Summary
Här beskriver vi en ny, snabb teknik som modellerar öppen ryggmärgsskada hos råttor som eliminerar laminektomi. Lateral hemisektion utförs under visning genom ett mikroskop. Tekniken är mångsidig och kan även användas i hals-, bröst- och ländryggsregionerna hos andra djur.
Abstract
Tekniker för öppna ryggmärgsskador som modellerar lacerationsliknande skador är tidskrävande och invasiva eftersom de involverar laminektomi. Denna nya teknik eliminerar laminektomi genom att ta bort två ryggradsutskott och lyfta och sedan luta svanskotbågen. Det kirurgiska området öppnas upp utan behov av laminektomi. Lateral hemisektion utförs sedan med direkt synlig kontroll under ett mikroskop. Traumat minimeras och kräver endast ett litet bensår.
Denna teknik har flera fördelar: den är snabbare och därför mindre betungande för djuret, och bensåret är mindre. Eftersom laminektomin elimineras är det mindre risk för oönskad skada på ryggmärgen, och det finns inga benflisor som kan orsaka problem (benflisor inbäddade i ryggmärgen kan orsaka svullnad och sekundär skada). Kotkanalen förblir intakt. Den huvudsakliga begränsningen är att hemisektionen endast kan utföras i de intervertebrala utrymmena.
Resultaten visar att denna teknik kan utföras mycket snabbare än den traditionella kirurgiska metoden, med laminektomi (11 min vs. 35 min). Denna teknik kan vara användbar för forskare som arbetar med djurmodeller av öppen ryggmärgsskada eftersom den är allmänt anpassningsbar och inte kräver någon ytterligare specialiserad instrumentering.
Introduction
Ryggmärgsskador är tyvärr vanliga skador hos människor. Ryggmärgsskador kan kompliceras på olika sätt, till exempel av infektioner, och det är kliniskt viktigt att studera dessa skador1. Eftersom det inte finns något entydigt, definitivt botemedel mot ryggmärgsskada, behövs djurmodeller fortfarande för att öka forskarnas förståelse och främja möjliga behandlingar 2,3. Även om slutna skador oftast modelleras (kompression och kontusion) är det kliniskt viktigt att förstå skärsår, vilket endast kan modelleras i öppna skador4. Modeller med öppna sår som använder transsektion eller hemisektion kan användas för att visa en mer exakt lokalisering av ett sår jämfört med modeller med slutna skador, på grund av skadans art (kontusion kontra kirurgiskt snitt). Experiment med öppna sår kan kasta ljus över mer specifika neuronala skador på ett kontrollerat, tillförlitligt och replikerbart sätt5. Den fullständiga eller partiella transsektionen av ryggmärgen är en allmänt använd teknik för öppna sår och kan ses i detalj i artikeln av Brown och Martinez6.
När man studerade öppen ryggmärgsskada hos råttor uppvisade flera djur problem som uppstod vid operationen: benflisor från laminektomin fastnade i ryggmärgen och orsakade svullnad; det större bensåret behövde lång tid för att läka; Operationen tog för lång tid. En alternativ kirurgisk teknik utvecklades för att eliminera dessa problem. Målet var att utveckla en snabbare teknik som är skonsammare för djuret. Denna nyutvecklade teknik är mycket snabbare än traditionella SCI-tekniker. Det kirurgiska tillvägagångssättet är minimalt invasivt, vilket resulterar i ett mindre bensår samtidigt som problem som uppstår vid laminektomi elimineras.
Alla tekniker för öppna sår innebär att man öppnar dura7. Flera nyligen genomförda studier har undersökt olika, nyutvecklade tekniker, i syfte att förbättra de tidigare metoderna 8,9. Även om öppningen av dura inte kan uteslutas med denna nya teknik, orsakar den ett mindre sår på dura samtidigt som den ger en pålitlig, kontrollerad skada på ryggmärgen. Genom att konsultera litteraturen om ryggmärgsskadetekniker försökte många författare minimera operationstiden genom att genomföra mindre ändringar av den ursprungliga tekniken10. Laminektomi är alltid en del av dessa kirurgiska ingrepp, även om det är tidskrävande och kräver att ett större bensårgörs. Denna kirurgiska teknik kan vara lämplig för forskare som använder modeller för ryggmärgsskada med öppna sår, särskilt fullständig transsektion eller lateral hemisektion utförd i de intervertebrala utrymmena (Figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med EU-direktivet (2010/63/EU) och godkändes av den djuretiska kommittén vid den ungerska nationella myndigheten för livsmedelskedjesäkerhet (PEI/001/2894-11/2014). Alla tillämpliga institutionella och statliga bestämmelser om etisk användning av djur följdes under denna studie.
1. Förberedelse före operationen
- Sterilisera alla instrument som används under proceduren (se materialtabellen) och desinficera ytorna där arbetet ska utföras före proceduren.
- Injicera en engångsdos subkutan antibiotika profylaktiskt.
OBS: Se materialtabellen för information om antibiotikadosering. - Lämna djuren i operationssalen i 1 timme för att acklimatisera dem och minska deras stress före operationen.
- Bedöva råttan via en intramuskulär injektion av en kombination av ketamin och xylazin (ketamin 80 mg/kg kroppsvikt och xylazin 8 mg/kg kroppsvikt).
OBS: Förutom anestesi ger kombinationen ketamin-xylazin tillräcklig smärtlindring för denna procedur. Smärtlindringsregimen kan modifieras enligt de institutionella riktlinjerna för djuranvändning. - Håll råttan varm under ingreppet med hjälp av ett uppvärmt bord eller infrarött ljus och håll ögonen fuktiga under hela narkosen med hjälp av oftalmisk salva (applicera igen vid behov).
- Fixera djuret på operationsbordet med hjälp av kirurgtejp på fram- och baktassarna och svansen, och beroende på skadestället, även på nacken. Om det behövs, placera råttan i en stereotaktisk ram för att stabilisera den under operationen.
- Använd steril kirurgisk sutur, placera en ögla runt råttans övre framtänder och fixera denna på kanten av operationsbordet.
- Dra ut tungan i sidled för luftvägshantering.
- Raka pälsen på ryggen, minst 2 cm åt varje håll där snittet ska göras.
- Desinficera huden i operationsområdet minst tre gånger med en povidon-jodlösning och steril gasbinda. Var särskilt noga med att blötlägga pälsen som omger området. Fäst operationsområdet med ett sterilt draperi.
- Bedöm anestesiens lämplighet innan du gör det första snittet genom att nypa ihop djurets tår och svans. Fortsätt att övervaka anestesiens tillräcklighet under hela ingreppet.
2. Kirurgi
- Placera hudsnittet med ett skalpellblad 20. För att öppna operationsområdet, placera ett 2-2,5 cm långt snitt längs ryggraden och skär igenom alla hudlager. Placera detta snitt parallellt med ryggraden med L1-kotan som mittpunkt, så att den sträcker sig ~1 cm i både kranial- och kaudalriktningen längs ryggraden.
- Mobilisera sidorna av såret genom att skära igenom bindväven som omger musklerna.
- Placera två parallella snitt längs ryggraden och penetrera benhinnan. Placera snitten precis intill ryggradsutskotten på båda sidor, över avståndet mellan Th13- och L1-kotorna.
- Dissekera musklerna som är fästa vid kotorna med hjälp av ett raspatorium tills alla ryggradsligament är synliga. Sätt på plats en upprullningsdon.
- Ta bort ryggradsutskotten i den 13:e bröstkotan och den 1:a ländkotan med hjälp av en tandbenstång för att visualisera hela operationsområdet. Härpå, kontrollera proceduren genom att view en förstorad (4x-16x förstoring) mikroskopisk bild.
- Använd steril gasbinda för att kontrollera blödning under hela proceduren, vid behov.
- Lyft försiktigt återstoden av L1-ryggradsutskotten och höj L1-kotbågen. Skär av ligamentum flavum för att komma åt ryggmärgen. Höj de kaudala ryggradsutskotten ytterligare, vilket ger tillgång till spinal dura mater, som också är avskuren. Tippa de kaudala ryggradsutskotten i kraniell riktning för att visualisera pia mater.
- Titta genom pia mater för den bakre medianvenen, som visar ryggradens mittlinje.
- Använd venen som en riktad bisektris, placera ett snitt med en mikrokirurgisk skalpell samtidigt som du skonar venen. Placera snittet under venen, i det tvärgående planet genom ryggmärgens anteroposteriora diameter. Skär av halva ryggmärgen genom att flytta bladet i sidled bort från mittlinjen.
OBS: Snittet är ensidigt, på höger sida, vid det 4:e ländryggssegmentet. - Försök att placera snittet för att undvika att skära av den främre spinalartären. Se till att övertryck inte appliceras på ryggradskroppen när du klipper ryggmärgen för att skona den främre ryggartären på ryggmärgens ventrala sida.
Figur 1: Konstverk som visar stegen i den nya öppna SCI-tekniken på råttor. A) De exponerade ryggkotorna. B) Borttagna ryggradsutskott (Th13 och L1). (C) L1-kotans lyfta och lutande kotbåge. (D) Hemisektion utförd på höger sida, med hemisekterad ryggmärg visad separat, inzoomad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Stäng inte dura mater direkt under sårförslutningen. Sutur (suturstorlek 4-0) musklerna längs ryggradsutskotten och stäng indirekt det lilla såret på dura mater.
- Stäng det dorsala bindvävsskiktet med suturer.
- Sy slutligen huden runt snittstället.
3. Postoperativ vård och uppföljning
- Låt djuren vakna i sina burar. Håll djuret/djuren varma med hjälp av en värmelampa utöver det temperaturkontrollerade rummet. Lämna inte råttorna ensamma efter att de vaknat efter operationen, och sätt dem inte tillsammans med andra råttor i samma bur.
- Övervaka deras andningsfrekvens minst var 10:e minut tills de är helt vakna. Om det behövs, applicera mild stimulering (t.ex. gnugga huvudet) för att hjälpa dem att vakna från anestesi.
- När djuren är pigga och tillräckligt aktiva, transportera dem säkert tillbaka till djurhuset.
- Håll råttorna under noggrann uppsikt under de första 24 timmarna efter operationen. Efter de första 24 timmarna efter operationen kontrolleras djuren minst två gånger om dagen fram till slutet av försöket och övervaknings för tecken på lidande.
- Bedöm dem noggrant en gång om dagen för tecken på lidande med hjälp av relevant institutionellt djurskyddsprotokoll och var särskilt noga med att kontrollera deras sår för tecken på infektion och inflammation.
OBS: Stress och infektion påverkar djurens välfärd och resultatet av försöken. - Administrera antibiotika subkutant varje dag fram till slutet av experimenten. Håll djuren i sterila burar, ett djur per bur, och ge mat och vatten ad libitum, samma som tidigare. I slutet av försöken (eller om någon allvarlig biverkning observeras under försökets tidsram) ska djuren avlivas på ett humant sätt, i enlighet med relevant institutionellt djurskyddsprotokoll.
OBS: Här avlivades djuren (under djup sömn inducerad av kombinationen ketamin och xylazin) genom att först administrera en fysiologisk koksaltsperfusion (1/3 ml/g kroppsvikt) följt av en 4 % paraformaldehydperfusion (1 ml/g kroppsvikt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter hemisektionen visar råttorna förlamning i det ipsilaterala bakbenet (in vivo bevis på lyckad hemisektion). Noggrann provutvärdering kan endast göras efter avlägsnande av ryggmärgen (se figur 2, där den borttagna ryggmärgen kan ses från både ventrala och dorsala sidan).
Figur 2: Ventrala och dorsala vyer av den borttagna ryggmärgen efter hemisektion. Hela den borttagna ryggmärgen sedd från den ventrala sidan (A) och den dorsala sidan (B) sedd sida vid sida. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Först analyseras den borttagna ryggmärgen i sin helhet under ett mikroskop med 4x-16x förstoring (för att utvärdera skadans grad och precision). Provet analyseras sedan vidare med hjälp av histologi, där platsen för skadan kan ses mer i detalj. Hematoxylin och eosin (H&E) färgning användes för att bereda proverna (figur 3).
Figur 3: Histologiskt prov som visar hemisektion. Histologiskt prov färgat med hematoxylin och eosin, som visar hemisektionen, sett i mikroskop (16x förstoring). Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 och figur 3 visar att snittet är helt acceptabelt i längd och placering. Kvaliteten på proverna var minst lika bra som de som erhölls från djur vars ryggmärg hemisekterades med den traditionella kirurgiska metoden med laminektomi (för en detaljerad beskrivning av den traditionella kirurgiska metoden, se 6). Bilderna skiljer sig inte kvalitativt från resultatet av någon annan kirurgisk metod, även om denna teknik är snabbare och det inte finns någon laminektomi.
Resultaten visar att denna teknik kan utföras mycket snabbare än den traditionella kirurgiska metoden med laminektomi (11 min vs. 35 min). Ryggmärgen exponeras i 10-15 sekunder med denna metod, jämfört med minst 3,5 minuter med laminektomi (tills duran). Sammanfattningsvis är denna nya minimalinvasiva SCI-metod utan laminektomi mycket snabbare och kräver ingen ytterligare specialiserad instrumentering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna minimalinvasiva ryggmärgsskadeteknik utvecklades när man studerade ryggmärgsskadade råttor, och teamet ställdes inför problem som uppstod från själva operationen (benflisor från laminektomin som orsakar kompression och skadar ryggmärgen, operationen tar för lång tid, långsam läkning av ett stort bensår). Genom att eliminera laminektomin blev ingreppet mycket snabbare (11 min jämfört med 35 min), ryggradskanalens struktur förblev intakt, bensåret var mycket mindre och det fanns inga benflisor som kunde skada ryggmärgen.
Avlägsnandet av de spinösa utskotten kan inte elimineras eftersom avlägsnandet av det övre (kraniala) spinösa utskottet är nödvändigt för att luta det nedre (kaudala) spinösa utskottet bakåt. Avlägsnandet av den nedre ryggradsprocessen förbättrar avsevärt ryggmärgens synlighet, vilket underlättar hemisektion.
Hemisektionen är den mest kritiska delen av protokollet. Här utförs hemisektionen på fri hand, även om detta inte är en förutsättning. Ett stereotaktiskt instrument kan användas istället. Råttan kan också placeras i en stereotaktisk ram för att stabilisera djuret under operation6. Detta steg kräver endast en liten modifiering av den teknik som beskrivs här. Detta kan också vara till hjälp om någon med liten erfarenhet utför proceduren.
Denna nya teknik är extremt mångsidig. Här utfördes ingreppet vid L4 ländryggssegmentet (L1-kotan); Den kan dock användas i andra segment av ryggmärgen som är skräddarsydda för de specifika behoven i det aktuella experimentet (denna teknik har även använts i bröst- och halsregionerna). Den kan också enkelt justeras för att genomföra en fullständig transsektion av ryggmärgen istället för en hemisektion. Att lyfta kotbågen möjliggör direkt inspektion av den givna delen av ryggmärgen. Således kan en liten skiva av ryggmärgsvävnad också tas bort för att säkerställa fullständig transsektion.
Användningen av denna nya teknik är inte begränsad till råttor utan kan också tillämpas på andra arter som används för att modellera ryggmärgsskador (t.ex. möss, grisar, hundar). Den huvudsakliga begränsningen med denna teknik är att eftersom hemisektionen (eller transsektionen) endast kan utföras i intervertebrala utrymmen, är den inte lämplig för dem som specifikt behöver snittet för att placeras i vertebrala utrymmen. Dessutom, eftersom det är en öppen sårteknik, är den inte optimal för modellering av kontusioner eller kompressionsskador.
Denna teknik kan dock vara det perfekta valet för att studera öppen ryggmärgsskada, eftersom hemisektionen (eller transsektionen) utförs exakt och är lätt reproducerbar. Ryggradsbanor kan också studeras med färre artefakter eftersom kotkanalen förblir intakt. Det kan vara särskilt användbart när man studerar minimalt invasiva terapeutiska metoder. Med hjälp av denna teknik kan fokus ligga enbart på behandlingen istället för på eventuella biverkningar av operationen11.
Sammanfattningsvis kräver denna nya, minimalt invasiva teknik varken ny utrustning eller dyra inställningar eftersom endast utrustning som är lättillgänglig i laboratorier som arbetar med djur används. Den kan enkelt anpassas till de specifika behoven i en viss studie (skadeställe, hemi- eller transsektion, typ av djur). Det är också lätt att lära sig. Därför kan denna modifiering vara av intresse för forskare som arbetar med öppna SCI-djurmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några kända konkurrerande ekonomiska intressen eller personliga relationer som skulle kunna ha påverkat det arbete som redovisas i denna uppsats.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Gergely Ángyán för det ursprungliga konstverket. Detta forskningsarbete finansierades av Semmelweis University, Budapest, Ungern. Denna studie stöddes också av det ungerska operativa programmet för utveckling av mänskliga resurser (EFOP-3.6.2-16-2017-00006). Ytterligare stöd erhölls från det tematiska excellensprogrammet (2020-4.1.1.-TKP2020) från ministeriet för innovation och teknik i Ungern, inom ramen för det tematiska programmet för terapi vid Semmelweis universitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Augmentin (1,000 mg/200 mg powder) | GlaxoSmithKline, UK | One-time dose of s.c. antibiotics prophylactically (10 mg of amoxicillin and 2 mg clavulanic acid; Augmentin 1,000 mg/200 mg powder). Every day following surgery, 10 mg of amoxicillin and 2 mg of clavulanic acid (Augmentin 1,000 mg/200 mg powder) per day per animal | |
| Betadine | EGIS, Hungary | Disinfect the skin of the surgical area using a povidone-iodine solution | |
| Calypsol (50 mg/mL) | Richter Gedeon, Hungary | Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly | |
| CP XYLAZIN 2% (20 mg/mL) | Produlab Pharma B.V., the Netherlands | Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly | |
| Dental bone forceps | Dentech, Hungary | BS 0127 | Remove the spinous processes of the 13th thoracic vertebra and the 1st lumbar vertebra using dental bone forceps |
| dental surgical micromotor | W&H, Austria | MF-TECTORQUE | Using a dental surgical micromotor, a laminectomy is performed at the L1 vertebra |
| optical microscope | Zeiss, Germany | OPMI19-FC | Control the procedure by viewing an enlarged (16x magnification) microscopic image |
| physiological saline solution (0.9% NaCl) | Fresenius Kabi, Germany | Keep the rat's eyes moist throughout the entire anesthesia using physiological saline solution drops (reapply as necessary) | |
| raspatorium | Dentech, Hungary | FK 1164 | Dissect the muscles attached to the vertebrae with the aid of a raspatorium, until all the spinal ligaments are visible. |
| retractor | Dentech, Hungary | RT 1253 | |
| scalpel | Dentech, Hungary | BB 173 | |
| scalpel | Dentech, Hungary | BB 184 | |
| scalpel blade 12 | B. Braun, Germany | 12 | |
| scalpel blade 20 | B. Braun, Germany | 20 | |
| sterile cut gauze 10 x 10 cm | Sterilux, Hartmann, Germany | ||
| sutures (monofilament, synthetic; absorbable and nonabsorbable), size: 4-0 | B. Braun, Germany | ||
| tweezer (13 cm) | Dentech, Hungary | BD 1555 | |
| tweezer (delicate tissue forceps) | Dentech, Hungary | BD 1670 |
References
- Failli, V., et al. Functional neurological recovery after spinal cord injury is impaired in patients with infections. Brain. 135, Pt 11 3238-3250 (2012).
- Guan, B., Chen, R., Zhong, M., Liu, N., Chen, Q. Protective effect of Oxymatrine against acute spinal cord injury in rats via modulating oxidative stress, inflammation and apoptosis. Metabolic Brain Disease. 35 (1), 149-157 (2020).
- Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Disease Models & Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
- Minakov, A. N., Chernov, A. S., Asutin, D. S., Konovalov, N. A., Telegin, G. B. Experimental models of spinal cord injury in laboratory rats. Acta Naturae. 10 (3), 4-10 (2018).
- Borbély, Z., et al. Effect of rat spinal cord injury (hemisection) on the ex vivo uptake and release of [3H]noradrenaline from a slice preparation. Brain Research Bulletin. 131, 150-155 (2017).
- Brown, A. R., Martinez, M. Thoracic spinal cord hemisection surgery and open-field locomotor assessment in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59738 (2019).
- Taoka, Y., Okajima, K.
- Hou, S., Saltos, T. M., Iredia, I. W., Tom, V. J. Surgical techniques influence local environment of injured spinal cord and cause various grafted cell survival and integration. Journal of Neuroscience Methods. 293, 144-150 (2018).
- Mattucci, S., et al. Development of a traumatic cervical dislocation spinal cord injury model with residual compression in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 322, 58-70 (2019).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Ashammakhi, N., et al. Regenerative therapies for spinal cord injury. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 25 (6), 471-491 (2019).
