Summary
В этой статье мы опишем новый, быстрый метод моделирования открытой травмы спинного мозга у крыс, который исключает ламинэктомию. Латеральная гемисекция проводится при просмотре через микроскоп. Методика универсальна и также может быть использована в шейном, грудном и поясничном отделах спинного мозга других животных.
Abstract
Методы открытой травмы спинного мозга, моделирующие рваные раны, являются трудоемкими и инвазивными, поскольку они включают ламинэктомию. Эта новая методика исключает ламинэктомию путем удаления двух остистых отростков и подъема, а затем наклона хвостовой дуги позвонка. Операционная область открывается без необходимости ламинэктомии. Затем выполняется латеральная гемисекция под непосредственным видимым контролем под микроскопом. Травма сведена к минимуму, требуется лишь небольшая костная рана.
Эта методика имеет ряд преимуществ: она быстрее и, следовательно, менее обременительна для животного, а костная рана меньше. Поскольку ламинэктомия исключается, снижается вероятность нежелательного повреждения спинного мозга, и отсутствуют осколки костей, которые могут вызвать проблемы (осколки костей, застрявшие в спинном мозге, могут вызвать отек и вторичное повреждение). Позвоночный канал остается неповрежденным. Основным ограничением является то, что гемисекция может быть выполнена только в межпозвонковых пространствах.
Результаты показывают, что этот метод может быть выполнен намного быстрее, чем традиционный хирургический подход с использованием ламинэктомии (11 мин против 35 мин). Этот метод может быть полезен для исследователей, работающих с животными моделями открытой травмы спинного мозга, поскольку он широко адаптируется и не требует каких-либо дополнительных специализированных инструментов.
Introduction
Травмы спинного мозга (ТСМ), к сожалению, являются распространенными травмами у людей. ТСМ могут осложняться по-разному, например, инфекциями, и клинически важно изучать эти повреждения1. Поскольку не существует единственного, определенного лекарства от ТСМ, по-прежнему необходимы животные модели для дальнейшего понимания исследователями и продвижения возможных методов лечения 2,3. Несмотря на то, что чаще всего моделируются закрытые травмы (сдавливание и ушиб), клинически важно понимать рваные раны, которые могут быть смоделированы только при открытых травмах4. Модели открытой раны с использованием транссекции или гемисекции могут быть использованы для демонстрации более точной локализации раны по сравнению с моделями закрытой травмы из-за характера травмы (ушиб или хирургический разрез). Эксперименты с открытой раной могут пролить свет на более специфические повреждения нейронов контролируемым, надежным и воспроизводимым способом5. Полное или частичное рассечение спинного мозга является широко используемым методом открытой намотки и может быть подробно рассмотрено в статье Brown and Martinez6.
При изучении открытой травмы спинного мозга у крыс у нескольких животных были выявлены проблемы, возникшие в результате операции: осколки костей от ламинэктомии застряли в спинном мозге и вызвали отек; Большая костная рана долго заживала; Операция заняла слишком много времени. Для устранения этих проблем была разработана альтернативная хирургическая техника. Цель состояла в том, чтобы разработать более быструю технику, более щадящую для животного. Эта недавно разработанная техника намного быстрее, чем традиционные методы ТСМ. Хирургический подход является минимально инвазивным, что приводит к уменьшению костной раны и устранению проблем, возникающих при ламинэктомии.
Все методы открытой намотки предполагают вскрытие твердой мозговой оболочки7. В нескольких недавних исследованиях были изучены различные, недавно разработанные методы, направленные на улучшение предыдущих методов 8,9. Несмотря на то, что вскрытие твердой мозговой оболочки не может быть исключено с помощью этой новой техники, она вызывает меньшую рану на твердой мозговой оболочке, обеспечивая надежную, контролируемую травму спинного мозга. Обращаясь к литературе по технике повреждения спинного мозга, многие авторы пытались свести к минимуму время операции, внося незначительные изменения впервоначальную методику. Ламинэктомия всегда является частью этих хирургических процедур, хотя она занимает много времени и требует нанесения более крупной костной раны. Этот хирургический метод может быть подходящим для исследователей, использующих модели повреждений спинного мозга с открытой раной, в частности, полную транссекцию или боковую гемисекцию, выполняемую в межпозвонковых пространствах (рис. 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с животными были проведены в соответствии с Директивой ЕС (2010/63/EU) и были одобрены комитетом по этике животных Венгерского национального управления по безопасности пищевой цепи (PEI/001/2894-11/2014). В ходе исследования были соблюдены все применимые институциональные и правительственные нормы, касающиеся этичного использования животных.
1. Подготовка перед операцией
- Перед процедурой простерилизуйте все инструменты, используемые во время процедуры (см. Таблицу материалов), и продезинфицируйте поверхности, на которых будет выполняться работа.
- Вводят однократную дозу подкожных антибиотиков в профилактических целях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию о дозировке антибиотиков см. в таблице материалов. - Оставьте животных в операционной на 1 час, чтобы они акклиматизировались и снизили стресс перед операцией.
- Обезболить крысу путем внутримышечной инъекции комбинации кетамина и ксилазина (кетамин 80 мг/кг массы тела (м.т.) и ксилазин 8 мг/кг м.т.).
ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к анестезии,комбинация этамина и ксилазина обеспечивает достаточную анальгезию для этой процедуры. Режим анальгезии может быть изменен в соответствии с рекомендациями по использованию животных в учреждении. - Держите крысу в тепле во время процедуры, используя нагретый стол или инфракрасный свет, и держите глаза влажными на протяжении всей анестезии, используя офтальмологическую мазь (при необходимости наносите повторно).
- Зафиксируйте животное на операционном столе с помощью хирургической ленты на передних и задних лапах и хвосте, а также, в зависимости от места травмы, на шее. При необходимости поместите крысу в стереотаксическую рамку, чтобы стабилизировать ее во время операции.
- С помощью стерильного хирургического шва наложите петлю на верхние передние зубы крысы и зафиксируйте ее на краю операционного стола.
- Вытяните язык вбок для управления дыхательными путями.
- Сбрейте мех на спине, не менее чем на 2 см в каждую сторону от того места, где будет сделан разрез.
- Продезинфицируйте кожу операционного поля не менее трех раз, используя раствор повидон-йода и стерильную марлю. Позаботьтесь о том, чтобы замочить мех, окружающий территорию. Закрепите место операции стерильной простыней.
- Оцените адекватность анестезии перед установкой первого разреза, зажав пальцы ног и хвост животного. Продолжайте контролировать адекватность анестезии в течение всей процедуры.
2. Хирургия
- Сделайте разрез кожи с помощью лезвия скальпеля 20. Чтобы открыть операционную зону, сделайте разрез длиной 2-2,5 см вдоль позвоночника, прорезав все слои кожи. Расположите этот разрез параллельно позвоночному столбу, используя позвонок L1 в качестве средней точки, чтобы он простирался на ~1 см как в краниальном, так и в каудальном направлении вдоль позвоночного столба.
- Мобилизуйте боковые стороны раны, разрезая соединительную ткань, окружающую мышцы.
- Сделайте два параллельных разреза вдоль позвоночника, проникая в надкостницу. Сделайте разрезы рядом с отростками позвоночника с обеих сторон, охватывая расстояние между позвонками Th13 и L1.
- Рассекайте мышцы, прикрепленные к позвонкам, с помощью распатория до тех пор, пока не будут видны все спинномозговые связки. Установите на место втягивающее устройство.
- Удалить спинномозговые отростки13-го грудного позвонка и1-го поясничного позвонка с помощью зубных костных щипцов для визуализации всей операционной области. После этого контролируйте процедуру, просматривая увеличенное (4-16-кратное увеличение) микроскопическое изображение.
- Используйте стерильную марлю для остановки кровотечения на протяжении всей процедуры, когда это необходимо.
- Осторожно приподнимите оставшиеся отростки L1 позвоночника, приподняв дугу позвонка L1. Разрежьте желтую связку, чтобы получить доступ к спинному мозгу. Поднимите каудальные отростки позвоночника дальше, открывая доступ к твердой мозговой оболочке, которая также разрывается. Наклоните каудальные отростки позвоночника в краниальном направлении, чтобы визуализировать pia mater.
- Посмотрите через pia mater на наличие задней срединной вены, демонстрирующей среднюю линию позвоночника.
- Используя вену в качестве направленной биссектрисы, сделайте разрез с помощью микрохирургического скальпеля, сохраняя при этом вену. Разрез делают под веной, в поперечной плоскости через переднезадний диаметр спинного мозга. Перережьте половину спинного мозга, переместив лезвие в сторону от центральной линии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез односторонний, с правой стороны, на4-м поясничном сегменте. - Постарайтесь сделать разрез так, чтобы не перерезать переднюю спинномозговую артерию. Следите за тем, чтобы при перерезании спинного мозга на тело позвонка не оказывалось избыточного давления, чтобы сохранить переднюю спинномозговую артерию на вентральной стороне спинного мозга.
Рисунок 1: Рисунок, показывающий этапы новой открытой техники ТСМ на крысах. (А) Обнаженные позвонки. (B) Удаление спинномозговых отростков (Th13 и L1). (C) Поднятая и наклоненная дуга позвонка L1. (D) Гемисекция, выполненная с правой стороны, с гемисекцией спинного мозга, показанной отдельно, увеличенной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
- Не закрывайте твердую мозговую оболочку непосредственно во время закрытия раны. Плотно сшивают (размер шва 4-0) мышцы вдоль спинномозговых отростков, опосредованно закрывая небольшую ранку на твердой мозговой оболочке.
- Закройте дорсальный соединительнотканный слой швами.
- Наконец, наложите швы на кожу вокруг места разреза.
3. Послеоперационный уход и последующее наблюдение
- Дайте животным проснуться в своих клетках. Согревайте животное (животных) с помощью тепловой лампы в дополнение к комнате с регулируемой температурой. Не оставляйте крыс одних после того, как они проснулись после операции, и не сажайте их вместе с другими крысами в одну клетку.
- Контролируйте частоту дыхания не реже чем каждые 10 минут, пока он полностью не придет в себя. При необходимости применяйте мягкую стимуляцию (например, растирание головы), чтобы помочь им проснуться от анестезии.
- Когда животные будут бдительны и достаточно активны, безопасно транспортируйте их обратно в домик для животных.
- Держите крыс под пристальным наблюдением в течение первых 24 часов после операции. После первых 24 часов после операции осматривайте животных не реже двух раз в день до конца эксперимента, отслеживая признаки дистресса.
- Тщательно осматривайте их один раз в день на наличие признаков стресса, используя соответствующий протокол благополучия животных, и уделяйте особое внимание проверке их ран на наличие признаков инфекции и воспаления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стресс и инфекции влияют на благополучие животных и результаты экспериментов. - Вводите антибиотики подкожно каждый день до окончания экспериментов. Держите животных в стерильных клетках, по одному животному в клетке, и давайте им еду и воду вволю, как и раньше. По окончании экспериментов (или если в течение эксперимента будет наблюдаться какая-либо серьезная побочная реакция) усыпляйте животных гуманно, в соответствии с соответствующим институциональным протоколом благополучия животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном случае животных усыпляли (в глубоком сне, вызванном комбинацией кетамина и ксилазина) путем введения физиологического раствора (1/3 мл/г м.т.), а затем 4% перфузии параформальдегида (1 мл/г м.т.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После гемисекции у крыс наблюдается паралич ипсилатеральной задней конечности (доказательство успешной гемисекции in vivo ). Тщательная оценка образца может быть проведена только после удаления спинного мозга (см. рисунок 2, где удаленный спинной мозг виден как с вентральной, так и с дорсальной стороны).
Рисунок 2: Вентральный и дорсальный виды удаленного спинного мозга после гемисекции. Весь удаленный спинной мозг при осмотре с вентральной стороны (А) и дорсальной стороны (В) показан рядом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Сначала удаленный спинной мозг анализируется целиком под микроскопом с 4-16-кратным увеличением (для оценки степени и точности травмы). Затем образец дополнительно анализируется с помощью гистологии, где место повреждения можно увидеть более подробно. Для подготовки образцов использовали окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) (рис. 3).
Рисунок 3: Гистологический образец, показывающий гемисекцию. Гистологический образец, окрашенный гематоксилином и эозином, показывает гемисекцию, рассматриваемую под микроскопом (16-кратное увеличение). Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
На рисунках 2 и 3 видно, что разрез вполне приемлем по длине и расположению. Качество образцов было, по крайней мере, таким же хорошим, как и у животных, спинной мозг которых был гемисектирован с использованием традиционного хирургического доступа с ламинэктомией (подробное описание традиционного хирургического метода см. в 6). Снимки качественно не отличаются от результата любого другого хирургического подхода, несмотря на то, что эта методика более быстрая и отсутствует ламинэктомия.
Результаты показывают, что этот метод может быть выполнен намного быстрее, чем традиционный хирургический подход с использованием ламинэктомии (11 мин против 35 мин). Спинной мозг обнажается в течение 10-15 с при этом методе, по сравнению с минимум 3,5 мин при ламинэктомии (до закрытия твердой мозговой оболочки). В заключение, этот новый минимально инвазивный метод ТСМ без ламинэктомии намного быстрее и не требует каких-либо дополнительных специализированных инструментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот минимально инвазивный метод травмы спинного мозга был разработан при изучении крыс с травмами спинного мозга, и команда столкнулась с проблемами, возникающими из-за самой операции (осколки костей от ламинэктомии, вызывающие компрессию и повреждение спинного мозга, слишком долгая операция, медленное заживление большой костной раны). Благодаря устранению ламинэктомии процедура стала намного быстрее (11 мин против 35 мин), структура позвоночного канала осталась неповрежденной, костная рана была намного меньше, отсутствовали костные осколки, которые могли бы повредить спинной мозг.
Удаление остистых отростков не может быть устранено, так как удаление верхнего (краниального) остистого отростка необходимо для наклона нижнего (каудального) остистого отростка назад. Удаление нижнего остистого отростка значительно улучшает видимость спинного мозга, облегчая гемисекцию.
Гемисекция является наиболее важной частью протокола. Здесь гемисекция выполняется от руки, хотя это не является обязательным условием. Вместо него можно использовать стереотаксический инструмент. Крыса также может быть помещена в стереотаксическую рамку для стабилизации животного во время операции6. Этот шаг потребует лишь небольшой модификации техники, описанной здесь. Это также может быть полезно, если процедуру выполняет человек с небольшим опытом.
Эта новая методика чрезвычайно универсальна. Здесь процедура проводилась в поясничном сегменте L4 (позвонок L1); Тем не менее, он может быть использован в других сегментах спинного мозга в соответствии с конкретными потребностями реального эксперимента (этот метод также использовался в грудном и шейном отделах). Его также можно легко настроить для осуществления полного рассечения спинного мозга вместо гемисекции. Подъем дуги позвонка позволяет провести непосредственный осмотр данного участка спинного мозга. Таким образом, небольшой диск ткани спинного мозга также может быть удален для обеспечения полного рассечения.
Использование этого нового метода не ограничивается крысами, но также может быть применено к другим видам, используемым для моделирования травм спинного мозга (например, мыши, свиньи, собаки). Основным ограничением этой методики является то, что, поскольку гемисекция (или транссекция) может быть выполнена только в межпозвонковых пространствах, она не подходит для тех, кому конкретно нужно, чтобы разрез был сделан в позвоночных пространствах. Более того, поскольку это открытая методика, она не является оптимальной для моделирования ушибов или компрессионных травм.
Тем не менее, этот метод может быть идеальным выбором для изучения открытой ТСМ, так как гемисекция (или транссекция) выполняется точно и легко воспроизводима. Спинномозговые пути также могут быть изучены с меньшим количеством артефактов, поскольку позвоночный канал остается нетронутым. Это может быть особенно полезно при изучении малоинвазивных терапевтических подходов. Используя эту технику, можно сосредоточить внимание исключительно на лечении, а не на возможных побочных эффектах операции11.
В заключение следует отметить, что этот новый, минимально инвазивный метод не требует ни нового оборудования, ни дорогостоящего оборудования, поскольку используется только оборудование, доступное в лабораториях, работающих с животными. Он может быть легко адаптирован к конкретным потребностям данного исследования (место травмы; геми- или транссекция; тип животного). Он также прост в освоении. Поэтому данная модификация может представлять интерес для исследователей, работающих с открытыми моделями ТСМ на животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этой статье.
Acknowledgments
Авторы благодарят Гергея Ангьяна (Gergely Ángyán) за оригинальную работу. Эта исследовательская работа была профинансирована Университетом Земмельвайса, Будапешт, Венгрия. Это исследование также проводилось при поддержке Венгерской оперативной программы развития людских ресурсов (EFOP-3.6.2-16-2017-00006). Дополнительная поддержка была получена от Тематической программы передового опыта (2020-4.1.1.-TKP2020) Министерства инноваций и технологий Венгрии в рамках тематической программы «Терапия» Университета Земмельвайса.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Augmentin (1,000 mg/200 mg powder) | GlaxoSmithKline, UK | One-time dose of s.c. antibiotics prophylactically (10 mg of amoxicillin and 2 mg clavulanic acid; Augmentin 1,000 mg/200 mg powder). Every day following surgery, 10 mg of amoxicillin and 2 mg of clavulanic acid (Augmentin 1,000 mg/200 mg powder) per day per animal | |
| Betadine | EGIS, Hungary | Disinfect the skin of the surgical area using a povidone-iodine solution | |
| Calypsol (50 mg/mL) | Richter Gedeon, Hungary | Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly | |
| CP XYLAZIN 2% (20 mg/mL) | Produlab Pharma B.V., the Netherlands | Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly | |
| Dental bone forceps | Dentech, Hungary | BS 0127 | Remove the spinous processes of the 13th thoracic vertebra and the 1st lumbar vertebra using dental bone forceps |
| dental surgical micromotor | W&H, Austria | MF-TECTORQUE | Using a dental surgical micromotor, a laminectomy is performed at the L1 vertebra |
| optical microscope | Zeiss, Germany | OPMI19-FC | Control the procedure by viewing an enlarged (16x magnification) microscopic image |
| physiological saline solution (0.9% NaCl) | Fresenius Kabi, Germany | Keep the rat's eyes moist throughout the entire anesthesia using physiological saline solution drops (reapply as necessary) | |
| raspatorium | Dentech, Hungary | FK 1164 | Dissect the muscles attached to the vertebrae with the aid of a raspatorium, until all the spinal ligaments are visible. |
| retractor | Dentech, Hungary | RT 1253 | |
| scalpel | Dentech, Hungary | BB 173 | |
| scalpel | Dentech, Hungary | BB 184 | |
| scalpel blade 12 | B. Braun, Germany | 12 | |
| scalpel blade 20 | B. Braun, Germany | 20 | |
| sterile cut gauze 10 x 10 cm | Sterilux, Hartmann, Germany | ||
| sutures (monofilament, synthetic; absorbable and nonabsorbable), size: 4-0 | B. Braun, Germany | ||
| tweezer (13 cm) | Dentech, Hungary | BD 1555 | |
| tweezer (delicate tissue forceps) | Dentech, Hungary | BD 1670 |
References
- Failli, V., et al. Functional neurological recovery after spinal cord injury is impaired in patients with infections. Brain. 135, Pt 11 3238-3250 (2012).
- Guan, B., Chen, R., Zhong, M., Liu, N., Chen, Q. Protective effect of Oxymatrine against acute spinal cord injury in rats via modulating oxidative stress, inflammation and apoptosis. Metabolic Brain Disease. 35 (1), 149-157 (2020).
- Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: from pathology to potential therapies. Disease Models & Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
- Minakov, A. N., Chernov, A. S., Asutin, D. S., Konovalov, N. A., Telegin, G. B. Experimental models of spinal cord injury in laboratory rats. Acta Naturae. 10 (3), 4-10 (2018).
- Borbély, Z., et al. Effect of rat spinal cord injury (hemisection) on the ex vivo uptake and release of [3H]noradrenaline from a slice preparation. Brain Research Bulletin. 131, 150-155 (2017).
- Brown, A. R., Martinez, M. Thoracic spinal cord hemisection surgery and open-field locomotor assessment in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59738 (2019).
- Taoka, Y., Okajima, K.
- Hou, S., Saltos, T. M., Iredia, I. W., Tom, V. J. Surgical techniques influence local environment of injured spinal cord and cause various grafted cell survival and integration. Journal of Neuroscience Methods. 293, 144-150 (2018).
- Mattucci, S., et al. Development of a traumatic cervical dislocation spinal cord injury model with residual compression in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 322, 58-70 (2019).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), 01324 (2019).
- Ashammakhi, N., et al. Regenerative therapies for spinal cord injury. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 25 (6), 471-491 (2019).
