Summary
Qui, descriviamo un protocollo che descrive in dettaglio come eseguire la terapia sonodinamica in un modello di glioblastoma murino in vivo utilizzando ultrasuoni focalizzati guidati dalla risonanza magnetica.
Abstract
La terapia sonodinamica (SDT) è un'applicazione degli ultrasuoni focalizzati (FUS) che consente a un agente sonosensibilizzante di innescare i tumori per una maggiore sensibilità durante la sonicazione. Sfortunatamente, gli attuali trattamenti clinici per il glioblastoma (GBM) sono carenti, portando a bassi tassi di sopravvivenza a lungo termine tra i pazienti. L'SDT è un metodo promettente per il trattamento del GBM in modo efficace, non invasivo e specifico per il tumore. I sonosensibilizzatori entrano preferenzialmente nelle cellule tumorali rispetto al parenchima cerebrale circostante. L'applicazione di FUS in presenza di un agente sonosensibilizzante genera specie ossidative reattive con conseguente apoptosi. Sebbene questa terapia si sia dimostrata efficace in precedenza negli studi preclinici, mancano parametri standardizzati stabiliti. Sono necessari metodi standardizzati per ottimizzare questa strategia terapeutica per l'uso preclinico e clinico. In questo articolo, descriviamo in dettaglio il protocollo per eseguire la SDT in un modello preclinico di roditore GBM utilizzando la FUS guidata dalla risonanza magnetica (MRgFUS). MRgFUS è una caratteristica importante di questo protocollo, in quanto consente di mirare in modo specifico a un tumore cerebrale senza la necessità di interventi chirurgici invasivi (ad esempio, craniotomia). Il dispositivo da banco utilizzato in questo caso è in grado di concentrarsi su una posizione specifica in tre dimensioni facendo clic su un target su un'immagine MRI, rendendo la selezione del target un processo semplice. Questo protocollo fornirà ai ricercatori un metodo preclinico standardizzato per MRgFUS SDT, con la flessibilità aggiuntiva di modificare e ottimizzare i parametri per la ricerca traslazionale.
Introduction
Il glioblastoma (GBM) è una forma di tumore cerebrale altamente aggressivo che ha un'incidenza di 3,21 per 100.000 persone ed è il tumore cerebrale maligno più comune1. L'attuale standard di cura comprende la resezione chirurgica, la radioterapia e la chemioterapia2. A causa della natura invasiva e infiltrativa del tumore, la resezione completa del tumore è rara. Il tessuto residuo ai margini del tumore determina un alto tasso di recidiva del tumore e un basso tasso di sopravvivenza inferiore al 6% dopo 5 anni1.
A causa di questa prognosi, i ricercatori stanno esplorando nuove opzioni terapeutiche per combattere questa malattia mortale. La terapia sonodinamica (SDT) è un trattamento non invasivo che combina ultrasuoni focalizzati a bassa intensità (FUS) e agenti sonosensibilizzanti per produrre un effetto citotossico nelle cellule bersaglio3. Ad esempio, i sonosensibilizzanti a base di porfirina come l'acido 5-aminolevulinico (5-ALA) sono assorbiti preferenzialmente dalle cellule tumorali e aumentano la produzione di specie ossidative reattive (ROS) a livelli dannosi se esposti a ultrasuoni focalizzati. Livelli sovraespressi di ROS nelle cellule possono danneggiare le strutture cellulari e innescare l'apoptosi. Poiché il 5-ALA è assorbito preferenzialmente dalle cellule tumorali, il tessuto sano all'interno della regione di trattamento è illeso 3,4. Studi preliminari in vitro hanno rivelato che molte cellule tumorali vengono lisate dal trattamento SDT, sebbene il tasso di morte cellulare dipenda dalla linea cellulare. Studi preliminari in vivo hanno prodotto risultati simili, confermando che la SDT può innescare l'apoptosi5.
Questo protocollo ha lo scopo di descrivere tecniche e parametri efficaci per il trattamento SDT di modelli di roditori con cellule GBM impiantate per via intracranica utilizzando una piattaforma di ricerca FUS da banco. I ricercatori possono utilizzare questo protocollo per eseguire e ottimizzare SDT per la ricerca FUS traslazionale.
Protocol
Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati e condotti in conformità con il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Johns Hopkins University (IACUC). Topi femmina nudi atimici (età: 10 settimane) sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali). Sono state seguite tutte le normative di livello di biosicurezza 2 (BSL-2), compreso l'uso di maschere, guanti e camici.
1. Impianti tumorali e imaging a bioluminescenza
- Durante la fase iniziale dello studio, eseguire l'impianto di tumore intracranico, seguendo un rapporto precedentemente pubblicato6.
NOTA: In questo studio, 100.000 cellule di xenotrapianto di GBM umano M59 in 4 μL di sospensione cellulare sono state utilizzate per l'impianto a una profondità di 3,0 mm nel cranio. - Prima del trattamento, quantificare le dimensioni del tumore in ciascun topo in modo non invasivo utilizzando un sistema di imaging a luminescenza in vivo (vedere Tabella dei materiali) sulla base di un rapporto pubblicato in precedenza7.
NOTA: Questo è stato fatto alla data del trattamento, 7 giorni dopo gli impianti iniziali del tumore. - Utilizzando la quantificazione per immagini, dividere i topi in sottogruppi comparabili per il trattamento.
NOTA: In questo studio, sono stati inclusi due sottogruppi: (1) topi portatori di tumore non trattati (n = 4) e (2) topi portatori di tumore sottoposti a SDT (n = 4). Non è stata osservata alcuna differenza statisticamente significativa nelle dimensioni del tumore pre-trattamento tra i due gruppi (p > 0,05).
2. Impostazione del giorno del trattamento
- Rimuovere il cloridrato di 5-ALA (vedere la tabella dei materiali) dal congelatore e pesare 200 mg/kg di peso del topo di 5-ALA (ad esempio, per un topo di 25 g, pesare 5 mg.). Fallo solo sotto la luce ambientale.
NOTA: Sterile tutta l'attrezzatura prima dell'uso. - Sciogliere la quantità totale di 5-ALA in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), in modo che a ciascun animale venga somministrata una soluzione da 60 mg/mL di 5-ALA con il dosaggio corretto (ad esempio, per un topo da 25 g, sciogliere 5 mg di 5-ALA in 83,33 μL di PBS).
- Per ciascun animale del gruppo di prova SDT, iniettare la quantità appropriata di soluzione di 5-ALA nell'animale per via intraperitoneale (calcolata nelle fasi 2.1 e 2.2).
- Lasciare gli animali nelle loro gabbie per 3 ore per metabolizzare il 5-ALA.
3. Preparazione dei requisiti per gli esperimenti
- Riempire un serbatoio con acqua deionizzata (DI).
NOTA: La quantità di acqua necessaria si basa sul numero di topi utilizzati nello studio. - Collegare i tubi di ingresso e uscita al degasatore a ultrasuoni (vedere la tabella dei materiali) e collegare il degasatore all'alimentazione (1 = ON, 0 = OFF).
- Posizionare l'altra estremità dei tubi di ingresso e uscita nel serbatoio dell'acqua deionizzata.
- Accendere il degasatore e farlo funzionare per 45 min.
- Riempire l'acqua appena degassata fino alla parte superiore di un contenitore ermetico e sigillato da utilizzare durante lo studio.
- Versare il gel per ultrasuoni (vedere la tabella dei materiali) in una provetta conica, quindi metterlo in una centrifuga e centrifugare a 160 x g per 5 minuti per rimuovere l'aria dal gel.
NOTA: È necessaria una quantità sufficiente di gel per formare una cucchiaiata di gel sulla testa di ogni animale.
4. Configurazione del sistema MRgFUS
- Collegare il sistema MRgFUS (vedere la tabella dei materiali) utilizzando lo schema elettrico come mostrato nella Figura 1 (pannello inferiore).
- Collegare tutti i componenti necessari (computer desktop, monitor, piattaforma MRgFUS, oscilloscopio, amplificatore) all'alimentazione.
- Collegare tutti i cavi nelle posizioni corrette.
- Collegare il trasduttore desiderato alla piattaforma MRgFUS tramite i cavi BNC e coassiali, quindi collegare la scatola di adattamento dell'impedenza corrispondente ai fili corretti.
NOTA: Per il presente studio è stato utilizzato un trasduttore a 515 kHz.
- Accendi tutti i dispositivi.
- Sul sistema operativo del computer desktop, aprire l'applicazione AUREUS, che è già integrata nel software di sistema FUS.
- Selezionare Connetti tutto l'hardware per collegare l'hardware al sistema e assicurarsi che i componenti comunichino con il software.
- Selezionare il trasduttore utilizzato selezionando il menu a tendina e scegliendo il trasduttore desiderato.
5. Inizializzazione
- Svitare la vite inferiore dal fantoccio e riempire la cavità con acqua deionizzata e degassata fino a quando non trabocca, quindi sostituire nuovamente la vite.
- Inserire il fantoccio nella posizione corrispondente del letto per risonanza magnetica (vedere la Figura 2), quindi posizionare il letto per risonanza magnetica nella base per risonanza magnetica nello slot corrispondente.
- Posizionare la base per risonanza magnetica nella posizione corrispondente nello scanner per risonanza magnetica (vedere Tabella dei materiali). Regolare la base in modo che il letto per risonanza magnetica fantasma possa scivolare nel foro per risonanza magnetica senza ostruzioni per ottenere un'immagine di alta qualità del fantoccio. Contrassegnare questa posizione in modo che sia facilmente replicabile in futuro.
NOTA: Una volta trovata questa posizione, la posizione non verrà modificata per il resto del trattamento. Pertanto, assicurati che sia un luogo adeguato per il posizionamento della risonanza magnetica dell'animale, altrimenti l'intera registrazione dovrà essere ripetuta. - Eseguire una risonanza magnetica del fantoccio utilizzando le impostazioni nella Tabella 1.
- Rimuovere la base dal foro del magnete, ma tenerla sullo scanner. Rimuovere il letto per risonanza magnetica contenente il fantoccio dalla culla, quindi posizionare il letto con il fantoccio sul sistema MRgFUS facendo scorrere il piolo sul fondo nella sua fessura corretta.
- Inserire la punta di registrazione nelle fessure magnetiche sul braccio del trasduttore in modo che sia rivolta verso il basso verso il fantoccio (vedere la Figura 2).
- Sul software, scegliere Seleziona una nuova posizione iniziale, quindi selezionare Modalità jog attivata per iniziare la ricerca guidata della messa a fuoco. Dopo aver attivato la modalità jog, utilizzare i tasti sinistra, destra, su, giù, pagina su e pagina giù per spostare manualmente il braccio del trasduttore rispettivamente nelle direzioni sinistra, destra, avanti, indietro, su e giù.
- Regolare manualmente il puntatore in tutte e tre le dimensioni fino a quando la punta del puntatore non tocca il centro del motivo a croce che si trova sulla parte superiore del fantoccio (vedere la Figura 2).
- Scaricare le immagini MRI fantasma sul computer e inserirle in una cartella nella directory scelta, quindi caricare le immagini MRI nel software selezionando Carica immagini fantasma. Le fette fantasma assiali popoleranno quindi lo schermo sul lato destro. Scorrere queste sezioni tramite la barra di scorrimento del mouse. Regolare la luminosità facendo clic e tenendo premuta l'immagine, quindi spostando il mouse verso l'alto o verso il basso.
NOTA: Se uno qualsiasi dei file nella cartella non è un file DICOM non compresso, il software non sarà in grado di leggerli e importarli, quindi rimuovere tutti gli altri file da quella cartella. - Scorri fino a qualsiasi immagine del fantasma in cui c'è un cerchio chiaro con tre buchi scuri in ciascuno. Fai clic al centro del fantasma e apparirà un cerchio rosso. Fare clic e trascinare sul cerchio fino a quando non ha lo stesso diametro e si allinea con la circonferenza del fantoccio (vedere la Figura 2).
- Le coordinate di questa posizione sono denominate "posizione iniziale"; salvate questa operazione facendo clic su Imposta L/R, A/P e S/I.
- Fare clic su Jog Mode Off, rimuovere la punta di registrazione dal braccio del trasduttore, quindi selezionare Exit Focus Finding. Confermare la posizione iniziale per completare la sequenza di inizializzazione.
6. Preparazione animale per SDT
- Anestetizzare il topo utilizzando una miscela di isoflurano-O2 in una camera di induzione. Impostare la portata del gas a 1,0 mL/min e il vaporizzatore al 2,0% per l'induzione dell'anestesia, che in genere richiede 3-5 minuti nella camera (vedere la tabella dei materiali).
- Valutare l'animale per un'adeguata sedazione pizzicando il dito del piede. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per evitare la secchezza delle cornee.
NOTA: Monitorare la profondità dell'anestesia durante tutta la procedura. - Iniettare nel topo 40 μL di mezzo di contrasto gadolinio attraverso la vena caudale (vedere Tabella dei materiali).
- Rimuovere eventuali peli che ostruiscono il cuoio capelluto sopra il cranio utilizzando una crema depilatoria e un rasoio elettronico.
- Fissare l'animale al letto per risonanza magnetica seguendo i seguenti passaggi (vedere la Figura 3).
- Collegare il tubo di ingresso del letto di risonanza magnetica (Figura 3A) a una fonte di isoflurano per l'anestesia e impostare la portata del gas su 1,0 mL/min e il vaporizzatore su 2,0% per l'induzione dell'anestesia. Collegare il tubo di uscita a un contenitore del filtro al carbone per l'assorbimento dell'anestesia.
- Posizionare il cono del naso nella sua fessura, come mostrato nella Figura 3B. Far scorrere la barra del morso attraverso i fori della barra del morso sia nel cono del naso che all'estremità del letto, come mostrato, con l'estremità della protezione del morso in bilico sul pozzetto aperto nel letto MRI.
- Posiziona l'animale sul letto per risonanza magnetica con le orecchie allineate con i fori stereotassici della barra auricolare e aggancia i denti attraverso la protezione del morso per tenerlo in posizione. Fai scorrere l'ogiva nasale in avanti in modo che sia sopra il muso dell'animale per fornire un flusso costante di anestesia.
- Far scorrere le barre auricolari attraverso i fori su entrambi i lati del letto per risonanza magnetica e sollevare la testa dell'animale fino a quando entrambe le barre auricolari non possono entrare nei canali uditivi del topo.
NOTA: Non spingersi troppo oltre, in quanto ciò potrebbe danneggiare i timpani dell'animale. - Assicurati che l'animale sia in una posizione comoda. Quindi, utilizzando un cacciavite a testa piatta, avvitare le viti compatibili con la risonanza magnetica per bloccare entrambe le barre auricolari, il cono nasale e la barra del morso. Questo bloccherà l'animale in posizione e impedirà qualsiasi movimento della testa fino a quando l'animale non verrà rimosso dal letto.
NOTA: Assicurarsi che non vi siano disturbi al posizionamento dell'animale sul letto di risonanza magnetica dopo questo passaggio. Se l'animale si muove, l'intera configurazione (passaggio 6.5) dovrà essere ripetuta, indipendentemente da quanto sia avanti il protocollo. - Mentre l'animale è in attesa, posiziona il lettino per la risonanza magnetica su un termoforo caldo per mantenere la temperatura corporea.
NOTA: Monitorare e mantenere la temperatura corporea durante tutta la procedura.
- L'isoflurano viene continuamente fornito all'animale tramite tubi attaccati ai coni nasali durante tutto il trattamento quando la cuccia dell'animale viene fissata sul sistema FUS, utilizzando i dispositivi forniti sulla piattaforma.
7. Procedure di risonanza magnetica
- Prendere il letto per risonanza magnetica con l'animale fissato stereotassicamente e posizionarlo nella culla per risonanza magnetica precedentemente collegata allo scanner per risonanza magnetica (vedere Tabella dei materiali), inserendo il foro del letto per risonanza magnetica alla sua estremità con il piolo sulla base per risonanza magnetica, come mostrato nella Figura 3. Collegare i tubi di ingresso e di uscita per anestesia ai tubi corrispondenti nella macchina per la risonanza magnetica.
- Far scorrere la culla per risonanza magnetica contenente l'animale nel foro per risonanza magnetica, assicurandosi di mantenere la stessa posizione in cui è stato posizionato il fantoccio.
- Eseguire un localizzatore per vedere la posizione del cervello animale e quindi una risonanza magnetica pesata in T1 post-contrasto che copra l'intero cervello utilizzando le impostazioni di risonanza magnetica della Tabella 2.
- Esportare la scansione MRI come un insieme di file DICOM non compressi, uno per ogni sezione.
8. Trattamento con ultrasuoni focalizzati (Figura 4)
- Rimuovere l'animale dalla culla per risonanza magnetica dopo il completamento della scansione e posizionarlo sulla piattaforma inserendo la parte anteriore del letto nel piolo corrispondente sul retro della piattaforma e inserendo la parte posteriore del letto nel piolo corrispondente.
- Collegare il tubo di ingresso del letto di risonanza magnetica a una fonte di isoflurano per l'anestesia e impostare la portata del gas a 1,0 mL/min e il vaporizzatore al 2,0% per il mantenimento dell'anestesia. Collegare il tubo di uscita a un contenitore del filtro al carbone per l'assorbimento dell'anestesia.
- Trasferire l'insieme di file DICOM sul computer e inserirli in una cartella nella directory di lavoro principale dello studio corrente.
NOTA: Fare riferimento al passaggio 5.9 per i requisiti dei file. - Nel software, vai alla pagina di inizializzazione principale e attiva la modalità jog facendo clic su Ricerca guidata della messa a fuoco, quindi fai clic su Modalità jog attivata.
- Metti una piccola quantità di gel centrifugato per ultrasuoni sulla testa dell'animale, con abbastanza gel da coprire l'intero cuoio capelluto sopra il cranio.
- Versare l'acqua degassata e degassata nel bagnomaria fino all'80%, quindi inserire il bagnomaria nelle colonne corrispondenti sulla piattaforma.
- Abbassare il bagnomaria riempito con acqua deionizzata fino a quando la membrana inferiore tocca il gel ad ultrasuoni sulla testa dell'animale, formando una superficie di accoppiamento tra l'acqua e il gel. Assicurarsi che il gel per ultrasuoni copra l'intera testa dell'animale fino al bagnomaria e che non vi siano bolle d'aria nel gel per ultrasuoni tra il bagnomaria e il cuoio capelluto del topo.
- Immergere il trasduttore a ultrasuoni nel bagnomaria, assicurandosi che non si formino bolle d'aria sulla superficie del trasduttore.
- Abbassare il braccio del trasduttore utilizzando la modalità Jog Down verso il trasduttore parzialmente sommerso e accoppiarlo al trasduttore allineando le fessure magnetiche tra loro mentre la superficie del trasduttore rimane sommersa.
- Disattivare la modalità jog, quindi uscire dalla ricerca focalizzata, come fatto durante la fase di inizializzazione. Assicurati di confermare la posizione iniziale come fatto prima.
- Vai alla scheda del trattamento, quindi carica i file di risonanza magnetica pesati in T1 post-contrasto facendo clic sull'icona della cartella in alto al centro dello schermo. Selezionare la cartella contenente i file DICOM caricati in precedenza sul computer e aprirli. Questo passaggio dovrebbe caricare automaticamente tutti i file DICOM nel pannello in alto a destra.
- Successivamente, nella scheda Modalità di sonicazione , selezionare la modalità di trattamento appropriata scegliendo Burst o Onda continua. Se si è in modalità burst, nella scheda Impostazioni sonicazione , immettere la lunghezza della raffica, il periodo di burst e il numero di periodi. Questi parametri corrisponderanno a ciascuna posizione di sonicazione. In modalità onda continua, immettere solo la durata della sonicazione.
NOTA: In questo studio, è stata utilizzata la modalità a onda continua per una durata di 120 s. - Fare clic sull'icona del bersaglio in alto al centro della pagina e selezionare le posizioni corrette sulla sezione MRI corretta in cui deve essere puntata la regione focale FUS. Un quadrato rosso chiaro con un cerchio rosso sarà presente dove si fa clic. È possibile scegliere più di una selezione.
- A sinistra dell'immagine MRI c'è una tabella, che verrà popolata con le coordinate 3D delle regioni focali selezionate. Nell'ultima colonna della tabella, inserire il livello di potenza da sonicare in ogni punto focale, che può essere calcolato separatamente per ogni trasduttore utilizzato per ottenere i livelli di pressione o intensità desiderati. Fare clic su ciascun punto focale nella tabella per confermare, il che comporterà l'evidenziazione delle coordinate e la regione focale corrispondente sull'immagine diventerà blu.
NOTA: Fare riferimento alla scheda tecnica del trasduttore per determinare come tradurre il livello di potenza inserito nella tabella in pressione o intensità, poiché questi valori sono specifici del trasduttore. - Una volta soddisfatte tutte le aree focali, selezionare Test movimento. Ciò richiederà al software di spostare il trasduttore in tutti i punti focali per garantire che i movimenti siano possibili. Dopo la conferma, il software indicherà che il test di movimento è stato completato. Se si verifica un errore, regolare le regioni focali in modo che possano rientrare negli assi 3D dei motori del trasduttore.
- Una volta pronto, selezionare Begin Sonication (Inizia sonicazione) per avviare il protocollo di sonicazione, spostando il trasduttore e applicando i parametri FUS corretti in ciascuna regione focale selezionata.
- Una volta terminato il protocollo di sonicazione, disaccoppiare il trasduttore dal braccio del trasduttore, rimuovere il bagnomaria dalla piattaforma e rimuovere il gel per ultrasuoni dal cuoio capelluto dell'animale.
- Svitare il morso e le barre auricolari, rimuovere l'animale dal letto per risonanza magnetica, quindi posizionare l'animale su un tappetino caldo fino a quando l'animale non si sveglia dall'anestesia. A questo punto, rimetti l'animale nella sua gabbia.
- Per gli animali successivi, ripetere lo stesso protocollo, a partire dal paragrafo 6.
- Una volta trattati gli animali desiderati, pulire tutte le superfici toccate dagli animali con etanolo al 70% (vedi Tabella dei materiali).
- Uscire dal software, quindi arrestare e spegnere ogni apparecchiatura.
9. Fasi post-trattamento
- Ripetere il protocollo del sistema di imaging in vivo (IVIS) della sezione 1 per la misurazione della bioluminescenza 24 ore dopo il trattamento. Per analizzare l'efficacia del trattamento, confrontare le registrazioni della bioluminescenza prima e dopo il trattamento per determinare il tasso di crescita sia per i gruppi trattati che per quelli non trattati.
- Eseguire scansioni MRI di follow-up utilizzando le stesse impostazioni del passaggio 6.4. Utilizzando le scansioni con mezzo di contrasto, confrontare l'intensità media della scala di grigi della regione tumorale o calcolare il volume totale coperto dall'agente di contrasto per determinare le differenze nel volume del tumore prima e dopo il trattamento.
Representative Results
Le dimensioni del tumore diminuiscono negli animali trattati con SDT 24 ore dopo il trattamento.
Il giorno del trattamento con SDT, il segnale di bioluminescenza medio originale per i gruppi di controllo e di trattamento (N = 4 ciascuno) era rispettivamente di 2,0 x 10 6 ± 3,1 x 10 6 e 2,3 x 10 6 ± 1,3 x 10 6 p/s/cm2/sr. I valori medi di bioluminescenza corrispondenti alle dimensioni del tumore prima del trattamento tra i due gruppi non erano statisticamente significativi (p = 0,89). Il segnale medio di bioluminescenza del gruppo di trattamento è stato di 3,57 x 10 6 ± 2,3 x 10 6 24 ore dopo SDT, mentre il segnale bioluminescente del gruppo di controllo è stato aumentato a 5,5 x 10 6 ± 8,2 x 10 6 p/s/cm2/sr. Come mostrato nella Figura 5, ciò corrisponde a un tasso di crescita rispettivamente dell'83,4% ± del 78% e del 172% ± del 34%, ipotizzando una crescita esponenziale (p = 0,08). Dei quattro animali trattati, tre avevano tassi di crescita più bassi dopo il trattamento rispetto ai controlli. C'era un valore anomalo nel gruppo di trattamento che mostrava una crescita paragonabile ai controlli, distorcendo le deviazioni.
Inoltre, gli animali sono stati sottoposti a successiva risonanza magnetica con mezzo di contrasto il giorno successivo al trattamento per il confronto pre e post-trattamento del tumore. L'intensità media in scala di grigi dell'agente di contrasto nei tumori è stata condotta su ciascuna fetta di risonanza magnetica per ciascun animale per misurare la quantità di agente di contrasto che entrava nei tumori dopo il trattamento, come stima delle dimensioni del tumore. Prima del trattamento, l'intensità media della scala di grigi del tumore tra i gruppi di controllo e trattati era simile. In media, questa intensità della scala di grigi è aumentata nel gruppo di controllo a una magnitudo maggiore rispetto ai gruppi trattati, anche se questo non era significativo (p = 0,47). Questi dati sono riportati nella Tabella 2. L'elevata variabilità di questi risultati è potenzialmente dovuta al fatto che le risonanze magnetiche sono state eseguite solo 24 ore dopo il trattamento, momento in cui il potenziale terapeutico della SDT sta solo iniziando a manifestarsi. Ciononostante, la Figura 6 mostra un esempio delle lesioni create dalla SDT.
Figura 1: Configurazione del sistema FUS. (Torna su) Sistema MRgFUS con componenti etichettati. (Anteriore) 1. Piattaforma. 2. Braccio del trasduttore motorizzato dell'asse. 3. Trasduttore FUS. 4. Bagnomaria. 5. Letto per risonanza magnetica. 6. Monitorare. 7. Scatola di corrispondenza dell'impedenza del trasduttore. 8. Scatola dell'amplificatore di potenza. 9. Generatore di funzioni. 10. Porta BNC del canale 1 del generatore di funzioni. 11. Computer desktop. (In basso) Sistema MRgFUS con schema elettrico codificato a colori con le seguenti connessioni. (Indietro) 1. Cavi di alimentazione. 2. Monitorare HDMI su HDMI desktop. 3. Porta B, USB B a USB A desktop. 4. Oscilloscopio LAN ethernet a desktop ethernet. 5. Interfaccia di movimento da Ethernet a Ethernet desktop. 6. Ingresso ausiliario dell'oscilloscopio da BNC a ingresso AWG BNC. 7. Oscilloscopio canale 1 (anteriore) BNC a SYNC BNC. 8. Corrispondenza scatola uscita BNC a RF ingresso coassiale. 9. Uscita RF coassiale alla scatola corrispondente coassiale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Registrazione fantasma. (A) Configurazione del sistema e software durante la registrazione fantasma. (B) Screenshot della schermata di registrazione fantasma, dove il cerchio rosso è la circonferenza selezionata della sezione trasversale assiale. (C) Fantasma posizionato sul letto della risonanza magnetica, vista dall'alto. (D) Vista laterale del fantoccio, dove la linea rossa si trova nella fetta assiale corrispondente al cerchio in C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Posizionamento dell'animale. (A) Letto e culla per risonanza magnetica, con varie parti etichettate: 1. Culla per risonanza magnetica. 2. Letto per risonanza magnetica stereotassica. 3. Barre auricolari. 4. Barra del morso. 5. Cono nasale. 6. Foro per piolo del letto MRI. 7. Tubi per anestesia isoflurano. (B) Illustrazione che rappresenta il posizionamento del topo sul letto di risonanza magnetica e il posizionamento sulla culla, con la bobina RF (arancione) (illustrazione modificata utilizzando il modello Biorender 2022). (C) Illustrazione che rappresenta il posizionamento del topo sul letto di risonanza magnetica durante un trattamento FUS (illustrazione modificata utilizzando il modello Biorender 2022). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Selezione del punto focale. Esempio di selezione di un punto di sonicazione in un singolo animale. Ogni colonna rappresenta una sezione di risonanza magnetica post-contrasto pesata in T1 in cui ogni sezione è di 0,5 mm nella direzione prossimale (fetta 1) e distale (fetta 5). Il contorno del tumore è stato segmentato manualmente ed è delineato in rosso (riga 1) e le posizioni di sonicazione corrispondenti (riga 2) sono rappresentate da un quadrato verde chiaro (centro focale massimo) e da un cerchio blu (metà della circonferenza focale massima). Ogni posizione è stata sonicata per 2 minuti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Tasso di crescita dopo SDT. Il tasso di crescita dei tumori GBM da pre a 24 ore dopo il trattamento SDT in animali trattati e non trattati (controllo) con tumori intracranici M59 in base alla luminescenza misurata. Le barre di errore indicano la deviazione standard. È stato eseguito un test T di uno studente a due campioni per determinare la significatività. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Lesione generata da SDT. Le scansioni MRI pesate in T1 pre e post-contrasto da un modello animale con una fetta assiale rappresentativa che mostra una lesione nel tumore creata da SDT. (A sinistra) Risonanza magnetica eseguita prima del trattamento SDT, con il tumore delineato in rosso. (Al centro) Selezione del punto focale FUS in cui la pressione massima è rappresentata da cerchi azzurri e le regioni di pressione massima sono rappresentate da cerchi blu. (Destra) Scansioni MRI post-SDT, in cui il tumore è delineato in rosso. Vengono mostrate le lesioni create dall'SDT e il foro della siringa per l'impianto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Sequenza | T1 |
| Tempo di ripetizione | 3000 millimetri |
| Tempo di eco | 30 millimetri |
| Spessore fetta | 0,5 millimetri |
| Numero di fette | 25 |
| Spaziatura dei pixel | 0,187 mm x 0,187 mm |
| Matrice di acquisizione | Dimensioni 133 x 133 |
| Medie | 4 |
Tabella 1: Impostazioni MRI.
| Controllo | Gruppo SDT | Valore P | |
| Pre-trattamento | 7,49 x 10 3 ± 2,2 x 103 | 7,48 x 10 3 ± 1 x 103 | 0.99 |
| Post-trattamento | 8,79 x 103 ± 7,7 x 102 | 7,95 x 10 3 ± 1,1 x 103 | 0.33 |
| Differenza percentuale | 16% ± 16% | 7% ± 12% | 0.47 |
Tabella 2: Scala di grigi MRI pesata in T1 con aumento del post-contrasto.
Discussion
Sono necessarie nuove opzioni terapeutiche ed efficaci per i pazienti con GBM. Questo protocollo ha delineato un trattamento preclinico mediato da FUS per il GBM che è attualmente in fase di indagine approfondita per la traduzione clinica. Sebbene la SDT abbia un potenziale entusiasmante, c'è ancora molto da capire e ottimizzare in ambito preclinico.
Uno dei componenti più importanti di questo protocollo è l'utilizzo di FUS guidato da risonanza magnetica per colpire il tumore per la massima efficacia. Utilizzando un fantoccio, è possibile creare uno spazio di coordinate 3D, in cui a ogni pixel delle sezioni assiali di risonanza magnetica può essere assegnata una coordinata. Quindi, una semplice procedura di selezione della posizione di sonicazione sull'immagine RM informa il trasduttore su dove puntare. Il sistema FUS preclinico utilizzato è altamente versatile e applicabile quando è necessario mirare a sedi di patologia specifica come un tumore, compresi i tumori a sede più profonda che sarebbero difficili da colpire senza la conferma dell'imaging. Utilizzando il gadolinio come agente di contrasto, c'è una chiara visualizzazione del tumore, consentendo all'utente di prendere decisioni informate nella scelta dei bersagli. Il vantaggio che la SDT ha rispetto a molti altri trattamenti è che si tratta di una terapia specifica per il tumore. La FUS a bassa intensità dovrebbe colpire solo il tessuto tumorale, lasciando relativamente intatto il parenchima cerebrale sano 3,8.
I risultati di questo esperimento evidenziano come i vantaggi di questo protocollo possano portare a risultati terapeutici simili ad altri risultati in letteratura per la SDT. La Figura 5 mostra che entro 24 ore dal giorno del trattamento, c'è stato un rallentamento della crescita del tumore nella coorte trattata. Sebbene insignificante utilizzando questa piccola dimensione del campione, la significatività potrebbe risultare con un numero maggiore di animali. Questo ritardo nella crescita del tumore è simile a quello mostrato nell'articolo pionieristico su questo argomento di Wu et al. (2019), che ha mostrato una crescita del tumore rallentata nel tempo negli animali trattati, nonché un aumento dei tempi di sopravvivenza9.
Le considerazioni che sono state fatte durante la progettazione di questo protocollo includevano il ceppo animale, il tipo di tumore e la selezione dell'agente sonosensibilizzante. I topi nudi atimici sono stati scelti per questo protocollo per diversi motivi. Innanzitutto, il topo nudo è più facile da sonicare poiché la mancanza di peli impedisce qualsiasi attenuazione. Inoltre, la mancanza di un sistema immunitario consente l'impianto di xenotrapianti derivati dal paziente (PDX) in modo che il modello tumorale assomigli più da vicino alla situazione clinica. Lo svantaggio dell'utilizzo di un modello atimico è che il sistema immunitario non può essere caratterizzato, quindi qualsiasi risposta immunitaria generata da SDT non sarà misurata in questi studi10. La linea tumorale scelta è una linea PDX aggressiva e in rapida crescita. Il momento del trattamento è molto importante perché l'instaurazione del tumore deve essere verificata, ma il carico tumorale non deve riempire l'emisfero cranico. Diverse linee cellulari richiedono tempi di incubazione diversi per ottenere un tumore di dimensioni ottimali per la sperimentazione preclinica. In questo protocollo, il 5-ALA è stato utilizzato come sonosensibilizzante a causa del suo assorbimento preferenziale nei tumori del GBM, che è stato confermato in vitro per questa linea cellulare in esperimenti precedenti (dati non pubblicati). Altri sonosensibilizzanti possono essere sostituiti e testati per determinare il composto più adatto per efficacia e sicurezza. Infine, il trattamento è stato iniziato 3 ore dopo l'iniezione di 5-ALA, poiché la letteratura precedente ha dimostrato che questo è il momento ottimale con quel dosaggio di iniezione5.
I parametri FUS scelti in questo protocollo (10 W/cm 2 per2 min a 515 kHz in ogni posizione target) sono stati decisi sulla base di una revisione della letteratura precedente e di esperimenti iniziali 4,9. È stata scelta una griglia di punti di sonicazione che copre l'intero tumore per generare l'effetto ROS in tutto il tumore. L'intensità utilizzata qui è superiore a quella di altre pubblicazioni, ma in un breve lasso di tempo, non si prevede che ciò porti ad effetti negativi legati alla temperatura, poiché intensità fino a 25 W/cm2 sono state utilizzate con successo in un modello murino senza effetti collaterali significativi11. È importante sottolineare che in letteratura non è stato pubblicato alcun set standardizzato o ottimizzato di parametri FUS. Pertanto, i valori specifici qui riportati possono essere regolati per determinare l'insieme ottimale di parametri, portando alla massima riduzione del tessuto tumorale mantenendo la sicurezza. Inoltre, poiché diverse linee cellulari hanno diversi livelli di vascolarizzazione e ipossia, potrebbe essere necessario modificare questo trattamento. Abbiamo mostrato una diminuzione complessiva della crescita tumorale (Figura 5) entro 24 ore dal trattamento con SDT, anche se i parametri devono essere ottimizzati e più animali devono essere testati per determinare l'effetto massimo di questo trattamento. Le scansioni MRI post-trattamento non mostrano la comparsa di lesioni create dal trattamento con FUS nel tessuto sano, con l'effetto localizzato al tessuto tumorale (Figura 6). C'è anche l'opportunità di combinare la SDT con altre tecniche FUS, come la permeabilizzazione transitoria della barriera emato-encefalica, per massimizzare l'assorbimento di 5-ALA nel tumore12. Questo protocollo può essere ulteriormente integrato eseguendo varie tecniche istologiche per verificarne la sicurezza e l'efficacia a livello strutturale. Una colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) può essere eseguita per verificare la presenza di danni strutturali o tumorali13, mentre una colorazione terminale con deossinucleotidil transferasi dUTP nick end labeling (TUNEL) può essere eseguita per verificare l'apoptosi cellulare14. Indipendentemente da ciò, questo protocollo presenta un trattamento sicuro e specifico per il tumore in cui i cambiamenti sono evidenti anche 24 ore dopo il trattamento, il che è evidente confrontando il tasso di crescita dei tumori trattati con SDT e dei tumori non trattati, nonché confrontando le fette tumorali prima e dopo la sonicazione.
Con qualsiasi protocollo, ci sono sempre svantaggi o limitazioni che devono essere soppesati. Il limite principale dell'attuale protocollo è il tempo e i costi. Nel frattempo, uno dei vantaggi di questo protocollo è la sua mira focalizzata automatizzata. Per realizzare questa procedura mirata, è necessario eseguire scansioni MRI per ogni singolo animale per garantire che il targeting del tumore sia corretto, un processo che può richiedere tempo e denaro. Inoltre, a seconda del numero di punti focali desiderati, la quantità di tempo per eseguire questo protocollo potrebbe essere di ore anche per pochi animali, con conseguente basso numero di animali sperimentali. Nonostante questi inconvenienti, questo protocollo mirato non invasivo rimane una preferenza fattibile rispetto alle opzioni di chirurgia aperta.
In conclusione, questo protocollo ha mostrato la capacità del trattamento SDT di ridurre la crescita del tumore nel cervello entro 24 ore dal trattamento, mantenendo il tessuto neurale sano in un modello murino preclinico. Gli studi sull'efficacia della SDT e l'ottimizzazione dei vari parametri per aumentare la produzione di ROS sono necessari per rendere questo trattamento clinicamente idoneo. Dovrebbero essere esplorate nuove strade per l'uso della SDT come modello terapeutico non invasivo.
Disclosures
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi. Amir Manbachi insegna e fa consulenza per BK Medical (GE Healthcare), Neurosonics Medical ed è inventore di una serie di tecnologie FUS in attesa di brevetto. Betty Tyler ha ricevuto finanziamenti per la ricerca dal NIH ed è co-proprietaria di Accelerating Combination Therapies*. Ashvattha Therapeutics Inc. ha anche concesso in licenza uno dei suoi brevetti ed è azionista di Peabody Pharmaceuticals (*include azioni o opzioni).
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il sostegno finanziario del National Science Foundation (NSF) STTR Phase 1 Award (#: 1938939), dell'ASME Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Award (#: N660012024075) e del Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research (ICTR's) Clinical Research Scholars Program (KL2), amministrato dal National Institutes of Health (NIH) National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS). Le cellule sono state acquistate e fornite dalla Mayo Foundation for Medical Education and Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| 1 mL Syringes | BD | 309597 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton Company | 49AL65 | |
| 10 µL Pipette tips | USAScientific | ||
| 1000 mL Flask | Corning | MP-34514-25 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | CLS430791 | |
| 200 Proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | Falcon | 357543 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 430290 | |
| 500 mL filter | Corning | 431097 | |
| 5-Aminolevulinic acid hydrochloride | Research Products International | A11250 | |
| 7T PET-MR system | Bruker | Biospec 70/30 | |
| Aluminum foil | Reynolds Brand | ||
| Amplifier | FUS Instruments | 2175 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 | |
| Bone drill | Foredom | HP4-917 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004261 | |
| Charcoal isoflourane waste container | Patterson scientific | 78909457 | |
| Computer | FUS Instruments | 2269 | |
| Cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
| Desktop monitor | ASUS | VZ239H | |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Electronic shaver | Wahl | 93235-002 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Formalin | Thermo Fisher Scientific | SF100-20 | |
| Function generator | Siglent | QS0201X-E01B | |
| Gadolinium contrast agent (Gadavist) | McKesson Corporation | 2068062 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| Heat lamp | |||
| Heat pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-12 | |
| Induction chamber | Patterson scientific | 78933388 | |
| Isofluorane vaporizer | Patterson scientific | 78916954 | |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Isoflurane system | Patterson Scientific | 78935903 | |
| IVIS spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| Lightfield microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Nair | Church and Dwight Co. | 42010553 | |
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| P-20 pippette | Rainin | 17008650 | |
| Patient derived xenographs | Mayo Clinic | M59 | |
| Penicillin/Streptomyosin | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70-011-069 | |
| Pippetter | Drummond | 4-000-101 | |
| Povidone-iodine | Covetrus | PI050CV | |
| RK-50 MRgFUS system | FUS Instruments | 2182 | |
| Scale | |||
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Screwdriver set | Jakemy | JM-8160 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Stereotactic MRI prototype plastic imaging fixture | FUS Instruments | ||
| T-25 culture flask | Corning | 430641U | |
| Transducer and matching box | FUS Instruments | T515H750-118 | |
| Ultrasonic degasser | FUS Instruments | 2259 | |
| Ultrasound gel | ParkerLabs | 01-08 | |
| Water bath | FUS Instruments | ||
| Xylazine | Covetrus | 1XYL006 |
References
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