Vernetzte makroporöse 3D-Gerüste aus Mikrogelstäben

Um komplexes kooperatives Zellverhalten in 3D-Konstrukten zu untersuchen, müssen Gerüstplattformen eine konsistente Leistung in der Reproduzierbarkeit aufweisen, eine geeignete Geometrie für die Zellmigration aufweisen und gleichzeitig eine gewisse Flexibilität in Bezug auf die Parameteränderung zulassen, um ihren Einfluss auf das lebende Gewebe zu untersuchen¹. In den letzten Jahren hat sich das Konzept der makroporösen geglühten Partikel (MAP), das erstmals von Segura et al. beschrieben wurde, zu einer effizienten und vielseitigen Plattform für die 3D-Gerüstherstellung entwickelt². Die maßgeschneiderte Zusammensetzung der Mikrogele, die die Bausteine des endgültigen 3D-Gerüsts sind, definiert Eigenschaften wie die Steifigkeit des Konstrukts, die selektive chemische Reaktivität des Gelnetzwerks und die endgültige Porengröße des Gerüsts 2,3,4,5,6 vor. Zelladhäsive Peptide als Hinweise für Gerüst-Zell-Interaktionen werden in das Polymernetzwerk der Mikrogele eingebaut, um die Zellbindung zu ermöglichen, und können variiert werden, um ihre spezifischen Auswirkungen auf Zellen in Kultur zu untersuchen. Die 3D-Gerüste werden durch Verkettung der geglühten injizierbaren Mikrogele durch kovalente oder supramolekulare Bindungen stabilisiert, was zu robusten und definierten Konstrukten für die Zellkultur 2,3,5,7,8 führt.

Die Mikrofluidik hat sich als eine der genauesten und anpassungsfähigsten Methoden zur Herstellung definierter granularer Hydrogele etabliert⁹. Die Möglichkeit, größere Mengen der benötigten Bausteine in einem kontinuierlichen Prozess unter Beibehaltung ihrer chemischen, mechanischen und physikalischen Monodispersität herzustellen, trägt wesentlich zur Eignung dieses Verfahrens bei. Darüber hinaus kann die Größe und Form der hergestellten Mikrogele durch verschiedene Verfahren wie Chargenemulsionen, Mikrofluidik, Lithographie, elektrodynamisches Spritzen oder mechanische Fragmentierung manipuliert werden, die die Geometrie der Bausteine und damit die 3D-Struktur des endgültigen Gerüsts^{bestimmen 1,10}.

Kürzlich wurde über das Konzept makroporöser 3D-Gerüste berichtet, die aus funktionalisierten Mikrogelstäbchen bestehen, die sich schnell in wässrigen Lösungen ohne weitere Zusätze vernetzen¹¹. Die Anisotropie von Mikrogelstäbchen führte zu höheren Porositäten und Porenverteilungen mit größeren Porengrößen im Vergleich zur Verwendung kugelförmiger Mikrogele in dieser Studie¹¹. Auf diese Weise erzeugt weniger Material größere Poren mit einer Vielzahl unterschiedlicher Porengeometrien, während die Stabilität des 3D-Gerüsts erhalten bleibt. Das System besteht aus zwei Arten von Mikrogelstäbchen mit komplementären funktionellen primären Amin- und Epoxidgruppen, die innerhalb der Verkettungsreaktion verbraucht werden, wenn sie miteinander in Kontakt kommen. Die funktionellen Gruppen, die nicht am Verkettungsprozess beteiligt sind, bleiben aktiv und können für die selektive Nachmodifikation mit zelladhäsiven Peptiden oder anderen bioaktiven Faktoren verwendet werden. Fibroblastenzellen heften, verbreiten und vermehren sich, wenn sie in den 3D-Gerüsten kultiviert werden, wachsen zuerst auf der Mikrogeloberfläche und füllen die meisten Makroporen nach 5 Tagen. Eine vorläufige Kokulturstudie an humanen Fibroblasten und humanen Nabelvenendothelzellen (HUVECs) zeigte vielversprechende Ergebnisse für die Bildung gefäßartiger Strukturen innerhalb der miteinander verbundenen 3D-Gerüste¹¹.

1. Benötigtes Material und Präparate für die Mikrofluidik

1. Für das beschriebene mikrofluidische Verfahren verwenden Sie 1 mL und 5 mL Glasspritzen und Spritzenpumpen. Die On-Chip-Tröpfchenbildung wird über ein inverses Mikroskop beobachtet, das mit einer Hochgeschwindigkeitskamera ausgestattet ist.
2. Erstellen Sie das mikrofluidische Chipdesign (Abbildung 1B) unter Verwendung einer computergestützten Designsoftware und erstellen Sie eine Mastervorlage, wie bereits berichtet¹².
3. Erreichen Sie eine kontrollierte UV-Bestrahlung mit einer selbst konstruierten UV-LED (λ = 365 nm, Spotdurchmesser ~4,7 mm), die eine Bestrahlungsstärke von 957 mW/cm² durch ein 0,13 mm dickes Deckglas liefert.
   HINWEIS: Berücksichtigen Sie eine mögliche lokale Wärmeentwicklung durch die UV-LED während der Bestrahlung. Wenn dies der Fall ist, sorgen Sie für eine ausreichende Kühlung durch externen Luftstrom.

2. Herstellung mikrofluidischer Bauelemente

ANMERKUNG: Die Herstellung mikrofluidischer Bauelemente basiert auf einer früheren Veröffentlichung¹³.

1. Bereiten Sie 20 g einer 10:1 (Massen-)Mischung aus Polydimethylsiloxan (PDMS) und Härter her. 3 min kräftig mischen.
2. Mischen Sie 60 mg Öl Rot O in 2,0 g Toluol. Der PDMS-Mischung werden 50 μL Ölrot O in Toluollösung zugegeben. Mischen Sie, bis eine homogene Farbverteilung vorhanden ist, um unerwünschte Lichtstreuung zu verringern und die Spotgröße während der On-Chip-Gelierung fokussiert zu halten.
3. Entfernen Sie die Blasen, indem Sie die Mischung in einen Exsikkator geben, der mit einer Vakuumpumpe ausgestattet ist.
4. Das PDMS-Gemisch auf eine Höhe von 5-5,5 mm in die Masterschablone gießen und erneut entgasen.
5. Lassen Sie das PDMS 18 h bei Raumtemperatur aushärten, um den Abbau von Diazofarbstoffen zu vermeiden.
6. Schneiden Sie die PDMS-Struktur aus und stanzen Sie Ein- und Auslasslöcher mit einem Linienkern-Probenahmewerkzeug (0,77 mm Innendurchmesser, 1,07 mm Außendurchmesser).
7. Waschen Sie das PDMS- und Deckglas mit Isopropanol und entionisiertem Wasser wiederholt 5x und entfernen Sie anschließend die Flüssigkeit nach jedem Waschschritt über Druckluft oder Stickstoff.
8. Behandeln Sie das trockene Glas und das PDMS zusammen in einem Plasmaofen bei 0,2 mbar mit einem Sauerstofffluss von 20 ml / min für 60 s bei 100 W und verbinden Sie direkt, um das Glas und PDMS miteinander zu verbinden, um das mikrofluidische Gerät zu bilden.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die PDMS-Struktur während des Bindevorgangs zu biegen, um die Verformung der Kanalstruktur zu minimieren.
9. Um die Kanäle des mikrofluidischen Chips hydrophob zu machen, legen Sie das Gerät zusammen mit 50 μL Trichlor-(1 H,1 H,2 H,2 H-perfluoroctyl)-silan über Nacht in einen Exsikkator unter Vakuum (schließen Sie die Verbindung zur Pumpe nach Abnehmen des Dampfdrucks). Spülen Sie die Außenseite des Geräts mit Hydrofluorether ab.
   VORSICHT: Führen Sie diese Schritte in einem Abzug durch und vermeiden Sie jeglichen Kontakt mit dem Perfluorsilan. Verwenden Sie einen Glasvakuum-Exsikkator, der mit Fett versiegelt ist. Reinigen Sie den Exsikkator gründlich, bevor Sie ihn für andere Zwecke verwenden.

3. Lösungsvorbereitung für die Mikrofluidik

1. Für die kontinuierliche Ölphase Paraffinöl und Hexadecan (1:1 v/v) mischen und 8% (w/w) eines nichtionischen Tensids hinzufügen. Füllen Sie eine 1-ml-Glasspritze (erstes Öl, Abbildung 1) und eine 5-ml-Glasspritze (zweites Öl, Abbildung 1).
2. Bereiten Sie die Prepolymerlösungen für die disperse Phase in Braunglasfläschchen vor, um Photoinitiatorzersetzung und unbeabsichtigte Gelierung zu verhindern.
   1. Aminkomponenten-Prepolymerlösung mit GRGDS-PC
      1. Für eine 300-μL-Lösung werden 33,3 mg Stern-Polyethylenglykol-Acrylat (sPEG-AC) und 3,03 mg Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) abgewogen.
      2. 18,74 mg 2-Aminoethylmethacrylathydrochlorid (AMA) werden in 1,5 ml entionisiertem Wasser gelöst und die Lösung durch einen Spritzenfilter (0,20 μm Porengröße) geleitet.
         HINWEIS: AMA ist hygroskopisch und sollte entsorgt werden, sobald sich der Feststoff im Vorratsbehälter zu Klumpen bildet.
      3. Sterile 36 mM GRGDS-PC Aliquots in Wasser zubereiten und bis zum Gebrauch bei −20 °C lagern.
      4. Verwenden Sie 291,7 μL der AMA-Lösung, um sPEG-AC und LAP aufzulösen, und fügen Sie 8,3 μL der GRGDS-PC-Lösung hinzu. Nehmen Sie die Lösung mit einer 1-ml-Glasspritze auf und schützen Sie sie mit Aluminiumfolie vor Licht.
   2. Epoxidkomponenten-Prepolymerlösung
      1. Für eine 300-μL-Lösung werden 33,3 mg Stern-Polyethylenglykol-Acrylat (sPEG-AC), 3,03 mg LAP eingewogen und in 300 μl entionisiertem Wasser gelöst. Fügen Sie 2,4 mg Glycidylmethacrylat (GMA) hinzu.
         HINWEIS: Starkes Schütteln beschleunigt die Auflösung von GMA. Nehmen Sie die Lösung mit einer 1-ml-Glasspritze auf und schützen Sie sie mit Aluminiumfolie vor Licht.

4. Herstellung und Reinigung von amin- und epoxidfunktionalisierten Mikrogelstäben

Abbildung 1: Anordnung der mikrofluidischen On-Chip-Gelierungsanordnung . (A) Frontansicht und Winkelansicht der Bauteilanordnung während der Mikrofluidik. (B) Mikrofluidisches Chipdesign für die On-Chip-Gelierung von Mikrogelstäben. (1) PE-Rohr zum ersten Öleinlass. (2) Lichtgeschütztes PE-Rohr zum dispersen Phaseneinlass. (3) PE-Rohr zum zweiten Öleinlass. (4) PE-Rohr vom Auslass zum Produktauffangbehälter. (5) UV-Lampe und Bestrahlungsstelle auf dem geraden 80-μm-Kanal in der Nähe des Auslasses. (6) Mikroskopobjektiv/Beobachtungsposition. (7) Farbige PDMS-Komponente des mikrofluidischen Geräts. (8) Deckglas mit PDMS verbunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

1. Führen Sie die Nadeln in die PE-Röhrchen ein und entfernen Sie das Gas aus der Spritze und dem Röhrchen.
2. Führen Sie ein PE-Rohr in den Auslass für die Produktsammlung ein.
3. Setzen Sie alle Glasspritzen in die Spritzenpumpen ein, und führen Sie jedes Schlauchende in den entsprechenden Einlass ein (Abbildung 1).
   HINWEIS: Schützen Sie den Prepolymerschlauch über Aluminiumfolie oder ein schwarzes Rohr vor Licht, um eine unbeabsichtigte Gelierung zu vermeiden.
4. Fokussieren Sie das Mikroskop auf den Öl-Wasser-Querschnitt.
5. Starten Sie die erste Ölspritzenpumpe (Durchflussrate = 100-200 μL/h), um den Kanal zuerst mit Öl zu füllen, um eine Kanalbenetzung durch die disperse Phase zu verhindern.
6. Verringern Sie den ersten Öldurchfluss auf 30 μL/h und starten Sie die Prepolymerspritzenpumpe (Durchflussrate = 100-200 μL/h), bis die dispergierte wässrige Phase am Querschnitt beobachtet werden kann.
7. Stellen Sie die Prepolymer-Durchflussrate auf 30 μL/h ein und fokussieren Sie das Mikroskop auf den Auslass.
8. Starten Sie die zweite Ölspritzenpumpe (Durchfluss 300 μL/h) und warten Sie, bis das Durchflussregime stabil ist.
9. Legen Sie das Auslassrohr in einen Auffangbehälter.
   HINWEIS: Legen Sie das Ende des Röhrchens in den oberen Teil des Behälters, um einen Druckanstieg aufgrund der Ansammlung des Produkts im Laufe der Zeit zu vermeiden.
10. Stellen Sie das UV-Bestrahlungssystem so ein, dass die Bestrahlungsstärke im Bereich von 900-1000 mW/^cm2 liegt (verwendete Bestrahlungsstärke = 957 mW/cm²) und der Bestrahlungsfleck im geraden Kanalteil vor dem Auslass liegt (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht in der Nähe des Öl-Wasser-Querschnitts zu bestrahlen, um eine Verstopfung des Kanals zu vermeiden. Für zusätzlichen Schutz decken Sie die Kanalstrukturen vor dem Bestrahlungsfleck auf der Oberseite des Geräts ab.
11. Stellen Sie vor der UV-Bestrahlung die Durchflussraten des Prepolymers und des ersten Öls ein, um das gewünschte Aspektverhältnis im Bereich von 3,0 bis 4,5 zu erreichen, und stellen Sie die Bestrahlungszeit der dispergierten Phase auf ~ 2,3 s ein, abhängig von der Größe des Bestrahlungsflecks.
12. Starten Sie die UV-Bestrahlung und stellen Sie ggf. die Durchflussmengen gemäß dem vorherigen Unterabschnitt erneut ein.
    HINWEIS: Beobachten Sie die Produktion zu Beginn und überwachen Sie das stabile Fließverhalten im Auslass und die Gleichmäßigkeit der Mikrogelstäbe. Der zweite Ölfluss kann eingestellt werden, um den Produkttransport innerhalb des Auslasses zu optimieren.
13. Ändern Sie den Sammelbehälter und notieren Sie sich die Startzeit und die Durchflussraten der Produktsammlung.
    HINWEIS: Schützen Sie das Produkt vor Staub. Stoppen Sie das Sammeln, bevor die Lösung einer Spritze zur Neige geht.
14. Um die Sammlung zu beenden, entfernen Sie den Sammelcontainer, und notieren Sie sich die Uhrzeit. Stoppen Sie die Bestrahlung und alle Spritzenpumpen.
15. Waschen Sie das Produkt anschließend jeweils 5x mit n-Hexan, Isopropanol und entionisiertem Wasser. Entfernen Sie den Überstand nach der Stäbchensedimentation.
    HINWEIS: Dispergieren Sie das Produkt nach jeder Lösungszugabe vorsichtig und warten Sie 10 Minuten, bevor Sie das Lösungsmittel unter Berücksichtigung der molekularen Diffusion ersetzen. Ersetzen Sie das Isopropanol allmählich durch Wasser, um zu verhindern, dass die Stäbchen an die Oberfläche der Flüssigkeit schwimmen. Mehrere zusätzliche Waschschritte mit Wasser verringern die verbleibenden Isopropanolspuren.

5. Makroporöse Gerüstbildung

1. Bestimmen Sie die Anzahl der Mikrogelstäbchen pro Dispersionsvolumen für die epoxid- und aminfunktionalisierten Proben.
2. Stellen Sie die Anzahl der epoxid- und aminfunktionalisierten Proben durch Verdünnung oder Konzentration auf einen ähnlichen Wert zwischen 1.000-5.000 Stäbchen/100 μL ein.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine Zentrifuge bei ~ 2.000 x g für 5-10 s, um die Sedimentation der Mikrogelstäbchen zu beschleunigen. Wenn die Anzahl der Stäbchen pro Dispersionsvolumen gering ist, kann die Stabvernetzung zu kleineren Stabclustern anstelle eines stabilen Konstrukts führen. Wenn die Anzahl der Stäbchen pro Dispergiervolumen hoch ist, wird die Mischqualität der beiden Komponenten beeinträchtigt.
3. Die Dispersion der ersten Komponente (~ 1.200 Stäbchen) wird in ein konisches 1,5 ml oder 2 ml transparentes Fläschchen überführt.
4. Die zweite Komponente wird kontrolliert im Dauerbetrieb (100 μL Pipette) zugegeben. Nach der Zugabe den Inhalt direkt mit der Pipette mischen, um Flüssigkeit aufzunehmen und erneut hinzuzufügen. Die verkettete Struktur bildet sich beim Mischen innerhalb von Sekunden.
   HINWEIS: Wenn sich anstelle einer kohärenten Struktur mehrere Cluster bilden, überprüfen Sie erneut die Anzahl der Mikrogelstäbchen pro Volumen oder sorgen Sie für eine kontrolliertere Mischung der beiden Komponenten.

6. Zellkleber nach der Modifikation

1. Berechnen Sie die theoretische Anzahl der Epoxidgruppen in der vernetzten Struktur basierend auf der Flussrate der dispergierten Polymerphase, der Anzahl der während einer bestimmten Zeit gesammelten Mikrogele und dem Verdünnungsfaktor der Mikrogeldispersion, die für die Gerüstbildung verwendet wird.
   HINWEIS: Nähern Sie sich der theoretischen Anzahl von Epoxidgruppen pro Gerüst durch die folgende Gleichung.
   
   
   n_th: Theoretische Substanzmenge
   c_{GMA: GMA-Konzentration} in Prepolymerlösung
   Q: Durchflussrate der Prepolymerlösung
2. Fügen Sie der vernetzten Struktur GRGDS-PC-Lösung hinzu, um alle verbleibenden Epoxidgruppen mit dem Zelladhäsivpeptid zu modifizieren, das ein freies Amin und Thiol enthält (n [theoretische Epoxidgruppen] / n [GRGDS-PC] = 1). Über Nacht bei Raumtemperatur stehen lassen.
3. Entfernen Sie die nicht umgesetzten Moleküle, indem Sie mit entionisiertem Wasser waschen und den Überstand entfernen.

7. Sterilisation und Transfer in Zellkulturmedien

1. Reduzieren Sie den Wasserstand, um das miteinander verbundene Gerüst einfach unter Wasser zu tauchen.
2. Öffnen Sie die Durchstechflasche und bestrahlen Sie sie mit UV-Licht von λ = 250-300 nm. Verschließen Sie die Durchstechflasche und legen Sie die Durchstechflasche auf einen sauberen Tisch. 1x mit sterilem Wasser waschen.
3. Ersetzen Sie das Wasser in der Durchstechflasche durch Zellkulturmedien und lassen Sie das Gleichgewicht für 5 min einwirken. Wiederholen Sie dies mit frischen Zellkulturmedien 2x.
4. Das makroporöse Gerüst wird für das Experiment durch Gießen oder Verwenden eines Spatels in eine Zellkulturplatte überführt.

Abbildung 2: Makroporöse vernetzte Gerüststruktur. (A) 3D-Projektion eines 500 μm konfokalen Mikroskopie-Z-Stapels des vernetzten makroporösen Gerüstes. Maßstabsbalken stellt 500 μm dar. (B) Verkettetes Gerüst aus ~10.000 Mikrogelstäben auf einem Deckglas, das direkt aus Wasser genommen wird. Der Maßstabsbalken stellt 5 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Dieses Protokoll führt zu einem stabilen makroporösen 3D-Konstrukt, das aus miteinander verbundenen Amin- und epoxidfunktionalisierten Mikrogelstäbchen besteht (Abbildung 2A). Das Konstrukt sollte eine kompakte Geometrie aufweisen, wenn die beschriebene Art der Mischung verwendet wird, die innerhalb von 2 s oder 3 s gebildet wird (Abbildung 2B).

Die Stabilität des vernetzten Konstrukts hängt von den Mikrogel-Stäbchenbausteinen ab, aus denen es besteht. Die aminfunktionalisierten Mikrogelstäbchen weisen eine durchschnittliche Steifigkeit von 2,0 ± 0,2 kDa auf, bestimmt durch Nanoindentation (Abbildung 3A). Wenn die Stäbe zu weich sind, kann die vernetzte makroporöse Struktur aufgrund der Verformung der Bausteine nicht erreicht werden. Um aktive funktionelle Gruppen nachzuweisen, kann Fluoresceinisothiocyanat (FITC) verwendet werden, um primäre Aminogruppen zu visualisieren, und Fluoresceinamin-Isomer I kann verwendet werden, um Epoxidgruppen zu markieren (Abbildung 3B, C). Die Amin-Mikrogel-Stäbchen haben Abmessungen mit einer durchschnittlichen Länge von 553 μm ± 29 μm und einer durchschnittlichen Breite von 193 μm ± 7 μm in deionisiertem Wasser, was zu einem Aspektverhältnis von ~3,0 und einer Verringerung des Volumens (Kollaps) um ~73% ihrer Größe in Zellkulturmedien führt11.

Abbildung 3: Mikrogeleigenschaften. (A) Effektiver Elastizitätsmodul von Amin- und Epoxid-Mikrogel-Stäbchen zusammen mit Amin- und Epoxid-Mikrogelkugeln, gemessen durch Nanoindentation. Die Daten werden als Boxplot angezeigt, der sich vom 25. bis 75. Perzentil erstreckt, wobei die Schnurrhaare von 5% bis 95% Quantile reichen. Die Linien innerhalb der Kästchen stellen die Mediane dar, die leeren Quadrate die Mittelwerte und die schwarzen Quadrate die Ausreißer (n = 40; p-Werte werden mittels Einweg-ANOVA mit Bonferroni-Korrektur, **p < 0,01, ****p < 0,0001) berechnet. (B) Oben: Konfokalmikroskopische Aufnahme eines mit FITC funktionalisierten Amin-Mikrogel-Stäbchens und eines mit Fluorescein-Amin-Isomer funktionalisierten Epoxid-Mikrogel-Stäbchens I. Unten: Entsprechende Hellfeldbilder. Alle Maßstabsbalken repräsentieren 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Wie in der zugehörigen Publikation beschrieben, führen kugelförmige Mikrogele, die mit der gleichen Methode hergestellt werden, zu mehreren miteinander verbundenen Clustern und nicht zu einem stabilen makroporösen Gerüst11. Das höhere Aspektverhältnis der Mikrogelstäbe ermöglicht eine bessere Gesamtstabilität durch effizientere Strukturüberbrückung in 3D (Abbildung 4).

Abbildung 4: Einfluss des Seitenverhältnisses auf die Strukturbildung . (A) Hellfeldbild eines miteinander verbundenen Konstrukts aus Mikrogelstäben. (B) Hellfeldbild von miteinander verbundenen Clustern aus kugelförmigen Mikrogelen. Maßstabsbalken repräsentieren 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Mittelwerte der Makroporen in den Gerüsten aus Mikrogelstäbchen liegen bei 100 μm, wobei 90% der Porengrößen von 30 μm bis über 150 μm reichen11. Kugelartige Mikrogele ergeben Cluster mit Porengrößen zwischen ~10 μm und 55 μm, mit einem Mittelwert um 22 μm11. Dies stimmt mit den berichteten Zahlen anderer Studien überein, die MAPs auf Basis der kugelförmigen Mikrogele 2,4,14 herstellen.

Die Autoren versichern, dass es keine Interessenkonflikte gibt.