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Methodenartikel

In vitro Aufschluss von Emulsionen in einem einzigen Tröpfchen durch mehrphasigen Austausch simulierter Magen-Darm-Flüssigkeiten

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DOI:

10.3791/64158

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18. November 2022

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1Department of Applied Physics, Faculty of Sciences, Campus de Fuentenueva, University of Granada, 2Department of Physical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Campus de Cartuja, University of Granada, 3Department of Software Engineering, School of Computer and Telecommunication Engineering, Campus de Aynadamar, University of Granada

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine hängende Tropfen-Oberflächenfilmwaage, die mit einem Multi-Subphasen-Austausch mit dem Spitznamen OCTOPUS implementiert ist, ermöglicht die Nachahmung von Verdauungsbedingungen durch den sequentiellen Subphasenaustausch der ursprünglichen Bulk-Lösung mit simulierten Magen-Darm-Flüssigkeiten. Der simulierte In-vitro-Aufschluss wird überwacht, indem in situ die Grenzflächenspannung der aufgeschlossenen Grenzflächenschicht aufgezeichnet wird.

Zusammenfassung

Emulsionen werden derzeit verwendet, um Nährstoffe und Medikamente zu verkapseln und zu liefern, um verschiedene Magen-Darm-Erkrankungen wie Fettleibigkeit, Nährstoffanreicherung, Nahrungsmittelallergien und Verdauungskrankheiten zu bekämpfen. Die Fähigkeit einer Emulsion, die gewünschte Funktionalität bereitzustellen, nämlich eine bestimmte Stelle im Magen-Darm-Trakt zu erreichen, die Lipolyse zu hemmen / zu verzögern oder die Verdaulichkeit zu erleichtern, hängt letztendlich von ihrer Anfälligkeit für enzymatischen Abbau im Magen-Darm-Trakt ab. In Öl-in-Wasser-Emulsionen sind Lipidtröpfchen von Grenzflächenschichten umgeben, in denen die Emulgatoren die Emulsion stabilisieren und die verkapselte Verbindung schützen. Das Erreichen einer maßgeschneiderten Verdaulichkeit von Emulsionen hängt von ihrer ursprünglichen Zusammensetzung ab, erfordert aber auch die Überwachung der Entwicklung dieser Grenzflächenschichten, da sie verschiedenen Phasen der gastrointestinalen Verdauung unterzogen werden. Eine hängende Tropfenfolienwaage, die mit einem Multi-Subphasen-Austausch implementiert ist, ermöglicht die Simulation des In-vitro-Aufschlusses von Emulsionen in einem einzigen wässrigen Tröpfchen, das in Öl getaucht wird, indem ein kundenspezifisches statisches Aufschlussmodell angewendet wird. Der Transit durch den Magen-Darm-Trakt wird durch den Subphasenaustausch der ursprünglichen Tröpfchenlösung mit künstlichen Medien nachgeahmt, die die physiologischen Bedingungen jedes Kompartiments / Schritts des Magen-Darm-Trakts nachahmen. Die dynamische Entwicklung der Grenzflächenspannung wird in situ während der gesamten simulierten gastrointestinalen Verdauung aufgezeichnet. Die mechanischen Eigenschaften der verdauten Grenzflächen, wie Grenzflächendilatationselastizität und Viskosität, werden nach jeder Verdauungsphase (Mund-, Magen-, Dünndarm) gemessen. Die Zusammensetzung jedes Verdauungsmediums kann abgestimmt werden, um die Besonderheiten der Verdauungsbedingungen, einschließlich Magen-Darm-Erkrankungen und Verdauungsmedien für Säuglinge, zu berücksichtigen. Die spezifischen Grenzflächenmechanismen, die die Proteolyse und Lipolyse beeinflussen, werden identifiziert und liefern Werkzeuge zur Modulation der Verdauung durch die Grenzflächentechnik von Emulsionen. Die erzielten Ergebnisse können manipuliert werden, um neuartige Lebensmittelmatrices mit maßgeschneiderten Funktionalitäten wie geringer Allergenität, kontrollierter Energieaufnahme und verminderter Verdaulichkeit zu entwerfen.

Einleitung

Zu verstehen, wie Fett verdaut wird, was den Emulsionsaufschluss beinhaltet, ist wichtig, um Produkte mit maßgeschneiderter Funktionalität rational zu entwerfen1. Das Substrat für die Fettverdauung ist eine Emulsion, da Fett beim Verzehr durch mechanische Einwirkung und Mischen mit Biotensiden in Mund und Magen emulgiert wird. Außerdem ist das meiste Fett, das vom Menschen konsumiert wird, bereits emulgiert (wie Milchprodukte), und im Falle von Säuglingen oder einigen älteren Menschen ist dies die einzige Form des Konsums. Daher ist das Design von emulsionsbasierten Produkten mit spezifischen Verdauungsprofilen in der Ernährung sehr wichtig1. Darüber hinaus können Emulsionen Nährstoffe, Medikamente oder lipophile Bioaktiva2 verkapseln und abgeben, um verschiedene gastrointestinale Erkrankungen wie Fettleibigkeit3, Nährstoffanreicherung, Nahrungsmittelallergien und Verdauungskrankheiten zu bekämpfen. In Öl-in-Wasser-Emulsionen sind Lipidtröpfchen von Grenzflächenschichten aus Emulgatoren wie Proteinen, Tensiden, Polymeren, Partikeln und Gemischen umgeben4. Emulgatoren spielen eine zweifache Rolle: Stabilisierung der Emulsion5 und Schutz/Transport der verkapselten Verbindung an eine bestimmte Stelle. Das Erreichen einer maßgeschneiderten Verdaulichkeit von Emulsionen hängt von ihrer ursprünglichen Zusammensetzung ab, erfordert aber auch die Überwachung der kontinuierlichen Entwicklung dieser Grenzfläche während des Transports durch den Magen-Darm-Trakt (Abbildung 1).

Diagramm der Verdauung von Säuglingen; Grenzflächentechnik, neuartige Lebensmittelmatrizen, Fettleibigkeit, Nährstoffanreicherung.
Abbildung 1: Anwendung der Grenzflächentechnik von Emulsionen zur Behandlung einiger der wichtigsten gastrointestinalen Erkrankungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Lipidverdauung ist letztendlich ein Grenzflächenprozess, da sie die Adsorption von Lipasen (Magen oder Pankreas) an die Öl-Wasser-Grenzfläche emulgierter Lipidtröpfchen durch die Grenzflächenschicht erfordert, um die im Öl enthaltenen Triglyceride zu erreichen und in freie Fettsäuren und Monoacylglyceride zu hydrolysieren6. Dies ist in Abbildung 2 schematisiert. Die Magenlipase konkurriert mit Pepsin und Phospholipiden im Magen um die Öl-Wasser-Schnittstelle (Abbildung 2, Magenverdauung). Dann konkurrieren Pankreaslipase / Colipase mit Trypsin / Chymotrypsin, Phospholipiden, Gallensalzen und Verdauungsprodukten im Dünndarm. Proteasen können die Grenzflächenabdeckung verändern und die Lipaseadsorption verhindern oder begünstigen, während Gallensalze sehr oberflächenaktiv sind und den größten Teil des verbleibenden Emulgators verdrängen, um die Lipaseadsorption zu fördern (Abbildung 2, Darmverdauung). Schließlich hängen die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Lipolyse von den Grenzflächeneigenschaften der anfänglichen/magisch verdauten Emulsion ab, wie z. B. der Dicke, inter- / intramolekularen Verbindungen sowie elektrostatischen und sterischen Wechselwirkungen. Dementsprechend bietet die Überwachung der Entwicklung der Grenzflächenschicht während ihrer Verdauung eine experimentelle Plattform, um Grenzflächenmechanismen und -ereignisse zu identifizieren, die die Lipase-Adsorption und damit die Lipidverdauung beeinflussen.

Diagramm des Verdauungsprozesses; zeigt die Magen- und Darmverdauung von Nahrungsemulsionen mit Enzymen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Rolle von Grenzflächen bei der gastrointestinalen Lipidverdauung. Die Pepsinhydrolyse verändert die Grenzflächenzusammensetzung in der Magenphase, während die Magenlipase Triglyceride hydrolysiert. Im Dünndarm hydrolysieren Trypsin / Chymotrypsin den Grenzflächenfilm weiter, während die Lipolyse durch die Adsorption von BS / Lipasen, die Hydrolyse von Triglyceriden und die Desorption von lipolytischen Produkten durch Solubilisierung in den BS-Mizellen / -Komplex erfolgt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Hängetropfenausrüstung an der Universität Granada (UGR) ist mit einer patentierten Technologie, der koaxialen Doppelkapillare, ausgestattet, die den Subphasenaustausch der Bulklösung7 ermöglicht. Die Kapillare, die den hängenden Tropfen hält, besteht aus einer Anordnung von zwei koaxialen Kapillaren, die unabhängig voneinander mit jedem Kanal eines Doppelmikroinjektors verbunden sind. Jeder Mikroinjektor kann unabhängig voneinander betrieben werden, was den Austausch des abgeworfenen Inhalts durch Durchlaufermöglicht 7. Dementsprechend besteht der Subphasenaustausch aus der gleichzeitigen Injektion der neuen Lösung mit der inneren Kapillare und der Extraktion der Bulklösung mit der äußeren Kapillare bei gleicher Durchflussrate. Dieser Prozess ermöglicht den Austausch der Bulk-Lösung ohne Störung des Grenzflächenbereichs oder des Volumens des Tröpfchens. Dieses Verfahren wurde später zu einem Multi-Subphasen-Austausch aufgerüstet, der bis zu acht sequentielle Subphasenaustausche der Tröpfchen-Bulk-Lösung8 ermöglicht. Dies ermöglicht die Simulation des Verdauungsprozesses in einem einzigen wässrigen Tröpfchen, das in lipidischen Medien suspendiert ist, indem die Bulk-Lösung sequentiell mit künstlichen Medien ausgetauscht wird, die die verschiedenen Kompartimente (Mund, Magen, Dünndarm) nachahmen. Das gesamte Setup ist in Abbildung 3 dargestellt, einschließlich der Details der Komponenten. Die Spritzen im Mikroinjektor sind mit den acht Vias-Ventilen verbunden, die jeweils mit einem Mikrozentrifugenröhrchen verbunden sind, das die künstliche Verdauungsflüssigkeit mit den in Abbildung 2 beschriebenen Komponenten enthält.

Mikroinjektionsaufbau mit Lichtquelle, Mikropositionierer, CCD-Kamera für die Zellanalyse.
Abbildung 3: Gesamtansicht des OCTOPUS mit allen Komponenten. Die CCD-Kamera, das Mikroskop, der Mikropositionierer, die thermostabilisierte Zelle und die Doppelkapillare sind unabhängig voneinander mit einem Doppelmikroinjektor mit zwei Spritzen verbunden, die mit acht Vias-Ventilen verbunden sind. Jede Spritze ist mit Kapillare, vier Mikrozentrifugenröhrchen mit Probe und einem Austrag verbunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4A zeigt, wie jede der künstlichen Verdauungsflüssigkeiten durch Subphasenaustausch durch die Doppelkapillare in den hängenden Tropfen injiziert wird. Jede in Abbildung 2 beschriebene Verdauungsverbindung kann gleichzeitig/nacheinander angewendet werden, wodurch die Passage durch den Magen-Darm-Trakt simuliert wird. Die künstlichen Verdauungsflüssigkeiten enthalten verschiedene Enzyme und Biotenside, die die Grenzflächenspannung des Ausgangsemulgators verändern, wie in Abbildung 4B schematisiert. Die ebenfalls an der UGR entwickelte Software DINATEN (siehe Tabelle der Materialien) zeichnet die Entwicklung der Grenzflächenspannung in Echtzeit auf, wenn die erste Grenzflächenschicht in vitro aufgeschlossen wird. Außerdem wird nach jeder Verdauungsphase die dilatative Elastizität der Grenzflächenschicht berechnet, indem periodische Schwingungen des Volumens / der Grenzflächenfläche auf die stabilisierte Grenzflächenschicht aufgebracht und die Reaktion der Grenzflächenspannung aufgezeichnet wird. Die Periode/Frequenz und die Amplitude der Schwingung können variiert werden, und die Bildverarbeitung mit der Software CONTACTO liefert die dilatationsrheologischen Parameter8.

Diagramm und Grafik der Enzymreaktion, Grenzflächenspannung vs. Verdauungszeit, Proteolyse, Lipolyse.
Abbildung 4: Beispiele für Verdauungsprofile . (A) Die anfängliche Emulgatorschicht wird künstlichen Verdauungsmedien ausgesetzt, die durch sequenziellen Subphasenaustausch der verschiedenen Lösungen in den hängenden Tropfen in die Mikrozentrifuge eingebracht werden. (B) Die allgemeine Entwicklung der Grenzflächenspannung (y-Achse) des Ausgangsemulgators als Funktion der Zeit (x-Achse), wie sie in vitro von den verschiedenen Enzymen/Biotensiden in den künstlichen Medien verdaut wird. Ein abschließender Subphasenaustausch mit reiner Darmflüssigkeit misst die Desorption von verdautem Lipid durch Solubilisierung in gemischten Mizellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Diese Studie stellt das allgemeine Protokoll zur Messung der In-vitro-Verdauung von Grenzflächenschichten mit hängenden Tropfengerätenvor 9. Die anfängliche Grenzflächenschicht wird nacheinander Bedingungen ausgesetzt, die die Passage durch den Magen-Darm-Trakt nachahmen, wie in Abbildung 2 dargestellt. Diese verschiedenen Verdauungsmedien werden durch Subphasenaustausch der verschiedenen in den Mikrozentrifugenröhrchen enthaltenen Lösungen in den Pendeltropfen injiziert (Abbildung 4A). Die Zusammensetzung dieser Medien kann in Abhängigkeit von den zu bewertenden gastrointestinalen Bedingungen, nämlich Magen- / Darmproteolyse / Lipolyse, angepasst werden, was die Messung kumulativer Effekte und Sinergien ermöglicht10. Die experimentellen Bedingungen, die verwendet werden, um den Verdauungsprozess in jedem Kompartiment nachzuahmen, folgen dem von INFOGEST veröffentlichten internationalen Konsensprotokoll, das den pH-Wert und die Mengen an Elektrolyten und Enzymen detailliert beschreibt11. Das experimentelle Gerät, das auf Pendant Drop basiert, ermöglicht die Aufzeichnung der Grenzflächenspannung in situ während des simulierten Verdauungsprozesses. Die dilatative Rheologie der Grenzflächenschicht wird am Ende jedes Verdauungsschritts berechnet. Auf diese Weise bietet jeder Emulgator ein Aufschlussprofil, das die Eigenschaften der aufgeschlossenen Grenzflächen veranschaulicht, wie in Abbildung 4B dargestellt. Dies ermöglicht die Extraktion von Rückschlüssen auf seine Anfälligkeit oder Resistenz gegenüber den verschiedenen Stadien des Verdauungsprozesses. Im Allgemeinen enthalten die künstlichen Verdauungsmedien sauren / basischen pH-Wert, Elektrolyte, Proteasen (Magen und Darm), Lipasen (Magen und Darm), Gallensalze und Phospholipide, die in ihren jeweiligen Verdauungsflüssigkeiten (Magen oder Darm) gelöst sind. Abbildung 4B zeigt ein generisches Profil der Entwicklung der Grenzflächenspannung eines Emulgators, der zuerst einer Proteasewirkung ausgesetzt wurde, gefolgt von Lipasen. Im Allgemeinen fördert die Proteolyse der Grenzflächenschicht eine Erhöhung der Grenzflächenspannung aufgrund der Desorption hydrolysierter Peptide9,12, während die Lipolyse zu einer sehr starken Verringerung der Grenzflächenspannung aufgrund der Adsorption von Gallensalzen und Lipasen führt 13. Ein abschließender Subphasenaustausch mit Darmflüssigkeit verbraucht die Bulk-Lösung von unadsorbiertem/verdautem Material und fördert die Desorption löslicher Verbindungen und die Solubilisierung von verdauten Lipiden in gemischten Mizellen. Dies wird durch die erhöhte Grenzflächenspannung quantifiziert (Abbildung 4B).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das experimentelle Design, das im hängenden Tropfen implementiert wurde, um den In-vitro-Aufschluss in einem einzigen Tröpfchen zu simulieren, die Messung kumulativer Effekte und Synergien ermöglicht, wenn der Verdauungsprozess sequentiell auf die ursprüngliche Grenzflächenschicht10 angewendet wird. Die Zusammensetzung jedes Verdauungsmediums kann leicht abgestimmt werden, um den Besonderheiten der Verdauungsbedingungen Rechnung zu tragen, einschließlich gastrointestinaler Pathologien oder Verdauungsmedien für Säuglinge14. Dann kann die Identifizierung der Grenzflächenmechanismen, die die Proteolyse und Lipolyse beeinflussen, verwendet werden, um die Verdauung durch die Grenzflächentechnik von Emulsionen zu modulieren. Die erzielten Ergebnisse können bei der Entwicklung neuartiger Lebensmittelmatrices mit maßgeschneiderten Funktionalitäten wie geringer Allergenität, kontrollierter Energieaufnahme und verminderter Verdaulichkeit angewendet werden 15,16,17,18,19.

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Protokoll

1. Reinigungsreihenfolge für alle Glaswaren, die in oberflächenwissenschaftlichen Experimenten verwendet werden

  1. Schrubben Sie die Glaswaren mit einer konzentrierten Reinigungslösung (siehe Materialtabelle), die in Wasser (10%) verdünnt ist.
  2. Spülen Sie gründlich mit einer Sequenz aus Leitungswasser, Propanol, destilliertem Wasser und Reinstwasser. In einer Kabine trocknen und bis zum Gebrauch in einem geschlossenen Schrank aufbewahren.

2. Probenvorbereitung

  1. Bereiten Sie künstliche Verdauungsmedien gemäß den standardisierten INFOGEST-Protokollen11,20 vor (siehe Materialtabelle). Einzelheiten sind Tabelle 1 zu entnehmen und enthalten kleine Anpassungen an die Anforderungen der Grenzflächenarbeiten, um eine oberflächenaktive Kontamination und die Verdünnung der Proben zu verhindern (1:10)10.
  2. Bereiten Sie die Emulgatorlösung wie folgt vor.
    1. 0,01 l einer konzentrierten Lösung von (1 kg· L−1) Emulgator oder ein Gemisch von Emulgatoren (siehe Materialtabelle) in einem ersten Puffer (Tabelle 1) und über Nacht unter leichtem Rühren lagern.
    2. Auf 0,1 kg verdünnen. L−1 (oder nach Bedarf), um die Schnittstelle zu sättigen; ein Pseudoplateau in der Grenzflächenspannung nach 1 h Adsorption an einem konstanten Grenzflächenbereich nach dem zuvor veröffentlichten Bericht21 erreichen.
    3. Vor Gebrauch 15 min unter leichter Erregung aufbewahren.
  3. Reinigen Sie die Ölphase.
    1. Bereiten Sie eine Mischung aus Pflanzenöl (Sonnenblume, Olive, Triplein usw.) vor. und Magnesiummetasilikatharze (siehe Werkstofftabelle) in einem Verhältnis von 2:1 w/w in einem großen Becherglas. Unter leichter mechanischer Erregung für mindestens 3 h aufbewahren.
    2. Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 8.000 x g für 30 min bei Raumtemperatur in einer handelsüblichen Zentrifuge (siehe Materialtabelle).
    3. Filtern Sie das Ölgemisch unter Vakuum mit einem Spritzenfilter (0,2 μm Porengröße) (siehe Materialtabelle). In sauberen bernsteinfarbenen Flaschen verschlossen und bis zum Gebrauch mit Stickstoff besprudelt aufbewahren.

3. Kalibrierung und Reinigung des OCTOPUS

  1. Spülen Sie alle Schläuche mit Reinstwasser, indem Sie eine Reihenfolge der Reinigung beider Spritzen und aller Ventile durch eine Kapillare (Ventile 6/4) und zum äußeren Ausgang (Ventil 8-blaue Farbe) einstellen. Drücken Sie dazu im linken Dialog auf die Schaltfläche "Reinigen" (ergänzende Abbildung 1A).
  2. Überprüfen Sie die Oberflächenspannung7 von Wasser bei Raumtemperatur, indem Sie einen Wassertropfen bilden und in Echtzeit für 5 min messen (ergänzende Abbildung 1B, C).
    1. Stellen Sie die Differenzdichte auf Luft-Wasser ein (0,9982 kg· L−1) im linken Dialog, Ergänzende Abbildung 1B.
  3. Füllen Sie die saubere Küvette (optisches Glas) mit 0,002 l sauberem Pflanzenöl und legen Sie sie in den Küvettenhalter in der Thermostatzelle (Abbildung 3).
  4. Stellen Sie den Thermostat ein und stellen Sie den Temperaturausgleich auf 37 °C ein.
  5. Überprüfen Sie die Grenzflächenspannung von Wasser-Öl bei Raumtemperatur7.
    1. Stellen Sie die Differenzdichte auf Pflanzenöl-Wasser (Olivenöl: 0,800 kg· L−1) (ergänzende Abbildung 1C).
    2. Injizieren Sie 40 μL mit einer Rate von 0,5 μL·s−1 und messen Sie in Echtzeit jede Sekunde bis zum Ende der Injektion. Dies ist ein einfacher dynamischer Prozess (ergänzende Abbildung 1B, D).
    3. Zeichnen Sie die Grenzflächenspannung als Funktion des Tröpfchenvolumens in einem Datenblatt auf.
    4. Überprüfen Sie, ob der Tröpfchenvolumenbereich einen vom Tröpfchenvolumen unabhängigen Wert für die Grenzflächenspannung liefert. Zeichnen Sie den Grenzflächenbereich als Funktion des Tröpfchenvolumens auf.
    5. Programmieren Sie einen Prozess mit zwei Schritten (ergänzende Abbildung 1B und ergänzende Abbildung 2A), indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
      1. Injizieren Sie mit einer Innenspritze ein Volumen, das in diesem Bereich konstanter Grenzflächenspannung enthalten ist.
      2. Halten Sie die Grenzflächenfläche konstant auf dem in Schritt 3.5.4 ausgewählten Wert und notieren Sie die Grenzflächenspannung für 5 min7.

4. Programmierung eines experimentellen Prozesses in DINATEN für jeden Verdauungsschritt

HINWEIS: Zu den Prozessparametern siehe ergänzende Abbildung 1B.

  1. Führen Sie die anfängliche Kontrolle durch.
    1. Zur Tropfenbildung injizieren Sie 10 μL (±5 μL) Emulgatorlösung in die Kapillare (Ventil 6) (ergänzende Abbildung 2A).
    2. Die Adsorption an einer konstanten Grenzflächenfläche21 von 20 mm 2 (±10 mm2) wird für 1 h aufgezeichnet (ergänzende Abbildung 2B).
    3. Erfassen Sie die dilatative Rheologie8 (ergänzende Abbildung 2C).
      1. Stellen Sie die Amplitude der Oszillation auf 1,25 μL, Periode 10 s ein.
      2. Die Adsorption am ausgewählten Grenzflächenbereich (Schritt 4.1.2) wird 10 s lang aufgezeichnet.
      3. Wiederholen Sie Schritt 4.1.3 in verschiedenen Zeiträumen: 5 s, 20 s, 50 s und 100 s.
  2. Aufzeichnung der Magenverdauung.
    1. Die Adsorption21 an der ausgewählten Grenzflächenfläche wird für 10 s aufgezeichnet.
    2. Subphasenaustausch7 mit Flüssigkeit in Ventil 2 (sSGF) und Magenenzymen (Tabelle 1) (ergänzende Abbildung 2D).
      1. Füllen Sie die linke Spritze aus Ventil 2. Injizieren Sie 125 μL in das Ventil 6-Kapillare mit der linken Spritze bei 5 μL·s−1.
      2. Extrahieren Sie 125 μL aus der Kapillare mit der rechten Spritze bei 5 μL·s−1. Entladen Sie die rechte Spritze zum Austrittsventil 8. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.2.1-4.2.2.2 10 Mal, um einen vollständigen Austausch zu gewährleisten.
    3. Die Adsorption21 an der ausgewählten Grenzflächenfläche in Schritt 4.1.2 wird für 1 h aufgezeichnet (ergänzende Abbildung 2B).
    4. Erfassen Sie die dilatative Rheologie8 (ergänzende Abbildung 2C).
      1. Stellen Sie die Amplitude der Oszillation auf 1,25 μL, Periode 10 s ein.
      2. Die Adsorption des ausgewählten Grenzflächenbereichs in Schritt 4.1.2 wird 10 s lang aufgezeichnet. Wiederholen Sie zu verschiedenen Perioden: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.
  3. Aufzeichnung der Darmverdauung.
    1. Die Adsorption21 an der ausgewählten Grenzflächenfläche in Schritt 4.1.2 wird für 10 s aufgezeichnet (ergänzende Abbildung 2B).
    2. Subphasenaustausch7 mit Flüssigkeit in Ventil 3 (sSIF) und intestinalen Enzymen/Gallensalzen/Phospholipiden (Tabelle 1) (ergänzende Abbildung 2D).
      1. Füllen Sie die linke Spritze aus Ventil 2. Injizieren Sie 125 μL in das Ventil 6-Kapillare mit der linken Spritze bei 5 μL·s−1. Extrahieren Sie 125 μL aus der Kapillare mit der rechten Spritze bei 5 μL·s−1.
      2. Entladen Sie die rechte Spritze zum Austrittsventil 8. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.2.1-4.3.2.2 10 Mal, um einen vollständigen Austausch zu gewährleisten.
    3. Die Adsorption21 an der ausgewählten Grenzflächenfläche in Schritt 4.1.2 wird für 1 h aufgezeichnet.
    4. Erfassen Sie die dilatative Rheologie8 (ergänzende Abbildung 2C).
      1. Stellen Sie die Amplitude der Oszillation auf 1,25 μL, Periode 10 s ein.
      2. Die Adsorption am ausgewählten Grenzflächenbereich in Schritt 4.1.2 wird für 10 s aufgezeichnet.
      3. Wiederholen Sie zu verschiedenen Perioden: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.
  4. Notieren Sie die Desorption anhand der folgenden Schritte.
    1. Die Adsorption21 an der ausgewählten Grenzflächenfläche in Schritt 4.1.2 wird für 10 s aufgezeichnet (ergänzende Abbildung 2B).
    2. Subphasenaustausch7 mit Flüssigkeit in Ventil 5 (sSIF) (Tabelle 1, ergänzende Abbildung 2D).
      1. Füllen Sie die linke Spritze aus Ventil 5. Injizieren Sie 125 μL in die Ventil-5-Kapillare mit der linken Spritze bei 5 μL·s−1.
      2. Extrahieren Sie 125 μL aus der Kapillare mit der rechten Spritze bei 5 μL·s−1. Entladen Sie die rechte Spritze zum Austrittsventil 8. Wiederholen Sie die Schritte 4.4.2.1-4.4.2.2 10 Mal, um einen vollständigen Austausch zu gewährleisten.
    3. Die Adsorption21 an der ausgewählten Grenzflächenfläche in Schritt 4.1.2 wird für 1 h aufgezeichnet (ergänzende Abbildung 2B).
    4. Erfassen Sie die dilatative Rheologie8 (ergänzende Abbildung 2C).
      1. Halten Sie die Amplitude von 1,25 μL, Periode 10 s.
      2. Die Adsorption am ausgewählten Grenzflächenbereich in Schritt 4.1.2 wird für 10 s aufgezeichnet.
      3. Wiederholen Sie Schritt 4.4.4 in verschiedenen Zeiträumen: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.

5. Aufbau des Experiments

  1. Füllen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit den künstlichen Aufschlussmedien und verbinden Sie sie jeweils über den entsprechenden Schlauch mit dem jeweiligen Ventil.
  2. Füllen Sie den Schlauch in die Ventile 2-5, indem Sie von Ventil 2, Ventil 3, Ventil 4 und Ventil 5 bis zum äußeren Ausgang (Ventil 8) reinigen (ergänzende Abbildung 1A).
  3. Füllen Sie den Schlauch in Ventil 1, indem Sie 5 Mal von Ventil 1 bis Ventil 6-Kapillare reinigen.
  4. Legen Sie die Kapillare in die Ölphase. Legen Sie die linke Spritze mit Ventil 1 ein (Ausgangslösung, Tabelle 1).
  5. Beginnen Sie mit der sequenziellen Verarbeitung von Schritt 4.1-initial, Schritt 4.2-Magen, Schritt 4.3-Darm und Schritt 4.4-Desorption und speichern Sie die Daten am Ende jedes Prozesses.

6. Berechnung der dilatatorischen rheologischen Parameter mit der Bildverarbeitungssoftware CONTACTO8

HINWEIS: Für Details siehe Maldonado-Valderrama et al.8.

  1. Laden Sie die Bilder, die der Flächenschwingung entsprechen, mit einer bestimmten Frequenz und Amplitude (ergänzende Abbildung 3A).
  2. Drücken Sie Rheologie (ergänzende Abbildung 3B) und erhalten Sie die dilatatorischen Parameter (ergänzende Abbildung 3C).
  3. Kopieren Sie die Ergebnisse und fügen Sie sie in die Datentabelle ein.

7. Darstellung der Versuchsergebnisse

  1. Berechnen Sie die Zeitspalte in jedem der Schritte des Verdauungsprozesses neu, indem Sie die letzten Daten der Zeit des vorherigen Schritts hinzufügen.
  2. Zeichnen Sie die Grenzflächenspannung im Vergleich zur additiven Zeit für jeden der Schritte des verwendeten Verdauungsprozesses auf.
  3. Zeichnen Sie die endgültige Grenzflächenspannung / dilatatorische Elastizität und Viskosität, die am Ende jedes Schritts im Vergleich zur Verdauungsphase erhalten wird: Anfangsphase, Magenverdauung, Zwölffingerdarmverdauung und Desorption.

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Ergebnisse

Dieser Abschnitt zeigt verschiedene Beispiele für Aufschlussprofile, die mit dem OCTOPUS gemessen wurden. Das allgemeine Erscheinungsbild der simulierten Aufschlussprofilübereinstimmungen ist in Abbildung 4B dargestellt. Die Grenzflächenspannung wird im Verdauungsprofil meist gegen die Zeit dargestellt. Die verschiedenen betrachteten Phasen/Verdauungsschritte werden in unterschiedlichen Farben dargestellt. Die erste Phase bildet die Ausgangsschicht und entspricht je nach Fall der Adsorptions...

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Diskussion

Dieser Artikel beschreibt ein verallgemeinertes Protokoll zur Messung der In-vitro-Verdauung von Grenzflächenschichten unter Verwendung von Pendant-Drop-Geräten. Das Protokoll kann an die spezifischen Anforderungen des Experiments angepasst werden, indem die Zusammensetzung der Verdauungspuffer abgestimmt wird, die auf dem harmonisierten Protokoll INFOGEST11,20 basieren, um den Vergleich mit der Literatur zu erleichtern. Die Verdauungsenzyme und Biotensi...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Papier berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch die Projekte RTI2018-101309-B-C21 und PID2020-631-116615RAI00 finanziert, gefördert durch MCIN/AEI/10.13039/501100011033 und durch "EFRE A way of making Europe". Diese Arbeit wurde (teilweise) von der Biocolloid and Fluid Physics Group (siehe PAI-FQM115) der Universität Granada (Spanien) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alpha-Chymotrypsin aus der Bauchspeicheldrüse des RindesSigma-AldrichC4129Enzym
Beta-LactoglobulinSigma-AldrichL0130Emulgfier
RinderserumalbuminSigma-Aldrich9048-46-8Emulgrier
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4
Kronton InstrumenteCentrikon T-124Zur Trennung von Öl und Harzen
CitruspektinSigma-AldrichP9135Emulsfier
Co-Lipase AUS DER BAUCHSPEICHELDRÜSE DES SCHWEINSSigmaC3028Enzym
CONTACTOUniversität Granada (UGR)https://core.ugr.es/dinaten/, letzter Zugriff: 18.07.2022
DINATENUniversität Granada (UGR)https://core.ugr.es/dinaten/, letzter Zugriff: 18.07.2022
MagenlipaseLipolytechRGE15-1GEnzym
Humanserum AlbuminSigma-Aldrich70024-90-7Emulgator
INFOGESThttp://www.proteomics.ch/IVD/
Lipase aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins, Typ IISigma-AldrichL33126Enzym
Magnesiummetasilikat HarzeFluka1343-88-0Harze zur Reinigung von Öl
Micro 90International ProdukteM-9051-04Reiniger
NaClSigma7647-14-5Elektrolyt
NaH2PO4Scharlau10049-21-5Zur Herstellung
von Puffer OCTOPUSProducciones Cientí ficas y Té cnicas S.L. (G&oakute; Behälter, Spanien)Pendandt Drop Equipment mit Multi-Subphasen-Austausch
Sigma-Aldrich1514Öl
Pankreas aus der Bauchspeicheldrüse des SchweinsSigmaP7545-25 gEnzym
PepsinSigma-AldrichP6887Enzym
Pluronic F127SigmaP2443Emulgator
Pluronic F68SigmaP1300Emulgor
NatriumdesoxycholatSigmaGallensalze
NatriumglycodeoxycholatSigmaC9910Gallensalze
NatriumtaurocholatSigma86339Gallensalze
SpritzenfilterMillex-DPSLGP033R  Spritzenvorsatzfilter 0,22 & Mikro; m Porengröße Polyethersulfon
TrypsinSigma-AldrichT1426Enzym
Elektrolytzentrifuge Olivenöl

Referenzen

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