Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Bewertung der Funktion von mechanisch aktivierten Ionenkanälen in nativen Urothelzellen unter Verwendung des fluoreszierendenCa2+ -Sensors GCaMP5G.
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Methodenartikel
Ex Vivo Analyse von mechanisch aktivierten Ca2+ Transienten in Urothelzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mechanisch aktivierte Ionenkanäle sind biologische Wandler, die mechanische Reize wie Dehnungs- oder Scherkräfte in elektrische und biochemische Signale umwandeln. Bei Säugetieren sind mechanisch aktivierte Kanäle essentiell für die Erkennung äußerer und innerer Reize in so unterschiedlichen Prozessen wie Berührungsempfindung, Gehör, Regulierung des Volumens roter Blutkörperchen, Basalblutdruckregulierung und Suffizienzgefühl in der Harnblase. Während die Funktion von mechanisch aktivierten Ionenkanälen in der In-vitro-Umgebung mit der Patch-Clamp-Technik ausgiebig untersucht wurde, bleibt die Beurteilung ihrer Funktion in ihrer natürlichen Umgebung eine schwierige Aufgabe, oft aufgrund des begrenzten Zugangs zu den Expressionsstellen dieser Kanäle (z. B. afferente Terminals, Merkel-Zellen, Barorezeptoren und Nierentubuli) oder Schwierigkeiten bei der Anwendung der Patch-Clamp-Technik (z. B. die apikalen Oberflächen von Urothelschirmzellen). Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Bewertung mechanisch evozierter Ca 2+ Transienten unter Verwendung des Fluoreszenzsensors GCaMP5G in einer ex vivo urothelialen Präparation, einer Technik, die leicht für die Untersuchung von mechanisch evozierten Ca2+ -Ereignissen in anderen nativen Gewebepräparaten angepasst werden könnte.
Einleitung
Epithelzellen in den Harnwegen sind mechanischen Kräften ausgesetzt, wenn das Harnfiltrat durch die Nephrone wandert, und der Urin wird aus dem Nierenbecken gepumpt und wandert durch die Harnleiter, um in der Harnblase gespeichert zu werden. Es ist seit langem bekannt, dass mechanische Kräfte (z. B. Scherspannung und Dehnung), die von Flüssigkeiten auf die Epithelzellen ausgeübt werden, die die Harnwege auskleiden, die Rückresorption von Protein im proximalen Tubulus und von gelösten Stoffen im distalen Nephronregulieren 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11
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Protokoll
Die Pflege und der Umgang mit den Tieren wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden weibliche, 2-4 Monate alte C57Bl/6J-Mäuse verwendet. Die Mäuse wurden kommerziell erworben (siehe Materialtabelle).
1. Montage und Einrichtung der Ausrüstung
- Führen Sie eine Ca2+ -Bildgebung mit einem aufrechten Mikroskop durch, das mit einer hochauflösenden Kamera und einer stabilen Lichtquelle ausgestattet ist (siehe Materialtabelle).
- Erfassen Sie die Bilder mit einer ....
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Ergebnisse
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Bewertung mechanisch evozierter Ca2+-Transienten in Regenschirmzellen unter Verwendung des fluoreszierendenCa2+-Sensors GCaMP5G. Die adenovirale Transduktion wurde verwendet, um GCaMP5G in Urothelzellen zu exprimieren, da sie eine hohe Effizienz aufweist und ein erhöhtes Expressionsniveau erzeugt. Fluoreszenzbilder von gefärbten Kryoschnitten aus einer transduzierten Blase sind in Abbildung 2D dargestellt. Für diese .......
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Diskussion
Alle Organismen und scheinbar die meisten Zelltypen exprimieren Ionenkanäle, die auf mechanische Reize reagieren 20,33,34,35,36,37. Die Funktion dieser mechanisch aktivierten Kanäle wurde überwiegend mit der Patch-Clamp-Technik untersucht. Aufgrund von Zugänglichkeitsproblemen waren Patch-Clamp-Studien von mechanisch aktivier.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01DK119183 (an G.A. und M.D.C.) und S10OD028596 (an G.A.) sowie durch die Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores des Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 20x Objektiv | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾ ” Katheter | Medline | Suresite IV Folie | |
| 4x Objektiv | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/Digital-Wandler | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP Antikörper | Abcam | Ab6556 | |
| Strahlteiler | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolarer Temperaturregler | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M Lösung |
| cellSens Software | Olympus | Imaging Software | |
| CMOS-Kamera | Hamamatsu | ORCA-Fusion | |
| Esel Anti-Kaninchen konjugiert mit Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glaskapillaren Corning 8250 Glas | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glukose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline-Heizung | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Lichtquelle | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Verteiler Pumpenschlauch | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Verteiler Pumpenschlauch | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mäuse | Jackson Lab | 664 | 2-4 Monate altes Weibchen C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Mikromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Mikroskop | Olympus | BX51W | |
| Eindeckmedium mit DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade mit DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp-Software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-Clamp-Software zur elektrophysiologischen Datenerfassung und -analyse |
| Peristaltikpumpe | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelektrischer Aktuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipettenhalter | World Precision Instruments | ||
| Pipettenabzieher | Narishige | PP-830 | |
| Beheizte Schnellwechselbasis mit Perfusion und Adapterring-Kit | Warner Instruments | QE-1 | Schnellwechselplattform passend für 35 mm Schüssel |
| Rhodamin-Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Wissenschaftliche Grafik- und Datenanalysesoftware |
| Silikonelastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Einkanaliger Open-Loop-Piezo-Controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Quadratisches Gitterhalterpad | Ted Pella | 10520 | |
| Naht | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon-Montagestange | Sonderanfertigung | Verwendung zur Montage des piezoelektrischen Aktuators im Mikromanipulator | |
| Schläuche | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O Gerät | National Instruments | NI USB-6501 |
Referenzen
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C.
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Nachdrucke und Genehmigungen
