Method Article

Mechano-Node-Pore Sensing: Eine schnelle, markierungsfreie Plattform für viskoelastische Multiparameter-Einzelzellmessungen

DOI:

10.3791/64665

⸱

December 2nd, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Bioengineering, University of California, Berkeley and University of California, San Francisco, 2Department of Mechanical Engineering, University of California, Berkeley, 3Department of Electrical Engineering and Computer Sciences, University of California, Berkeley

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird eine Methode zur mechanischen Phänotypisierung einzelner Zellen unter Verwendung einer elektronikbasierten mikrofluidischen Plattform namens Mechano-Node-Pore Sensing (Mechano-NPS) vorgestellt. Diese Plattform hält einen moderaten Durchsatz von 1-10 Zellen / s aufrecht und misst gleichzeitig die elastischen und viskosen biophysikalischen Eigenschaften der Zellen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zelluläre mechanische Eigenschaften sind an einer Vielzahl von biologischen Prozessen und Krankheiten beteiligt, die von der Stammzelldifferenzierung bis zur Krebsmetastasierung reichen. Herkömmliche Methoden zur Messung dieser Eigenschaften, wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Mikropipettenaspiration (MA), erfassen reichhaltige Informationen, die die volle viskoelastische Reaktion einer Zelle widerspiegeln. Diese Methoden sind jedoch durch einen sehr geringen Durchsatz begrenzt. Hochdurchsatzansätze wie die Echtzeit-Deformierbarkeitszytometrie (RT-DC) können nur begrenzte mechanische Informationen messen, da sie oft auf Einzelparameter-Anzeigen beschränkt sind, die nur die elastischen Eigenschaften einer Zelle widerspiegeln. Im Gegensatz zu diesen Methoden ist die Mechano-Node-Poren-Sensorik (Mechano-NPS) eine flexible, markierungsfreie mikrofluidische Plattform, die die Lücke schließt, um multiparameter-viskoelastische Messungen einer Zelle mit moderatem Durchsatz zu erreichen. Eine Gleichstrommessung (DC) wird verwendet, um Zellen zu überwachen, während sie einen mikrofluidischen Kanal durchlaufen, und verfolgt ihre Größe und Geschwindigkeit vor, während und nachdem sie durch eine enge Verengung gezwungen werden. Diese Informationen (d. H. Größe und Geschwindigkeit) werden verwendet, um die transversale Verformung jeder Zelle, den Widerstand gegen Verformung und die Erholung von der Verformung zu quantifizieren. Im Allgemeinen bietet diese elektronikbasierte mikrofluidische Plattform mehrere viskoelastische Zelleigenschaften und damit ein vollständigeres Bild des mechanischen Zustands einer Zelle. Da sie eine minimale Probenvorbereitung erfordert, eine einfache elektronische Messung (im Gegensatz zu einer Hochgeschwindigkeitskamera) verwendet und die Vorteile der Standard-Softlithographie-Fertigung nutzt, ist die Implementierung dieser Plattform einfach, zugänglich und an die nachgelagerte Analyse anpassbar. Die Flexibilität, der Nutzen und die Empfindlichkeit dieser Plattform haben einzigartige mechanische Informationen zu einer Vielzahl von Zellen geliefert, mit dem Potenzial für viele weitere Anwendungen in der Grundlagenforschung und klinischen Diagnostik.

Introduction

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Einzelzellen sind dynamische, viskoelastische Materialien1. Eine Vielzahl von internen und externen Prozessen (z. B. Beginn der Mitose oder Umbau der extrazellulären Matrix [ECM]) beeinflussen ihre Struktur und Zusammensetzung 2,3,4, was oft zu unterschiedlichen biophysikalischen Eigenschaften führt, die ihren aktuellen Zustand ergänzen. Insbesondere mechanische Eigenschaften haben sich als wichtige Biomarker für die Zellentwicklung, Physiologie und Pathologie erwiesen und liefern wertvolle quantitative Informationen, die kanonische molekulare und gene....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Gerätegeometrie entwerfen

  1. Wählen Sie die Breite der Größen- und Wiederherstellungssegmente so, dass sie breiter als der Durchmesser der größten zu messenden Zellen ist, aber auch ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) beibehält. In der ergänzenden Tabelle 2 finden Sie Beispiele für unterschiedliche Größen- und Rückgewinnungssegmentbreiten für verschiedene Zelllinien.
  2. Wählen Sie die Breite des Kontraktionssegments, um eine Dehnung von 30% -40% auf die durchschnittliche Größe der Zellen anzuwenden, die einer Mechanophenotypisierung unterzogen werden sollen. Die Dehnung ist definiert als

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Results

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Die hier vorgestellte Mechanophänotypisierungsplattform ist ein einfacher und vielseitiger Ansatz, um die biophysikalischen Eigenschaften einzelner Zellen mit moderatem Durchsatz zu messen. Die Zellen werden durch den mikrofluidischen Kanal (Abbildung 1A) unter Verwendung eines konstanten druckgetriebenen Flusses geleitet. Während des Passierens der Zellen werden die Länge des mikrofluidischen Kanals und die erzeugten Stromimpulse mit der Datenerfassungshardware aufgezeichnet. Das erfasste S.......

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Discussion

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Die Messung der mechanischen Eigenschaften einzelner Zellen mit dieser Mechanophänotypisierungstechnik besteht aus drei Phasen: Geräteherstellung, Datenerfassung und Datenanalyse. Innerhalb jeder Phase gibt es bemerkenswerte Aspekte, die die experimentellen Ergebnisse erheblich beeinflussen können. Bei der Geräteherstellung sind konsistente Kanalgeometrien und die Einheitlichkeit von Gerät zu Gerät für genaue und wiederholbare Ergebnisse unerlässlich. Insbesondere sollten die Seitenwände jedes Geräts relativ glatt sein (.......

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Disclosures

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L. L. S hält das US-Patent Nr. 11,383,241: "Mechano-node-pore sensing", J. Kim, S. Han und L. L. Sohn, erteilt am 12. Juli 2022.

Acknowledgements

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Diese Forschung wurde durch Zuschüsse von NIBIB 1R01EB024989-01 und NCI 1R01CA190843-01 unterstützt. A. L. und R. R. wurden durch ein H2H8 Association Graduate Research Fellowship unterstützt. K. L. C. wurde durch ein National Science Foundation Graduate Research Fellowship und ein Siebel Scholar Fellowship unterstützt.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonJ.T. Baker5356-05Reinheit (GC)  ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)
Aluminiumfolien/an/a
Analoger TiefpassfilterThorLabsEF504≤ 240 kHz Durchlassband, koaxiale BNC-Durchführung  (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)
Biopsie-StanzeIntegra Miltex33-31AA-P/251mm, Einweg, mit Stößel (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)
Klingen/an/a
BNC-KabelPomona Electronics2249-C-12https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_
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mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs
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Reinraum-PolyestertupferThermo Fisher Scientific18383https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
StromvorverstärkerDL Instruments1211https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_
id=1419
Custom PCB (mit Komponenten)n/an/a sieheErgänzende Dateien 4 und 5
DatenerfassungsklemmenblockNational InstrumentsBNC-2120https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
Datenerfassungskabel auf BNC-2110National InstrumentsSHC68-68-EPMhttps://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
Datenerfassungsboard (DAQ)National InstrumentsPCI-6251https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html
ExsikkatorThermo Fisher Scientific5311-0250https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
Buchse BNC-auf-Bananenstecker-AdapterPomona Electronics72909https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
fötales Rinderserum (FBS)VWR89510-186https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs
GlasschneiderChemglassCG-1179-21https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Gold Etchant TFATranseneNC0977944https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
HeizplatteThermo Fisher ScientificSP131825 
Isopropylalkohol-Spektrum-ChemikalieI1056-4LTPLReinheit (GC)   ≥ 99,5 % (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)
Metall-Hardware-GehäuseHammond ManufacturingEJ12126https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
MethanolSigma-Aldrich34860Reinheit (GC)  ≥ 99,8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)
MF-321 EntwicklerKayaku Advanced Materialsn/ahttps://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 Positiver FotolackDuPontn/ahttps://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo FisherScientific 10010049https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
PhotomaskFineline Imagingn/aPhotomask sind Sonderanfertigungen aus unseren CAD-Designs (https://www.fineline-imaging.com/)
Plain Glass Mikroskop SlideFisher Scientific12-553-5BMaterial: Natron Kalk, L75 x B50 mm, Dicke: 0.90– 1,10 mm 
PlasmareinigerHarrick PlasmaPDC-001https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
Petrischale aus KunststoffThermoFisher Scientific FB0875712100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)
DruckreglerFluigentMFCS-EZhttps://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
Druckregler SoftwareFluigentMAESFLO
Programmierung & BerechnungssoftwareMATLABR2021bfür die Datenerfassung und -analyse (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)
PTFE-SchlauchCole Parmer06417-310.032" ID x 0.056" ( https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)
Scepter 2.0 Handheld Automatischer ZellzählerMillapore SigmaPHCC20060https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
Silizium WaferWafer World288576,2 mm, einseitig poliert (https://www.waferworld.com/product/2885)
Spin Coatern/an/a
SU-8 3025 Negativ-FotolackKayaku Advanced Materialsn/ahttps://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 EntwicklerKayaku Advanced Materialsn/ahttps://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 PolydimethlysiloxanDow Chemical 4019862https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
KlebebandScotch810-341296https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid=
Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO
2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm
vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH
VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
Titan, Platin, Goldn/an/a
Triple Output NetzteilKeysightE36311Ahttps://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653
UV Mask AlignerKarl Süss AmericaMJB3 Maske Aligner 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. Mechanical properties of the cytoskeleton and cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038(2017).
  2. Kim, J., et al. Characterizing cellular mechanical phenotypes with mec....

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Mechano Node Pore SensingSingle Cell ViscoelasticityMicrofluidic PlatformMechanical PhenotypingLabel Free MeasurementCell DeformationElectronic MeasurementCell Mechanical PropertiesDownstream AnalysisSoft Lithography

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