Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Mekano-node-pore-sensing: En rask, etikettfri plattform for enkeltcellede viskoelastiske målinger med flere parametere

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64665
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1,3, 1,2
1Graduate Program in Bioengineering, University of California, Berkeley and University of California, San Francisco, 2Department of Mechanical Engineering, University of California, Berkeley, 3Department of Electrical Engineering and Computer Sciences, University of California, Berkeley
* These authors contributed equally

Summary

Presentert her er en metode for å mekanisk fenotype enkeltceller ved hjelp av en elektronikkbasert mikrofluidisk plattform kalt mekano-node-pore sensing (mekano-NPS). Denne plattformen opprettholder moderat gjennomstrømning av 1-10 celler / s mens den måler både de elastiske og viskøse biofysiske egenskapene til celler.

Abstract

Cellulære mekaniske egenskaper er involvert i et bredt spekter av biologiske prosesser og sykdommer, alt fra stamcelledifferensiering til kreftmetastase. Konvensjonelle metoder for å måle disse egenskapene, for eksempel atomkraftmikroskopi (AFM) og mikropipette aspirasjon (MA), fanger rik informasjon, som reflekterer cellens fulle viskoelastiske respons; Imidlertid er disse metodene begrenset av svært lav gjennomstrømning. Tilnærminger med høy gjennomstrømning, for eksempel sanntids deformabilitetscytometri (RT-DC), kan bare måle begrenset mekanisk informasjon, da de ofte er begrenset til enkeltparameteravlesninger som bare gjenspeiler cellens elastiske egenskaper. I motsetning til disse metodene er mekano-node-pore-sensing (mekano-NPS) en fleksibel, etikettfri mikrofluidisk plattform som bygger bro over gapet i å oppnå multiparameter viskoelastiske målinger av en celle med moderat gjennomstrømning. En likestrømsmåling (DC) brukes til å overvåke celler når de passerer en mikrofluidisk kanal, og sporer størrelsen og hastigheten før, under og etter at de blir tvunget gjennom en smal innsnevring. Denne informasjonen (dvs. størrelse og hastighet) brukes til å kvantifisere hver celles tverrgående deformasjon, motstand mot deformasjon og gjenoppretting fra deformasjon. Generelt gir denne elektronikkbaserte mikrofluidiske plattformen flere viskoelastiske celleegenskaper, og dermed et mer komplett bilde av cellens mekaniske tilstand. Fordi det krever minimal prøvepreparering, bruker en enkel elektronisk måling (i motsetning til et høyhastighetskamera), og drar nytte av standard myk litografifabrikasjon, er implementeringen av denne plattformen enkel, tilgjengelig og tilpasningsdyktig til nedstrømsanalyse. Denne plattformens fleksibilitet, nytte og følsomhet har gitt unik mekanisk informasjon om et mangfoldig utvalg av celler, med potensial for mange flere applikasjoner innen grunnleggende vitenskap og klinisk diagnostikk.

Introduction

Enkeltceller er dynamiske, viskoelastiske materialer1. En rekke interne og eksterne prosesser (f.eks. Utbruddet av mitose eller ombygging av den ekstracellulære matrisen [ECM]), påvirker deres struktur og sammensetning 2,3,4, noe som ofte resulterer i distinkte biofysiske egenskaper som utfyller deres nåværende tilstand. Spesielt har mekaniske egenskaper vist seg å være viktige biomarkører for cellulær utvikling, fysiologi og patologi, noe som gir verdifull kvantitativ informasjon som kan supplere kanoniske molekylære og genetiske tilnærminger 5,6,7. For eksempel beskrev Li og medarbeidere nylig de mekaniske forskjellene mellom medikamentresistente og medikamentresponsive akutte promyelocytiske leukemiceller, samtidig som de brukte RNA-seq for å avdekke differensielt uttrykte cytoskjelettassosierte gener8. Ved å forstå det komplekse samspillet mellom encellemekanikk og cellulær funksjon, har mekanofenofontyping bredere anvendelser i å transformere grunnleggende vitenskap og klinisk diagnostikk9.

Det mest brukte verktøyet for måling av encellemekanikk er atomkraftmikroskopi (AFM). Mens AFM muliggjør en høyoppløselig, lokalisert måling av cellulære mekaniske egenskaper, forblir den begrenset til en gjennomstrømning på <0,01 celler / s10. Alternativt er optiske bårer, som bruker to divergerende laserstråler for å fange og deformere suspenderte enkeltceller11, begrenset til marginalt høyere gjennomstrømning av <1 celle / s12. Nylige fremskritt innen mikrofluidisk teknologi har muliggjort en ny generasjon enheter for rask, encellet, mekanisk vurdering12,13. Disse teknikkene benytter smale innsnevringskanaler 14,15, skjærstrøm 16 eller hydrodynamisk strekking 17 for å deformere celler raskt ved gjennomstrømninger på 10-1000 celler / s 18. Selv om målehastigheten for disse tilnærmingene er betydelig raskere enn konvensjonelle teknikker, bytter de ofte høy gjennomstrømningsevne for begrensede mekaniske avlesninger (tilleggstabell 1). Alle de nevnte raske mikrofluidiske metodene fokuserer på grunnleggende enkeltparameterberegninger, for eksempel transittid eller deformabilitetsforhold, som bare gjenspeiler cellens elastiske egenskaper. Gitt den iboende viskoelastiske naturen til enkeltceller, krever en robust og grundig mekanisk karakterisering av celler imidlertid vurdering av ikke bare elastiske komponenter, men også viskøse responser.

Mekano-node-pore-sensing (mekano-NPS)2,8 (figur 1A) er en mikrofluidisk plattform som adresserer eksisterende begrensninger med encellet mekanofenotyping. Denne metoden muliggjør måling av flere biofysiske parametere samtidig, inkludert cellediameter, relativ deformabilitet og restitusjonstid fra deformasjon, med en moderat gjennomstrømning på 1-10 celler/s. Denne teknikken er basert på node-pore sensing (NPS) 19,20,21,22,23,24, som innebærer å bruke en firepunkts sondemåling for å måle den modulerte strømpulsen produsert av en celle som passerer en mikrofluidisk kanal som er segmentert av bredere regioner, referert til som "noder". Den modulerte strømpulsen er et resultat av at cellen delvis blokkerer strømmen av strøm i segmentene (dvs. "porene") og nodene, med mer strøm blokkert i førstnevnte enn i sistnevnte. I mekano-NPS er ett segment, "kontraksjonskanalen", smalere enn en cellediameter; følgelig må en celle deformeres for å passere hele kanalen (figur 1B). Cellediameteren kan bestemmes av størrelsen på underpulsen som produseres når cellen passerer nodeporene før kontraksjonskanalen (figur 1B, C). Her er |ΔInp|, det nåværende fallet når cellen er i porene, proporsjonalt med volumforholdet mellom cellen og poren, V-celle/V-pore 2,8,19. Cellestivhet kan bestemmes av ΔTc, varigheten av den dramatisk større underpulsen som produseres når cellen passerer kontraksjonskanalen (figur 1B, C). En stivere celle vil ta lengre tid å passere kanalen enn en mykereen 2,8. Endelig kan celleutvinning, cellens evne til å gå tilbake til sin opprinnelige størrelse og form etter deformasjon, bestemmes av serien av underpulser produsert når cellen passerer nodeporene etter kontraksjonskanalen (figur 1B, C). Gjenopprettingstiden, ΔTr, er tiden det tar for de nåværende underpulsene å gå tilbake til størrelsen på de tidligere underpulsene, før cellen klemmes. Samlet sett registreres og analyseres de modulerte strømpulsene som produseres når en celle passerer den mikrofluidiske kanalen for å trekke ut de relevante enkeltcellede mekaniske parametrene (figur 1D) 2,8.

Reproduserbarheten og brukervennligheten til denne elektronikkbaserte mikrofluidiske plattformen har tidligere blitt demonstrert25. I tillegg presenterer plattformen en lav inngangsbarriere for encellet mekanofenotyping. Standard myk litografi brukes til å fremstille mikrofluidiske enheter. Målemaskinvaren består av billige komponenter, inkludert et enkelt kretskort (PCB), strømforsyning, forforsterker, datainnsamlingskort (DAQ) og datamaskin. Endelig er brukervennlig kode tilgjengelig for datainnsamling og analyse, noe som muliggjør enkel implementering. Denne mekanofenotypingsteknikken kan skille populasjoner av ikke-maligne og ondartede bryst- og lungeepitelcellelinjer, diskriminere mellom underlinjer i primære humane brystepitelceller, og karakterisere effekten av cytoskeletale forstyrrelser og andre farmakologiske midler 2,8. Samlet sett er denne plattformen en effektiv tilnærming for mekanofenotyping av enkeltceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design enhet geometri

  1. Velg bredden på størrelses- og gjenopprettingssegmentene slik at den er bredere enn diameteren til de største cellene som skal måles, men opprettholder også et tilstrekkelig signal-til-støy-forhold (SNR). Se supplerende tabell 2 for eksempler på ulike størrelses- og gjenopprettingssegmentbredder for ulike cellelinjer.
  2. Velg sammentrekningssegmentbredden for å bruke en 30% -40% belastning på den gjennomsnittlige størrelsen på cellene som skal gjennomgå mekanofenofontyping. Stamme er definert som Equation 1, hvor d er cellediameter og wc er kontraksjonskanalbredden 2,8. Se supplerende tabell 2 for ulike sammentrekningssegmentbredder for ulike cellelinjer.
    MERK: Hvis man ønsker å sammenligne celletyper eller forhold med vesentlig forskjellige diametre, bør separate enhetsdesign brukes med kontraksjonssegmentbredder som er spesifikke for hver celletype / tilstand.
  3. Design en referanseenhet for hver unike enhetsgeometri. Dette er nødvendig for å bestemme De, den effektive diameteren av dimensjoneringsporesegmentet i mikrofluidisk kanal.
    MERK: Referanseenheten bruker samme geometri som primærenheten. Den eneste modifikasjonen er at sammentrekningssegmentet skal være like bredt som det dimensjonerende poresegmentet for å tillate kalibrering med polystyrenperler av kjent størrelse. Utvidelse av sammentrekningen forhindrer polystyrenperlene i å tette sammentrekningskanalen under kalibrering. Kalibreringsprosessen er nærmere beskrevet i trinn 4.1 og 5.3.1. Kalibrering kan også oppnås ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig celleteller, i så fall er det ikke nødvendig med referanseenhet. Denne prosessen er beskrevet i trinn 4.2.
  4. Velg kanalhøyden slik at de største cellene av interesse kan forlenges helt uten begrensning innenfor sammentrekningssegmentet2. Sørg for at kanalhøyden er større enn hmin Equation 2 (dette forutsetter at cellen er sfærisk predeformasjon, og at isometrisk deformasjon oppstår langs kanallengden og høyden under deformasjon).
    MERK: Gitt størrelsen på en nåværende subpulse, jo større hmin er, Equation 3jo lavere blir den totale SNR.
  5. Design og lag en fotomaske ved hjelp av datamaskinstøttet designprogramvare med de valgte kanalbreddene. En eksempelfil er gitt i Tilleggsfil 1. Skaler den mikrofluidiske maskedesignen med 1,5 % for å ta hensyn til krymping av polydimetylsiloksan (PDMS) etter peeling fra den negative masteren.
    MERK: En rekke enheter kan inkluderes på en enkelt maske så lenge den totale matrisen ikke overskrider størrelsen på waferen (supplerende figur 1A).
  6. Design og lag en fotomaske med elektroder som skal brukes til å utføre en firepunktssondemåling av mikrofluidisk enhetsstrøm (figur 1D). En eksempelfil er gitt i Tilleggsfil 1.
    MERK: En rekke elektroder kan inkluderes på en enkelt maske så lenge matrisen ikke overskrider størrelsen på glassglasset (supplerende figur 1B).

2. Fremstill enheter (figur 2)

  1. Forbered elektrodemønstre på et glassunderlag.
    1. Spinn frakk, mønster og behandle en positiv fotoresist på et vanlig glassglass i henhold til produktdatabladet. Et eksempel på denne prosedyren er beskrevet i Tilleggsfil 2.
    2. Utfør metallavsetning, løfting og gulletsing.
      1. Utfør tynnfilmavsetning på 75 Å Ti, 250 Å Pt og 250 Å Au på lysbildet. Et eksempel på denne prosedyren ved bruk av elektronpistolfordampning er skissert i tilleggsfil 3.
      2. Senk lysbildet i aceton i 15 minutter for å utføre en løfting av overflødig metall.
      3. I en avtrekksvifte, bruk en engangspipette for å slippe støpt gulletschant på regionen av elektroder som vil bli utsatt for mikrofluidisk kanal, som vist i tilleggsfigur 2. Vær forsiktig for å unngå å slippe etchant andre steder på lysbildet.
        FORSIKTIG: Gull etchant kan forårsake hud- og øyeirritasjon. Ikke pust damp, og ikke innta. Håndter med forsiktighet, bruk passende personlig verneutstyr (PPE) og kast avfall i henhold til lokale avhendingsforskrifter.
      4. Skyll lysbildet med avionisert (DI) vann og tørk det med tørt nitrogen (N2).
    3. Hvis flere elektroder er trykt på samme glassglass, terning lysbildet i individuelle chips.
      1. Bruk et glassskjæreverktøy for å score lysbildet langs de mønstrede elektrodegrensene.
      2. Knekk glasset langs poengsummen for å dele lysbildet i individuelle sjetonger.
    4. Inspiser elektrodene visuelt under et mikroskop. Sikre at individuelle elektroder ikke er elektrisk åpne eller at elektroder ikke kortsluttes sammen.
  2. Lag en negativ mesterform for kanaler.
    1. Spinnbelegg, mønster og prosess En SU-8 epoksy motstår på en polert silisiumskive i henhold til produktdatabladet. Et eksempel på denne prosedyren er beskrevet i Tilleggsfil 2.
    2. Mål funksjonshøyder ved hjelp av et profilometer og inspiser funksjonene visuelt under et mikroskop (supplerende figur 3). Sørg for at de ønskede geometriene er veldefinerte.
  3. Mugg PDMS-kanaler med myk litografi.
    1. Forbered PDMS ved å veie en elastomer og en tverrbinding med et masseforhold på 10:1 i en engangskopp.
      MERK: For en wafer med en diameter på 3 er 30 g PDMS tilstrekkelig.
    2. Bland PDMS kraftig i 30 s med en engangsgaffel, til PDMS er ugjennomsiktig med bobler.
    3. Avgass PDMS i et vakuumkammer i ca. 30-90 minutter, eller til PDMS er gjennomsiktig uten synlige bobler.
    4. Plasser waferen med SU-8 master mold i en engangs petriskål og hell PDMS over midten av waferen.
    5. Plasser petriskålen som inneholder PDMS og wafer i et vakuumkammer og avgass i ca. 30 minutter, eller til det ikke er noen bobler igjen i PDMS.
    6. Stek PDMS ved 80 °C i 2 timer i ovn eller på kokeplate.
    7. Med et skarpt blad, kutt og fjern PDMS fra SU-8 negativ master.
    8. Terning den støpte PDMS-platen i individuelle former ved hjelp av et skarpt blad
    9. Kjerne innløps- og utløpstilgangshullene ved hjelp av en engangsbiopsistans. For best resultat, bruk en ny stans for hver PDMS-plate. Et skarpere slag produserer glattkantede hull, og minimerer partikler som kan hindre kontraksjonskanalen.
      MERK: Diameteren på tilgangshullene skal være litt mindre enn slangens ytre diameter. For eksempel, hvis du bruker polytetrafluoretylen (PTFE) rør med en ytre diameter på 1/32 i, bør et 1,5 mm hull stanses.
  4. Bind et glass-/elektrodesubstrat til PDMS-kanalene.
    1. Rengjør elektrodeglasset med metanol (≥99,8%). Tørk med tørr N2.
    2. Rengjør PDMS-enheten med scotch tape, etterfulgt av skylling med isopropylalkohol (IPA) og avionisert vann (DI; 18 MΩ / cm2). Tørk med tørr N2. Rengjør deretter med scotch tape igjen.
    3. Plasser glassunderlaget med prefabrikkerte elektroder og den tilberedte PDMS-formen (funksjonssiden opp) i en plasmarenser.
    4. Utsett begge for oksygenplasma i 2 minutter (100-300 mTorr, 30 W).
    5. Juster og plasser PDMS-formen med funksjonssiden med forsiden ned på glassunderlaget med prefabrikkerte elektroder.
      MERK: Liming er øyeblikkelig når plasmabehandlet PDMS og glass kommer i kontakt; Følgelig vil ytterligere justeringsendringer ikke være mulig. For å lette justeringen kan 20 μL av en 2: 1-fortynning av metanol i DI-vann pipetteres på den plasmabehandlede glassoverflaten. Metanolløsningen fungerer som en fysisk barriere mellom det behandlede glasset og PDMS, noe som muliggjør justeringsjusteringer. Hvis du bruker metanol, bake den justerte og parrede enheten ved 50 ° C i 2 timer for å fordampe løsningen og fullføre bindingsprosessen.
    6. Inspiser visuelt den limte enheten under et mikroskop. Sørg for at elektrodene og kanalgeometriene er riktig justert.

3. Mål celler (figur 1D)

  1. Forbered trykkkilden, PCB, benchtop maskinvare, og datainnsamling programvare.
    1. Koble den mikrofluidiske enheten til PCB ved hjelp av klemmen. Et eksempel på PCB er gitt i Tilleggsfil 4 (GERBER-filer) og Tilleggsfil 5 (skjema-, tavle- og PCB-delelistefiler).
      1. Juster klemmens fjærbelastede pinner med elektrodekontaktputene på den mikrofluidiske enheten og juster klemmens topppinner med hullene på PCB.
      2. Sett klemmens hodepinner godt inn i PCB-hullene, og sørg for at de fjærbelastede pinnene holder seg på linje med elektrodekontaktputene.
    2. Sett opp og koble til den elektroniske maskinvaren.
      1. Koble to av strømforsyningens utgangsporter til PCB-ens forsyningsspenningsport med en dobbel banan plug-to-Bayonet Neill-Concelman (BNC) kvinnelig adapter og en BNC-kabel.
      2. Slå på strømforsyningen. Still utgangen som er koblet til BNCs indre leder til +15 V og sett den andre utgangen til -15 V. Aktiver begge utgangene for å drive kretsen.
      3. Koble den tredje av strømforsyningens utgangsporter til inngangsspenningsporten på PCB med en BNC-kabel. Sett utgangen til ønsket påført spenning, men ikke aktiver den før du starter eksperimentet.
      4. Koble PCB-utgangsstrømporten til inngangen til strømforsterkeren med en BNC-kabel.
      5. Koble utgangen fra den nåværende forforsterkeren til en analog inngang på BNC-rekkeklemmen i datainnsamlingssystemet med en BNC-kabel. Du kan eventuelt koble til et analogt lavpassfilter på linje med BNC-kabelen for å filtrere ut høyfrekvent interferens.
        MERK: For å forbedre SNR, PCB og enhet kan være plassert i et tykt metallkapsling. Alle BNC-kabler og fluidic tubing kan føres gjennom hull boret inn i kabinettet.
    3. Installere og sette opp nødvendig programvare på den personlige datamaskinen (PC)
      1. Slå på og koble trykkregulatoren til PC-en. Installer eventuell nødvendig trykkregulatorprogramvare i henhold til produsentens instruksjoner.
      2. Installer MATLAB og verktøykassen for datainnsamling på PC-en. Kontroller at de nødvendige driverne for datainnsamlingssystemet er installert, slik at grensesnittet MATLAB Data Acquisition Toolbox kan oppdage det.
      3. Last ned det inkluderte datainnsamlingsskriptet, "NPS.m", fra https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public.
    4. Åpne og konfigurer skriptet for datainnsamling.
      1. Angi de riktige verdiene for å initialisere datainnsamlingsøkten, som inkluderer leverandør-ID, DAQs enhets-ID og det analoge inndatakanalnummeret (linje 34–36 i det inkluderte skriptet).
        MERK: Enhets-ID-en finner du ved hjelp av funksjonen "daq.getDevices" eller "daqlist".
      2. Angi ønsket samplingsfrekvens for anskaffelsen (linje 23 i det medfølgende skriptet). For optimale resultater, bør den settes til minst 10 kHz.
  2. Forbered cellesuspensjonen.
    1. Forbered en løsning av 2% føtalt bovint serum (FBS) i 1x fosfatbufret saltvann (PBS), og filtrer med et 0,22 μm filter.
    2. Dyrk og forbered cellene i henhold til den aktuelle cellekulturprotokollen for den valgte cellelinjen. Suspender cellene i den tilberedte løsningen av 2% FBS i 1x PBS ved en konsentrasjon på 1-5 x 105 celler / ml. Hold cellene på is i løpet av forsøkene.
  3. Mål de fysiske egenskapene til cellene.
    1. Legg celleprøven i slangen og koble den til enhetens innløp.
      1. Klipp 30 cm PTFE-rør med barberblad eller skarp kniv.
      2. Fest den ene enden av slangen til en luerlåssprøyte. Bruk sprøyten til å trekke opp celleprøven i den andre enden av slangen.
      3. Sett slangen forsiktig inn i innløpet på enheten.
      4. Koble den motsatte enden av slangen til den mikrofluidiske trykkregulatoren.
        MERK: Et filter kan legges mellom den mikrofluidiske trykkregulatoren og slangen for å forhindre tilbakestrømning av væske inn i trykkregulatoren.
    2. Kjør eksperimentet.
      1. Still inn ønsket konstant kjøretrykk på trykkregulatorprogramvaren og la prøven fylle enheten.
        MERK: Trykket er vanligvis 2-21 kPa. Strømningshastigheten må være lav nok til å tillate klart definerte pulser, men rask nok til å tillate tilstrekkelig gjennomstrømning.
        1. Hvis bobler dannes i mikrofluidiske kanaler, bruk blindfylling: koble til stikkontakten og bruk lavt trykk på innløpet for å tvinge luft ut gjennom gasspermeabel PDMS. Å forlate bobler i kanalen vil føre til en ustabil strømlinje og forhindre nøyaktige målinger.
        2. Hvis rusk tetter den mikrofluidiske kanalen, løsner du den ved å trykke lett på toppen av PDMS-enheten mens du påfører kjøretrykket, "pulserer" et høyere trykk ved å slå trykket av og på, eller fjerne slangen og sette den inn igjen. Hvis ruskene forblir, kan det være nødvendig å bytte til en ny enhet.
      2. Still inn ønsket spenning ved å rotere spenningsknappen på strømforsyningen og aktiver spenningen ved å trykke på På-knappen .
        MERK: Spenningen er vanligvis 1-5 V. Velg den laveste spenningen som er nødvendig for en tilstrekkelig SNR. Den samme spenningen skal brukes under alle forhold som skal sammenlignes.
      3. Slå på gjeldende forforsterker og still følsomheten (A / V) så lavt som mulig; Alternativt kan du stille forsterkningen (V/A) så høyt som mulig uten å overbelaste forforsterkeren eller overskride den maksimale analoge inngangsspenningen til DAQ-en. I denne studien ble sensitiviteten satt til 10-7 A/V.
        MERK: Riktig følsomhets- / forsterkningsverdi vil avhenge av både den påførte spenningen og grunnlinjemotstanden til den mikrofluidiske kanalen.
      4. Trykk på den grønne Kjør-knappen i MATLAB-båndmenyen for å starte datainnsamlingsskriptet NPS.m og begynne å ta prøver av og lagre dataene.
      5. For å avslutte eksperimentet, trykk på Stopp-knappen nederst til venstre i figurvinduet for å stoppe datainnsamlingsskriptet. Deaktiver strømforsyningsutgangen ved å trykke på På-knappen . Sett trykkkilden til null trykk i trykkregulatorprogramvaren.
      6. På dette tidspunktet kan eksperimentet settes på pause for å gjøre ett eller flere av følgende:
        1. Bytt ut den nåværende enheten med en ny.
        2. Last slangen på nytt med flere celleprøver.
          MERK: For å unngå krysskontaminering av prøver, bruk nye enheter for å måle celler av forskjellige typer eller forhold.
        3. Løsne enheten fra PCB og undersøk kanalens tilstand under et mikroskop. For å starte eksperimentet på nytt med samme enhet, må du passe på å ikke introdusere luftbobler. Det kan være nødvendig å trykke forsiktig på sprøytestemplet for å holde celleprøven helt i enden av slangen mens du setter den inn i innløpet til enheten.

4. Kalibrer den mikrofluidiske enheten

  1. Alternativ 1: Mål polystyrenperlene i referanseenheter.
    1. Velg en polystyrenperlestørrelse som er mindre enn størrelseskanalen.
    2. Tilsett 1,5% Tween og polystyrenperler til den filtrerte PBS- og FBS-løsningen som ble brukt under celleforsøkene, i en konsentrasjon på 1-3 x 105 perler / ml.
    3. Fortsett med eksperimentet som beskrevet i avsnitt 3, ved hjelp av referanseenheten beskrevet i trinn 1.3, og bruk samme spenning som brukes under eksperimentering. Bruk den gjennomsnittlige størrelsen på det nåværende fallet som produseres som perler som passerer de dimensjonerende porene og den kjente diameteren på perlene for å beregne De, som beskrevet i avsnitt 5.
  2. Alternativ 2: Mål cellestørrelsen uavhengig med en separat måleenhet.
    1. I stedet for å følge protokollen i trinn 4.1, kan du bruke et kommersielt tilgjengelig måleinstrument for cellestørrelse til å måle den gjennomsnittlige størrelsen på cellene i prøven. I dette tilfellet er det ikke nødvendig med referanseenhet. Bruk det gjennomsnittlige strømfallet som produseres når celler passerer dimensjonsporen og den målte gjennomsnittlige cellediameteren for å beregne De som beskrevet i avsnitt 5.

5. Analyser data for å trekke ut cellefenotyper

MERK: Databehandling kan utføres ved hjelp av MATLAB-kommandolinjegrensesnittprogramfilen mNPS_procJOVE.m kl. https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE. Se tilleggsfil 6 for flere instruksjoner.

  1. Forbehandle dataene (figur 3A).
    1. Beregn den målte elektriske strømmen ved å bruke forsterkningsverdien som brukes i strøm-til-spenning-forforsterkeren på rådataene som er innhentet av DAQ.
    2. Fjern høyfrekvent støy ved å bruke en rektangulær utjevningsfunksjon og/eller et lavpassfilter på råstrømmålingen. Deretter oppdaterer du de filtrerte dataene til en lavere samplingsfrekvens. Beregn også de tilsvarende tidsstempeldataene med denne lavere samplingsfrekvensen.
    3. Beregn et montert grunnlinjestrømsignal ved å bruke en metode som asymmetriske minste kvadraters utjevning26.
    4. Beregn det omtrentlige første derivatet (differansesignalet) av de forhåndsbehandlede gjeldende dataene ved å ta forskjellen mellom påfølgende datapunkter.
  2. Identifiser cellehendelser og trekk ut subpulsdata (figur 3B).
    1. Søk etter kandidatcellehendelser ved å undersøke de forhåndsbehandlede dataene. Avvis cellehendelser som overlapper med andre cellehendelser (dvs. tilfeldighetshendelser) (supplerende figur 4), har dårlig baselinetilpasning eller har en uventet eller feilaktig pulsform (f.eks. der en tresko kan ha vært tilstede i kanalen).
    2. Trekk ut delpulsdata for hver cellehendelse.
      1. Hvert nodeporesegment vil vises som en tilsvarende underpuls innenfor den totale signalpulsen (figur 1B, C). Identifiser starten på hver delpuls ved å beregne tidspunktet når differansesignalet når en lokal minimumsverdi. Identifiser slutten av hver underpuls ved å beregne tidspunktet når differansesignalet når en lokal maksimumsverdi.
      2. Bestem bredden på hver delpuls som forløpt tid mellom start- og slutttidspunktet. Bestem amplituden til hver delpuls ved å beregne gjennomsnittet av forskjellen mellom den målte strømmen og grunnlinjestrømmen for alle datapunkter mellom start- og slutttidspunktene.
  3. Bestem cellemekanofenotypen for hver cellehendelse basert på subpulsdata.
    1. Bestem cellediameteren d basert på ligningen definert av Deblois og Bean24:
      Equation 4
      hvor ΔI/I er middelforholdet mellom subpulsamplitude og baselinestrøm i størrelsesunderpulsene, De er kanalens effektive diameter (målt i trinn 4), og L er den totale lengden på node-porekanalen.
      1. D e bestemmes ved å beregne gjennomsnittet ΔI/I produsert av et sett partikler med kjent diameter (enten celler eller perler, se trinn 4), ved å bruke den kjente diameteren som d, og løse Eq. 1 for De.
    2. Kvantifiser cellens motstand mot deformasjon.
      1. Bestem væskehastigheten U-strømmen ved å beregne gjennomsnittlig cellehastighet i størrelsesunderpulsene, ved hjelp av de kjente segmentlengdene og målt varighet av hver underpulse.
      2. Bestem helcelledeformabilitetsindeksen (wCDI), definert av Kim et al.2 som:
        Equation 5
        hvor L c er lengden på kontraksjonssegmentet, h-kanal er kanalhøyden, og ΔT c er varigheten av kontraksjonsunderpulsen.
    3. Identifiser cellens restitusjonstid fra deformasjon, definert som den første utvinningsunderpulsen med en amplitude innen 8% av gjennomsnittlig amplitude fra størrelsesunderpulsen2.
    4. Beregn cellens tverrgående deformasjon innenfor sammentrekningssegmentet.
      1. Beregn den effektive diameteren til kontraksjonssegmentet (De,c) som definert av Kim et al.2:Equation 6 , hvor w c er bredden på kontraksjonssegmentet og wnp er bredden på alle andre segmenter.
      2. Beregn den ekvivalente sfæriske diameteren dc av cellen i sammentrekningen ved igjen å bruke ligningen definert av Deblois og Bean24:
        Equation 7
        hvor ΔI c / Ic er forholdet mellom subpulsamplitude og grunnlinjestrøm i kontraksjonsunderpulsen og Lc er lengden på sammentrekningssegmentet.
      3. Beregn cellens forlengelseslengde Ldeformeres som beskrevet av Kim et al.2:
        Equation 8
      4. Til slutt, beregne cellens tverrgående deformasjon δdeformere, som er definert av Kim et al.2 å være Equation 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mekanofenotypingsplattformen som presenteres her er en enkel og allsidig tilnærming for å måle de biofysiske egenskapene til enkeltceller med moderat gjennomstrømning. Celler strømmes gjennom den mikrofluidiske kanalen (figur 1A) ved hjelp av konstant trykkdrevet strømning. Når cellene transiterer, registreres lengden på den mikrofluidiske kanalen og de produserte pulser ved hjelp av datainnsamlingsmaskinvaren. Det oppkjøpte signalet (figur 1B, C) behandles deretter ved hjelp av tilpasset programvare på MATLAB for å trekke ut de relevante enkeltcellede mekaniske egenskapene. Figur 1D viser en grafisk oversikt over forsøksprotokollen.

For å fremstille enheter opprettes en negativ hovedform opprinnelig og brukes til å støpe PDMS (figur 2). Vellykkede masterformer, vist i supplerende figur 3, inneholder glatte, vertikale sidevegger og ingen defekter i mikrofluidikkkanalen (figur 4Ai). Det må utvises forsiktighet ved fremstilling av denne første hovedformen fordi i dårlig produserte wafere (supplerende figur 3) vil eventuelle feil overføres til alle påfølgende PDMS-avstøpninger (figur 4Aii), noe som gjør dem ubrukelige. Vellykkede PDMS-avstøpninger blir deretter plasmabundet til glassglass med mønstrede elektroder (figur 1A).

For eksperimenter, en enhets elektrodeputer er koblet til PCB (figur 1D) for å muliggjøre strømmåling. Rør, som inneholder en celleprøve, settes deretter inn i enhetens innløp og kobles til en mikrofluidisk strømningsregulator, noe som muliggjør en trykkdrevet strøm av celler gjennom mikrofluidisk kanal. Det er viktig at en liveavlesning av gjeldende måling vises under et eksperiment. Dette gjør det mulig for brukere å sikre at enheten fungerer som tiltenkt. Vellykkede celletransitthendelser består av lett gjenkjennelige subpulser (figur 4Bi). Komplikasjoner, som tilstopping, kan oppstå under eksperimentering og kan identifiseres ved live avlesning av hendelser med unormale pulsformer (figur 4Bii).

For dataanalyse er de kritiske signalparametrene som må trekkes ut for hver celletransitthendelse beskrevet i figur 1B og beskrevet i trinn 5.2.2. Råsignalet skal ha en tilstrekkelig SNR til å filtrere ut støyen og trekke ut de viktige komponentene (figur 3A). Kritisk bør den nåværende signalstigningen fra hver node være robust nok til at underpulser lett kan identifiseres fra differansesignalet ∂ I / ∂t (figur 3B).

Den målte wCDI og restitusjonstider kan brukes til å gjøre direkte sammenligninger mellom celler eller tilstander. Spesielt er wCDI en relativ indikator på cellestivhet som er omvendt proporsjonal med den elastiske modulen (supplerende figur 5); dermed tilsvarer en større verdi av wCDI en mykere mekanisk fenotype. For eksempel, i figur 5A, har ondartede MCF-7-celler en større wCDI-distribusjon enn ikke-ondartede MCF-10A-celler, noe som indikerer at de ondartede MCF-7-cellene er mykere enn deres ikke-ondartede MCF-10A-kolleger. Dette er i samsvar med en rekke empiriske studier som har vist at kreftceller er mykere enn deres ikke-ondartede kolleger27. På samme måte, i figur 5B, viser MCF-10A og MCF-7 celler behandlet med latrunculin en økning i wCDI. Latrunculin er et potent farmakologisk middel som forstyrrer aktincytoskjelettet28. Følgelig er det konsistent å observere en større wCDI , og dermed en mykere fenotype, i celler behandlet med dette legemidlet. Til slutt, i figur 5C, sammenlignes wCDI mellom to humane underlinjer av brystepitelceller, luminalepitel (LEP) og myoepitel (MEP). I denne sammenligningen er det igjen en distinkt wCDI-fordeling som skiller de to primære celletypene, noe som indikerer at LEP-celler er mykere enn MEP-celler. Utover wCDI kan utvinningstider også kvantifiseres for å gi en relativ indikator på celleviskositet. En lengre restitusjonstid indikerer en mer tyktflytende fenotype. Figur 5D viser restitusjonstidene, fordelt på tre forskjellige kategorier, for hver av tilstandene i figur 5A-C. Ubehandlet MCF-10A og MCF-7 har en større andel celler som gjenoppretter umiddelbart (ΔTr = 0), noe som indikerer en lavere viskositet enn deres latrunculinbehandlede motpart.

wCDI og restitusjonstid er relative beregninger av encellet elastisitet og viskositet. Derfor er metoden som presenteres her best egnet til å karakterisere differensialresponsen mellom flere prøver av interesse. I sin nåværende form gir protokollen som presenteres her ikke absolutte kvantifiseringer av definerte mekaniske parametere, for eksempel Youngs modul.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over mekanofenotypingsplattformen. (A) Bilde av den mikrofluidiske enheten. (B) Kanalgeometri, med en representativ strømpuls fra en enkeltcelletransitthendelse. Δ Inp representerer den nåværende dråpen fra cellen som kommer inn i poren, og ΔIc representerer den nåværende dråpen fra cellen som kommer inn i sammentrekningen. Δ T p representerer tiden som trengs for at cellen skal passere porene, Δ Tc representerer tiden som trengs for at cellen skal passere kontraksjonskanalen, og ΔTr representerer tiden som trengs for at cellen skal komme seg. (C) Reell strømpuls fra en celletransitthendelse. (D) Eksperimentell arbeidsflyt: (1) celler suspenderes i PBS og (2) drives gjennom mikrofluidisk enhet med konstant trykk. Når cellene passerer den mikrofluidiske kanalen, måles (3) strømpulser ved hjelp av datainnsamlingsmaskinvare. (4) Strømpulsene analyseres for å trekke ut flere encellede mekaniske egenskaper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Oversikt over enhetsfabrikasjon . (A) Negative hovedformer er (1) produsert ved hjelp av fotolitografi. (2) PDMS støpes deretter på de negative hovedformene. (3) De støpte enhetene er terninger, med innløps- og utløpshull stanset. (B) Samtidig er glassglass (1) mønstret for å fremstille metallelektroder. (2) E-strålefordampning brukes til å avsette metall på lysbildet, etterfulgt av en (3) løfteprosess for å fjerne overflødig metall, og etterlater de ønskede metallelektrodene. (C) PDMS-enheten og glass med metallelektroder bindes deretter sammen ved hjelp av oksygenplasma for å fullføre fabrikasjonsprosessen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Databehandling og analyse . (A) Råstrømdata (venstre) forhåndsbehandles (høyre) ved å bruke en rektangulær utjevningsfunksjon og lavpassfilter, etterfulgt av omsampling til en lavere samplingsfrekvens. Grunnlinjestrømsignalet er deretter utstyrt med asymmetriske minste kvadraters utjevning26. (B) Tidspunktene ved starten og slutten av hver delpuls er identifisert som henholdsvis lokale minimumskrav og maksimum i differansesignalet ∂ I/∂t (til venstre). For hver underpuls bestemmes bredden Δt av forløpt tid mellom start og slutt, og amplituden ΔI bestemmes av den gjennomsnittlige forskjellen mellom den målte strømmen og grunnlinjestrømmen. De ekstraherte subpulsdataene kan representeres som et rektangulært signal (høyre); Hver underpulse tilsvarer ett segment i enhetens geometri. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Eksempler på vellykkede og feilaktige resultater under fabrikasjon og eksperimentering . (A) Bilder av PDMS-avstøpninger av sammentrekningssegmenter hentet fra to forskjellige negative masterformer. (i) er et eksempel på en velfabrikkert kanal med glatte sidevegger, veldefinert geometri og ingen merkbare feil. (ii) er et eksempel på en dårlig fabrikkert kanal med betydelige defekter i kontraksjonskanalen (skissert i røde rektangler), som enten helt eller delvis vil hindre partikkelstrømmen (skalastenger = 150 μm). (B) Eksempler på filtrerte strømpulser generert av "NPS.m" under datainnsamling. (i) Eksempel på en vellykket cellehendelse, der en celle passerer kanalen som tiltenkt. (ii) Eksempel på strømpulser produsert når enheten er "tilstoppet". I dette tilfellet hindrer rusk cellestrømmen i kanalens andre pore. Dette fører til cellehendelser som vises "avskåret" (indikert med den røde linjen) midtveis i den andre størrelsespulsen. Reduksjonene i strømmen (indikert av de blå linjene) etter "avskåret" er forårsaket av partikler (rusk eller celler) som bygger seg opp rundt blokkeringen og derfor blokkerer en større del av strømmen. En skarp nedadgående pigg i strømmen (indikert av det grønne rektangelet) reflekterer en partikkel som er i stand til å passere rundt blokkeringen og derfor bare midlertidig blokkere en større del av strømmen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Eksempler på wCDI og cellegjenvinning mellom ulike tilstander. (A) wCDI-fordeling mellom to brystepitelcellelinjer, ikke-ondartet MCF-10A og ondartet MCF-7. (B) wCDI av MCF-10A eller MCF-7, hvor hver celletype var ubehandlet, behandlet med Lat-A og behandlet med Lat-B. (C) wCDI-fordeling mellom to primære humane brystepitelunderlinjer: myoepitelial (MEP) og luminal epitel (LEP) celler. (D) Gjenopprettingstider som tilsvarer de fire forholdene blant A, B og C. Gjenopprettingstider ble binned for enkel visning. Alle tilstandene hadde en prøvestørrelse på n = 99 celler. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Kim et al.2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: Eksempler på enhetsmatriser for både mikrofluidiske kanaler og elektroder. Begge bildene, representert som gjennomsiktighetsmasker, bør utformes med hvitt (som representerer gjennomsiktig) i områdene der fotoresisten vil bli utsatt for UV og svart i områdene der den vil bli blokkert mot UV-eksponering. (A) En rekke mikrofluidiske kanaler, med to parallelle kanaler per "enhet" (rektangel), arrangert på en 3 i Si wafer. Enheten helt til høyre er merket som "ref" og er utformet, som beskrevet i trinn 1.3, for bruk i kalibrering. (B) En matrise av elektroder, med to elektroder per enhet, slik at begge kanalene i en enhet fra (A) vil justere over hver elektrodedesign fra (B). Denne matrisen ble arrangert for en 2 i x 3 i glassglass. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Skjemaer som illustrerer regioner i elektrodedesignet og hvordan man etser bort gull riktig (trinn 2.1.2.3). Det øverste laget av gull må fjernes fra måleelektrodene, ellers vil biofouling og elektrolyse oppstå under målingen. Imidlertid bør gull forbli på kontaktputene, fordi det myke gullet gir en overlegen elektrisk forbindelse med pinnene til pogo pin-kontakten. (A) Skjematisk viser hvordan den mikrofluidiske kanalen (i blått) krysser med det mønstrede metallet (svart). Som angitt er metallet vinkelrett på mikrofluidisk kanal og direkte under det måleelektrodene, hvor gull må etses, mens de store metallrektanglene til siden av kanalen er kontaktputene, hvor gull må forbli. (B) Skjematisk viser hvor gull etchant bør brukes på mønstret metall, samt hvor det ikke skal. Den grønne regionen indikerer hvor etsning er nødvendig, den gule regionen indikerer hvor etsning kan forekomme og vil ikke påvirke effektiviteten til enheten, og den røde regionen indikerer hvor gull ikke må etses. (C) Skjematisk visning av en typisk, vellykket etset enhet. Gult indikerer regioner der gull fortsatt er til stede, og grått indikerer regioner der platinalaget har blitt eksponert. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3: Bilder av vellykkede og dårlig fabrikkerte kontraksjonskanaler. (A) Bilder av kontraksjonskanaler på negative masterformer fra to individuelle Si-wafere. (i) Et eksempel på en godt fabrikkert hovedform som vil produsere en ideell PDMS-kanal som den som er vist i figur 4Ai. (ii) Et eksempel på en dårlig fabrikkert mesterform, som ble brukt til å lage PDMS-kanalen vist i figur 4Aii. Regionene skissert i røde rektangler samsvarer med feilene som er angitt i figur 4Aii, og demonstrerer overføringen av defekter fra hovedformen til PDMS-mikrokanalene (skalastenger = 150 μm). (B) Bilder av tverrsnittet av PDMS-kontraksjonskanaler, som viser høyden og bredden til forskjellige former. Disse tverrsnittene ble oppnådd ved å kutte PDMS-kontraksjonskanalen vinkelrett på strømningsretningen. (i) Et eksempel på en godt fabrikkert PDMS-form laget ved hjelp av waferen vist i (Ai), som demonstrerer glatte vertikale sidevegger. (ii) Et eksempel på en dårlig fabrikkert PDMS-form opprettet ved hjelp av waferen vist i (Aii) som demonstrerer skrå sidevegger (skalastenger = 20 μm). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 4: Eksempel på en sammenfallende cellehendelse (produsert når mer enn én celle passerer kanalen samtidig). Signalet ble behandlet i henhold til trinn 5.1.1-5.1.3 i protokollens punkt 5. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 5: Forholdet mellom wCDI og den elastiske modulen 20,29,30,31,32,33,34,35. (A) Sammenligning av Jurkat-, MCF7- og MCF10A-celler målt ved denne teknikken versus mikropipette-aspirasjon. wCDI er omvendt proporsjonal med kortikal spenning. (B) Sammenligning av MCF7- og MCF10A-celler målt med denne teknikken versus publiserte AFM-data. (C) Sammenligning av A549- og BEAS-2B-celler målt med denne teknikken versus publiserte AFM-data. Over flere celletyper er wCDI omvendt proporsjonal med elastisk modul. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Kim m.fl.2. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 1: Eksempler på encellede mekanofenotypingsteknikker og hvordan de sammenlignes med mekano-NPS. Teknikker er oppført i rekkefølge av økende gjennomstrømning 12,2,36,37. Mekanisk informasjon refererer til om enheten kan måle både de elastiske og viskøse mekaniske egenskapene til hver celle. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggstabell 2: Eksempel på størrelses-, kontraksjons- og gjenopprettingssegmentbredder for forskjellige cellelinjer. MEP og LEP refererer til to linjer av primære humane brystepitelceller, hvor MEP refererer til myoepitelceller og LEP refererer til luminale epitelceller 2,8. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tilleggsfil 1: Eksempel på AutoCAD-utforming. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Eksempelprotokoll for behandling av fotolitografi. To eksempelprotokoller er skissert for mønster og behandling av fotoresist eller SU-8 epoksy. Den første beskriver anvendelsen av positiv fotoresist på et glassglass for å fungere som et offerlag for elektrodefabrikasjon. Den andre beskriver anvendelsen av SU-8 epoksy på en silisiumskive for å skape avlastningsstrukturer for støping av PDMS mikrofluidiske kanaler. Disse protokollene ble tilpasset fra MF-321 og SU8 3000 datablad fra produsenten. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: Eksempelprotokoll for tynnfilmavsetning av 75 Å Ti, 250 Å Pt og 250 Å Au ved bruk av elektronstrålefordampning. En eksempelprotokoll for utførelse av tynnfilmavsetning av 75 Å Ti, 250 Å Pt og 250 Å Au ved bruk av en elektronstrålefordamper er skissert. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 4: GERBER-filer Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 5: Listefiler for skjema-, tavle- og PCB-deler Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 6: MATLAB kommandolinjegrensesnitt. Denne filen inneholder detaljerte instruksjoner for databehandling ved hjelp av MATLAB-kommandolinjegrensesnittet26. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Måling av de mekaniske egenskapene til enkeltceller ved hjelp av denne mekanofenotypingsteknikken består av tre trinn: enhetsfabrikasjon, datainnsamling og dataanalyse. Innenfor hvert trinn er det bemerkelsesverdige aspekter som kan påvirke de eksperimentelle resultatene betydelig. Under fabrikasjon av enheter er konsistente kanalgeometrier og enhetlighet fra enhet til enhet avgjørende for nøyaktige og repeterbare resultater. Spesielt bør sideveggene til hver enhet være relativt glatte (figur 4Ai), og kanalhøydene på tvers av replikasjonsenheter skal være sammenlignbare. Alle enheter med defekter som delvis hindrer cellestrømmen, spesielt i kontraksjonskanalen (figur 4Aii), skal kastes. Bruk av enheter med merkbare defekter i kanalgeometrien vil resultere i unøyaktige og ikke-reproduserbare resultater. Under datainnsamling er det viktig at brukeren kan gjenkjenne tilstedeværelsen av en tresko i kanalen under datainnsamlingen. Et eksempelskript, "NPS.m" (tilgjengelig på https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public), viser gjeldende målinger, slik at brukeren kan overvåke kanaltilstanden og celletransitthendelsene i sanntid. Pulser som er karakteristiske for en tresko er vist i figur 4B. En tresko i kontraksjonskanalen som fortsatt tillater noen celler å strømme, er spesielt viktig å adressere, da celler vil oppleve økt belastning på obstruksjonsstedet, noe som resulterer i unøyaktige wCDI-er. Til slutt, under dataanalyse, bør brukerne være flittige med å velge nøyaktige terskler som innganger for analysealgoritmen. Hvis tersklene er satt for høyt, vil programmet ikke identifisere hendelser produsert av mindre celler, forvrenge resultater og feilaktig fremstilling av den målte cellepopulasjonen.

Utover disse kritiske stadiene er det flere aspekter av protokollen som kan kreve justering når man studerer forskjellige celletyper eller forhold. For eksempel, å bruke denne teknikken på prøver som er betydelig mindre enn de som tidligere er studert, krever smalere kontraksjonskanaler. Fremstilling av smalere kanaler kan kreve mer kostbare fabrikasjonsmetoder, for eksempel elektronstrålelitografi38. I tillegg, fordi Δ I / I ~ ΔV celle / Δ V sammentrekning (hvor V-celle ogV-sammentrekning er volumene av henholdsvis deformert celle og kanal), resulterer smalere kanaler i større baseline-motstand og redusert SNR19. Endelig kan smale kanaler øke risikoen for tilstopping, noe som gjør eksperimentell utførelse mer utfordrende. Dette spesielle problemet kan potensielt reduseres ved å bruke flere innløpsfiltre.

En begrensning av denne teknikken er den statiske kontraksjonskanalen, som bare kan bruke en enkelt gjennomsnittlig belastning på en populasjon av celler. For å sammenligne deformabiliteten til celler med forskjellige størrelser, eller for å undersøke en enkeltcellepopulasjon ved forskjellige anvendte stammer, må flere enheter med varierende kontraksjonskanalbredder brukes. Plattformen er også begrenset av PDMS-veggene, som begrenser rekkevidden av stivheter den kan måle. For eksempel er noen veldig stive planteceller stivere enn PDMS-veggene som forventes å deformere dem39,40. Videre kan trykket som kreves for å presse slike stive partikler gjennom kontraksjonskanalen overvinne styrken av bindingen mellom PDMS og glassglass, noe som fører til delaminering. Imidlertid kan man fremstille mikrofluidiske kanaler til stivere materialer som glass eller silisium, for dermed å overvinne disse begrensningene. Til tross for disse mindre begrensningene, er denne plattformen fortsatt ideell for mekanisk måling av celler med moderat gjennomstrømning. I forhold til andre metoder, for eksempel optiske bårer eller AFM, muliggjør denne teknikken høyere gjennomstrømning. Sammenlignet med andre mikrofluidiske teknologier med moderat til høy gjennomstrømning, som RT-DC, er denne teknikken i stand til å undersøke mer biofysiske egenskaper ved å måle både de viskøse og elastiske egenskapene til enkeltceller. Til slutt gjør det enkle eksperimentelle oppsettet, som bruker billig elektronikk i motsetning til kompleks optikk, denne teknikken til en svært tilgjengelig teknologi.

Samlet sett har denne mekanofenotypingsteknikken et enormt løfte som et verktøy for mange potensielle studier og applikasjoner. Det har tidligere blitt brukt på et mangfoldig sett av celletyper, inkludert primære prøver, og har vist sin effektivitet ved å måle virkningen av cytoskeletale og nukleære komponenter på cellulære viskoelastiske egenskaper 2,8. Videre, fordi celler forblir levedyktige etter screening med denne plattformen2, har forskere muligheten til å utføre nedstrøms analyse. Denne plattformen er også ideell for kobling med oppstrøms mikrofluidisk cellesortering, og låner seg til applikasjoner som måling av sirkulerende tumorceller. Fremover er denne plattformen fortsatt et konkurransedyktig og allsidig verktøy for multivariable mekaniske målinger av enkeltceller, med applikasjoner for å forstå celleadferd41, bestemme sykdomsprogresjon 42 og overvåke legemiddelrespons43. Utover grunnleggende vitenskapelig forskning har denne teknikken også stort løfte som et klinisk verktøy, spesielt en billig, stasjonær plattform for rask diagnostisk screening. Videre, gitt det lave effektbehovet og minimalt behov for prøvepreparering før måling, er denne teknikken spesielt godt egnet for miljøer med lav ressurs, hvor tilgjengelige diagnostiske instrumenter er sårt tiltrengt44.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L. L. S har amerikansk patent nr. 11,383,241: "Mechano-node-pore sensing", J. Kim, S. Han og L. L. Sohn, utstedt juli 12, 2022.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra NIBIB 1R01EB024989-01 og NCI 1R01CA190843-01. A. L. og R. R. ble støttet av en H2H8 Association Graduate Research Fellowship. K. L. C. ble støttet av et National Science Foundation Graduate Research Fellowship og et Siebel Scholar Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone J.T. Baker 5356-05 Purity (GC)  ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)
Aluminum Foil n/a n/a
Analog Low-Pass Filter ThorLabs EF504 ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)
Biopsy Punch Integra Miltex 33-31AA-P/25 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)
Blade n/a n/a
BNC Cable Pomona Electronics 2249-C-12 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_
medium=cpc&utm_campaign=
Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term=
&utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ
pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx
mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs
w-EALw_wcB
Cleanroom Polyester Swab Thermo Fisher Scientific 18383 https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
Current Preamplifier DL Instruments 1211 https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_
id=1419
Custom PCB (w/ components) n/a n/a see Supplemental files 4 and 5
DAQ Terminal Block National Instruments BNC-2120 https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
DAQ to BNC-2110 cable  National Instruments SHC68-68-EPM https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
Data Acquisition Board (DAQ) National Instruments PCI-6251 https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html
Dessicator Thermo Fisher Scientific 5311-0250 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
Female BNC To Banana Plug Adapter Pomona Electronics 72909 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 89510-186 https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs
Glass Cutter Chemglass CG-1179-21 https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Gold Etchant TFA Transene NC0977944 https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
Hot Plate Thermo Fisher Scientific SP131825 
Isopropyl Alcohol Spectrum Chemical I1056-4LTPL Purity (GC)  ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)
Metal Hardware Enclosure Hammond Manufacturing EJ12126 https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Purity (GC)  ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)
MF-321 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist DuPont n/a https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
Photomask Fineline Imaging n/a Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/)
Plain Glass Microscope Slide Fisher Scientific 12-553-5B Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm 
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001 https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
Plastic Petri Dish Thermo Fisher Scientific FB0875712 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)
Pressure Controller Fluigent MFCS-EZ https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
Pressure Controller Software Fluigent MAESFLO
Programming & Computation Software MATLAB R2021b for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)
PTFE Tubing Cole Parmer 06417-31 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)
Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter Millapore Sigma PHCC20060 https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
Silicon Wafer Wafer World 2885 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885)
Spin Coater n/a n/a
SU-8 3025 Negative Photoresist Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 Polydimethlysiloxane Dow Chemical 4019862 https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Tape Scotch 810-341296 https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid=
Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO
2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm
vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH
VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
Titanium, Platinum, Gold n/a n/a
Triple Output Power Supply Keysight E36311A https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653
UV Mask Aligner Karl Suss America MJB3 Mask Aligner 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. Mechanical properties of the cytoskeleton and cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038 (2017).
  2. Kim, J., et al. Characterizing cellular mechanical phenotypes with mechano-node-pore sensing. Microsystems & Nanoengineering. 4, 17091 (2018).
  3. Mierke, C. T. Bidirectional mechanical response between cells and their microenvironment. Frontiers in Physics. 9, 619 (2021).
  4. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: The force journey of a tumor cell. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1), 113-127 (2009).
  5. Nia, H. T., Munn, L. L., Jain, R. K. Physical traits of cancer. Science. 370 (6516), (2020).
  6. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  7. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  8. Li, B., et al. Mechanical phenotyping reveals unique biomechanical responses in retinoic acid-resistant acute promyelocytic leukemia. iScience. 25 (2), 103772 (2022).
  9. Kozminsky, M., Sohn, L. L. The promise of single-cell mechanophenotyping for clinical applications. Biomicrofluidics. 14 (3), 031301 (2020).
  10. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  11. Wottawah, F., et al. Optical rheology of biological cells. Physical Review Letters. 94 (9), 1-4 (2005).
  12. Darling, E. M., Di Carlo, D. High-throughput assessment of cellular mechanical properties. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 35-62 (2015).
  13. Carey, T. R., Cotner, K. L., Li, B., Sohn, L. L. Developments in label-free microfluidic methods for single-cell analysis and sorting. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 11 (1), 1529 (2019).
  14. Bagnall, J. S., et al. Deformability of tumor cells versus blood cells. Scientific Reports. 5, 18542 (2015).
  15. Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
  16. Otto, O., et al. Real-time deformability cytometry: On-the-fly cell mechanical phenotyping. Nature Methods. 12 (3), 199-202 (2015).
  17. Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (20), 7630-7635 (2012).
  18. Guck, J., Chilvers, E. R. Mechanics meets medicine. Science Translational Medicine. 5 (212), 3-6 (2013).
  19. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: A robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab on a Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
  20. Carbonaro, A., Sohn, L. L. A resistive-pulse sensor chip for multianalyte immunoassays. Lab on a Chip. 5 (10), 1155-1160 (2005).
  21. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Direct detection of antibody-antigen binding using an on-chip artificial pore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (3), 820-824 (2003).
  22. Saleh, O. A., Sohn, L. L. An artificial nanopore for molecular sensing. Nano Letters. 3 (1), 37-38 (2003).
  23. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Quantitative sensing of nanoscale colloids using a microchip Coulter counter. Review of Scientific Instruments. 72 (12), 4449-4451 (2001).
  24. DeBlois, R. W., Bean, C. P. Counting and sizing of submicron particles by the resistive pulse technique. Review of Scientific Instruments. 41 (7), 909-916 (1970).
  25. Li, B., et al. Evaluating sources of technical variability in the mechano-node-pore sensing pipeline and their effect on the reproducibility of single-cell mechanical phenotyping. PLoS ONE. 16 (10), 0258982 (2021).
  26. Zhang, Z. M., Chen, S., Liang, Y. Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. Analyst. 135 (5), 1138-1146 (2010).
  27. Alibert, C., Goud, B., Manneville, J. B. Are cancer cells really softer than normal cells. Biology of the Cell. 109 (5), 167-189 (2017).
  28. Fujiwara, I., Zweifel, M. E., Courtemanche, N., Pollard, T. D. Latrunculin A accelerates actin filament depolymerization in addition to sequestering actin monomers. Current Biology. 28 (19), 3183-3192 (2018).
  29. Saleh, O. A. A novel resistive pulse sensor for biological measurements. , Princeton University. Princeton. PhD Thesis (2003).
  30. Dokukin, M. E., Guz, N. V., Sokolov, I. Quantitative study of the elastic modulus of loosely attached cells in AFM indentation experiments. Biophysical Journal. 104 (10), 2123-2131 (2013).
  31. Li, Q., et al. Probing the elasticity of breast cancer cells using AFM. 13th International Conference on Biomedical Engineering. IFMBE Proceedings. Lim, C. T., Goh, J. C. H. 23, Springer. Berlin, Heidelberg. 2122-2125 (2009).
  32. Rother, J., et al. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046 (2014).
  33. Li, Q., et al. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (4), 609-613 (2008).
  34. Xu, C., et al. Elasticity measurement of breast cancer cells by atomic force microscopy. Proc. SPIE 9230. Twelfth International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine. (PIBM 2014). 92300, (2014).
  35. Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 84 (3), 2071-2079 (2003).
  36. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  37. Urbanska, M., et al. A comparison of microfluidic methods for high-throughput cell deformability measurements. Nature Methods. 17, 587-593 (2020).
  38. Hill, R. T., Chilkoti, A. Surface Patterning. Biomaterials Science: An Introduction to Materials: Third Edition. , Elsevier Academic Press. NY. 276-301 (2013).
  39. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. Journal of Applied Polymer Science. 131 (22), 41050 (2014).
  40. Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  41. Stephens, A. D., Banigan, E. J., Adam, S. A., Goldman, R. D., Marko, J. F. Chromatin and lamin a determine two different mechanical response regimes of the cell nucleus. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1984-1996 (2017).
  42. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force microscopy of nonadherent cells: A comparison of leukemia cell deformability. Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
  43. Evers, T. M. J., Holt, L. J., Alberti, S., Mashaghi, A. Reciprocal regulation of cellular mechanics and metabolism. Nature Metabolism. 3 (4), 456-468 (2021).
  44. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing enables label-free surface-marker profiling of single cells. Analytical Chemistry. 87 (5), 2988-2995 (2015).

Tags

Bioteknologi utgave 190
Mekano-node-pore-sensing: En rask, etikettfri plattform for enkeltcellede viskoelastiske målinger med flere parametere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lai, A., Rex, R., Cotner, K. L.,… More

Lai, A., Rex, R., Cotner, K. L., Dong, A., Lustig, M., Sohn, L. L. Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements. J. Vis. Exp. (190), e64665, doi:10.3791/64665 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter