Summary
Hier beschrijven we een protocol dat beschrijft hoe sonodynamische therapie kan worden uitgevoerd in een in vivo muisglioblastoommodel met behulp van magnetische resonantiegeleide gefocusseerde echografie.
Abstract
Sonodynamische therapie (SDT) is een toepassing van gefocusseerde echografie (FUS) waarmee een sonosensibiliserend middel tumoren kan voorbereiden voor verhoogde gevoeligheid tijdens sonicatie. Helaas ontbreken de huidige klinische behandelingen voor glioblastoom (GBM), wat leidt tot lage overlevingskansen op lange termijn bij patiënten. SDT is een veelbelovende methode om GBM op een effectieve, niet-invasieve en tumorspecifieke manier te behandelen. Sonosensibilisatoren dringen bij voorkeur tumorcellen binnen in vergelijking met het omringende hersenparenchym. De toepassing van FUS in aanwezigheid van een sonosensibiliserend middel genereert reactieve oxidatieve stoffen die resulteren in apoptose. Hoewel eerder is aangetoond dat deze therapie effectief is in preklinische studies, is er een gebrek aan vastgestelde gestandaardiseerde parameters. Gestandaardiseerde methoden zijn nodig om deze therapeutische strategie te optimaliseren voor preklinisch en klinisch gebruik. In dit artikel beschrijven we het protocol om SDT uit te voeren in een preklinisch GBM-knaagdiermodel met behulp van magnetische resonantiegeleide FUS (MRgFUS). MRgFUS is een belangrijk kenmerk van dit protocol, omdat het een specifieke targeting van een hersentumor mogelijk maakt zonder dat invasieve operaties (bijv. craniotomie) nodig zijn. Het tafelmodel dat hier wordt gebruikt, kan scherpstellen op een specifieke locatie in drie dimensies door op een doel op een MRI-beeld te klikken, waardoor het selecteren van het doel een eenvoudig proces wordt. Dit protocol biedt onderzoekers een gestandaardiseerde preklinische methode voor MRgFUS SDT, met de extra flexibiliteit om parameters voor translationeel onderzoek te wijzigen en te optimaliseren.
Introduction
Glioblastoom (GBM) is een vorm van zeer agressieve hersenkanker met een incidentie van 3,21 per 100.000 mensen en is de meest voorkomende kwaadaardige hersentumor1. De huidige zorgstandaard omvat chirurgische resectie, bestraling en chemotherapie2. Vanwege de invasieve en infiltratieve aard van de tumor is volledige tumorresectie zeldzaam. Restweefsel aan de tumorranden resulteert in een hoog percentage tumorrecidief en een laag overlevingspercentage van minder dan 6% na5 jaar.
Vanwege deze prognose onderzoeken onderzoekers nieuwe therapeutische opties om deze dodelijke ziekte te bestrijden. Sonodynamische therapie (SDT) is een niet-invasieve behandeling die gefocusseerde echografie met lage intensiteit (FUS) en sonosensibiliserende middelen combineert om een cytotoxisch effect te produceren in gerichte cellen3. Op porfyrine gebaseerde sonosensibilisatoren zoals 5-aminolevulinezuur (5-ALA) worden bijvoorbeeld bij voorkeur opgenomen door tumorcellen en verhogen de productie van reactieve oxidatieve stoffen (ROS) tot schadelijke niveaus bij blootstelling aan gerichte echografie. Overexpressieve niveaus van ROS in cellen kunnen cellulaire structuren beschadigen en apoptose veroorzaken. Aangezien 5-ALA bij voorkeur wordt opgenomen door tumorcellen, blijft gezond weefsel in het behandelde gebied ongedeerd 3,4. Voorlopige in vitro studies hebben aangetoond dat veel kankercellen worden gelyseerd door SDT-behandeling, hoewel de snelheid van celdood afhankelijk is van de cellijn. Voorlopige in vivo studies leveren vergelijkbare resultaten op, die bevestigen dat SDT apoptose kan veroorzaken5.
Dit protocol heeft tot doel effectieve technieken en parameters te beschrijven voor de SDT-behandeling van knaagdiermodellen met intracraniaal geïmplanteerde GBM-cellen met behulp van een benchtop FUS-onderzoeksplatform. Onderzoekers kunnen dit protocol gebruiken om SDT uit te voeren en te optimaliseren voor translationeel FUS-onderzoek.
Protocol
Alle dierstudies zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Athymische naakte vrouwelijke muizen (leeftijd: 10 weken) werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Materiaaltabel). Alle voorschriften van bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) werden gevolgd, inclusief het gebruik van maskers, handschoenen en jassen.
1. Tumorimplantaties en bioluminescentiebeeldvorming
- Voer tijdens de beginfase van het onderzoek intracraniële tumorimplantatie uit, volgens een eerder gepubliceerd rapport6.
OPMERKING: In deze studie werden 100.000 M59 menselijke GBM-xenotransplantaatcellen in 4 μL celsuspensie gebruikt voor implantatie op een diepte van 3,0 mm in de schedel. - Kwantificeer voorafgaand aan de behandeling de tumorgrootte in elke muis niet-invasief met behulp van een in vivo luminescentiebeeldvormingssysteem (zie Tabel met materialen) volgens een eerder gepubliceerd rapport7.
OPMERKING: Dit werd gedaan op de datum van de behandeling, 7 dagen na de eerste tumorimplantaties. - Verdeel de muizen met behulp van beeldvormende kwantificering in vergelijkbare subgroepen voor behandeling.
OPMERKING: In deze studie werden twee subgroepen opgenomen: (1) onbehandelde tumordragende muizen (n = 4) en (2) tumordragende muizen die SDT ondergingen (n = 4). Er werd geen statistisch significant verschil in tumorgrootte vóór de behandeling waargenomen tussen de twee groepen (p > 0,05).
2. Instelling van de behandelingsdag
- Haal 5-ALA-hydrochloride (zie materiaaltabel) uit de vriezer en weeg 200 mg/kg muisgewicht van 5-ALA af (weeg bijv. voor een muis van 25 g 5 mg af). Doe dit alleen bij omgevingslicht.
NOTITIE: Steriel alle apparatuur voor gebruik. - Los de totale hoeveelheid 5-ALA op in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), zodat elk dier een oplossing van 60 mg/ml 5-ALA krijgt toegediend met de juiste gewichtsdosering (bijv. voor een muis van 25 g, los 5 mg 5-ALA op in 83,33 μL PBS).
- Injecteer voor elk dier in de SDT-testgroep de juiste hoeveelheid oplossing van 5-ALA intraperitoneaal in het dier (berekend in stap 2.1 en 2.2).
- Laat de dieren 3 uur in hun kooien om de 5-ALA te metaboliseren.
3. Voorbereiding van de vereisten voor experimenten
- Vul een reservoir met gedeïoniseerd (DI) water.
OPMERKING: De benodigde hoeveelheid water is gebaseerd op het aantal muizen dat in het onderzoek is gebruikt. - Bevestig de instroom - en uitstroombuizen aan de ultrasone ontgasser (zie Materiaaltabel) en steek de stekker van de ontgasser in het stopcontact (1 = AAN, 0 = UIT).
- Plaats het andere uiteinde van de Flow in en Flow out buizen in het DI-waterreservoir.
- Zet de ontgasser aan en laat 45 minuten draaien.
- Vul het pas ontgaste water tot aan de bovenkant van een luchtdichte, afgesloten container voor gebruik tijdens het onderzoek.
- Giet ultrasone gel (zie Materiaaltabel) in een conische buis, plaats deze vervolgens in een centrifuge en draai gedurende 5 minuten op 160 x g om eventuele lucht uit de gel te verwijderen.
OPMERKING: Er is voldoende gel nodig om een klodder gel op de kop van elk dier te vormen.
4. Installatie van het MRgFUS-systeem
- Sluit het MRgFUS-systeem aan (zie Materiaaltabel) met behulp van het bedradingsschema zoals te zien is in afbeelding 1 (onderpaneel).
- Sluit alle benodigde componenten (desktopcomputer, monitor, MRgFUS-platform, oscilloscoop, versterker) aan op stroom.
- Sluit alle kabels aan op de juiste locaties.
- Sluit de gewenste transducer via de BNC- en coaxkabels aan op het MRgFUS-platform en sluit vervolgens de bijbehorende impedantie-matchingbox aan op de juiste draden.
OPMERKING: Voor dit onderzoek werd een transducer van 515 kHz gebruikt.
- Schakel alle apparaten in.
- Open op het besturingssysteem van de desktopcomputer de AUREUS-applicatie, die al is geïntegreerd in de FUS-systeemsoftware.
- Selecteer Alle hardware aansluiten om de hardware op het systeem aan te sluiten en ervoor te zorgen dat de onderdelen communiceren met de software.
- Selecteer de gebruikte transducer door het vervolgkeuzemenu te selecteren en de gewenste transducer te kiezen.
5. Initialisatie
- Draai de onderste schroef los van het fantoom en vul de holte met gedeïoniseerd en ontgast water totdat het overstroomt, en plaats de schroef vervolgens weer terug.
- Plaats het fantoom op de overeenkomstige locatie van het MRI-bed (zie afbeelding 2) en plaats het MRI-bed vervolgens in de MRI-houder in de overeenkomstige sleuf.
- Plaats de MRI-houder op de overeenkomstige plaats in de MRI-scanner (zie Materiaaltabel). Stel de houder zo af dat het fantoom-MRI-bed zonder obstakels in de MRI-boring kan schuiven om een hoogwaardig beeld van het fantoom te verkrijgen. Markeer deze locatie zodat deze in de toekomst gemakkelijk kan worden gerepliceerd.
OPMERKING: Zodra deze locatie is gevonden, wordt de locatie voor de rest van de behandeling niet meer gewijzigd. Zorg er daarom voor dat het een geschikte locatie is voor het plaatsen van MRI-tests bij dieren, anders moet de hele registratie worden herhaald. - Maak een MRI-scan van het fantoom met behulp van de instellingen in tabel 1.
- Verwijder de houder uit de magneetboring, maar bewaar deze op de scanner. Verwijder het MRI-bed met het fantoom uit de houder en plaats het bed met het fantoom op het MRgFUS-systeem door de pin aan de onderkant in de juiste gleuf te schuiven.
- Plaats de registratietip op de magnetische sleuven op de transducerarm zodat deze naar beneden wijst in de richting van het fantoom (zie afbeelding 2).
- Kies in de software Selecteer een nieuwe startpositie en selecteer vervolgens Jog-modus Aan om te beginnen met begeleid gericht zoeken. Nadat de jog-modus is omgeschakeld, gebruikt u de toetsen links, rechts, omhoog, omlaag, pagina omhoog en pagina omlaag om de transducerarm handmatig te verplaatsen in respectievelijk links, rechts, vooruit, achteruit, omhoog en omlaag.
- Pas de aanwijzer handmatig aan in alle drie de dimensies totdat de punt van de aanwijzer het midden van het kruispatroon raakt dat aan de bovenkant van het fantoom ligt (zie afbeelding 2).
- Download de fantoom-MRI-beelden naar de computer en plaats ze in een map in de gekozen map en laad vervolgens de MRI-beelden in de software door Fantoombeelden laden te selecteren. De axiale fantoomsegmenten vullen dan het scherm aan de rechterkant. Scroll door deze segmenten via de muisschuifbalk. Pas de helderheid aan door op de afbeelding te klikken en vast te houden en vervolgens de muis omhoog of omlaag te bewegen.
OPMERKING: Als een van de bestanden in de map geen ongecomprimeerde DICOM-bestanden zijn, kan de software ze niet lezen en importeren, dus verwijder alle andere bestanden uit die map. - Scroll naar een afbeelding van het fantoom met een duidelijke cirkel met drie donkere gaten in elk. Klik op het midden van het fantoom en er verschijnt een rode cirkel. Klik en sleep op de cirkel totdat deze dezelfde diameter heeft en op één lijn ligt met de omtrek van het fantoom (zie figuur 2).
- De coördinaten van deze positie worden aangeduid als 'thuispositie'; sla dit op door te klikken op L/R, A/P en S/I instellen.
- Klik op Jog-modus uit, verwijder de registratietip van de transducerarm en selecteer vervolgens Focus zoeken afsluiten. Bevestig de uitgangspositie om de initialisatievolgorde te voltooien.
6. Diervoorbereiding voor SDT
- Verdoof de muis met behulp van een isofluraan-O2-gasmengsel in een inductiekamer. Stel het gasdebiet in op 1.0 ml/min en de verdamper op 2.0% voor anesthesie-inductie, waarvoor doorgaans 3-5 minuten in de kamer nodig is (zie Materiaaltabel).
- Beoordeel het dier op adequate sedatie door in de teen te knijpen. Breng een oogzalf aan op de ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
NOTITIE: Houd de anesthesiediepte tijdens de procedure in de gaten. - Injecteer de muis met 40 μL gadoliniumcontrastmiddel via de staartader (zie Materiaaltabel).
- Verwijder al het haar dat de hoofdhuid boven de schedel blokkeert met behulp van een ontharingscrème en een elektronisch scheerapparaat.
- Zet het dier vast aan het MRI-bed met behulp van de volgende stappen (zie figuur 3).
- Sluit de inlaatbuis van het MRI-bed (Figuur 3A) aan op een bron van isofluraan voor anesthesie en stel het gasdebiet in op 1.0 ml/min en de verdamper op 2.0% voor anesthesie-inductie. Sluit de uitlaatbuis aan op een koolstoffilterbus voor absorptie van anesthesie.
- Plaats het neuskegelstuk in de gleuf, zoals weergegeven in afbeelding 3B. Schuif de bijtstang door de bijtstanggaten in zowel de neuskegel als aan het einde van het bed, zoals afgebeeld, met het uiteinde van de bijtbeschermer zwevend boven de open put in het MRI-bed.
- Plaats het dier op het MRI-bed met zijn oren uitgelijnd met de stereotactische gaten in de oorbalk en klem zijn tanden door de bijtbescherming om het op zijn plaats te houden. Schuif de neuskegel naar voren zodat deze zich over de snuit van het dier bevindt om een gestage stroom anesthesie te bieden.
- Schuif de oorbalken door de gaten aan beide zijden van het MRI-bed en til de kop van het dier op totdat beide oorbalken in de gehoorgangen van de muis passen.
NOTITIE: Duw niet te ver, omdat dit de trommelvliezen van het dier kan beschadigen. - Zorg ervoor dat het dier zich in een comfortabele houding bevindt. Draai vervolgens met een platte schroevendraaier de MRI-compatibele schroeven vast om beide oorbalken, de neuskegel en de bijtstang vast te zetten. Hierdoor wordt het dier op zijn plaats vergrendeld en wordt elke hoofdbeweging voorkomen totdat het dier uit het bed wordt gehaald.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de positionering van het dier op het MRI-bed na deze stap niet wordt verstoord. Als het dier beweegt, moet de hele opstelling (stap 6.5) worden herhaald, ongeacht hoe ver het protocol is. - Terwijl het dier wacht, plaatst u het MRI-bed op een warm warmtekussen om de lichaamstemperatuur op peil te houden.
NOTITIE: Houd de lichaamstemperatuur tijdens de procedure in de gaten en houd deze op peil.
- Isofluraan wordt gedurende de hele behandeling continu aan het dier toegediend via buisjes die aan de neuskegels zijn bevestigd wanneer het bed van het dier op het FUS-systeem is bevestigd, met behulp van de bevestigingen op het platform.
7. MRI-procedures
- Neem het MRI-bed met het dier stereotactisch gefixeerd en plaats het in de MRI-houder die eerder op de MRI-scanner is aangesloten (zie Materiaaltabel), door het gat in het MRI-bed aan het uiteinde naar de pin op de MRI-wieg te steken, zoals weergegeven in figuur 3. Bevestig de inlaat- en uitlaatanesthesieslangen aan de overeenkomstige buizen in de MRI-machine.
- Schuif de MRI-houder met het dier in de MRI-boring en zorg ervoor dat u dezelfde positie behoudt als waar het fantoom is geplaatst.
- Voer een lokalisator uit om de locatie van de hersenen van dieren te zien en vervolgens een post-contrast T1-gewogen MRI-scan die de hele hersenen bestrijkt met behulp van de MRI-instellingen uit tabel 2.
- Exporteer de MRI-scan als een set niet-gecomprimeerde DICOM-bestanden, één voor elk plakje.
8. Gerichte ultrasone behandeling (Figuur 4)
- Haal het dier na voltooiing van de scan uit de MRI-houder en plaats het op het platform door de voorkant van het bed in de overeenkomstige pin aan de achterkant van het platform te steken en de achterkant van het bed in de bijbehorende pin te steken.
- Sluit de inlaatbuis van het MRI-bed aan op een bron van isofluraan voor anesthesie en stel het gasdebiet in op 1.0 ml/min en de verdamper op 2.0% voor onderhoud van anesthesie. Sluit de uitlaatbuis aan op een koolstoffilterbus voor absorptie van anesthesie.
- Breng de set DICOM-bestanden over naar de computer en plaats ze in een map in de hoofdwerkmap van het huidige onderzoek.
OPMERKING: Raadpleeg stap 5.9 voor bestandsvereisten. - Ga in de software naar de hoofdinitialisatiepagina en schakel de Jog-modus in door te klikken op Guided Focus Finding en klik vervolgens op Jog-modus aan.
- Plaats een beetje gecentrifugeerde ultrasone gel op de kop van het dier, met voldoende gel om de hele hoofdhuid boven de schedel te bedekken.
- Giet DI en ontgast water tot 80% in het waterbad en plaats het waterbad vervolgens op de overeenkomstige kolommen op het platform.
- Laat het waterbad gevuld met DI-water zakken totdat het onderste membraan de ultrasone gel op de kop van het dier raakt en een koppelingsoppervlak vormt tussen het water en de gel. Zorg ervoor dat de ultrasone gel de hele kop van het dier tot aan het waterbad bedekt en dat er geen luchtbellen in de ultrasone gel tussen het waterbad en de hoofdhuid van de muis zitten.
- Dompel de ultrasone transducer onder in het waterbad en zorg ervoor dat er geen luchtbellen op het oppervlak van de transducer ontstaan.
- Laat de transducerarm zakken met behulp van de Jog-modus naar beneden in de richting van de gedeeltelijk ondergedompelde transducer en koppel deze aan de transducer door de magnetische sleuven met elkaar uit te lijnen terwijl het transduceroppervlak ondergedompeld blijft.
- Schakel de Jog-modus uit en sluit vervolgens Gericht zoeken afsluiten, zoals gedaan tijdens de initialisatiestap. Zorg ervoor dat u de uitgangspositie bevestigt zoals eerder gedaan.
- Ga naar het tabblad Behandeling en upload vervolgens de T1-gewogen MRI-bestanden na contrast door op het mappictogram in het midden bovenaan het scherm te klikken. Selecteer de map met de DICOM-bestanden die eerder naar de computer zijn geüpload en open deze. Deze stap zou automatisch alle DICOM-bestanden in het paneel rechtsboven moeten laden.
- Selecteer vervolgens op het tabblad Sonicatiemodus de juiste behandelingsmodus door Burst of Continuous Wave te kiezen. Als de burst-modus is ingeschakeld, voert u op het tabblad Sonicatie-instellingen de burst-lengte, burst-periode en het aantal perioden in. Deze parameters komen overeen met elke sonicatielocatie. Als u zich in de continue golfmodus bevindt, voert u alleen de sonicatieduur in.
OPMERKING: In deze studie werd de continue golfmodus gebruikt voor een duur van 120 s. - Klik op het doelpictogram in het midden bovenaan de pagina en selecteer de juiste locaties op het juiste MRI-segment waar het FUS-brandpunt moet worden gericht. Er zal een lichtrood vierkant met een rode cirkel aanwezig zijn waar op wordt geklikt. Er kan meer dan één selectie worden gekozen.
- Links van het MRI-beeld bevindt zich een tabel met de 3D-coördinaten van de geselecteerde brandpuntsgebieden. Voer in de laatste kolom van de tabel het vermogensniveau in dat op elk brandpuntspunt moet worden gesoniseerd, dat afzonderlijk kan worden berekend voor elke transducer die wordt gebruikt om de gewenste druk- of intensiteitsniveaus te verkrijgen. Klik op elk brandpuntspunt in de tabel om te bevestigen, waardoor de coördinaten worden gemarkeerd en het bijbehorende brandpuntsgebied op de afbeelding blauw wordt.
NOTITIE: Raadpleeg het gegevensblad van de transducer om te bepalen hoe het in de tabel ingevoerde vermogensniveau moet worden vertaald in druk of intensiteit, aangezien deze waarden transducerspecifiek zijn. - Als u tevreden bent met alle brandpuntsgebieden, selecteert u Bewegingstest. Dit zal de software ertoe aanzetten de transducer naar alle brandpuntsafstanden te verplaatsen om ervoor te zorgen dat de bewegingen mogelijk zijn. Na bevestiging geeft de software Motion Test Completed aan. Als er een fout optreedt, past u de brandpuntsgebieden aan zodat ze binnen de 3D-assen van de transducermotoren passen.
- Als u klaar bent, selecteert u Begin Sonication om het sonicatieprotocol te starten, waarbij u de transducer verplaatst en de juiste FUS-parameters toepast op elk geselecteerd brandpuntsgebied.
- Zodra het sonicatieprotocol is voltooid, koppelt u de transducer los van de transducerarm, verwijdert u het waterbad van het platform en veegt u de ultrasone gel van de hoofdhuid van het dier.
- Schroef de beet en oorbalken los, haal het dier uit het MRI-bed en plaats het dier vervolgens op een warm kussen totdat het dier wakker wordt uit de narcose. Breng het dier nu terug naar zijn kooi.
- Herhaal voor volgende dieren hetzelfde protocol, beginnend bij sectie 6.
- Nadat de gewenste dieren zijn behandeld, reinigt u alle oppervlakken die door dieren zijn aangeraakt met 70% ethanol (zie Materiaaltabel).
- Sluit de software af en sluit vervolgens elk apparaat af en schakel het uit.
9. Stappen na de behandeling
- Herhaal het in-vivobeeldvormingssysteem (IVIS)-protocol uit rubriek 1 voor bioluminescentie die 24 uur na de behandeling wordt gemeten. Om de effectiviteit van de behandeling te analyseren, vergelijkt u de bioluminescentie-opnames voor en na de behandeling om de groeisnelheid voor zowel behandelde als onbehandelde groepen te bepalen.
- Voer follow-up MRI-scans uit met dezelfde instellingen als in stap 6.4. Vergelijk met behulp van contrastversterkte scans de gemiddelde grijswaardenintensiteit van het tumorgebied of bereken het totale volume dat door het contrastmiddel wordt bedekt om verschillen in tumorvolume voor en na de behandeling te bepalen.
Representative Results
De tumorgrootte neemt af bij dieren die 24 uur na de behandeling met SDT worden behandeld.
Op de dag van de SDT-behandeling was het oorspronkelijke gemiddelde bioluminescentiesignaal voor de controle- en behandelingsgroepen (N = 4 elk) respectievelijk 2,0 x 10 6 ± 3,1 x 10 6 en 2,3 x 10 6 ± 1,3 x 10 6 p/s/cm2/sr. De gemiddelde bioluminescentiewaarden die overeenkomen met de tumorgrootte vóór de behandeling tussen de twee groepen waren niet statistisch significant (p = 0,89). Het gemiddelde bioluminescentiesignaal van de behandelingsgroep was 3,57 x 10 6 ± 2,3 x 10 6 24 uur na SDT, terwijl het bioluminescente signaal van de controlegroep werd verhoogd tot 5,5 x 10 6± 8,2 x 10 6 p/s/cm2/sr. Zoals te zien is in figuur 5, komt dit overeen met een groeipercentage van respectievelijk 83,4% ± 78% en 172% ± 34%, uitgaande van een exponentiële groei (p = 0,08). Van de vier behandelde dieren hadden er drie een lagere groeisnelheid na de behandeling in vergelijking met controles. Er was één uitschieter in de behandelingsgroep die een vergelijkbare groei vertoonde als de controlegroep, waardoor de afwijkingen scheef waren.
Bovendien ondergingen de dieren de dag na de behandeling daaropvolgende contrastversterkte MR-beeldvorming voor vergelijking van de tumor voor en na de behandeling. De gemiddelde grijswaardenintensiteit van contrastmiddel in tumoren werd uitgevoerd over elk MRI-plakje voor elk dier om te meten hoeveel contrastmiddel tumoren binnendrong na behandeling, als een schatting van de tumorgrootte. Vóór de behandeling was de gemiddelde intensiteit van de tumorgrijswaarden tussen de controlegroep en de behandelde groep vergelijkbaar. Gemiddeld nam deze grijswaardenintensiteit in de controlegroep toe tot een grotere omvang dan in de behandelde groepen, hoewel dit niet significant was (p = 0,47). Deze gegevens zijn te zien in tabel 2. De grote variabiliteit van deze resultaten is mogelijk te wijten aan het feit dat MRI's pas 24 uur na de behandeling werden genomen, op welk moment het therapeutisch potentieel van SDT pas begint op te treden. Toch toont figuur 6 een voorbeeld van de laesies die door SDT zijn veroorzaakt.
Afbeelding 1: Installatie van het FUS-systeem. (Boven) MRgFUS-systeem met gelabelde componenten. (Voorkant) 1. Platform. 2. Het wapen van de as gemotoriseerde transducer. 3. FUS-transducer. 4. Waterbad. 5. MRI-bed. 6. Bewaken. 7. Transducer impedantie bijpassende doos. 8. Eindversterker doos. 9. Functie generator. 10. Functie generator kanaal 1 BNC-poort. 11. Desktopcomputer. (Onder) MRgFUS-systeem met kleurgecodeerd bedradingsschema met de volgende aansluitingen. (Terug) 1. Netsnoeren. 2. Monitor HDMI naar desktop HDMI. 3. Poort B USB B naar desktop USB A. 4. Oscilloscoop LAN ethernet naar desktop ethernet. 5. Bewegingsinterface ethernet naar desktop ethernet. 6. Oscilloscoop aux in/out BNC naar AWG-ingang BNC. 7. Oscilloscoopkanaal 1 (voorzijde) BNC naar SYNC BNC. 8. Overeenkomende doosuitgang BNC met RF-ingang coaxiaal. 9. RF-uitgang coaxiaal naar bijpassende doos coaxiaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fantoomregistratie. (A) Systeemconfiguratie en software tijdens fantoomregistratie. (B) Schermafbeelding van het fantoomregistratiescherm, waarbij de rode cirkel de geselecteerde omtrek van de axiale doorsnede is. (C) Fantoom geplaatst op het MRI-bed, bovenaanzicht. (D) Zijaanzicht van het fantoom, waarbij de rode lijn zich in de axiale schijf bevindt die overeenkomt met de cirkel in C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Plaatsing van het dier. (A) MRI-bed en -wieg, met verschillende onderdelen gelabeld: 1. MRI-wieg. 2. Stereotactisch MRI-bed. 3. Oorstangen. 4. Bijtbar. 5. Neuskegel. 6. MRI-gat voor bedpen. 7. Isofluraan anesthesiebuisjes. (B) Illustratie van de plaatsing van de muis op het MRI-bed en plaatsing op de wieg, met de RF-spoel (oranje) (illustratie aangepast met behulp van Biorender 2022-sjabloon). (C) Illustratie van de plaatsing van de muis op het MRI-bed tijdens een FUS-behandeling (illustratie aangepast met behulp van Biorender 2022-sjabloon). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Selectie van brandpuntsafstanden. Voorbeeld van een selectie van een sonicatiepunt in een enkel dier. Elke kolom vertegenwoordigt een T1-gewogen post-contrast MRI-plak waarbij elke plak 0,5 mm in de proximale (plak 1) tot distale (plak 5) richting is. De tumorgrens is handmatig gesegmenteerd en wordt rood omlijnd (rij 1), en de bijbehorende sonicatielocaties (rij 2) worden weergegeven door een lichtgroen vierkant (focaal max. midden) en een blauwe cirkel (halve max. focale focale omtrek). Elke locatie werd gedurende 2 minuten gesoniceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Groeipercentage na SDT. De groeisnelheid van GBM-tumoren van pre- tot 24 uur na SDT-behandeling bij behandelde en onbehandelde (controle)dieren met intracraniële M59-tumoren op basis van de gemeten luminescentie. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. De T-toets van een student met twee steekproeven werd uitgevoerd om de significantie te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: SDT gegenereerde laesie. Pre- en post-contrast verbeteren T1-gewogen MRI-scans van een diermodel met een representatieve axiale plak die een laesie in de tumor laat zien die is veroorzaakt door SDT. (Links) MRI-scan gemaakt voorafgaand aan SDT-behandeling, met de tumor rood omlijnd. (Midden) FUS-focuspuntselectie waarbij de maximale druk wordt weergegeven door lichtblauwe cirkels en de half-maximale drukgebieden worden weergegeven door blauwe cirkels. (Rechts) Post-SDT MRI-scans, waarbij de tumor rood is omlijnd. SDT-gecreëerde laesies en het spuitgat voor implantatie worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Volgorde | T1 |
| Herhaling tijd | 3000 ms |
| Echo tijd | 30 ms |
| Plak dikte | 0,5 mm |
| Aantal plakjes | 25 |
| Pixelafstand | 0,187 mm x 0,187 mm |
| Acquisitie matrix | 133 x 133 cm |
| Gemiddelden | 4 |
Tabel 1: MRI-instellingen.
| Beheersen | SDT Groep | P-waarde | |
| Voorbehandeling | 7,49 x 10 3 ± 2,2 x 103 | 7.48 x 10 3 ± 1 x 103 | 0.99 |
| Nabehandeling | 8,79 x 103 ± 7,7 x 102 | 7,95 x 10 3 ± 1,1 x 103 | 0.33 |
| Procentueel verschil | 16 % ± 16 % | 7% ± 12% | 0.47 |
Tabel 2: Post-contrast verbeterde T1-gewogen MRI-grijstinten.
Discussion
Nieuwe therapeutische en effectieve behandelingsopties zijn noodzakelijk voor patiënten met GBM. Dit protocol heeft een preklinische FUS-gemedieerde behandeling voor GBM geschetst die momenteel uitgebreid wordt onderzocht voor klinische vertaling. Hoewel SDT een opwindend potentieel heeft, valt er nog veel te begrijpen en te optimaliseren in de preklinische setting.
Een van de belangrijkste componenten van dit protocol is het gebruik van MR-geleide FUS om de tumor aan te pakken voor maximale werkzaamheid. Met behulp van een fantoom kan een 3D-coördinatenruimte worden gecreëerd, waaraan elke pixel van axiale MRI-segmenten een coördinaat kan worden toegewezen. Vervolgens informeert een eenvoudige procedure voor het selecteren van de sonicatielocatie op het MR-beeld de transducer waar hij op moet richten. Het gebruikte preklinische FUS-systeem is zeer veelzijdig en toepasbaar wanneer het nodig is om locaties met specifieke pathologie zoals een tumor aan te pakken, inclusief dieper zittende tumoren die moeilijk te bereiken zouden zijn zonder beeldvormingsbevestiging. Door gadolinium als contrastmiddel te gebruiken, is er een duidelijke visualisatie van de tumor, waardoor de gebruiker weloverwogen beslissingen kan nemen bij het kiezen van doelen. Het voordeel dat SDT heeft ten opzichte van veel andere behandelingen is dat het een tumorspecifieke therapie is. FUS met een lage intensiteit mag zich alleen richten op het tumorweefsel, terwijl het gezonde hersenparenchym relatief onaangeroerd blijft 3,8.
De resultaten van dit experiment laten zien hoe de voordelen van dit protocol kunnen leiden tot therapeutische resultaten die vergelijkbaar zijn met andere bevindingen in de literatuur voor SDT. Figuur 5 laat zien dat er binnen slechts 24 uur na de dag van de behandeling een vertraging van de tumorgroei was in het behandelde cohort. Hoewel onbeduidend met deze kleine steekproefomvang, kan significantie het gevolg zijn van een groter aantal dieren. Deze vertraging in tumorgroei is vergelijkbaar met wat werd aangetoond in het baanbrekende artikel over dit onderwerp van Wu et al. (2019), dat een vertraagde tumorgroei in de loop van de tijd bij behandelde dieren vertoonde, evenals verhoogde overlevingstijden9.
Overwegingen die werden gemaakt bij het ontwerpen van dit protocol waren onder meer de dierstam, het tumortype en de selectie van sonosensibiliserende middelen. Athymische naaktmuizen werden om meerdere redenen gekozen voor dit protocol. Ten eerste is de naaktmuis gemakkelijker te sonificeren, omdat het ontbreken van haar elke verzwakking verhindert. Ook maakt het ontbreken van een immuunsysteem de implantatie van van patiënten afgeleide xenotransplantaten (PDX'en) mogelijk, zodat het tumormodel meer lijkt op de klinische situatie. Het nadeel van het gebruik van een athymisch model is dat het immuunsysteem niet kan worden gekarakteriseerd, dus een SDT-gegenereerde immuunrespons zal in deze onderzoeken niet wordengemeten10. De gekozen tumorlijn is een agressieve en snelgroeiende PDX-lijn. Het tijdstip van de behandeling is erg belangrijk omdat de vestiging van de tumor moet worden geverifieerd, maar de tumorbelasting mag de schedelhelft niet vullen. Verschillende cellijnen hebben verschillende incubatietijden nodig om een tumor van optimale grootte te bereiken voor preklinische experimenten. In dit protocol werd 5-ALA gebruikt als sonosensibilisator vanwege de preferentiële opname in GBM-tumoren, wat in vitro is bevestigd voor deze cellijn in eerdere experimenten (niet-gepubliceerde gegevens). Andere sonosensibilisatoren kunnen worden vervangen en getest om de verbinding te bepalen die het meest geschikt is voor werkzaamheid en veiligheid. Ten slotte werd de behandeling 3 uur na de 5-ALA-injectie gestart, aangezien eerdere literatuur heeft aangetoond dat dit het optimale moment is met die injectiedosering5.
De FUS-parameters die in dit protocol zijn gekozen (10 W/cm2 gedurende 2 minuten bij 515 kHz op elke doellocatie) werden bepaald op basis van een overzicht van eerdere literatuur en initiële experimenten 4,9. Er werd gekozen voor een raster van sonicatiepunten die de hele tumor bedekken om het ROS-effect door de hele tumor te genereren. De intensiteit die hier wordt gebruikt is hoger dan in andere publicaties, maar in korte tijd zal dit naar verwachting niet leiden tot nadelige temperatuurgerelateerde effecten, aangezien intensiteiten tot 25 W/cm2 met succes zijn gebruikt in een muismodel zonder significante bijwerkingen11. Belangrijk is dat er in de literatuur geen gestandaardiseerde of geoptimaliseerde set FUS-parameters is gepubliceerd. Daarom kunnen de specifieke waarden die hier worden gerapporteerd worden aangepast om de optimale set parameters te bepalen, wat leidt tot de maximale vermindering van tumorweefsel met behoud van veiligheid. Bovendien, aangezien verschillende cellijnen verschillende niveaus van vascularisatie en hypoxie hebben, kan het nodig zijn deze behandeling aan te passen. We hebben een algehele verminderde tumorgroei aangetoond (Figuur 5) binnen 24 uur na SDT-behandeling, hoewel de parameters moeten worden geoptimaliseerd en meer dieren moeten worden getest om het maximale effect van deze behandeling te bepalen. MRI-scans na de behandeling laten geen laesies zien die zijn ontstaan door FUS-behandeling in gezond weefsel, waarbij het effect gelokaliseerd is in tumorweefsel (Figuur 6). Er is ook de mogelijkheid om SDT te combineren met andere FUS-technieken, zoals het tijdelijk permeabiliseren van de bloed-hersenbarrière, om de opname van 5-ALA in de tumor te maximaliseren12. Dit protocol kan verder worden aangevuld door verschillende histologietechnieken uit te voeren om de veiligheid en werkzaamheid op structureel niveau te controleren. Een hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) kan worden uitgevoerd om te controleren op structurele of tumorschade13, terwijl een terminale deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL)-kleuring kan worden uitgevoerd om te controleren op cellulaire apoptose14. Hoe dan ook, dit protocol biedt een veilige en tumorspecifieke behandeling waarbij veranderingen zelfs 24 uur na de behandeling merkbaar zijn, wat duidelijk wordt door de groeisnelheid van tumoren die zijn behandeld met SDT en onbehandelde tumoren te vergelijken, evenals door tumorplakjes voor en na sonicatie te vergelijken.
Bij elk protocol zijn er altijd nadelen of beperkingen die moeten worden afgewogen. De belangrijkste beperking van het huidige protocol zijn tijd en kosten. Ondertussen is een van de voordelen van dit protocol het geautomatiseerde gerichte doel. Om deze gerichte procedure uit te voeren, moeten voor elk individueel dier MRI-scans worden gemaakt om ervoor te zorgen dat de tumor correct wordt gericht, een proces dat zowel tijdrovend als duur kan zijn. Bovendien, afhankelijk van het aantal gewenste brandpuntsafstanden, kan de hoeveelheid tijd om dit protocol uit te voeren uren zijn voor zelfs maar een paar dieren, wat resulteert in een laag aantal proefdieren. Ondanks deze nadelen blijft dit gerichte niet-invasieve protocol een haalbare voorkeur in vergelijking met open chirurgische opties.
Concluderend toonde dit protocol het vermogen van SDT-behandeling aan om tumorgroei in de hersenen binnen 24 uur na de behandeling te verminderen met behoud van gezond neuraal weefsel in een preklinisch muismodel. Studies naar de effectiviteit van SDT en het optimaliseren van de verschillende parameters om de ROS-productie te verhogen zijn nodig om deze behandeling klinisch geschikt te maken. Er moeten nieuwe wegen worden verkend voor het gebruik van SDT als een niet-invasief therapeutisch model.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder dat er commerciële of financiële relaties zijn die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict. Amir Manbachi doceert en adviseert voor BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical en is een uitvinder van een aantal FUS-technologieën waarvoor patent is aangevraagd. Betty Tyler heeft onderzoeksfinanciering van NIH en is mede-eigenaar van Accelerating Combination Therapies*. Ashvattha Therapeutics Inc. heeft ook een van haar patenten in licentie gegeven en ze is aandeelhouder van Peabody Pharmaceuticals (*inclusief aandelen of opties).
Acknowledgments
De auteurs erkennen de financiële steun van de National Science Foundation (NSF) STTR Phase 1 Award (#: 1938939), door ASME Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Award (#: N660012024075), en Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research's (ICTR's) Clinical Research Scholars Program (KL2), beheerd door het National Institutes of Health (NIH) National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS). De cellen werden gekocht van en geleverd door de Mayo Foundation for Medical Education and Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| 1 mL Syringes | BD | 309597 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton Company | 49AL65 | |
| 10 µL Pipette tips | USAScientific | ||
| 1000 mL Flask | Corning | MP-34514-25 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | CLS430791 | |
| 200 Proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | Falcon | 357543 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 430290 | |
| 500 mL filter | Corning | 431097 | |
| 5-Aminolevulinic acid hydrochloride | Research Products International | A11250 | |
| 7T PET-MR system | Bruker | Biospec 70/30 | |
| Aluminum foil | Reynolds Brand | ||
| Amplifier | FUS Instruments | 2175 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 | |
| Bone drill | Foredom | HP4-917 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004261 | |
| Charcoal isoflourane waste container | Patterson scientific | 78909457 | |
| Computer | FUS Instruments | 2269 | |
| Cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
| Desktop monitor | ASUS | VZ239H | |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Electronic shaver | Wahl | 93235-002 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Formalin | Thermo Fisher Scientific | SF100-20 | |
| Function generator | Siglent | QS0201X-E01B | |
| Gadolinium contrast agent (Gadavist) | McKesson Corporation | 2068062 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| Heat lamp | |||
| Heat pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-12 | |
| Induction chamber | Patterson scientific | 78933388 | |
| Isofluorane vaporizer | Patterson scientific | 78916954 | |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Isoflurane system | Patterson Scientific | 78935903 | |
| IVIS spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| Lightfield microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Nair | Church and Dwight Co. | 42010553 | |
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| P-20 pippette | Rainin | 17008650 | |
| Patient derived xenographs | Mayo Clinic | M59 | |
| Penicillin/Streptomyosin | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70-011-069 | |
| Pippetter | Drummond | 4-000-101 | |
| Povidone-iodine | Covetrus | PI050CV | |
| RK-50 MRgFUS system | FUS Instruments | 2182 | |
| Scale | |||
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Screwdriver set | Jakemy | JM-8160 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Stereotactic MRI prototype plastic imaging fixture | FUS Instruments | ||
| T-25 culture flask | Corning | 430641U | |
| Transducer and matching box | FUS Instruments | T515H750-118 | |
| Ultrasonic degasser | FUS Instruments | 2259 | |
| Ultrasound gel | ParkerLabs | 01-08 | |
| Water bath | FUS Instruments | ||
| Xylazine | Covetrus | 1XYL006 |
References
- Tan, A. C., et al. Management of glioblastoma: State of the art and future directions. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (4), 299-312 (2020).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- McHale, A. P., Callan, J. F., Nomikou, N., Fowley, C., Callan, B. Sonodynamic therapy: concept, mechanism and application to cancer treatment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 880, 429-450 (2016).
- Ohmura, T., et al. Sonodynamic therapy with 5-aminolevulinic acid and focused ultrasound for deep-seated intracranial glioma in rat. Anticancer Research. 31 (7), 2527-2533 (2011).
- Shono, K., et al. Elevated cellular PpIX potentiates sonodynamic therapy in a mouse glioma stem cell-bearing glioma model by downregulating the Akt/NF-κB/MDR1 pathway. Scientific Reports. 11 (1), 15105 (2021).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), e1986 (2010).
- Poussard, A., et al. In vivo imaging systems (IVIS) detection of a neuro-invasive encephalitic virus. Journal of Visualized Experiments. (70), e4429 (2012).
- Borah, B. M., et al. Sonodynamic therapy in combination with photodynamic therapy shows enhanced long-term cure of brain tumor. Scientific Reports. 10 (1), 21791 (2020).
- Wu, S. -K., Santos, M. A., Marcus, S. L., Hynynen, K. MR-guided focused ultrasound facilitates sonodynamic therapy with 5-Aminolevulinic acid in a rat glioma model. Scientific Reports. 9 (1), 10465 (2019).
- Zhang, Q., et al. Sonodynamic therapy-assisted immunotherapy: A novel modality for cancer treatment. Cancer Science. 109 (5), 1330-1345 (2018).
- Nonaka, M., et al. Sonodynamic therapy consisting of focused ultrasound and a photosensitizer causes a selective antitumor effect in a rat intracranial glioma model. Anticancer Research. 29 (3), 943-950 (2009).
- Pi, Z., et al. Sonodynamic therapy on intracranial glioblastoma xenografts using sinoporphyrin sodium delivered by ultrasound with microbubbles. Annals of Biomedical Engineering. 47 (2), 549-562 (2019).
- Rodgers, G., et al. Virtual histology of an entire mouse brain from formalin fixation to paraffin embedding. Part 1: Data acquisition, anatomical feature segmentation, tracking global volume and density changes. Journal of Neuroscience Methods. 364, 109354 (2021).
- Chimata, A. V., Deshpande, P., Mehta, A. S., Singh, A. Protocol to study cell death using TUNEL assay in Drosophila imaginal discs. STAR Protocols. 3 (1), 101140 (2022).
