Mechano-Node-Pore Sensing: Eine schnelle, markierungsfreie Plattform für viskoelastische Multiparameter-Einzelzellmessungen

Zusammenfassung

Hier wird eine Methode zur mechanischen Phänotypisierung einzelner Zellen unter Verwendung einer elektronikbasierten mikrofluidischen Plattform namens Mechano-Node-Pore Sensing (Mechano-NPS) vorgestellt. Diese Plattform hält einen moderaten Durchsatz von 1-10 Zellen / s aufrecht und misst gleichzeitig die elastischen und viskosen biophysikalischen Eigenschaften der Zellen.

Zusammenfassung

Zelluläre mechanische Eigenschaften sind an einer Vielzahl von biologischen Prozessen und Krankheiten beteiligt, die von der Stammzelldifferenzierung bis zur Krebsmetastasierung reichen. Herkömmliche Methoden zur Messung dieser Eigenschaften, wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Mikropipettenaspiration (MA), erfassen reichhaltige Informationen, die die volle viskoelastische Reaktion einer Zelle widerspiegeln. Diese Methoden sind jedoch durch einen sehr geringen Durchsatz begrenzt. Hochdurchsatzansätze wie die Echtzeit-Deformierbarkeitszytometrie (RT-DC) können nur begrenzte mechanische Informationen messen, da sie oft auf Einzelparameter-Anzeigen beschränkt sind, die nur die elastischen Eigenschaften einer Zelle widerspiegeln. Im Gegensatz zu diesen Methoden ist die Mechano-Node-Poren-Sensorik (Mechano-NPS) eine flexible, markierungsfreie mikrofluidische Plattform, die die Lücke schließt, um multiparameter-viskoelastische Messungen einer Zelle mit moderatem Durchsatz zu erreichen. Eine Gleichstrommessung (DC) wird verwendet, um Zellen zu überwachen, während sie einen mikrofluidischen Kanal durchlaufen, und verfolgt ihre Größe und Geschwindigkeit vor, während und nachdem sie durch eine enge Verengung gezwungen werden. Diese Informationen (d. H. Größe und Geschwindigkeit) werden verwendet, um die transversale Verformung jeder Zelle, den Widerstand gegen Verformung und die Erholung von der Verformung zu quantifizieren. Im Allgemeinen bietet diese elektronikbasierte mikrofluidische Plattform mehrere viskoelastische Zelleigenschaften und damit ein vollständigeres Bild des mechanischen Zustands einer Zelle. Da sie eine minimale Probenvorbereitung erfordert, eine einfache elektronische Messung (im Gegensatz zu einer Hochgeschwindigkeitskamera) verwendet und die Vorteile der Standard-Softlithographie-Fertigung nutzt, ist die Implementierung dieser Plattform einfach, zugänglich und an die nachgelagerte Analyse anpassbar. Die Flexibilität, der Nutzen und die Empfindlichkeit dieser Plattform haben einzigartige mechanische Informationen zu einer Vielzahl von Zellen geliefert, mit dem Potenzial für viele weitere Anwendungen in der Grundlagenforschung und klinischen Diagnostik.

Einleitung

Einzelzellen sind dynamische, viskoelastische Materialien¹. Eine Vielzahl von internen und externen Prozessen (z. B. Beginn der Mitose oder Umbau der extrazellulären Matrix [ECM]) beeinflussen ihre Struktur und Zusammensetzung ^2,3,4, was oft zu unterschiedlichen biophysikalischen Eigenschaften führt, die ihren aktuellen Zustand ergänzen. Insbesondere mechanische Eigenschaften haben sich als wichtige Biomarker für die Zellentwicklung, Physiologie und Pathologie erwiesen und liefern wertvolle quantitative Informationen, die kanonische molekulare und genetische Ansätze ergänzen können ^5,6,7. Zum Beispiel beschrieben Li et al. kürzlich die mechanischen Unterschiede zwischen arzneimittelresistenten und medikamentenresponsiven akuten promyelozytären Leukämiezellen, während sie auch RNA-seq verwendeten, um differentiell exprimierte Zytoskelett-assoziierte Gene aufzudecken⁸. Durch das Verständnis des komplexen Zusammenspiels zwischen Einzelzellmechanik und Zellfunktion hat die Mechanophänotypisierung breitere Anwendungen bei der Transformation der Grundlagenforschung und der klinischen Diagnostik⁹.

Das am weitesten verbreitete Werkzeug zur Messung der Einzelzellmechanik ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM). Während AFM eine hochauflösende, lokalisierte Messung zellulärer mechanischer Eigenschaften ermöglicht, bleibt es auf einen Durchsatz von <0,01 Zellen/s^{begrenzt 10}. Alternativ sind optische Stretcher, die zwei divergente Laserstrahlen verwenden, um suspendierte Einzelzellen¹¹ einzufangen und zu verformen, auf geringfügig höhere Durchsätze von <1 Zelle/n¹² beschränkt. Jüngste Fortschritte in der mikrofluidischen Technologie haben eine neue Generation von Geräten für die schnelle, einzellige, mechanische Bewertung ermöglicht^12,13. Diese Techniken verwenden enge Verengungskanäle^14,15, Scherströmung¹⁶ oder hydrodynamische Dehnung 17, um Zellen bei Durchsätzen von 10-1.000 Zellen / s ¹⁸ schnell zu verformen. Während die Messrate dieser Ansätze wesentlich schneller ist als bei herkömmlichen Techniken, tauschen sie häufig Hochdurchsatzfähigkeiten gegen begrenzte mechanische Auslesungen aus (Zusatztabelle 1). Alle oben genannten schnellen mikrofluidischen Methoden konzentrieren sich auf grundlegende Einzelparametermetriken wie Transitzeit oder Verformbarkeitsverhältnisse, die nur die elastischen Eigenschaften einer Zelle widerspiegeln. Angesichts der intrinsischen viskoelastischen Natur einzelner Zellen erfordert eine robuste und gründliche mechanische Charakterisierung von Zellen jedoch nicht nur die Berücksichtigung elastischer Komponenten, sondern auch viskoser Reaktionen.

Mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)^2,8 (Abbildung 1A) ist eine mikrofluidische Plattform^, die bestehende Einschränkungen bei der Einzelzell-Mechanophänotypisierung adressiert. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Messung mehrerer biophysikalischer Parameter, einschließlich Zelldurchmesser, relativer Verformbarkeit und Erholungszeit von Verformung, mit einem moderaten Durchsatz von 1-10 Zellen / s. Diese Technik basiert auf Node-Pore Sensing (NPS) 19,20,21,22,23,24, bei der eine Vier-Punkt-Sondenmessung verwendet wird, um den modulierten Stromimpuls zu messen, der von einer Zelle erzeugt wird, die einen mikrofluidischen Kanal durchquert, der durch breitere Regionen^, sogenannte "Knoten", segmentiert wurde. Der modulierte Stromimpuls ist das Ergebnis der teilweisen Blockierung des Stromflusses in den Segmenten (d. H. "Poren") und Knoten, wobei in ersteren mehr Strom blockiert wird als in letzteren. Beim Mechano-NPS ist ein Segment, der "Kontraktionskanal", schmaler als ein Zelldurchmesser; Folglich muss sich eine Zelle verformen, um den gesamten Kanal zu durchlaufen (Abbildung 1B). Der Zelldurchmesser kann durch die Größe des Subpulses bestimmt werden, der erzeugt wird, wenn die Zelle die Knotenporen vor dem Kontraktionskanal durchquert (Abbildungen 1B,C). Hier ist |ΔI_np|, der Stromabfall, wenn sich die Zelle in der Pore befindet, proportional zum Volumenverhältnis der Zelle zur Pore, _V-Zelle/_V-Pore ^2,8,19. Die Zellsteifigkeit kann durch ΔT_c bestimmt werden, die Dauer des dramatisch größeren Subpulses, der entsteht, wenn die Zelle den Kontraktionskanal durchquert (Abbildungen 1B,C). Eine steifere Zelle braucht länger, um den Kanal zu passieren als eine weichere ^2,8. Schließlich kann die Zellerholung, die Fähigkeit der Zelle, nach der Verformung zu ihrer ursprünglichen Größe und Form zurückzukehren, durch die Reihe von Subpulsen bestimmt werden, die erzeugt werden, wenn die Zelle die Knotenporen nach dem Kontraktionskanal durchquert (Abbildungen 1B,C). Die Erholungszeit, ΔT_r, ist die Zeit, die benötigt wird, bis die aktuellen Subpulse wieder die Größe der vorherigen Subpulse erreichen, bevor die Zelle gequetscht wird. Insgesamt werden die modulierten Stromimpulse, die erzeugt werden, wenn eine Zelle den mikrofluidischen Kanal durchquert, aufgezeichnet und analysiert, um die relevanten mechanischen Einzelzellparameter zu extrahieren (Abbildung 1D)^2,8.

Die Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit dieser elektronikbasierten mikrofluidischen Plattform wurde bereits nachgewiesen²⁵. Darüber hinaus bietet die Plattform eine niedrige Eintrittsbarriere für die Einzelzell-Mechanophänotypisierung. Standard-Softlithographie wird verwendet, um mikrofluidische Geräte herzustellen. Die Messhardware besteht aus kostengünstigen Komponenten, darunter eine einfache Leiterplatte (PCB), ein Netzteil, ein Vorverstärker, eine Datenerfassungsplatine (DAQ) und ein Computer. Schließlich steht benutzerfreundlicher Code für die Datenerfassung und -analyse zur Verfügung, der eine einfache Implementierung ermöglicht. Diese Mechanophänotypisierungstechnik kann Populationen von nicht-malignen und malignen Brust- und Lungenepithelzelllinien unterscheiden, zwischen Unterlinien in primären menschlichen Brustepithelzellen unterscheiden und die Auswirkungen von Zytoskelettstörungen und anderen pharmakologischen Wirkstoffen charakterisieren ^2,8. Insgesamt ist diese Plattform ein effektiver Ansatz für die Mechanophänotypisierung einzelner Zellen.

Protokoll

1. Gerätegeometrie entwerfen

1. Wählen Sie die Breite der Größen- und Wiederherstellungssegmente so, dass sie breiter als der Durchmesser der größten zu messenden Zellen ist, aber auch ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) beibehält. In der ergänzenden Tabelle 2 finden Sie Beispiele für unterschiedliche Größen- und Rückgewinnungssegmentbreiten für verschiedene Zelllinien.
2. Wählen Sie die Breite des Kontraktionssegments, um eine Dehnung von 30% -40% auf die durchschnittliche Größe der Zellen anzuwenden, die einer Mechanophenotypisierung unterzogen werden sollen. Die Dehnung ist definiert als , wobei d der Zelldurchmesser und w_c die Kontraktionskanalbreite ^2,8 ist. Siehe Zusatztabelle 2 für unterschiedliche Kontraktionssegmentbreiten für verschiedene Zelllinien.
   HINWEIS: Wenn man Zelltypen oder -bedingungen mit wesentlich unterschiedlichen Durchmessern vergleichen möchte, sollten separate Gerätedesigns mit Kontraktionssegmentbreiten verwendet werden, die für jeden Zelltyp / jede Zellbedingung spezifisch sind.
3. Entwerfen Sie ein Referenzgerät für jede eindeutige Gerätegeometrie. Dies ist notwendig, um D_e, den effektiven Durchmesser des Größenporensegments des mikrofluidischen Kanals, zu bestimmen.
   HINWEIS: Das Referenzgerät verwendet dieselbe Geometrie wie das primäre Gerät. Die einzige Änderung besteht darin, dass das Kontraktionssegment gleich breit sein sollte wie das Porengrößensegment, um eine Kalibrierung mit Polystyrolperlen bekannter Größe zu ermöglichen. Die Verbreiterung der Kontraktion verhindert, dass die Polystyrolperlen den Kontraktionskanal während der Kalibrierung verstopfen. Der Kalibrierungsvorgang wird in den Schritten 4.1 und 5.3.1 näher beschrieben. Die Kalibrierung kann auch mit einem handelsüblichen Zellzähler erfolgen, wobei in diesem Fall kein Referenzgerät benötigt wird. Dieser Vorgang wird in Schritt 4.2 beschrieben.
4. Wählen Sie die Kanalhöhe so, dass sich die größten interessierenden Zellen innerhalb des Kontraktionssegments² ohne Einschränkung vollständig verlängern können. Stellen Sie sicher, dass die Kanalhöhe größer als h_min ist (dies setzt voraus, dass die Zelle eine sphärische Vorverformung aufweist und dass während der Verformung eine isometrische Verformung entlang der Kanallänge und -höhe auftritt).
   HINWEIS: Angesichts der Größe eines Stromsubpulses ist das Gesamt-SNR umso niedriger, je größer das h_min ist.
5. Entwerfen und erstellen Sie eine Fotomaske mit computergestützter Designsoftware mit den gewählten Kanalbreiten. Eine Beispieldatei finden Sie in Ergänzungsdatei 1. Skalieren Sie das mikrofluidische Maskendesign um 1,5 %, um die Schrumpfung von Polydimethylsiloxan (PDMS) nach dem Abziehen vom Negativmaster zu berücksichtigen.
   HINWEIS: Ein Array von Geräten kann auf einer einzelnen Maske enthalten sein, solange das gesamte Array die Größe des Wafers nicht überschreitet (ergänzende Abbildung 1A).
6. Entwerfen und erstellen Sie eine Fotomaske mit Elektroden, die verwendet wird, um eine Vier-Punkt-Sondenmessung des mikrofluidischen Gerätestroms durchzuführen (Abbildung 1D). Eine Beispieldatei finden Sie in Ergänzungsdatei 1.
   HINWEIS: Eine Anordnung von Elektroden kann auf einer einzelnen Maske angebracht werden, solange die Anordnung die Größe des Objektträgers nicht überschreitet (ergänzende Abbildung 1B).

2. Geräte herstellen (Abbildung 2)

1. Bereiten Sie Elektrodenmuster auf einem Glassubstrat vor.
   1. Schleudern, mustern und verarbeiten Sie einen positiven Fotolack auf einem einfachen Glasobjektträger gemäß Produktdatenblatt. Ein Beispiel für dieses Verfahren ist in der Zusatzakte 2 beschrieben.
   2. Führen Sie Metallabscheidung, Abheben und Goldätzen durch.
      1. Führen Sie eine Dünnschichtabscheidung von 75 Å Ti, 250 Å Pt und 250 Å Au auf dem Objektträger durch. Ein Beispiel für dieses Verfahren mit Elektronenkanonenverdampfung ist in der Zusatzakte 3 beschrieben.
      2. Tauchen Sie den Objektträger 15 Minuten lang in Aceton, um überschüssiges Metall abzuheben.
      3. Verwenden Sie in einem Abzug eine Einwegpipette, um Goldätzmittel auf den Bereich der Elektroden zu tropfen, die dem mikrofluidischen Kanal ausgesetzt werden, wie in der ergänzenden Abbildung 2 gezeigt. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, dass Ätzmittel an anderer Stelle auf der Folie fallen.
         ACHTUNG: Goldätzmittel können Haut- und Augenreizungen verursachen. Atmen Sie keine Dämpfe ein und nehmen Sie sie nicht ein. Behandeln Sie vorsichtig, tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) und entsorgen Sie Abfälle gemäß den örtlichen Entsorgungsvorschriften.
      4. Spülen Sie den Objektträger mit entionisiertem (DI) Wasser ab und trocknen Sie ihn mit trockenem Stickstoff (N₂).
   3. Wenn mehrere Elektroden auf denselben Objektträger gedruckt sind, würfeln Sie den Objektträger in einzelne Chips.
      1. Verwenden Sie ein Glasschneidewerkzeug, um den Objektträger entlang der gemusterten Elektrodengrenzen zu ritzen.
      2. Zerbrechen Sie das Glas entlang der Partitur, um den Objektträger in einzelne Chips aufzuteilen.
   4. Untersuchen Sie die Elektroden visuell unter einem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass einzelne Elektroden nicht elektrisch geöffnet sind oder dass Elektroden nicht miteinander kurzgeschlossen sind.
2. Stellen Sie eine Negativ-Masterform für Kanäle her.
   1. Schichten, Mustern und Verarbeiten eines SU-8-Epoxidlacks auf einem polierten Siliziumwafer gemäß Produktdatenblatt. Ein Beispiel für dieses Verfahren ist in der Zusatzakte 2 beschrieben.
   2. Messen Sie die Merkmalshöhen mit einem Profilometer und untersuchen Sie die Merkmale visuell unter einem Mikroskop (ergänzende Abbildung 3). Stellen Sie sicher, dass die gewünschten Geometrien genau definiert sind.
3. Form-PDMS-Kanäle mit weicher Lithographie.
   1. Bereiten Sie PDMS vor, indem Sie ein Elastomer und einen Vernetzer im Massenverhältnis 10:1 in einem Einwegbecher wiegen.
      HINWEIS: Für einen Wafer mit einem Durchmesser von 3 Zoll sind 30 g PDMS ausreichend.
   2. Mischen Sie das PDMS kräftig für 30 s mit einer Einweggabel, bis das PDMS undurchsichtig mit Blasen ist.
   3. Entgasen Sie das PDMS in einer Vakuumkammer für ca. 30-90 min oder bis das PDMS transparent und ohne sichtbare Blasen ist.
   4. Legen Sie den Wafer mit der SU-8-Masterform in eine Einweg-Petrischale und gießen Sie PDMS über die Mitte des Wafers.
   5. Die Petrischale mit PDMS und Wafer in eine Vakuumkammer stellen und ca. 30 min entgasen, oder bis keine Blasen mehr im PDMS verbleiben.
   6. Backen Sie das PDMS bei 80 °C für 2 h im Backofen oder auf einer Kochplatte.
   7. Schneiden Sie das PDMS mit einer scharfen Klinge ab und entfernen Sie es vom SU-8 Negativmaster.
   8. Die geformte PDMS-Platte mit einer scharfen Klinge in einzelne Formen schneiden
   9. Entkernen Sie die Ein- und Auslassöffnungen mit einem Einweg-Biopsiestempel. Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie für jede PDMS-Platte einen neuen Stempel verwenden. Ein schärferer Stempel erzeugt glattkantige Löcher und minimiert Partikel, die den Kontraktionskanal behindern könnten.
      HINWEIS: Der Durchmesser der Zugangslöcher sollte etwas kleiner sein als der Außendurchmesser des Rohres. Wenn beispielsweise Polytetrafluorethylen (PTFE)-Schläuche mit einem Außendurchmesser von 1/32 Zoll verwendet werden, sollte ein 1,5-mm-Loch gestanzt werden.
4. Verkleben Sie ein Glas-/Elektrodensubstrat mit den PDMS-Kanälen.
   1. Reinigen Sie die Elektrodenglasträger mit Methanol (≥99,8%). Trocken mit trockenem N₂.
   2. Reinigen Sie das PDMS-Gerät mit Klebeband, gefolgt von einer Spülung mit Isopropylalkohol (IPA) und entionisiertem Wasser (DI; 18 MΩ/cm²). Trocken mit trockenem N₂. Dann noch einmal mit Klebeband reinigen.
   3. Legen Sie das Glassubstrat mit vorgefertigten Elektroden und die vorbereitete PDMS-Form (Feature Side Up) in einen Plasmareiniger.
   4. Beide 2 min (100-300 mTorr, 30 W) Sauerstoffplasma aussetzen.
   5. Richten Sie die PDMS-Form aus und platzieren Sie sie mit der Feature-Seite nach unten auf dem Glassubstrat mit vorgefertigten Elektroden.
      HINWEIS: Die Verklebung erfolgt sofort, sobald das plasmabehandelte PDMS und das Glas in Kontakt kommen. Weitere Trassenänderungen sind daher nicht möglich. Um die Ausrichtung zu erleichtern, können 20 μL einer 2:1-Verdünnung von Methanol in DI-Wasser auf die plasmabehandelte Glasoberfläche pipettiert werden. Die Methanollösung fungiert als physikalische Barriere zwischen dem behandelten Glas und PDMS und ermöglicht Ausrichtungsanpassungen. Wenn Sie Methanol verwenden, backen Sie die ausgerichtete und gesteckte Vorrichtung bei 50 °C für 2 h ein, um die Lösung zu verdampfen und den Klebevorgang abzuschließen.
   6. Untersuchen Sie das verklebte Gerät visuell unter einem Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Elektroden und Kanalgeometrien richtig ausgerichtet sind.

3. Zellen messen (Abbildung 1D)

1. Bereiten Sie Druckquelle, Leiterplatte, Tischhardware und Datenerfassungssoftware vor.
   1. Verbinden Sie das mikrofluidische Gerät über die Klemme mit der Leiterplatte. Ein Beispiel für die Leiterplatte finden Sie in Supplementary File 4 (GERBER-Dateien) und Supplementary File 5 (Schaltplan-, Platinen- und PCB-Stücklistendateien).
      1. Richten Sie die federbelasteten Stifte der Klemme mit den Elektrodenkontaktpads auf dem mikrofluidischen Gerät aus und richten Sie die Stifte der Klemme mit den Löchern auf der Leiterplatte aus.
      2. Führen Sie die Stifte der Klemme fest in die Leiterplattenlöcher ein und stellen Sie sicher, dass die federbelasteten Stifte mit den Elektrodenkontaktpads ausgerichtet bleiben.
   2. Richten Sie die elektronische Hardware ein und schließen Sie sie an.
      1. Verbinden Sie zwei der Ausgangsanschlüsse des Netzteils mit einer Doppelbananenstecker-Bajonett-Neill-Concelman-Buchse (BNC) und einem BNC-Kabel mit dem Versorgungsspannungsanschluss der Leiterplatte.
      2. Schalten Sie das Netzteil ein. Stellen Sie den an den Innenleiter des BNC angeschlossenen Ausgang auf +15 V und den anderen Ausgang auf -15 V ein. Aktivieren Sie beide Ausgänge, um den Stromkreis mit Strom zu versorgen.
      3. Verbinden Sie den dritten Ausgangsanschluss des Netzteils mit einem BNC-Kabel mit dem Eingangsspannungsanschluss der Leiterplatte. Stellen Sie den Ausgang auf die gewünschte angelegte Spannung ein, aktivieren Sie ihn jedoch erst, wenn Sie das Experiment starten.
      4. Verbinden Sie den Ausgangsstromanschluss der Leiterplatte mit einem BNC-Kabel mit dem Eingang des Stromvorverstärkers.
      5. Verbinden Sie den Ausgang des Stromvorverstärkers mit einem BNC-Kabel mit einem analogen Eingang am BNC-Klemmblock des Datenerfassungssystems. Schließen Sie optional einen analogen Tiefpassfilter in Linie mit dem BNC-Kabel an, um hochfrequente Störungen herauszufiltern.
         HINWEIS: Um das SNR zu verbessern, können die Leiterplatte und das Gerät in einem dicken Metallgehäuse untergebracht sein. Alle BNC-Kabel und fluidischen Schläuche können durch in das Gehäuse gebohrte Löcher geführt werden.
   3. Installieren und Einrichten der erforderlichen Software auf dem PC
      1. Schalten Sie den Druckregler ein und schließen Sie ihn an den PC an. Installieren Sie die erforderliche Druckreglersoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      2. Installieren Sie MATLAB und die Data Acquisition Toolbox auf dem PC. Stellen Sie sicher, dass die erforderlichen Treiber für das Datenerfassungssystem installiert sind, damit die MATLAB Data Acquisition Toolbox-Schnittstelle es erkennen kann.
      3. Laden Sie das mitgelieferte Datenerfassungsskript "NPS.m" von https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public herunter.
   4. Öffnen und konfigurieren Sie das Datenerfassungsskript.
      1. Legen Sie die richtigen Werte fest, um die Datenerfassungssitzung zu initialisieren, einschließlich der Hersteller-ID, der Geräte-ID des DAQ und der Nummer des analogen Eingangskanals (Zeilen 34-36 im enthaltenen Skript).
         HINWEIS: Die Geräte-ID kann über die Funktion "daq.getDevices" oder "daqlist" gefunden werden.
      2. Stellen Sie die gewünschte Abtastrate für die Erfassung ein (Zeile 23 im mitgelieferten Skript). Für optimale Ergebnisse sollte es auf mindestens 10 kHz eingestellt werden.
2. Bereiten Sie die Zellsuspension vor.
   1. Eine Lösung von 2% fetalem Rinderserum (FBS) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) herstellen und mit einem 0,22 μm Filter filtrieren.
   2. Kultur und Vorbereitung der Zellen nach dem entsprechenden Zellkulturprotokoll der Zelllinie der Wahl. Die Zellen werden in der vorbereiteten Lösung von 2% FBS in 1x PBS in einer Konzentration von 1-5 x 10⁵ Zellen/ml suspendiert. Halten Sie die Zellen für die Dauer der Experimente auf Eis.
3. Messen Sie die physikalischen Eigenschaften der Zellen.
   1. Legen Sie die Zellprobe in den Schlauch und verbinden Sie sie mit dem Geräteeinlass.
      1. Schneiden Sie 30 cm PTFE-Schläuche mit einer Rasierklinge oder einem scharfen Messer ab.
      2. Befestigen Sie ein Ende des Schlauchs an einer Luer-Lock-Spritze. Verwenden Sie die Spritze, um die Zellprobe in das andere Ende des Schlauchs zu ziehen.
      3. Führen Sie den Schlauch vorsichtig in den Einlass des Geräts ein.
      4. Verbinden Sie das gegenüberliegende Ende des Schlauchs mit dem mikrofluidischen Druckregler.
         HINWEIS: Ein Filter kann zwischen dem mikrofluidischen Druckregler und dem Schlauch hinzugefügt werden, um einen Flüssigkeitsrückfluss in den Druckregler zu verhindern.
   2. Führen Sie das Experiment aus.
      1. Stellen Sie den gewünschten konstanten Steuerdruck auf der Druckreglersoftware ein und lassen Sie die Probe das Gerät füllen.
         HINWEIS: Der Druck beträgt typischerweise 2-21 kPa. Die Strömungsgeschwindigkeit muss langsam genug sein, um klar definierte Impulse zu ermöglichen, aber schnell genug, um einen ausreichenden Durchsatz zu ermöglichen.
         1. Wenn sich in den mikrofluidischen Kanälen Blasen bilden, verwenden Sie eine Sackgassenfüllung: Stecken Sie den Geräteauslass und üben Sie einen niedrigen Druck auf den Einlass aus, um Luft durch das gasdurchlässige PDMS zu drücken. Das Hinterlassen von Blasen im Kanal führt zu einer instabilen Strombasislinie und verhindert genaue Messungen.
         2. Wenn Schmutz den mikrofluidischen Kanal verstopft, entfernen Sie ihn, indem Sie leicht auf die Oberseite des PDMS-Geräts drücken, während Sie den Antriebsdruck ausüben, einen höheren Druck "pulsieren", indem Sie den Druck ein- und ausschalten oder den Schlauch entfernen und wieder einsetzen. Wenn die Trümmer zurückbleiben, kann es notwendig sein, auf ein neues Gerät umzusteigen.
      2. Stellen Sie die gewünschte Spannung ein, indem Sie den Spannungsregler am Netzteil drehen, und aktivieren Sie die Spannung durch Drücken der Ein-Taste .
         HINWEIS: Die Spannung beträgt typischerweise 1-5 V. Wählen Sie die niedrigste Spannung, die für ein angemessenes SNR erforderlich ist. Für alle zu vergleichenden Bedingungen sollte die gleiche Spannung verwendet werden.
      3. Schalten Sie den Stromvorverstärker ein und stellen Sie die Empfindlichkeit (A/V) so niedrig wie möglich ein; Alternativ können Sie die Verstärkung (V/A) so hoch wie möglich einstellen, ohne den Vorverstärker zu überlasten oder die maximale analoge Eingangsspannung des Datenerfassungsgeräts zu überschreiten. In dieser Studie wurde die Empfindlichkeit auf ^10-7 A / V eingestellt.
         HINWEIS: Der richtige Empfindlichkeits-/Verstärkungswert hängt sowohl von der angelegten Spannung als auch vom Basiswiderstand des mikrofluidischen Kanals ab.
      4. Klicken Sie auf die grüne Schaltfläche Ausführen im MATLAB-Menübandmenü, um das Datenerfassungsskript NPS.m zu starten und mit der Abtastung und Speicherung der Daten zu beginnen.
      5. Um das Experiment zu beenden, drücken Sie die Schaltfläche Stopp in der unteren linken Ecke des Abbildungsfensters, um das Datenerfassungsskript zu stoppen. Deaktivieren Sie den Netzteilausgang, indem Sie die Ein-Taste drücken . Stellen Sie die Druckquelle in der Druckreglersoftware auf Nulldruck ein.
      6. An diesem Punkt kann das Experiment angehalten werden, um eine oder mehrere der folgenden Aktionen auszuführen:
         1. Ersetzen Sie das aktuelle Gerät durch ein neues.
         2. Beladen Sie den Schlauch mit weiteren Zellproben.
            HINWEIS: Um eine Kreuzkontamination der Probe zu vermeiden, verwenden Sie neue Geräte, um Zellen verschiedener Typen oder Bedingungen zu messen.
         3. Lösen Sie das Gerät von der Leiterplatte und untersuchen Sie den Zustand des Kanals unter einem Mikroskop. Um das Experiment mit demselben Gerät neu zu starten, muss darauf geachtet werden, dass keine Luftblasen entstehen. Es kann notwendig sein, sanften Druck auf den Spritzenkolben auszuüben, um die Zellprobe am Ende des Schlauchs zu halten, während sie in den Geräteeinlass eingeführt wird.

4. Kalibrieren Sie das mikrofluidische Gerät

1. Option 1: Messen Sie die Polystyrolperlen in Referenzgeräten.
   1. Wählen Sie eine Polystyrolperlengröße, die kleiner als der Größenkanal ist.
   2. Fügen Sie der gefilterten PBS- und FBS-Lösung, die während der Zellexperimente verwendet wurde, 1,5% Tween- und Styroporperlen in einer Konzentration von 1-3 x 10⁵ Perlen / ml hinzu.
   3. Fahren Sie mit dem in Abschnitt 3 beschriebenen Experiment unter Verwendung des in Schritt 1.3 beschriebenen Referenzgeräts fort und legen Sie dieselbe Spannung an, die während des Experiments verwendet wurde. Verwenden Sie die durchschnittliche Größe des aktuellen Abfalls, der erzeugt wird, wenn Perlen die Größenporen passieren, und den bekannten Durchmesser der Perlen, um D_e zu berechnen, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
2. Option 2: Messen Sie die Zellgröße selbstständig mit einem separaten Messgerät.
   1. Anstatt dem Protokoll in Schritt 4.1 zu folgen, verwenden Sie ein handelsübliches Zellgrößenmessgerät, um die durchschnittliche Größe der Zellen in der Probe zu messen. In diesem Fall wird kein Referenzgerät benötigt. Verwenden Sie den durchschnittlichen Stromabfall, der erzeugt wird, wenn Zellen die Größenpore passieren, und den gemessenen durchschnittlichen Zelldurchmesser, um D_e wie in Abschnitt 5 beschrieben zu berechnen.

5. Analysieren Sie Daten, um Zellphänotypen zu extrahieren

HINWEIS: Die Datenverarbeitung kann mit der MATLAB-Befehlszeilenschnittstellen-Programmdatei mNPS_procJOVE.m auf https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE durchgeführt werden. Weitere Anweisungen finden Sie in der Zusatzdatei 6 .

1. Vorverarbeitung der Daten (Abbildung 3A).
   1. Berechnen Sie den gemessenen elektrischen Strom, indem Sie den im Strom-Spannungs-Vorverstärker verwendeten Verstärkungswert auf die vom Datenerfassungsgerät erfassten Rohdaten anwenden.
   2. Entfernen Sie hochfrequentes Rauschen, indem Sie eine rechteckige Glättungsfunktion und/oder einen Tiefpassfilter auf die Rohstrommessung anwenden. Berechnen Sie dann die gefilterten Daten erneut auf eine niedrigere Abtastrate. Berechnen Sie außerdem die entsprechenden Zeitstempeldaten mit dieser niedrigeren Abtastrate.
   3. Berechnen Sie ein angepasstes Basisstromsignal, indem Sie eine Methode wie asymmetrische Glättung der kleinsten Quadrate^{anwenden 26}.
   4. Berechnen Sie die ungefähre erste Ableitung (Differenzsignal) der vorverarbeiteten aktuellen Daten, indem Sie die Differenz zwischen nachfolgenden Datenpunkten nehmen.
2. Identifizieren Sie Zellereignisse und extrahieren Sie Subpulsdaten (Abbildung 3B).
   1. Suchen Sie nach Kandidatenzellereignissen, indem Sie die vorverarbeiteten Daten untersuchen. Zellereignisse zurückweisen, die sich mit anderen Zellereignissen überschneiden (d. h. Koinzidenzereignisse) (ergänzende Abbildung 4), eine schlechte Baseline-Anpassung aufweisen oder eine unerwartete oder fehlerhafte Pulsform aufweisen (z. B. wenn eine Verstopfung im Kanal vorhanden gewesen sein könnte).
   2. Extrahieren Sie Subpulsdaten für jedes Zellereignis.
      1. Jedes Knotenporensegment erscheint als entsprechender Subimpuls innerhalb des Gesamtsignalimpulses (Abbildungen 1B, C). Identifizieren Sie den Beginn jedes Subimpulses, indem Sie den Zeitpunkt berechnen, an dem das Differenzsignal einen lokalen Mindestwert erreicht. Identifizieren Sie das Ende jedes Subimpulses, indem Sie den Zeitpunkt berechnen, an dem das Differenzsignal einen lokalen Maximalwert erreicht.
      2. Bestimmen Sie die Breite jedes Subpulses als verstrichene Zeit zwischen Start- und Endzeitpunkt. Bestimmen Sie die Amplitude jedes Subimpulses, indem Sie den Mittelwert der Differenz zwischen dem gemessenen Strom und dem Basisstrom für alle Datenpunkte zwischen den Start- und Endzeitpunkten berechnen.
3. Bestimmen Sie den Zellmechanophänotyp für jedes Zellereignis basierend auf Subpulsdaten.
   1. Bestimmen Sie den Zellendurchmesser d basierend auf der Gleichung von Deblois und Bean²⁴:
      
      Dabei ist ΔI/I das mittlere Verhältnis von Subpulsamplitude zu Basislinienstrom in den Größensubpulsen, D_e der effektive Durchmesser des Kanals (gemessen in Schritt 4) und L die Gesamtlänge des Knotenporenkanals.
      1. D e wird bestimmt, indem der Mittelwert ΔI/I berechnet wird, der von einer Gruppe von Partikeln eines bekannten Durchmessers (entweder Zellen oder Perlen, siehe Schritt 4) erzeugt wird, wobei der bekannte Durchmesser als d verwendet wird und Gleichung 1 für D_e gelöst wird_.
   2. Quantifizieren Sie den Widerstand der Zelle gegen Verformung.
      1. Bestimmen Sie die Strömung der Fluidgeschwindigkeit U, indem Sie die mittlere Zellgeschwindigkeit in den Größensubpulsen unter Verwendung der bekannten Segmentlängen und der gemessenen Dauer jedes Subpulses berechnen.
      2. Bestimmen Sie den Ganzzellverformbarkeitsindex (wCDI), definiert von Kim et ^al.2 als:
         
         wobei L c die Länge des Kontraktionssegments, der_h-Kanal die Kanalhöhe und ΔT_c die Dauer des Kontraktionssubpulses ist.
   3. Identifizieren Sie die Erholungszeit der Zelle von der Verformung, definiert als der erste Erholungssubpuls mit einer Amplitude innerhalb von 8% der mittleren Amplitude aus dem Größensubpuls².
   4. Berechnen Sie die Querverformung der Zelle innerhalb des Kontraktionssegments.
      1. Berechnen Sie den effektiven Durchmesser des Kontraktionssegments (D_e,c) gemäß der Definition von Kim et al.2: , wobei w _c die Breite des Kontraktionssegments und w_np die Breite aller anderen Segmente ist.
      2. Berechnen Sie den äquivalenten sphärischen Durchmesser d_c der Zelle innerhalb der Kontraktion, indem Sie erneut die Gleichung von Deblois und Bean²⁴ verwenden:
         
         wobei ΔI c/I c das Verhältnis von Subpulsamplitude zu Basisstrom im Kontraktionssubpuls und L_c die Länge des Kontraktionssegments ist.
      3. Berechnen Sie die Dehnungslänge der_Zelle , wie von Kim et ^al.2 beschrieben:
         
      4. Schließlich berechnet man die transversale Verformung der Zelle δ_Verformung, die von Kim et al.2 als definiert wird.

Ergebnisse

Die hier vorgestellte Mechanophänotypisierungsplattform ist ein einfacher und vielseitiger Ansatz, um die biophysikalischen Eigenschaften einzelner Zellen mit moderatem Durchsatz zu messen. Die Zellen werden durch den mikrofluidischen Kanal (Abbildung 1A) unter Verwendung eines konstanten druckgetriebenen Flusses geleitet. Während des Passierens der Zellen werden die Länge des mikrofluidischen Kanals und die erzeugten Stromimpulse mit der Datenerfassungshardware aufgezeichnet. Das erfasste S...

Diskussion

Die Messung der mechanischen Eigenschaften einzelner Zellen mit dieser Mechanophänotypisierungstechnik besteht aus drei Phasen: Geräteherstellung, Datenerfassung und Datenanalyse. Innerhalb jeder Phase gibt es bemerkenswerte Aspekte, die die experimentellen Ergebnisse erheblich beeinflussen können. Bei der Geräteherstellung sind konsistente Kanalgeometrien und die Einheitlichkeit von Gerät zu Gerät für genaue und wiederholbare Ergebnisse unerlässlich. Insbesondere sollten die Seitenwände jedes Geräts relativ glatt sein (...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aceton	J.T. Baker	5356-05	Reinheit (GC)  ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)
Aluminiumfolie	n/a	n/a
Analoger Tiefpassfilter	ThorLabs	EF504	≤ 240 kHz Durchlassband, koaxiale BNC-Durchführung  (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)
Biopsie-Stanze	Integra Miltex	33-31AA-P/25	1mm, Einweg, mit Stößel (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)
Klinge	n/a	n/a
BNC-Kabel	Pomona Electronics	2249-C-12	https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ mittel=cpc& utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW& utm_term= & utm_content=Koaxial%20Kabel%20%28RF%29& gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB
Reinraum-Polyestertupfer	Thermo Fisher Scientific	18383	https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
Stromvorverstärker	DL Instruments	1211	https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419
Custom PCB (mit Komponenten)	n/a	n/a siehe	Ergänzende Dateien 4 und 5
Datenerfassungsklemmenblock	National Instruments	BNC-2120	https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
Datenerfassungskabel auf BNC-2110	National Instruments	SHC68-68-EPM	https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
Datenerfassungsboard (DAQ)	National Instruments	PCI-6251	https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html
Exsikkator	Thermo Fisher Scientific	5311-0250	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
Buchse BNC-auf-Bananenstecker-Adapter	Pomona Electronics	72909	https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
fötales Rinderserum (FBS)	VWR	89510-186	https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs
Glasschneider	Chemglass	CG-1179-21	https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Gold Etchant TFA	Transene	NC0977944	https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
Heizplatte	Thermo Fisher Scientific	SP131825
	Isopropylalkohol-Spektrum-Chemikalie	I1056-4LTPL	Reinheit (GC)   ≥ 99,5 % (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)
Metall-Hardware-Gehäuse	Hammond Manufacturing	EJ12126	https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Reinheit (GC)  ≥ 99,8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)
MF-321 Entwickler	Kayaku Advanced Materials	n/a	https://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 Positiver Fotolack	DuPont	n/a	https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Thermo Fisher	Scientific 10010049	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
Photomask	Fineline Imaging	n/a	Photomask sind Sonderanfertigungen aus unseren CAD-Designs (https://www.fineline-imaging.com/)
Plain Glass Mikroskop Slide	Fisher Scientific	12-553-5B	Material: Natron Kalk, L75 x B50 mm, Dicke: 0.90– 1,10 mm
Plasmareiniger	Harrick Plasma	PDC-001	https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
Petrischale aus Kunststoff	Thermo	Fisher Scientific FB0875712	100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)
Druckregler	Fluigent	MFCS-EZ	https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
Druckregler Software	Fluigent	MAESFLO
Programmierung & Berechnungssoftware	MATLAB	R2021b	für die Datenerfassung und -analyse (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)
PTFE-Schlauch	Cole Parmer	06417-31	0.032" ID x 0.056" ( https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)
Scepter 2.0 Handheld Automatischer Zellzähler	Millapore Sigma	PHCC20060	https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
Silizium Wafer	Wafer World	2885	76,2 mm, einseitig poliert (https://www.waferworld.com/product/2885)
Spin Coater	n/a	n/a
SU-8 3025 Negativ-Fotolack	Kayaku Advanced Materials	n/a	https://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 Entwickler	Kayaku Advanced Materials	n/a	https://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 Polydimethlysiloxan	Dow Chemical 4019862		https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Klebeband	Scotch	810-341296	https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
Titan, Platin, Gold	n/a	n/a
Triple Output Netzteil	Keysight	E36311A	https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653
UV Mask Aligner	Karl Süss America	MJB3 Maske Aligner