेन युक्त प्रोटीन 2) जीन अभिव्यक्ति18 को बढ़ाने के लिए क्रोमैटिन पहुंच को बढ़ावा देता है. एक ट्रांसक्रिप्शनल सह-नियामक के रूप में, ATAD2 ऑन्कोजेनिक ट्रांसक्रिप्शनल कारकों14 के क्रोमैटिन को नियंत्रित करता है, और ATAD2 की अतिअभिव्यक्ति19 कैंसर के कई प्रकार में गरीब रोग का निदान करने के लिए संबंधित है. Yta7, Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) ATAD2 का होमोलॉग, क्रोमैटिन15 में न्यूक्लियोसोम घनत्व कम हो जाता है। इसके विपरीत, Abo1, Schizosaccharomyces pombe (एस. pombe) ATAD2 के homolog, न्यूक्लियोसोम घनत्व16 बढ़ जाती है. एक अद्वितीय एकल अणु इमेजिंग तकनीक का प्रयोग, डीएनए पर्दा, चाहे Abo1 न्यूक्लियोसोम विधानसभा या disassembly करने के लिए योगदान देता है 17,20 संबोधित किया है.

परंपरागत रूप से, बायोमोलेक्यूल्स के जैव रासायनिक गुणों की जांच इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता शिफ्ट परख (ईएमएसए) या सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन (सह-आईपी) जैसे थोक प्रयोगों द्वारा की गई है, जिसमें बड़ी संख्या में अणुओं की जांच की जाती है, और उनके औसत गुणों की विशेषता 21,22 है। थोक प्रयोगों में, आणविक उप-राज्यों को पहनावा-औसत प्रभाव से छिपा दिया जाता है, और बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन की जांच प्रतिबंधित होती है। इसके विपरीत, एकल-अणु तकनीक थोक प्रयोगों की सीमाओं को दरकिनार करती है और बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन के विस्तृत लक्षण वर्णन को सक्षम करती है। विशेष रूप से, एकल अणु इमेजिंग तकनीक व्यापक रूप से डीएनए प्रोटीन और प्रोटीन प्रोटीन बातचीत23 का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. ऐसी ही एक तकनीक डीएनए पर्दा है, माइक्रोफ्लुइडिक्स और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (टीआईआरएफएम)24,25पर आधारित एक अद्वितीय एकल-अणु इमेजिंग तकनीक। डीएनए पर्दे में, सैकड़ों व्यक्तिगत डीएनए अणु लिपिड बाइलेयर से जुड़े होते हैं, जो लिपिड तरलता के कारण डीएनए अणुओं की द्वि-आयामी गति की अनुमति देता है। जब हाइड्रोडायनामिक प्रवाह लागू किया जाता है, तो डीएनए अणु बाइलेयर पर प्रवाह के साथ चलते हैं और एक प्रसार अवरोध पर फंस जाते हैं, जहां वे संरेखित और फैले हुए होते हैं। डीएनए intercalating एजेंटों के साथ दाग है, फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन इंजेक्ट कर रहे हैं, और TIRFM एक एकल अणु स्तर23 पर वास्तविक समय में प्रोटीन डीएनए बातचीत कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. डीएनए पर्दा मंच इस तरह के प्रसार, स्थानांतरण, और टक्कर26,27,28 के रूप में प्रोटीन आंदोलनों के अवलोकन की सुविधा. इसके अलावा, डीएनए पर्दे परिभाषित पदों, झुकाव, और topologies के साथ डीएनए पर प्रोटीन मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड 29,30,31 के चरण जुदाई के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है.

इस काम में, डीएनए पर्दे की तकनीक का उपयोग विशिष्ट प्रोटीन के प्रत्यक्ष दृश्य के माध्यम से चैपरोन के कार्य के लिए सबूत प्रदान करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, क्योंकि डीएनए पर्दा एक उच्च-थ्रूपुट प्लेटफॉर्म है, यह सांख्यिकीय विश्वसनीयता के लिए पर्याप्त डेटा संग्रह की एक सीमा की सुविधा प्रदान करता है। यहां, यह वर्णित किया गया है कि एस पोम्बे ब्रोमोडोमेन युक्त AAA + ATPase Abo1 की आणविक भूमिका की जांच करने के लिए डीएनए पर्दे की परख का विस्तार से संचालन कैसे किया जाए।

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Protocol

1. प्रवाह सेल की तैयारी

  1. पहले प्रकाशित रिपोर्ट25 के बाद नैनो खाई पैटर्न युक्त एक साफ फ्यूज्ड सिलिका स्लाइड तैयार करें.
    1. हीरे-लेपित ड्रिल बिट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके एक साफ फ्यूज्ड सिलिका स्लाइड(चित्रा 1ए)में 1 मिमी व्यास के साथ दो छेद ड्रिल करें।
    2. आर्गन गैस के 10 mTorr के साथ DC स्पटर32 ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके स्लाइड पर 250 एनएम मोटी एल्यूमीनियम (अल) जमा करें।
    3. स्पिन-कोट 1 मिनट के लिए 4,000 आरपीएम पर 4% 950K पॉली (मिथाइल मेथैक्रिलेट) (पीएमएमए) ( सामग्री की तालिकादेखें) की 310 एनएम मोटी परत और 3 मिनट के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर सेंकना।
    4. 80 केवी पर 0.724 एनए वर्तमान के साथ इलेक्ट्रॉन बीम (ईबीम) लिथोग्राफी33 का उपयोग करके दो छेदों के बीच पीएमएमए परत पर नैनो-ट्रेंच पैटर्न ड्रा करें।
      नोट: वास्तुकला और नैनो-ट्रेंच पैटर्न के आयाम चित्रा 1 ए में दिखाए गए हैं।
    5. 2 मिनट के लिए विकासशील समाधान (मिथाइल आइसोबुटिल कीटोन और आइसोप्रोपेनॉल का 1:3 अनुपात, सामग्री की तालिकादेखें) में स्लाइड्स को भिगोकर ईबीम-उजागर पीएमएमए निकालें।
    6. क्लोरीन (Cl2) और बोरॉन ट्राइक्लोराइड (BCl3) गैसों का उपयोग करके आगमनात्मक रूप से युग्मित प्लाज्मा-प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी (ICP-RIE) के साथ Etch Al परतें।
      नोट: ये दो गैसें अल को ईबीम-उजागर क्षेत्रों से हटा सकती हैं।
    7. सल्फर टेट्राफ्लोराइड (एसएफ4), टेट्राफ्लोरोमीथेन (सीएफ4), और ऑक्सीजन (ओ2) गैसों ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके स्लाइड पर नैनो-खाइयों को तराशें।
    8. 10 मिनट के लिए अल etchant (AZ 300 एमआईएफ डेवलपर, सामग्री की तालिकादेखें) में स्लाइड भिगोने से शेष अल परत निकालें.
    9. निर्माण के बाद, विआयनीकृत पानी के साथ स्लाइड कुल्ला और एक स्नान प्रकार sonicator का उपयोग कर 30 मिनट के लिए एसीटोन में sonicate.
    10. चुंबकीय सरगर्मी के साथ कम से कम 1 दिन के लिए 2% हेलमैनेक्स III समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) में स्लाइड्स को साफ करें।
    11. 30 मिनट के लिए एसीटोन में स्लाइड Sonicate और क्रमिक 30 मिनट के लिए 1 एम NaOH है.
    12. विआयनीकृत पानी के साथ स्लाइड कुल्ला और एक नाइट्रोजन (एन2) गैस के साथ सूखी.
  2. दो तरफा टेप के केंद्र पर एक साफ कागज (5 मिमी x 35 मिमी) रखें। कागज के साथ दो छेदों और नैनो-पैटर्न को कवर करने के लिए स्लाइड पर टेप संलग्न करें।
  3. एक साफ ब्लेड (चित्रा 1 ए) का उपयोग कर कागज का आबकारी करें।
  4. दो तरफा टेप के शीर्ष पर एक ग्लास coverslip रखो और एक microfluidic कक्ष (चित्रा 1 ए) के रूप में एक विंदुक टिप का उपयोग coverslip रगड़ें.
  5. दो खुर्दबीन स्लाइड के बीच इकट्ठे प्रवाह सेल रखें और उन्हें क्लिप.
  6. 45 मिनट के लिए एक 120 डिग्री सेल्सियस वैक्यूम ओवन में प्रवाह सेल सेंकना.
  7. चिप-आधारित विश्लेषण ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए द्रव कनेक्टर (नैनोपोर्ट) को गर्म गोंद बंदूक का उपयोग करके प्रत्येक खुले छेद में संलग्न करें और लुअर लॉक टयूबिंग की दो पंक्तियों को कनेक्ट करें।
  8. विआयनीकृत पानी के 3 एमएल युक्त एक ल्यूर लॉक सिरिंज कनेक्ट करें और कक्ष को धो लें।
  9. ड्रॉप-बाय-ड्रॉप कनेक्शन के माध्यम से लिपिड बफर (ट्रिस-एचसीएल के 20 मिमी, पीएच 8.0, और एनएसीएल के 100 मिमी) के 3 एमएल के साथ कक्ष को धोएं।
    नोट: ड्रॉप-बाय-ड्रॉप कनेक्शन कक्ष में हवा के बुलबुले इंजेक्शन से बचने के लिए प्रवाह सेल के लिए सभी सीरिंज लिंक.
  10. प्रति शॉट 5 मिनट इनक्यूबेशन के साथ दो शॉट्स में लिपिड बफर में 0.04x बायोटिनिलेटेड लिपिड के 1 एमएल इंजेक्षन।
    नोट: 1x बायोटिनिलेटेड लिपिड स्टॉक की तैयारी पहले से प्रकाशित रिपोर्ट34 में वर्णित है।
  11. लिपिड बफर के 3 एमएल के साथ कक्ष धो लें और स्लाइड सतह पर परिपक्व होने के लिए लिपिड बाइलेयर के लिए 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  12. बीएसए बफर के 1 एमएल (ट्रिस-एचसीएल के 40 एमएम, पीएच 8.0, एनएसीएल के 50 एमएम, एमजीसीएल2 के 2 एमएम, और बीएसए के 0.2 मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें और स्लाइड सतह को निष्क्रिय करने के लिए 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह कदम स्लाइड सतह पर प्रोटीन के निरर्थक बंधन को कम कर सकता है।
  13. बीएसए बफर के 1 एमएल में स्ट्रेप्टाविडिन के 0.025 मिलीग्राम / एमएल को दो शॉट्स और 10 मिनट इनक्यूबेशन प्रति शॉट के साथ इंजेक्ट करें।
  14. बीएसए बफर के 3 एमएल के साथ अवशिष्ट स्ट्रेप्टाविडिन को धो लें।
  15. बीएसए बफर के 1 एमएल में बायोटिनिलेटेड लैम्ब्डा फेज डीएनए के ~ 300 पीएम (30 माइक्रोन) को दो शॉट्स और 10 मिनट इनक्यूबेशन प्रति शॉट के साथ कक्ष में इंजेक्ट करें।
    नोट: बायोटिनिलेटेड लैम्ब्डा डीएनए की तैयारी पहले से प्रकाशित रिपोर्ट34 में वर्णित है।

2. प्रवाह सेल को माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम से जोड़ना और इसे माइक्रोस्कोप पर लोड करना

  1. Abo1 इमेजिंग बफर (Tris-HCl के 50 मिमी, पीएच 8.0, NaCl के 100 मिमी, DTT के 1 मिमी, एटीपी के 1 मिमी, MgCl2 के 2 मिमी, 1.6% ग्लूकोज, और ग्लोक्सी के 0.1x) तैयार करें, सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: ग्लोक्सी एक ऑक्सीजन मैला ढोने की प्रणाली है जो फ्लोरोसेंट रंगों के फोटोब्लीचिंग को कम करती है। ग्लूकोज ऑक्सीडेज और उत्प्रेरक के साथ 100x ग्लोक्सी स्टॉक की तैयारी संदर्भ35 में वर्णित है।
  2. एक सिरिंज पंप के लिए इमेजिंग बफर के 10 एमएल युक्त एक सिरिंज कनेक्ट करें और microfluidic प्रणाली में सभी ट्यूबिंग लाइनों में बुलबुले को हटा दें.
  3. प्रवाह सेल(चित्रा 1बी)में बुलबुला इंजेक्शन से बचने के लिए ड्रॉप-टू-ड्रॉप कनेक्शन के माध्यम से माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम के साथ तैयार प्रवाह सेल को जोड़ो।
  4. प्रवाह सेल और प्रवाह सेल धारकों को इकट्ठा करें और एक कस्टम-निर्मित टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप(चित्रा 1सी)पर असेंबली माउंट करें।
    चेतावनी: जब प्रवाह सेल खुर्दबीन के नीचे रखा जाता है, ध्यान से उद्देश्य लेंस की ऊंचाई सेट. प्रवाह सेल को उद्देश्य लेंस को नहीं छूना चाहिए। यह लेंस को नुकसान पहुंचा सकता है।
  5. प्रवाह सेल के केंद्र पर सूचकांक मिलान तेल ड्रॉप और तेल ड्रॉप पर एक कस्टम निर्मित कबूतर प्रिज्म ( सामग्री की तालिकादेखें) डाल दिया.

3. डीएनए पर्दे का उपयोग करके Abo1 द्वारा हिस्टोन असेंबली

  1. इमेजिंग बफर के 150 माइक्रोन में Abo1 के 5 एनएम और Cy5-लेबल वाले H3-H4 हिस्टोन डिमर (Cy5-H3-H4) ( सामग्री की तालिका देखें) के 12.5 एनएम मिलाएं। सभी प्रोटीन पहले प्रकाशित रिपोर्ट17 के बाद तैयार किए गए थे.
  2. 15 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण सेते हैं.
    नोट: Cy5 के फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए, इनक्यूबेशन अंधेरे में किया जाना चाहिए।
  3. लैम्ब्डा डीएनए अणुओं को दागने के लिए नमूना लूप के 100 माइक्रोन के माध्यम से इमेजिंग बफर में योयो -1 डाई के ~ 20 पीएम (2 माइक्रोन) इंजेक्ट करें।
  4. इमेजिंग सॉफ्टवेयर चलाएं ( सामग्री की तालिकादेखें) और डीएनए पर्दे अच्छी तरह से गठित हैं या नहीं की जांच करने के लिए 488 एनएम लेजर चालू करें।
    नोट: यदि डीएनए पर्दे अच्छी तरह से बनते हैं, तो डीएनए अणु, जो YOYO-1 से सने होते हैं, को प्रवाह की उपस्थिति में एक अवरोध पर संरेखित रेखाओं के रूप में दिखाया जाता है। प्रवाह बंद होने पर फैली हुई रेखाएँ पीछे हटती हैं और अवरोध से दूर फैलती हैं।
  5. डीएनए से योयो -1 डाई को खत्म करने के लिए उच्च नमक बफर (NaCl के 200 मिमी और MgCl2 के 40 मिमी) के 2 एमएल इंजेक्ट करें।
  6. YOYO-1 डाई को हटा दिए जाने के बाद, प्री-इनक्यूबेटेड प्रोटीन सैंपल को इंजेक्ट करें।
  7. जब प्रोटीन डीएनए पर्दे तक पहुंचते हैं, तो सिरिंज पंप बंद करें, शट-ऑफ वाल्व बंद करें, और Abo1 द्वारा हिस्टोन लोडिंग के लिए 15 मिनट इनक्यूबेट करें।
  8. 5 मिनट के लिए अनबाउंड Abo1 और हिस्टोन प्रोटीन बाहर धो लें.
  9. शट-ऑफ वाल्व पर स्विच करें और प्रवाह इंजेक्शन को फिर से शुरू करें।
  10. 637 एनएम लेजर पर मुड़ें और फ्लोरोसेंट प्रोटीन छवि जबकि बफर प्रवाह पर है.
  11. क्षणिक रूप से बफर प्रवाह को बंद करने के लिए जांच करें कि क्या हिस्टोन प्रोटीन डीएनए (चित्रा 2सी)पर लोड किए जाते हैं।
  12. एक छवि अधिग्रहण कार्यक्रम के साथ डीएनए पर्दे छवियों को इकट्ठा करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: जब बफर प्रवाह क्षणिक बंद हो जाता है, डीएनए कुल आंतरिक प्रतिबिंब के विकसित क्षेत्र से बाहर हटना, और फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन डीएनए के लिए बाध्य गायब हो जाते हैं.

4. डेटा विश्लेषण

  1. छवि अधिग्रहण कार्यक्रम द्वारा ली गई छवियों को छवि अनुक्रमों के रूप में TIFF प्रारूप में रूपांतरित करें।
    नोट: संदर्भ20 में वर्णित के रूप में छवि जम्मू (एनआईएच) का उपयोग कर सभी डेटा का विश्लेषण किया गया.
  2. छवि दृश्यों से एक एकल डीएनए अणु उठाओ और एक kymograph आकर्षित.
    नोट: कीमोग्राफ समय के एक समारोह के रूप में एक एकल डीएनए अणु से बंधे प्रत्येक हिस्टोन प्रोटीन की प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन दिखा सकता है।
  3. कीमोग्राफ से प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफ़ाइल बनाएं और इसे कई गाऊसी कार्यों के साथ फिट करें।
  4. प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रोफ़ाइल से चोटियों के केंद्र निर्देशांक ले लीजिए. इस चरण में, हिस्टोन प्रतिदीप्ति की न्यूनतम तीव्रता प्राप्त की जा सकती है।
  5. न्यूनतम तीव्रता से प्रोफाइल से एकत्र सभी शिखर तीव्रता को विभाजित करें। इस चरण में डीएनए से बंधे H3-H4 डिमर की संख्या का अनुमान लगाया गया है।
  6. अन्य डीएनए अणुओं के लिए 4.2-4.5 कदम प्रदर्शन.
  7. 1 kbp बिन आकार के साथ H3-H4 डिमर के बाध्यकारी वितरण के लिए एक हिस्टोग्राम बनाएं। विश्लेषण किए गए अणुओं की संख्या कम से कम 300 है।

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Representative Results

यह काम डीएनए पर्दा परख (चित्रा 1 ए) के लिए प्रवाह सेल तैयारी के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है। डीएनए पर्दे परख ने Abo1 द्वारा डीएनए पर हिस्टोन H3-H4 डिमर असेंबली के अध्ययन की सुविधा प्रदान की। सबसे पहले, डीएनए पर्दे के गठन को डीएनए अणुओं को योयो -1, एक इंटरकेलेटिंग डाई के साथ धुंधला करके जांचा गया था। हरे रंग की रेखाओं को समानांतर सरणियों में दिखाया गया था, यह दर्शाता है कि योयो -1 डीएनए अणुओं में परस्पर जुड़ा हुआ था, जो अच्छी तरह से गठबंधन किए गए थे और हाइड्रोडायनामिक प्रवाह(चित्रा 2ए)के तहत प्रसार बाधा पर फैले हुए थे। डीएनए और हिस्टोन प्रोटीन की बातचीत में बाधा डालने वाले YOYO-1 की संभावना को बाहर करने के लिए, YOYO-1 को हिस्टोन प्रोटीन जोड़ने से पहले एक उच्च नमक बफर के साथ डीएनए से हटा दिया गया था। जब Cy5-H3-H4 डिमर को Abo1 की अनुपस्थिति में डीएनए पर्दे में इंजेक्ट किया गया था, तो Cy5-H3-H4 डीएनए से बंधे नहीं थे, जो डीएनए (चित्रा 2B)के लिए H3-H4 डिमर के सहज बंधन की कमी का संकेत देते हैं। जब Cy5-H3-H4 Abo1 के साथ इंजेक्ट किया गया था, लाल फ्लोरोसेंट puncta डीएनए अणुओं पर देखा गया, सुझाव है कि Abo1 डीएनए (चित्रा 2C) पर एच 3-एच 4 डिमर लोड करता है. बफर प्रवाह क्षणिक बंद कर दिया गया था सुनिश्चित करने के लिए Cy5-H3-H4 डिमर डीएनए के लिए बाध्यकारी जबकि स्लाइड सतह के लिए बाँध नहीं था. जब प्रवाह बंद कर दिया गया था, फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन डीएनए के लिए बाध्य गायब हो गया क्योंकि डीएनए अणुओं evanescent क्षेत्र से बाहर हटना. इसके विपरीत, सतह पर सोखने वाले प्रोटीन समान रहे। फ्लोरोसेंट सिग्नल प्रवाह की अनुपस्थिति में गायब हो गए और प्रवाह फिर से शुरू होने पर फिर से प्रकट हुए, यह सुझाव देते हुए कि एच 3-एच 4 डिमर डीएनए(चित्रा 2सी)से बंधते हैं। डीएनए के लिए एच 3-एच 4 डिमर के बंधन की पुष्टि भी कीमोग्राफ द्वारा की गई थी, जिसमें प्रवाह बंद होने पर प्रतिदीप्ति संकेत गायब हो गए थे (चित्रा 2डी)। क्योंकि Abo1 एक AAA + ATPase है, Abo1 के हिस्टोन लोडिंग गतिविधि पर एटीपी हाइड्रोलिसिस के प्रभाव की जांच16 की गई थी। डीएनए पर्दे में या तो न्यूक्लियोटाइड (एपीओ) की अनुपस्थिति में या एडीपी (चित्रा 2ई) की उपस्थिति में कुछ फ्लोरोसेंट पंचर दिखाई दिए, यह दर्शाता है कि एच 3-एच 4 डिमर शायद ही कभी एपो राज्य में या एडीपी की उपस्थिति में डीएनए से बंधते हैं। चित्रा 2 एफ चित्रा 2 बी, सी, और चित्रा 2 ई के मात्रात्मक विश्लेषण प्रदर्शित करता है, दिखा रहा है कि डीएनए से बंधे एच 3-एच 4 डिमर की संख्या एटीपी की उपस्थिति में बढ़ जाती है। परिणाम बताते हैं कि एटीपी हाइड्रोलिसिस एबीओ 1 (चित्रा 2ई, एफ) द्वारा डीएनए पर एच 3-एच 4 लोडिंग के लिए आवश्यक है।

इसके बाद, यह परीक्षण किया गया कि क्या Abo1 अधिमानतः विडोम 601 अनुक्रम में हिस्टोन लोड करता है, जिसमें इन विट्रो में यादृच्छिक अनुक्रमों की तुलना में हिस्टोन के लिए दस गुना अधिक बाध्यकारी संबंध है, भले ही न्यूक्लियोसोम में विवो 601 अनुक्रम के लिए कोई विशिष्टता नहीं है विवो 36,37,38,39,40। डीएनए पर्दा लैम्ब्डा डीएनए के साथ बनाया गया था जिसमें एक छोर पर या आंतरिक रूप से विडोम 601 दोहराता है (चित्रा 3 ए, बी)। प्रत्येक डीएनए निर्माण पर एच 3-एच 4 डिमर का बाध्यकारी परिदृश्य प्राप्त किया गया था(चित्रा 3सी, डी)। Cy5-H3-H4 के बाध्यकारी स्थान प्रत्येक फ्लोरोसेंट पंचर17,41 के लिए 2 डी गाऊसी फिटिंग के केंद्र की स्थिति से अनुमान लगाया गया था. यदि Abo1 की H3-H4 लोडिंग गतिविधि डीएनए अनुक्रम पर निर्भर करती है, तो बाध्यकारी वितरण Widom 601 अनुक्रम की ओर तिरछा हो जाएगा। चित्रा 3 सी, डी लैम्ब्डा डीएनए पर एबीओ 1 द्वारा एच 3-एच 4 डिमर के बाध्यकारी वितरण हिस्टोग्राम को प्रदर्शित करता है जिसमें क्रमशः अंत में विडोम 601 दोहराता है (दस दोहराता है) और आंतरिक रूप से (पांच दोहराता है)। एकाधिक विडोम 601 दोहराव के लिए कोई अधिमान्य बंधन नहीं था, और बाध्यकारी वितरण यादृच्छिक था, यह सुझाव देते हुए कि एबीओ 1 में विडोम 601 अनुक्रम के लिए कोई प्राथमिकता नहीं है, बल्कि अनुक्रम-स्वतंत्र तरीके से डीएनए पर एच 3-एच 4 लोड करता है (चित्र 3सी, डी)।

Figure 1
चित्रा 1: प्रवाह सेल की तैयारी। (ए) प्रवाह कोशिका विधानसभा और डीएनए पर्दा प्रणाली के योजनाबद्ध। माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष एक फ्यूज्ड-सिलिका स्लाइड और दो तरफा टेप के साथ एक ग्लास कवरस्लिप के बीच बनाया जा सकता है। कक्ष में हाइड्रोडायनामिक प्रवाह के तहत, लैम्ब्डा डीएनए अणुओं की एक बड़ी मात्रा लिपिड बाइलेयर की तरलता के कारण एक प्रसार बाधा (यहां एक नैनो-ट्रेंच) पर संरेखित होती है और पर्दे की तरह फैली होती है। प्रसार बाधा के बढ़े हुए दृश्य में, नैनो-ट्रेंच में 1.5 माइक्रोन पिच, 350 एनएम चौड़ाई और 1.4 माइक्रोन गहराई के साथ देखा-दांत पैटर्न हैं। (बी)एक सिरिंज पंप, एक शट-ऑफ वाल्व, और एक नमूना लूप के साथ एक 6-तरफा नमूना इंजेक्शन वाल्व से मिलकर माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली की तस्वीर। (सी)स्लाइड धारक घटकों (बाएं), धारकों और प्रवाह सेल (मध्य) की विधानसभा, और एक कस्टम-निर्मित TIRF माइक्रोस्कोप (दाएं) पर घुड़सवार पूरी तरह से इकट्ठे प्रवाह सेल के चित्र. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एकल-अणु डीएनए पर्दे का उपयोग करके Abo1 द्वारा हिस्टोन लोडिंग का दृश्य। (ए) डीएनए पर्दे की छवि, जहां YOYO-1 (हरा) के साथ दाग डीएनए अणुओं एक प्रसार बाधा पर अच्छी तरह से गठबंधन कर रहे हैं. (बी) Abo1 के बिना Cy5-H3-H4 (लाल) की छवियां। (सी) बफर प्रवाह की उपस्थिति (शीर्ष) और अनुपस्थिति (नीचे) में Abo1 द्वारा लोड किए गए Cy5-H3-H4 (लाल) की छवियां। (डी) किमोग्राफ (सी) से एक एकल डीएनए अणु से निकाला गया। जब प्रवाह क्षणिक रूप से बंद हो जाता है, तो Cy5 प्रतिदीप्ति संकेत गायब हो जाते हैं, यह दर्शाता है कि Cy5-H3-H4 डीएनए से बांधता है लेकिन स्लाइड सतह पर नहीं। (ई) न्यूक्लियोटाइड (एपीओ) (शीर्ष) के बिना Abo1 द्वारा लोड किए गए Cy5-H3-H4 की छवि। ADP (नीचे) की उपस्थिति में Abo1 द्वारा लोड की गई Cy5-H3-H4 की छवि। (एफ) न्यूक्लियोटाइड के अनुसार Abo1 द्वारा लोड किए गए Cy5-H3-H4 की मात्रा का ठहराव। त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रतियों में मानक विचलन को दर्शाती हैं। प्रत्येक प्रयोग में 100-200 अणुओं का विश्लेषण शामिल था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: Abo1 द्वारा H3-H4 का अनुक्रम-स्वतंत्र लोडिंग। (ए) लैम्ब्डा डीएनए का एक छोर स्ट्रेप्टाविडिन के माध्यम से बायोटिनिलेटेड लिपिड से जुड़ा हुआ है, और दूसरे छोर में विडोम 601 अनुक्रम (शीर्ष) के दस दोहराव हैं। अन्य लैम्ब्डा डीएनए में लैम्ब्डा डीएनए (नीचे) के अंदर विडोम 601 अनुक्रम के पांच दोहराव होते हैं। (बी) लैम्ब्डा डीएनए युक्त लैम्ब्डा 601 दोहराता के साथ डीएनए पर्दे परख का योजनाबद्ध। (सी, डी) लैम्ब्डा डीएनए पर Cy5-H3-H4 के बाध्यकारी वितरण हिस्टोग्राम जिसमें Widom 601 अंत में दोहराता है (C) और आंतरिक रूप से (D)। डीएनए के लिए कोई अनुक्रम विशिष्टता नहीं है जब H3-H4 को Abo1 द्वारा इकट्ठा किया जाता है। त्रुटि पट्टियाँ 70% विश्वास अंतराल के साथ42 बूटस्ट्रैपिंग द्वारा प्राप्त की जाती हैं। (C) और (D) के लिए कुल घटनाएँ क्रमशः 312 और 252 हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एक एकल अणु इमेजिंग तकनीक के रूप में, डीएनए पर्दा डीएनए चयापचय प्रतिक्रियाओं43 की जांच के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. डीएनए पर्दा एक संकर प्रणाली है जो लिपिड तरलता, माइक्रोफ्लुइडिक्स और टीआईआरएफएम को जोड़ती है। अन्य एकल-अणु तकनीकों के विपरीत, डीएनए पर्दा प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन के उच्च-थ्रूपुट वास्तविक समय के दृश्य को सक्षम बनाता है। इसलिए, डीएनए पर्दा तकनीक आणविक बातचीत के पीछे तंत्र की जांच के लिए उपयुक्त है, जिसमें अनुक्रम-विशिष्ट संघ, डीएनए के साथ प्रोटीन आंदोलन, और डीएनए 17,20,26पर प्रोटीन-प्रोटीन टकराव शामिल है। इसके अतिरिक्त, डीएनए पर्दे की उच्च-थ्रूपुट प्रकृति सांख्यिकीय विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त डेटा के संग्रह को सक्षम बनाती है। डीएनए पर्दा प्रोटीन के जैव-भौतिक रासायनिक गुणों की जांच की सुविधा प्रदान करता है, जिसमें गतिज पैरामीटर, प्रसार गुणांक, गति और प्रक्रियात्मकता 17,26,27,30 शामिल हैं। महत्वपूर्ण बात, डीएनए पर्दे न्यूक्लियोसोम30 के आंतरिक अनुक्रम वरीयता इंगित करता है जो nucleosome बयान के बाध्यकारी परिदृश्य को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

डीएनए पर्दे परख से उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए कई बिंदुओं पर विचार करने की आवश्यकता है। सबसे पहले, लिपिड बाइलेयर को स्लाइड सतह पर उचित रूप से बनाया जाना चाहिए। लिपिड बाइलेयर की तरलता डीएनए अणुओं को स्लाइड पर स्थानांतरित करने और हाइड्रोडायनामिक प्रवाह की उपस्थिति में प्रसार अवरोध पर संरेखित करने की अनुमति देती है। लिपिड बाइलेयर सतह पर प्रोटीन के निरर्थक सोखना को रोकने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष की सतह को भी निष्क्रिय करता है। क्योंकि लिपिड बाइलेयर द्वारा निष्क्रियता पूरी नहीं होती है, फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए प्रोटीन को सतह पर गैर-विशिष्ट रूप से सोख लिया जाता है, जिससे परिणामों की गलत व्याख्या होती है। हालांकि, सतह से अटके प्रोटीन को क्षणिक प्रवाह को चालू और बंद करके डीएनए-बाध्य लोगों से अलग किया जा सकता है क्योंकि प्रवाह बंद होने पर डीएनए-बाध्य प्रोटीन गायब हो जाते हैं। दूसरा, फ्लोरोफोर्स के फोटोब्लीचिंग को दबाने की जरूरत है। कई एकल-अणु प्रतिदीप्ति इमेजिंग विधियां फोटोब्लीचिंग को कम करने के लिए ऑक्सीजन स्कैवेंजिंग सिस्टम को अपनाती हैं। कई ऑक्सीजन स्कैवेंजिंग सिस्टम विकसित किए गए हैं, जिनमें से सबसे लोकप्रिय ग्लोक्सी है। ग्लोक्सी, ग्लूकोज ऑक्सीडेज और उत्प्रेरक से मिलकर, एंजाइमेटिक रूप से समाधान में आणविक ऑक्सीजन को कम करता है लेकिन पीएच44,45,46 को कम करता है। कम पीएच शारीरिक स्थितियों के अनुकूल नहीं है और लिपिड तरलता को कम करता है। पीएच में कमी में देरी करने के लिए, (1) इमेजिंग बफर degassed विआयनीकृत पानी के साथ तैयार किया जाना चाहिए, (2) बफर तुरंत इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और (3) बफर सील और उपयोग तक बर्फ पर संग्रहीत किया जाना चाहिए.

डीएनए पर्दा प्रणाली में सुधार करने के लिए एक अनूठा मंच विकसित किया गया था जिसमें नक्काशीदार नैनो-खाइयां क्रोमियम नैनो-पैटर्न25 के बजाय प्रसार बाधाओं के रूप में काम करती हैं। चूंकि ये नैनो-खाइयां मजबूत सॉल्वैंट्स के साथ कठोर सफाई की स्थिति में अधिक मजबूत होती हैं, इसलिए वे दोहराने योग्य, स्पष्ट इमेजिंग की अनुमति देते हैं। हालांकि, डीएनए पर्दे की तकनीक की कई सीमाएँ हैं। निरंतर लेजर रोशनी के तहत, प्रोटीन को लेबल करने वाले फ्लोरोफोर्स को फोटोब्लीच किया जाता है, जिससे लंबे समय तक माप चुनौतीपूर्ण हो जाता है। डीएनए पर्दा कम पीएच (~ 6 से कम) पर काम नहीं करता है क्योंकि लिपिड बाइलेयर तरल नहीं होता है। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि और स्लाइड सतह के लिए प्रोटीन की निरर्थक बाध्यकारी प्रोटीन एकाग्रता अधिक है जब एकल अणु इमेजिंग परेशान. डीएनए पर्दे का एक और दोष यह है कि डीएनए पर्दे का स्थानिक रिज़ॉल्यूशन ~ 1 केबीपी / पिक्सेल है, इसलिए 1 केबीपी से कम प्रोटीन की गति नहीं देखी जा सकती है। इसके अलावा, डीएनए पर्दा डीएनए पर प्रोटीन पर हाइड्रोडायनामिक बल को लगातार लागू करता है। लेकिन प्रवाह द्वारा बल कमजोर है (1 pN से कम), और इसलिए यह चुनौतीपूर्ण है कि हिस्टोन या न्यूक्लियोसोम पर्दे में डीएनए के साथ चलते हैं। यह भी बताया गया था कि न्यूक्लियोसोम शायद ही कभी क्रोमैटिन रीमॉडेलर्स47 के बिना डीएनए के साथ स्लाइड करते हैं। यदि हिस्टोन या न्यूक्लियोसोम डीएनए के साथ स्लाइड करते हैं, तो उनमें से अधिकांश पर्दे में डीएनए के अंतिम क्षेत्र में रहेंगे। हालांकि, हमने पक्षपातपूर्ण वितरण नहीं देखा। दूसरी ओर, यदि डीएनए अंत से हिस्टोन या न्यूक्लियोसोम अपवाह होते हैं, तो वे डीएनए के अंत में समाप्त हो जाएंगे। हमने इसका पालन भी नहीं किया।

यह काम दर्शाता है कि डीएनए पर्दा परख क्रोमैटिन गतिशीलता की जांच के लिए एक एकल अणु इमेजिंग मंच आदर्श है। डीएनए पर्दे को उस प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है जिसके द्वारा ब्रोमोडोमेन युक्त एएए + एटीपीस जैसे हिस्टोन चैपरोन क्रोमेटिन को इकट्ठा करते हैं। ब्रोमोडोमेन युक्त AAA + ATPases का जैविक कार्य विवादास्पद है। मानव ATAD2 या एस cerevisiae Yta7 की कमी क्रोमैटिन संघनन18 के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति downregulates. इसके विपरीत, एस pombe Abo1 न्यूक्लियोसोम घनत्व16 बढ़ जाती है. एकल-अणु अध्ययनों से पता चलता है कि Abo1 डीएनए पर हिस्टोन H3-H4 लोडिंग को उत्प्रेरित करता है। यह दिखाया गया है कि एबीओ 1 की हिस्टोन लोडिंग गतिविधि एटीपी हाइड्रोलिसिस(चित्रा 2सी,ई,एफ)पर निर्भर है। इसके अलावा, एच 3-एच 4 डिमर के बाध्यकारी वितरण से पता चलता है कि एच 3-एच 4 डिमर ए बी ओ 1 द्वारा अनुक्रम-स्वतंत्र तरीके से डीएनए पर लोड किए जाते हैं (चित्र 3)। अंत में, डीएनए पर्दे का उपयोग हिस्टोन असेंबली में हिस्टोन चैपरोन के रूप में Abo1 की जैविक भूमिका को जानने के लिए किया जा सकता है। डीएनए पर्दे की तकनीक का उपयोग करते हुए, Abo1 द्वारा न्यूक्लियोसोम गठन और अन्य हिस्टोन चैपरोन जैसे CAF-1 और FACT का भविष्य में अध्ययन किया जाएगा।

इस प्रोटोकॉल के आधार पर, डीएनए पर्दे परख का उपयोग न्यूक्लियोसोम को स्थानांतरित और पुनर्व्यवस्थित करने वाले परिसरों को फिर से तैयार करके क्रोमैटिन पुनर्गठन का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक प्रोफेसर जी-जून गीत, कैरोल चो, पीएचडी, और जुवन जंग, पीएचडी, केएआईएसटी, दक्षिण कोरिया में एबीओ 1 और सीवाई5-एच 3-एच 4 के लिए दयालु समर्थन की सराहना करते हैं। यह काम नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ग्रांट (NRF-2020R1A2B5B01001792), उल्सान नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी के इंट्राम्यूरल रिसर्च फंड (1.210115.01) और इंस्टीट्यूट फॉर बेसिक साइंस (IBS-R022-D1) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL luer-lock syringe BecktonDickinson 301321
1' x 3' fused-silca slide glass G. Finkenbeiner 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness
10 mL luer-lock syringe BecktonDickinson 302149
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) Avanti 850375 This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 Biotinyl cap PE Avanti 870273 This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 PEG2000 PE Avanti 880130 This is a component of biotinylated lipid stock
3 mL luer-lock syringe BecktonDickinson 302832
6-way sample injection valve IDEX MX series II
950K PMMA All-resist 671.04
Acetone SAMCHUN A1759
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A2383
Aluminum (Al) TASCO, South Korea LT50AI414 Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch
Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa Millipore Z648027
Ampicillin Mbcell MB-A4128 Antibiotics
AZ 300 MIF developer Merck 10454110521 Used for removing aluminum
Blade DORCO DN52 12 mm x 6 m
Boron trichloride (BCl3) UNIONGAS Purity: >99.99%
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Catalase Sigma C40-1g This is a component of 100x gloxy stock
Chlorine (Cl2) UNIONGAS Purity: >99.99%
Clear double-sided tape 3M 313770
D-(+)-glucose Sigma G7528
DC sputter Sorona SRM-120 Used for deposition aluminum on a slide
Diamond-coated drill bit Eurotool DIB-211.00 Used for making holes in a fusced silica slide
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
Dove-prism Korea Electro-Optics Co. Ltd. 1906-106 Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating
Drill Dremel Dremel 3000 Used for making holes in a fusced silica slide
Electron Bean Lithography Nanobeam Ltd. NB3
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-1KG
Fingertight fittings IDEX F-300 It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Flangeless male nut IDEX P-235 It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Freeze Dryer, HyperCOOL Labogene HC3110 Used for lyophilizing liquid proteins
Glucose oxidase Sigma G2133-50KU This is a component of 100x gloxy stock
Guanidinium hydrochloride Acros Organics 364790025
Hamilton syringe Hamilton Company 80065 This syringe is used for sample injection
Hellmanex III Sigma Z805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg Cytiva 28-9893-36 Used for FPLC (size exclusion)
Hot plate stirrer Corning PC-420D
Hydrochloric acid Sigma H1759 Used for Tris-HCl
Index matching oil ZEISS 444970-9000-000
Inductively coupled plasma-reactive ion etching Top Technology Ltd. FabStar
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Glentham Life Sciences GC6586-100g Used for induction of β-galactosidase activity
Lambda phage DNA NEB N0311
LB broth BD difco 244610 Media for E.coli cell growth
Luer adapter 10-32 IDEX P-659 This connects luer-lock syringe and tubing
Magnesium chloride hexahydrate fisher bioreagents BP214
Methyl isobutyl ketone (MIBK) KAYAKU ADVANCED MATERIALS Used for developing solution
Microscope (Eclipse Ti2) Nikon Eclipse Ti2 Inverted fluorescence microscope
Microscope glass coverslip MARIENFELD 101142 22 x 50 mm (No. 1)
Microscope slide DURAN GROUP DU.2355013 Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm
Nanoport IDEX N-333-01
Objective lens Nikon CFI Plan Apochromat VC 60XC WI Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli Thermo Fisher Scientific C6060-03 Competent cell for overexpressing proteins
Oxygen (O2) NOBLEGAS, South Korea Purity: >99.99%
PFA tubing natural IDEX 1512L It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche 11359061001 Protease inhibitor
Sephacryl S-200 High Resolution Cytiva 17-0584-01 Used for FPLC (size exclusion)
Shut-off valve IDEX P-732
Sodium acetate Sigma 791741
Sodium chloride (NaCl) Sigma S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma s5881
Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa Spectrum laboratories 132660
Streptavidin Thermo Fisher Scientific S888
Sulfur tetralfluoride (SF4) NOBLEGAS, South Korea Purity: >99.99%
Syringe pump KD Scientific 78-8210
Tetrafluoromethane (CF4) NOBLEGAS, South Korea Purity: >99.99%
TritonX-100 Sigma T9284
Trizma base Sigma T1503 Used for Tris-HCl
TSKgel SP-5PW TOSOH 14715 Used for FPLC (ion exchange)
Union assembly IDEX P-760 This connects tubings
Urea Sigma U5378
Vacuum oven Jeio Tech OV-11
YOYO-1 Thermo Fisher Scientific Y3601 This intercalation dye is diluted in DMSO
β-mercaptoethanol (BME) Sigma M6250

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References

  1. Woodcock, C. L., Ghosh, R. P. Chromatin higher-order structure and dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (5), 000596 (2010).
  2. Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
  3. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  4. McGhee, J. D., Felsenfeld, G. Nucleosome structure. Annual Review of Biochemistry. 49, 1115-1156 (1980).
  5. Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622 (2013).
  6. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  7. Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658 (2013).
  8. Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
  9. Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
  10. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  11. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  12. Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
  13. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  14. Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
  15. Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Genetics. 199 (1), 105-116 (2015).
  16. Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
  17. Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764 (2019).
  18. Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
  19. Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
  20. Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
  21. Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
  22. Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
  23. Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
  24. Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
  25. Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
  26. Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
  27. Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
  28. Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
  29. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  30. Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
  31. Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
  32. Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
  33. Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001 (2009).
  34. Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320 (2020).
  35. Cold Spring Harbor Protocols. Gloxy. Vol. 2. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  36. Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13 (2010).
  37. Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
  38. Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the '601' sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
  39. Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
  40. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  41. Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
  42. Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
  43. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  44. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  45. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  46. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  47. Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001 (2011).

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डीएनए पर्दा तकनीक द्वारा हिस्टोन असेंबली के आणविक तंत्र का निर्णय लेना
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Kang, Y., Bae, S., An, S., Lee, J.… More

Kang, Y., Bae, S., An, S., Lee, J. Y. Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique. J. Vis. Exp. (181), e63501, doi:10.3791/63501 (2022).

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