Summary
Nous décrivons ici une nouvelle technique rapide de modélisation des lésions ouvertes de la moelle épinière chez le rat qui élimine la laminectomie. L’hémisection latérale est réalisée lors d’une visualisation au microscope. La technique est polyvalente et peut également être utilisée dans les régions cervicales, thoraciques et lombaires de la moelle épinière d’autres animaux.
Abstract
Les techniques de lésion de la moelle épinière ouverte modélisant des lésions de type lacération sont longues et invasives car elles impliquent une laminectomie. Cette nouvelle technique élimine la laminectomie en enlevant deux apophyses épineuses et en soulevant, puis en inclinant l’arc vertébral caudal. La zone chirurgicale s’ouvre sans qu’il soit nécessaire de recourir à une laminectomie. L’hémisection latérale est ensuite réalisée avec un contrôle visible direct au microscope. Le traumatisme est minimisé, ne nécessitant qu’une petite blessure osseuse.
Cette technique présente plusieurs avantages : elle est plus rapide et, par conséquent, moins contraignante pour l’animal, et la plaie osseuse est plus petite. Parce que la laminectomie est éliminée, il y a moins de risques de blessures indésirables à la moelle épinière et il n’y a pas d’éclats d’os qui peuvent causer des problèmes (les éclats d’os incrustés dans la moelle épinière peuvent causer un gonflement et des dommages secondaires). Le canal vertébral reste intact. La principale limitation est que l’hémisection ne peut être réalisée que dans les espaces intervertébraux.
Les résultats montrent que cette technique peut être réalisée beaucoup plus rapidement que l’approche chirurgicale traditionnelle, utilisant la laminectomie (11 min contre 35 min). Cette technique peut être utile pour les chercheurs qui travaillent avec des modèles animaux de lésions ouvertes de la moelle épinière, car elle est largement adaptable et ne nécessite pas d’instruments spécialisés supplémentaires.
Introduction
Les lésions de la moelle épinière (SCI) sont malheureusement des lésions fréquentes chez l’homme. Les lésions médullaires peuvent être compliquées de différentes manières, par exemple par des infections, et il est cliniquement important d’étudier ces lésions1. Parce qu’il n’existe pas de remède unique et définitif contre les lésions médullaires, les modèles animaux sont encore nécessaires pour approfondir la compréhension des chercheurs et faire progresser les traitements possibles 2,3. Bien que les blessures fermées soient le plus souvent modélisées (compression et contusion), il est cliniquement important de comprendre les lacérations, qui ne peuvent être modélisées que dans les blessures ouvertes4. Les modèles de plaie ouverte utilisant la transsection ou l’hémisection peuvent être utilisés pour démontrer une localisation plus précise d’une plaie par rapport aux modèles de blessure fermée, en raison de la nature de la blessure (contusion ou coupure chirurgicale). Les expériences sur les plaies ouvertes peuvent faire la lumière sur des lésions neuronales plus spécifiques de manière contrôlée, fiable et reproductible5. La section complète ou partielle de la moelle épinière est une technique de plaie ouverte largement utilisée et peut être examinée en détail dans l’article de Brown et Martinez6.
Lors de l’étude des lésions ouvertes de la moelle épinière chez le rat, plusieurs animaux ont présenté des problèmes découlant de la chirurgie : des éclats d’os provenant de la laminectomie se sont incrustés dans la moelle épinière et ont provoqué un gonflement ; la plus grande plaie osseuse a mis beaucoup de temps à guérir ; L’opération a pris trop de temps. Une autre technique chirurgicale a été mise au point pour éliminer ces problèmes. L’objectif était de développer une technique plus rapide et plus douce pour l’animal. Cette technique nouvellement développée est beaucoup plus rapide que les techniques traditionnelles de lésion médullaire. L’approche chirurgicale est peu invasive, ce qui permet d’obtenir une plaie osseuse plus petite tout en éliminant les problèmes découlant de la laminectomie.
Toutes les techniques d’enroulement ouvert impliquent l’ouverture de la dure-mère7. Plusieurs études récentes ont examiné différentes techniques nouvellement développées, visant à améliorer les méthodes précédentes 8,9. Même si l’ouverture de la dure-mère ne peut être exclue avec cette nouvelle technique, elle provoque une plaie plus petite sur la dure-mère tout en offrant une lésion fiable et contrôlée de la moelle épinière. En consultant la littérature sur les techniques de lésion de la moelle épinière, de nombreux auteurs ont essayé de minimiser la durée de la chirurgie en apportant des modifications mineures à la technique originale10. La laminectomie fait toujours partie de ces interventions chirurgicales, bien qu’elle prenne du temps et nécessite une plaie osseuse plus grande pour être faite6. Cette technique chirurgicale peut convenir aux chercheurs qui utilisent des modèles de lésions de la moelle épinière à plaie ouverte, en particulier la transsection complète ou l’hémisection latérale réalisée dans les espaces intervertébraux (Figure 1).
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Protocol
Toutes les procédures relatives aux animaux ont été effectuées conformément à la directive européenne (2010/63/UE) et ont été approuvées par le comité d’éthique animale de l’Office national hongrois de la sécurité de la chaîne alimentaire (PEI/001/2894-11/2014). Toutes les réglementations institutionnelles et gouvernementales applicables concernant l’utilisation éthique des animaux ont été respectées au cours de cette étude.
1. Préparation avant la chirurgie
- Stérilisez tous les instruments utilisés pendant l’intervention (voir le tableau des matériaux) et désinfectez les surfaces où le travail doit être effectué avant l’intervention.
- Injecter une dose unique d’antibiotiques sous-cutanés à titre prophylactique.
REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur la posologie des antibiotiques. - Laissez les animaux dans la salle d’opération pendant 1 h pour les acclimater et diminuer leur stress avant la chirurgie.
- Anesthésier le rat par injection intramusculaire d’une combinaison de kétamine et de xylazine (kétamine 80 mg/kg poids corporel et xylazine 8 mg/kg poids corporel).
REMARQUE : En plus de l’anesthésie, lacombinaison kétamine-xylazine fournit une analgésie suffisante pour cette procédure. Le régime d’analgésie peut être modifié conformément aux lignes directrices sur l’utilisation des animaux en établissement. - Gardez le rat au chaud pendant la procédure à l’aide d’une table chauffante ou d’une lumière infrarouge et gardez les yeux humides tout au long de l’anesthésie à l’aide d’une pommade ophtalmique (réappliquez si nécessaire).
- Fixez l’animal sur la table d’opération à l’aide de ruban adhésif chirurgical sur ses pattes avant et arrière et sa queue, et selon le site de la blessure, sur le cou également. Si nécessaire, placez le rat dans un cadre stéréotaxique pour le stabiliser pendant la chirurgie.
- À l’aide d’une suture chirurgicale stérile, placez une boucle autour des dents de devant supérieures du rat et fixez-la sur le bord de la table d’opération.
- Tirez la langue sur le côté pour la gestion des voies respiratoires.
- Rasez la fourrure sur le dos, d’au moins 2 cm dans chaque direction de l’endroit où l’incision sera faite.
- Désinfectez la peau de la zone chirurgicale au moins trois fois, à l’aide d’une solution de povidone iodée et d’une gaze stérile. Prenez un soin particulier à faire tremper la fourrure qui entoure la zone. Fixez le site chirurgical à l’aide d’un champ stérile.
- Évaluez l’adéquation de l’anesthésie avant de placer la première incision en pinçant les orteils et la queue de l’animal. Continuez à surveiller l’adéquation de l’anesthésie pendant toute la procédure.
2. Intervention chirurgicale
- Placez l’incision cutanée à l’aide d’une lame de scalpel 20. Pour ouvrir la zone chirurgicale, placez une incision de 2 à 2,5 cm de long le long de la colonne vertébrale, en coupant toutes les couches de la peau. Positionnez cette incision parallèlement à la colonne vertébrale en utilisant la vertèbre L1 comme point médian, en la faisant s’étendre de ~1 cm dans la direction crânienne et caudale le long de la colonne vertébrale.
- Mobilisez les côtés de la plaie en coupant le tissu conjonctif entourant les muscles.
- Placez deux incisions parallèles le long de la colonne vertébrale, pénétrant dans le périoste. Placez les incisions juste à côté des apophyses vertébrales des deux côtés, en couvrant la distance entre les vertèbres Th13 et L1.
- Disséquez les muscles attachés aux vertèbres à l’aide d’un râpatorium jusqu’à ce que tous les ligaments spinaux soient visibles. Mettez en place un écarteur.
- Retirez les apophyses vertébrales de la 13e vertèbre thoracique et de la 1re vertèbre lombaire à l’aide d’une pince osseuse dentaire pour visualiser l’ensemble de la zone chirurgicale. Ici, contrôlez la procédure en visualisant une image microscopique agrandie (grossissement 4x-16x).
- Utilisez de la gaze stérile pour contrôler les saignements tout au long de la procédure, si nécessaire.
- Soulevez avec précaution le reste des apophyses vertébrales L1, en élevant l’arc vertébral L1. Sectionnez le ligamentum flavum pour accéder à la moelle épinière. Soulevez davantage les apophyses caudales de la colonne vertébrale, permettant l’accès à la dure-mère spinale, qui est également sectionnée. Inclinez les apophyses caudales de la colonne vertébrale dans la direction crânienne pour visualiser la pie-mère.
- Regardez à travers la pie-mère pour la veine médiane postérieure, mettant en valeur la ligne médiane de la colonne vertébrale.
- En utilisant la veine comme bissectrice directionnelle, placez une incision à l’aide d’un scalpel microchirurgical tout en épargnant la veine. Placez l’incision sous la veine, dans le plan transversal à travers le diamètre antéropostérieur de la moelle épinière. Sectionnez la moitié de la moelle épinière en éloignant latéralement la lame de la ligne médiane.
REMARQUE : L’incision est unilatérale, sur le côté droit, au niveau du 4e segment lombaire. - Essayez de placer l’incision pour éviter de couper l’artère spinale antérieure. Assurez-vous qu’une pression excessive n’est pas appliquée sur le corps vertébral lors de la coupe de la moelle épinière afin d’épargner l’artère spinale antérieure sur la face ventrale de la moelle épinière.
Figure 1 : Illustration montrant les étapes de la nouvelle technique de la lésion médullaire ouverte chez le rat. (A) Les vertèbres exposées. (B) Ablation des apophyses vertébrales (Th13 et L1). (C) L’arc vertébral soulevé et incliné de la vertèbre L1. (D) Hémisection réalisée sur le côté droit, avec la moelle épinière hémisectée montrée séparément, agrandie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Ne fermez pas la dure-mère directement pendant la fermeture de la plaie. Suturez fermement (taille de suture 4-0) les muscles le long des processus de la colonne vertébrale, en fermant indirectement la petite plaie sur la dure-mère.
- Fermez la couche de tissu conjonctif dorsal avec des sutures.
- Enfin, suturez la peau autour du site d’incision.
3. Soins post-chirurgicaux et suivi
- Laissez les animaux se réveiller dans leurs cages. Gardez le(s) animal(s) au chaud à l’aide d’une lampe chauffante en plus de la pièce à température contrôlée. Ne laissez pas les rats seuls après leur réveil après l’opération, et ne les mettez pas avec d’autres rats dans la même cage.
- Surveillez sa fréquence respiratoire au moins toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’il soit complètement réveillé. Si nécessaire, appliquez une stimulation douce (par exemple, frottez la tête) pour faciliter leur réveil de l’anesthésie.
- Lorsque les animaux sont alertes et suffisamment actifs, transportez-les en toute sécurité jusqu’à l’animalerie.
- Gardez les rats sous étroite surveillance pendant les 24 premières heures suivant la chirurgie. Après les 24 premières heures suivant l’opération, examinez les animaux au moins deux fois par jour jusqu’à la fin de l’expérience, en surveillant les signes de détresse.
- Évaluez-les minutieusement une fois par jour pour détecter tout signe de détresse en utilisant le protocole de bien-être animal de l’établissement pertinent et prenez soin de vérifier leurs plaies pour détecter des signes d’infection et d’inflammation.
REMARQUE : Le stress et l’infection affectent le bien-être des animaux et le résultat des expériences. - Administrer des antibiotiques par voie sous-cutanée tous les jours jusqu’à la fin des expériences. Gardez les animaux dans des cages stériles, un animal par cage, et donnez de la nourriture et de l’eau ad libitum, comme auparavant. À la fin des expériences (ou si un effet indésirable grave est observé pendant la durée de l’expérience), euthanasier les animaux sans cruauté, conformément au protocole institutionnel pertinent en matière de bien-être animal.
NOTA : Ici, les animaux ont été euthanasiés (dans un sommeil profond induit par la combinaison de kétamine-xylazine) en leur administrant d’abord une perfusion physiologique de solution saline (1/3 mL/g p.c.) suivie d’une perfusion de paraformaldéhyde à 4 % (1 mL/g p.c.).
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Representative Results
Après l’hémisection, les rats présentent une paralysie du membre postérieur ipsilatéral (preuve in vivo d’une hémisection réussie). Une évaluation approfondie de l’échantillon ne peut être effectuée qu’après l’ablation de la moelle épinière (voir la figure 2, où la moelle épinière enlevée peut être vue à la fois des côtés ventral et dorsal).
Figure 2 : Vues ventrale et dorsale de l’ablation de la moelle épinière après hémisection. L’ensemble de la moelle épinière enlevée vue de la face ventrale (A) et de la face dorsale (B) montrée côte à côte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tout d’abord, la moelle épinière enlevée est analysée dans son intégralité au microscope à l’aide d’un grossissement de 4x-16x (pour évaluer le degré et la précision de la blessure). L’échantillon est ensuite analysé à l’aide de l’histologie, où le site de la blessure peut être vu plus en détail. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) a été utilisée pour préparer les échantillons (figure 3).
Figure 3 : Échantillon histologique montrant une hémisection. Échantillon histologique coloré à l’hématoxyline et à l’éosine, montrant l’hémisection, vu au microscope (grossissement 16x). Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les figures 2 et 3 montrent que la longueur et l’emplacement de l’incision sont parfaitement acceptables. La qualité des échantillons était au moins aussi bonne que celle des animaux dont la moelle épinière a été hémisectée par l’approche chirurgicale traditionnelle avec laminectomie (pour une description détaillée de la méthode chirurgicale traditionnelle, voir 6). Les images ne sont pas qualitativement différentes du résultat de toute autre approche chirurgicale, même si cette technique est plus rapide et qu’il n’y a pas de laminectomie.
Les résultats montrent que cette technique peut être réalisée beaucoup plus rapidement que l’approche chirurgicale traditionnelle utilisant la laminectomie (11 min contre 35 min). La moelle épinière est exposée pendant 10 à 15 s avec cette méthode, contre un minimum de 3,5 min avec la laminectomie (jusqu’à la fermeture de la dure-mère). En conclusion, cette nouvelle méthode mini-invasive de lésion médullaire sans laminectomie est beaucoup plus rapide et ne nécessite pas d’instruments spécialisés supplémentaires.
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Discussion
Cette technique mini-invasive de lésion de la moelle épinière a été développée lors de l’étude de rats lésés de la moelle épinière, et l’équipe a été confrontée à des problèmes découlant de la chirurgie elle-même (éclats d’os de la laminectomie provoquant une compression et endommageant la moelle épinière, chirurgie prenant trop de temps, cicatrisation lente d’une grande plaie osseuse). En éliminant la laminectomie, la procédure est devenue beaucoup plus rapide (11 min contre 35 min), la structure du canal vertébral est restée intacte, la plaie osseuse était beaucoup plus petite et il n’y avait pas d’éclats d’os qui pourraient endommager la moelle épinière.
L’ablation des apophyses épineuses ne peut pas être éliminée car l’ablation de l’apophyse épineuse supérieure (crânienne) est nécessaire pour incliner l’apophyse épineuse inférieure (caudale) vers l’arrière. L’ablation de l’apophyse épineuse inférieure améliore considérablement la visibilité de la moelle épinière, facilitant l’hémisection.
L’hémisection est la partie la plus critique du protocole. Ici, l’hémisection est effectuée à main levée, bien que ce ne soit pas une condition préalable. Un instrument stéréotaxique peut être utilisé à la place. Le rat peut également être placé dans un cadre stéréotaxique pour stabiliser l’animal pendant la chirurgie6. Cette étape ne nécessitera qu’une légère modification de la technique décrite ici. Cela peut également être utile si quelqu’un avec peu d’expérience effectue la procédure.
Cette nouvelle technique est extrêmement polyvalente. Ici, l’intervention a été réalisée au niveau du segment lombaire L4 (vertèbre L1) ; Cependant, il peut être utilisé dans d’autres segments de la moelle épinière adaptés aux besoins spécifiques de l’expérience réelle (cette technique a également été utilisée dans les régions thoracique et cervicale). Il pourrait également être facilement ajusté pour mettre en œuvre une section complète de la moelle épinière au lieu d’une hémisection. Le soulèvement de l’arc vertébral permet une inspection directe de la partie donnée de la moelle épinière. Ainsi, un petit disque de tissu de la moelle épinière peut également être retiré pour assurer une transection complète.
L’utilisation de cette nouvelle technique ne se limite pas aux rats, mais peut également s’appliquer à d’autres espèces utilisées pour modéliser les lésions de la moelle épinière (par exemple, les souris, les porcs, les chiens). La principale limitation de cette technique est que, comme l’hémisection (ou la transection) ne peut être effectuée que dans les espaces intervertébraux, elle ne convient pas à ceux qui ont spécifiquement besoin que la coupe soit placée dans les espaces vertébraux. De plus, comme il s’agit d’une technique à plaie ouverte, elle n’est pas optimale pour modéliser les contusions ou les blessures par compression.
Cependant, cette technique peut être le choix idéal pour étudier la lésion médullaire ouverte, car l’hémisection (ou la transection) est exécutée avec précision et est facilement reproductible. Les voies vertébrales peuvent également être étudiées avec moins d’artefacts car le canal vertébral reste intact. Il peut être particulièrement utile lors de l’étude d’approches thérapeutiques mini-invasives. En utilisant cette technique, l’attention peut se concentrer uniquement sur le traitement plutôt que sur les effets secondaires possibles de la chirurgie11.
En conclusion, cette nouvelle technique peu invasive ne nécessite ni nouvel équipement ni réglages coûteux, car seul le matériel facilement disponible dans les laboratoires travaillant avec des animaux est utilisé. Il peut facilement être adapté aux besoins spécifiques d’une étude donnée (site de la lésion, hémi- ou transection, type d’animal). Il est également facile à apprendre. Par conséquent, cette modification pourrait intéresser les chercheurs travaillant avec des modèles animaux de lésions médullaires ouvertes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu sembler influencer les travaux rapportés dans cet article.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Gergely Ángyán pour l’œuvre originale. Ce travail de recherche a été financé par l’Université Semmelweis, Budapest, Hongrie. Cette étude a également été financée par le Programme opérationnel hongrois de développement des ressources humaines (EFOP-3.6.2-16-2017-00006). Un soutien supplémentaire a été reçu du Programme d’excellence thématique (2020-4.1.1.-TKP2020) du ministère hongrois de l’Innovation et de la Technologie, dans le cadre du programme thématique Thérapie de l’Université Semmelweis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Augmentin (1,000 mg/200 mg powder) | GlaxoSmithKline, UK | One-time dose of s.c. antibiotics prophylactically (10 mg of amoxicillin and 2 mg clavulanic acid; Augmentin 1,000 mg/200 mg powder). Every day following surgery, 10 mg of amoxicillin and 2 mg of clavulanic acid (Augmentin 1,000 mg/200 mg powder) per day per animal | |
| Betadine | EGIS, Hungary | Disinfect the skin of the surgical area using a povidone-iodine solution | |
| Calypsol (50 mg/mL) | Richter Gedeon, Hungary | Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly | |
| CP XYLAZIN 2% (20 mg/mL) | Produlab Pharma B.V., the Netherlands | Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly | |
| Dental bone forceps | Dentech, Hungary | BS 0127 | Remove the spinous processes of the 13th thoracic vertebra and the 1st lumbar vertebra using dental bone forceps |
| dental surgical micromotor | W&H, Austria | MF-TECTORQUE | Using a dental surgical micromotor, a laminectomy is performed at the L1 vertebra |
| optical microscope | Zeiss, Germany | OPMI19-FC | Control the procedure by viewing an enlarged (16x magnification) microscopic image |
| physiological saline solution (0.9% NaCl) | Fresenius Kabi, Germany | Keep the rat's eyes moist throughout the entire anesthesia using physiological saline solution drops (reapply as necessary) | |
| raspatorium | Dentech, Hungary | FK 1164 | Dissect the muscles attached to the vertebrae with the aid of a raspatorium, until all the spinal ligaments are visible. |
| retractor | Dentech, Hungary | RT 1253 | |
| scalpel | Dentech, Hungary | BB 173 | |
| scalpel | Dentech, Hungary | BB 184 | |
| scalpel blade 12 | B. Braun, Germany | 12 | |
| scalpel blade 20 | B. Braun, Germany | 20 | |
| sterile cut gauze 10 x 10 cm | Sterilux, Hartmann, Germany | ||
| sutures (monofilament, synthetic; absorbable and nonabsorbable), size: 4-0 | B. Braun, Germany | ||
| tweezer (13 cm) | Dentech, Hungary | BD 1555 | |
| tweezer (delicate tissue forceps) | Dentech, Hungary | BD 1670 |
References
- Failli, V., et al. Functional neurological recovery after spinal cord injury is impaired in patients with infections. Brain. 135, Pt 11 3238-3250 (2012).
- Guan, B., Chen, R., Zhong, M., Liu, N., Chen, Q. Protective effect of Oxymatrine against acute spinal cord injury in rats via modulating oxidative stress, inflammation and apoptosis. Metabolic Brain Disease. 35 (1), 149-157 (2020).
- Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Disease Models & Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
- Minakov, A. N., Chernov, A. S., Asutin, D. S., Konovalov, N. A., Telegin, G. B. Experimental models of spinal cord injury in laboratory rats. Acta Naturae. 10 (3), 4-10 (2018).
- Borbély, Z., et al. Effect of rat spinal cord injury (hemisection) on the ex vivo uptake and release of [3H]noradrenaline from a slice preparation. Brain Research Bulletin. 131, 150-155 (2017).
- Brown, A. R., Martinez, M. Thoracic spinal cord hemisection surgery and open-field locomotor assessment in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59738 (2019).
- Taoka, Y., Okajima, K.
- Hou, S., Saltos, T. M., Iredia, I. W., Tom, V. J. Surgical techniques influence local environment of injured spinal cord and cause various grafted cell survival and integration. Journal of Neuroscience Methods. 293, 144-150 (2018).
- Mattucci, S., et al. Development of a traumatic cervical dislocation spinal cord injury model with residual compression in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 322, 58-70 (2019).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Ashammakhi, N., et al. Regenerative therapies for spinal cord injury. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 25 (6), 471-491 (2019).
