Summary
Denne protokol beskriver en effektiv metode til optimering af forarbejdningsteknologien af Tiebangchui forarbejdet med højlandsbygvin baseret på en Box-Behnken-designresponsflade kombineret med entropimetoden.
Abstract
Behandlingen af toksiske etnolægemidler er af stor betydning for deres sikre kliniske anvendelse. Således bør begrænsningerne ved traditionel forarbejdning behandles, og behandlingsmetoden for etnomedicin bør standardiseres ved hjælp af moderne forskningsmetoder. I denne undersøgelse blev behandlingsteknologien for en almindeligt anvendt tibetansk medicin Tiebangchui (TBC), den tørrede rod af Aconitum pendul Busch, forarbejdet med højlandsbygvin optimeret. Diester-diterpenoid alkaloid (DDA) (aconitin, 3-deoxyaconitin, 3-acetylaconitin) og monoester-diterpenoid alkaloid (MDA) (benzoylaconin) indhold blev anvendt som evalueringsindikatorer, og vægtkoefficienten for hvert evalueringsindeks blev bestemt ved entropimetoden.
Enkeltfaktortesten og Box-Behnken-designet blev brugt til at undersøge indflydelsen af forholdet mellem højlandsbygvin og TBC, skivetykkelse af TBC og forarbejdningstid. Omfattende scoring blev udført i henhold til den objektive vægt af hvert indeks bestemt ved entropimetoden. De optimale forarbejdningsbetingelser for TBC med højlandsbygvin var som følger: mængden af højlandsbygvin er fem gange så stor som TBC, en blødgøringstid på 24 timer og en TBC-tykkelse på 1,5 cm. Resultaterne viste, at den relative standardafvigelse mellem verifikationstesten og den forudsagte værdi var mindre end 2,55%, og den optimerede forarbejdningsteknologi for TBC behandlet med højlandsbygvin er enkel, gennemførlig og stabil og kan derfor give en reference til industriel produktion.
Introduction
Tiebangchui (TBC), den tørrede rod af Aconitum pendul Busch, er en velkendt tibetansk medicin og blev oprindeligt optaget i den klassiske tibetanske medicinske bog "Four Medical Tantra"1,2. Ifølge "Drug Standards of the Ministry of Health of the People's Republic of China (Tibetan Medicine)", TBC er effektiv til at udvise kulde, lindre smerter, fjerne vind, og beroligende chok, og er almindeligt anvendt til behandling af leddegigt i klinikker 3,4,5.
TBC indeholder hovedsageligt alkaloider, herunder meget toksiske diester-diterpenoidalkaloider (DDA'er) og de moderat toksiske monoester-diterpenoidalkaloider (MDA'er)6,7,8. Disse kemiske komponenter er aktive ingredienser med medicinske virkninger, men er giftige. En af de mest berømte aktive og giftige ingredienser, aconitin, forårsager forgiftning, når den overstiger 1 mg9. Derfor kan forkert eller overdreven brug af TBC resultere i forgiftning og endda død, og toksicitetsdæmpning og effektivitetsreservation af TBC er afgørende for dens sikre kliniske anvendelse10,11.
Behandling er en effektiv metode til afgiftning af TBC. Ifølge gamle tibetanske medicinbøger er forarbejdning med højlandsbygvin en effektiv måde at dæmpe toksicitet og bevare effektiviteten af TBC. TBC gennemblødes i højlandsbygvin, opbevares i en nat, tørres og tilsættes medicin12. Imidlertid rapporteres den specifikke behandlingsteknologi og potentielle påvirkningsfaktorer sjældent, og den traditionelle forarbejdningsproces er ofte afhængig af erfaring og mangler standardiserede metoder. Derfor er der behov for moderne videnskabelige og teknologiske metoder til optimering og standardisering af behandlingsprocessen.
Box-Behnken-designmetoden bruges til at undersøge interaktioner mellem forskellige faktorer og deres indflydelse på omfattende scoring gennem kvadratisk polynomisk tilpasning. Dette design tillader intuitiv observation af optimale forhold og har været meget udbredt inden for apotek13. For eksempel optimerede Box-Behnken-designmetoden, baseret på entropimetoden, med succes behandlingsteknologien til omrøring med eddike af Curcuma Longa Radix14. I denne undersøgelse blev Box-Behnken-responsoverfladens eksperimentelle design kombineret med entropimetoden anvendt til optimering af behandlingsteknologien for TBC behandlet med højlandsbygvin. Den optimerede behandlingsteknologi forventes at sikre kvalitetskontrol og sikker klinisk brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denne undersøgelse blev forarbejdningsteknologien for TBC behandlet med højlandsbygvin optimeret med et Box-Behnken-design kombineret med entropimetoden. DDA- og MDA-indhold blev anvendt som evalueringsindikatorer, og vægtkoefficienten for hvert evalueringsindeks blev bestemt ved entropimetoden.
1. Eksperimentel forberedelse
- Forbered højlandsbygvin15.
- Tag 500,00 g sort højlandsbygris og tilsæt fem gange mængden af vand. Kog risene, indtil det resterende vand er absorberet (~ 2 timer). Hæld det ud, vent til temperaturen falder til 37 ° C, tilsæt 4 g Jiuqu (se materialetabellen), bland godt, forsegl dåsen, pakk beholderen med bomuldsuld og lad den gryde i 7 dage.
- Tilsæt 300 ml vand på den 7. dag og forsegl igen. På den 8. dag skal du begynde at fjerne vinen og erstatte med 300 ml vand bagefter. Forsegl og gær i 1 dag, tag vinen, og tilsæt 300 ml vand igen. Gentag denne procedure tre gange og kombiner væskerne.
- Kog op, reducer derefter varmen til en simmer, og fortsæt med at lave mad, indtil det resterende vand er absorberet.
- For at forberede forarbejdede produkter skal du veje TBC nøjagtigt i en beholder, tilsæt højlandsbygvin og blød i 1 dag. Tør derefter i en elektrisk tørreovn med konstant temperatur.
BEMÆRK: Tørretemperaturen bør være mindre end 40 °C for at undgå ændringer i alkaloidsammensætningen. - Forbered testprøveopløsning.
- Balancer nøjagtigt TBC-forarbejdet produktpulver (2 g) i en konisk kolbe, tilsæt 40% ammoniakopløsning, og udfør ultralydassisteret ekstraktion med isopropanolethylacetat (1: 1) blandede opløsningsmidler (50 ml) (effekt: 200 W; frekvens: 40 kHz; temperatur: 40 ° C) i 30 minutter.
BEMÆRK: For at fremstille 40% ammoniakopløsning overføres 40 ml ammoniak til en 100 ml målekolbe og fortyndes derefter med rent vand. - Den ekstraherede opløsning justeres til den oprindelige vægt ved tilsætning af en isopropanol-ethylacetatblanding (1:1 v/v).
- Den ekstraherede opløsning (25 ml) overføres nøjagtigt til en rundbundet kolbe til genvinding af opløsningsmidlet under reduceret tryk, indtil det er tørt.
- Endelig overføres 0,05% saltsyre-methanolopløsning for at opløse resten fra trin 1.3.3 i en 5 ml målekolbe og fortyndes med 0,05% methanolhydrochloridopløsning. Opløsningen filtreres gennem et 0,22 μm mikroporøst membranfilter før injektion i HPLC-systemerne (High Performance Liquid Chromatography).
BEMÆRK: Forbered 0,05% methanolhydrochloridsyre ved at tilsætte 0,05 ml saltsyre til en 100 ml målekolbe, fortynd derefter med methanol.
- Balancer nøjagtigt TBC-forarbejdet produktpulver (2 g) i en konisk kolbe, tilsæt 40% ammoniakopløsning, og udfør ultralydassisteret ekstraktion med isopropanolethylacetat (1: 1) blandede opløsningsmidler (50 ml) (effekt: 200 W; frekvens: 40 kHz; temperatur: 40 ° C) i 30 minutter.
- Forbered en standardopløsning ved at veje 5,18 mg benzoylaconin, 13,13 mg aconitin, 10,05 mg 3-deoxyaconitin og 10,09 mg 3-acetylaconitin nøjagtigt, og anbring derefter de faste stoffer i en 5 ml volumetrisk kolbe individuelt. Fortynd med 0,05% methanolhydrochloridopløsning.
2. Kromatografisk tilstand
- Indstil de kromatografiske betingelser som vist i tabel 1 for HPLC. Nærmere oplysninger om de anvendte instrumenter findes i materialefortegnelsen.
3. Test af systemets tilpasningsevne
- Rækkevidde af linearitet
BEMÆRK: Først brugte vi HPLC til at bestemme toparealerne af benzoylaconitin, aconitin, 3-deoxyaconitin og 3-acetylaconitin i prøven og bestemte derefter tilfældigt toparealet af en kendt koncentration af standardopløsning. Dernæst sammenlignede vi forskellen mellem to topområder (prøveopløsning og standardopløsning) for at estimere koncentrationen af benzoylaconitin, aconitin, 3-deoxyaconitin og 3-acetylaconitin i forskellige prøver og justerede derefter standardopløsningen i et lineært område for at inkludere koncentrationen af prøven i kurven. Standardkurvekoncentrationerne er vist i tabel 2.- Forbered benzoylaconitin referenceopløsninger indeholdende 1,036 mg / ml, 0,518 mg / ml, 0,2072 mg / ml, 0,1036 mg / ml og 0,0518 mg / ml.
- Forbered aconitinreferenceopløsninger indeholdende 1,313 mg/ml, 0,5252 mg/ml, 0,2626 mg/ml, 0,1313 mg/ml og 0,05252 mg/ml.
- Forbered 3-deoxyaconitin referenceopløsninger indeholdende 1,005 mg / ml, 0,5025 mg / ml, 0,201 mg / ml, 0,1005 mg / ml og 0,402 mg / ml.
- Forbered 3-acetylaconitin referenceopløsninger indeholdende 0,2018 mg / ml, 0,1009 mg / ml, 0,04036 mg / ml, 0,02018 mg / ml og 0,01009 mg / ml.
- Undersøg lineariteten af hver forbindelse ved at plotte toparealet versus injektionskoncentrationen.
- For at udføre præcisionstesten injiceres 10 μL af hver referenceopløsning i HPLC-systemet seks gange dagligt, og der anvendes de samme HPLC-betingelser som beskrevet i trin 2.1 til at køre prøverne Registrer toparealet for hver komponent.
- Der udføres intradagstabilitetstest ved injektion af 10 μL af den tilberedte prøveopløsning via trin 1.3, og toparealerne bestemmes efter 0 timer, 2 timer, 4 timer, 8 timer, 14 timer, 12 timer og 24 timer16.
- Der udføres en reproducerbarhedstest ved at udtage seks prøver af samme batch TBC til fremstilling af analyseprøveopløsningen i henhold til trin 1.3. Der injiceres 10 μL af hver prøve i HPLC-systemet, og prøverne køres som beskrevet i trin 2.1.
- Udfør genoprettelsestesten for at evaluere metodens nøjagtighed. Der tilsættes 100 % af standardopløsningen af hver indekskomponent (benzoylaconitin, aconitin, 3-deoxyaconitin og 3-acetylaconicin) i testopløsningen for at beregne genfindingshastigheden. Da indholdet af benzoylaconitin f.eks. er 0,1524 mg/ml i TBC-prøven, skal du nøjagtigt afveje 0,1524 mg benzoylaconitinstandarder og tilføje til TBC-prøven og derefter forberede analyseprøveopløsningen i henhold til trin 1.3. Disse prøver køres med de samme HPLC-betingelser, som er beskrevet i trin 2.1. Beregn genvindingsgraden ved hjælp af ligning (1):
(1)
Her er A mængden af komponent (benzoylaconitin, aconitin, 3-deoxyaconitin eller 3-acetylaconitin), der skal måles i prøveopløsningen, B er mængden af tilsat standard (benzoylaconitin, aconitin, 3-deoxyaconitin eller 3-acetylaconitin), og C er den målte værdi af opløsningen indeholdende standardopløsningen og prøveopløsningen (se tabel 3). Se trin 2.1 for de kromatografiske betingelser for at udføre ovenstående trin. Genfindingshastigheden afspejler graden af tab af målkomponenten (benzoylaconitin, aconitin, 3-deoxyaconitin eller 3-acetylaconicin) under prøveanalysen; Jo højere inddrivelsesgraden er, desto lavere er tabet af målkomponenten.
(1)4. Enkeltfaktortest af TBC forarbejdet med højlandsving
BEMÆRK: Forholdet mellem højlandsbygvin og TBC, skivetykkelse af TBC og iblødsætningstid vil påvirke opløsningen af mere giftige komponenter (aconitin, 3-deoxyaconitin og 3-acetylaconitin) i TBC under TBC behandlet med højlandsbygvin17. Enkeltfaktortesten og Box-Behnken-designet blev brugt til at undersøge indflydelsen af forholdet mellem højlandsbygvin og TBC, skivetykkelse af TBC og iblødsætningstid.
- Udfør tilsætningstesten for højlandsbygvin (A) ved at oprette fem grupper af test, hver med 30 g TBC, hvor mængden af højlandsbygvin er to, tre, fire, fem og seks gange mængden af TBC i opskriften. Opblødningstiden er 12 timer, og skiverne er 1,0 cm tykke18.
BEMÆRK: Hver gruppe af samme tilstandstest skal behandles i tre parallelle grupper. - Udfør iblødsætningstidstesten (B) ved at oprette fem grupper af test, hver med 30 g TBC. Iblødsætningstiderne er 12 timer, 24 timer, 36 timer og 48 timer. Mængden af højlandsbygvin er fem gange så stor som TBC, og skiverne er 1,0 cm tykke19.
BEMÆRK: Hver gruppe af samme tilstandseksperiment skal behandles i tre parallelle grupper. - Udfør udskæringstykkelsestesten (C) ved at oprette fem grupper af test, hver med 30 g TBC. Skiverne er 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 og 2,5 cm tykke, blødgøringstiden er 24 timer, og mængden af højlandsbygvin er fem gange så stor som TBC20.
BEMÆRK: Hver gruppe af samme tilstandseksperiment skal behandles i tre parallelle grupper. - De forarbejdede produkter vejes nøjagtigt for hver testgruppe for at forberede analyseprøveopløsningen i henhold til trin 1.3. Bestem toparealet for hver prøve ved HPLC, og brug standardkurven til at estimere mængderne af MDA'er og DDA'er. I standardkurven er y toparealet og x er indholdet. Indholdet af MDA'er er benzoylaconitin, og indholdet af DDA'er er summen af aconitin, 3-deoxyaconitin og 3-acetylaconitin.
- Brug det samlede indhold af DDA'er og indholdet af MDA'er som evalueringsindikatorer, og bestem vægtkoefficienten for hvert evalueringsindeks og den omfattende scoring via entropimetoden (afsnit 5).
FORSIGTIG: TBC er giftigt, og derfor skal der træffes beskyttelsesforanstaltninger under behandlingen.
5. Entropimetode til beregning af den omfattende scoring
BEMÆRK: Vi bruger de eksperimentelle data fra udskæringstykkelsestesten i enkeltfaktortesten som et eksempel til at illustrere beregningsprocessen i detaljer. Vi anvender toparealet af komponenterne i hver stikprøve i tillægstabel S1 og standardkurven i tabel 2 til at beregne indholdet af MDA'er og DDA'er (se supplerende tabel S2). I den lineære ligning er y toparealet og x er indholdet. I denne undersøgelse blev den moderat toksiske MDA (benzoylaconitin) anvendt som den positive indikator, og det samlede indhold af DDA'er (aconitin, 3-deoxyaconitin og 3-acetylaconitin) med høj toksicitet blev anvendt som den negative indikator. Indholdet af MDA'er er benzoylaconitin, og indholdet af DDA'er er summen af aconitin, 3-deoxyaconitin og 3-acetylaconitin. Hver stikprøve har to evalueringsindikatorer: i = 1,2,...,n og j = 1,2,... m21.
- Brug ligning (2) til at standardisere indholdet af MDA22.
(2)
Således
BEMÆRK: Xij er værdien af j-th-indikatoren for den i'te prøve. Xij* er den standardiserede værdi af Xij. For eksempel repræsenterer i = 3 og j = 1, X31 værdien af den første indikator i den tredje stikprøve og
er den standardiserede værdi af den første indikator i den tredje stikprøve. er vist i supplerende tabel S3. 
- Brug ligning (3) til at standardisere det samlede indhold af DDA'erne23.
(3)
BEMÆRK: Her repræsenterer i = 3, j = 2, den anden indikator for den tredje prøve.
er den standardiserede værdi af den anden indikator i den tredje stikprøve. 
er vist i supplerende tabel S3. - Brug ligningerne (4) og (5) til at definere entropiværdien (Hj) for hver indikator23.
- Sandsynligheden for det j'te forsøg beregnes under den i'te evalueringsindikator Pij ved hjælp af ligning (4).
(4)
For nummer 3,
BEMÆRK: Sandsynlighedsværdierne for den første indikator og den anden indikator for den tredje stikprøve er henholdsvis 0,2374 og 0,2812.
er vist i supplerende tabel S3. - Beregn informationen entropi Hj.
(5)
BEMÆRK: H 1 er entropien af den første indikator (MDA'er) og H2 er entropien af den anden indikator (DDA'er) i udskæringstykkelsestesten.
- Sandsynligheden for det j'te forsøg beregnes under den i'te evalueringsindikator Pij ved hjælp af ligning (4).
- Brug ligning (6) til at beregne indikatorvægtene (Wj)23.
(6)
= 33,3%
= 66,7%
BEMÆRK: Wjer vægtkoefficienten for hver indikator. I skæretykkelsestesten er vægtkoefficienten for den positive indikator (MDA'er) og den negative indikator (DDA'er) henholdsvis 33,3% og 66,7%. - Brug ligning (7) til at beregne den omfattende scoring af indikatorerne23.
(7)
For nummer 3,
BEMÆRK: Si er den omfattende scoring af hver stikprøve. Vi skal opnå den højeste score som det centrale punkt i Box-Behnken-designet. S 1, S 2, S 3, S 4 og S5 er vist i supplerende tabel S3.
(2)
er den standardiserede værdi af den første indikator i den tredje stikprøve. er vist i supplerende tabel S3. 
(3)
er den standardiserede værdi af den anden indikator i den tredje stikprøve. 
er vist i supplerende tabel S3.
(4)
er vist i supplerende tabel S3.
(5)
(6)
= 33,3%
= 66,7%
(7)
6. Box-Behnken design
- Gennem enkeltfaktortesten skal du bruge tilstanden med den højeste omfattende score (se tabel 4, tabel 5, tabel 6 og figur 2) som midtpunktet for responsoverfladen. Brug mængden af højlandsbygvin (A), iblødsætningstid (B) og skivetykkelse af TBC (C) som påvirkende faktorer og den omfattende scoring som responsværdi24.
BEMÆRK: Baseret på enkeltfaktordataene i tabel 4, tabel 5 og tabel 6 beregnes den højeste omfattende score ved ligningerne (2), (3), (4), (5), (6) og (7) i afsnit 5, og det bedste punkt opnås. Mængden af højlandsbygvin var fem gange så stor som TBC, blødgøringstiden var 36 timer, og skæretykkelsen var 1,0 cm.
7. Trin til betjening af Box-Behnken-designsoftware
- Åbn softwaren (se materialetabellen), og vælg Nyt design | Box-Behnken Design (se trin 5.1; Supplerende fil 1).
- Indtast antallet af påvirkningsfaktorer, og indtast niveauoplysningerne (tre-niveau-tre-faktor; se tabel 7). Box-Behnken-designet består af 17 eksperimenter i denne undersøgelse. Klik til sidst på Fortsæt (se trin 5.2; Supplerende fil 1).
- Indstil den omfattende scoring (Y) ved ligningerne (2), (3), (4), (5), (6) og (7) i afsnit 5 som svar. Indtast antallet af svarværdier (billedet viser kun én svarværdi), og klik på Udfør (se trin 5.3; Supplerende fil 1).
- Behandl TBC med højlandsbygvin i henhold til designresultaterne, og gennemfør eksperimentet baseret på de 17 scenarier, der er designet til responsoverfladen.
- Prøveopløsningerne fremstilles ved at følge trin 1.3, og HPLC-systemets samlede indhold af MDA'er og DDA'er beregnes.
- Beregn den omfattende scoring for hver gruppe ved ligningerne (2), (3), (4), (5), (6) og (7) i trin 5, og indtast scoreresultaterne (se trin 5.4; Supplerende fil 1).
- Klik på Analysér for at analysere dato- og modeloplysningerne (se trin 5.4.1; Supplerende fil 1).
- Udfør statistisk validering af polynomiske ligninger og responsoverfladeanalyse plottet i 3D-modelplots opnået af softwaren.
- Klik på ANOVA i topmenuen og observer resultattabellen.
- Klik på Optimering for at få vist de forventede optimale procesbetingelser (se trin 5.4.2; Supplerende fil 1).
8. Valideringstest
- Ifølge resultaterne forudsagt fra Box-Behnken-responsoverfladedesignet skal du i trin 7.3 identificere den optimale behandlingstilstand for TBC. Her er det som følger: TBC gennemblødes i 24 timer i fem gange mængden af højlandsbygvin, og tykkelsen af TBC er 1,5 cm. Tag det optimale niveau af påvirkningsfaktorer som behandlingsbetingelser og opsæt tre parallelle sæt eksperimenter for at verificere behandlingsteknologiens stabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse indikerede præcisionen, stabiliteten, repeterbarheden og prøvegendannelsen af TBC, at metoden er mulig. De fire indekskomponenter i TBC havde et godt lineært forhold inden for et specifikt koncentrationsområde. Typiske kromatogrammer er vist i figur 1. Præcisionstestresultaterne (tabel 8) viste, at den relative standardafvigelse (RSD) for topområderne var 2,56%, 1,49% og 2,03% for henholdsvis benzoylaconin, aconitin og 3-deoxyaconitin og 0,21% for 3-acetylaconitin, hvilket indikerer, at instrumentets præcision var god. Undersøgelsen af stabilitet udført i 24 timer (n = 6) indikerede relative standardafvigelsesværdier på 2,76%, 2,21%, 2,98% og 2,31% for henholdsvis benzoylaconin, aconitin, 3-deoxyaconitin og 3-acetylaconitin (tabel 9), hvilket tyder på, at prøveopløsningen var stabil i 24 timer. Repeterbarhedstestresultaterne (tabel 10) viste, at RSD'erne for topområderne benzoylaconin, aconitin, 3-deoxyaconitin og 3-deoxyaconitin var henholdsvis 2,80%, 2,92%, 2,92% og 2,07%, hvilket viste, at repeterbarheden af denne metode var god. Resultaterne af genoprettelseseksperimentet viste, at de gennemsnitlige genoprettelseshastigheder for benzoylaconin, aconitin, 3-deoxyaconitin og 3-deoxyaconitin var henholdsvis 99,7%, 100,84%, 103,27% og 100,92%.
Enkeltfaktortesten af TBC forarbejdet med højlandsbygvin afslørede, at mængden af højlandsbygvin var fem gange så stor som TBC, iblødsætningstiden var 36 timer, og udskæringstykkelsen var 1,0 cm (figur 2). Det eksperimentelle design og resultaterne af responsoverflademodellen er vist i tabel 11. Resultaterne af den eksperimentelle ANOVA er vist i tabel 12. Faktorerne tilpasses ved regression for at opnå en kvadratisk multinomial regressionsligning (8). A: Tilsætning af højlandbygvin B: blødgøringstid; C: udskæring tykkelse. Resultaterne viste, at modellen var godt tilpasset og var i stand til at forudsige forholdet mellem den omfattende scoring af tilsætning af højlandsbygvin, iblødsætningstid og skivetykkelse. Rækkefølgen af faktorerne efter styrken af virkningerne var højlandsbygvin, tilsætning > skivetykkelse af medicinske urter > blødgøringstid.
(8)
Ifølge ligning (8) bruges Design-Expert 8.0.6-analysesoftware til at plotte en 3D-kurve via trin 7.2.1 (figur 3). En stejlere hældning af responsoverfladen indikerer en stærkere vandret interaktion mellem faktorer, og en blidere hældning er det modsatte. P-værdien (p < 0,0001) for modellen i tabel 12 viser, at modellen er signifikant med en R2 på 0,9754 og en ikke-signifikant uegnet term (p = 0,7253), hvilket indikerer, at modellen passer godt og bedre afspejler forholdet mellem tilsætningen af højbygvin, iblødsætningstid, skivetykkelse af lægeurter, og samlet score.
Ifølge den objektive vægt af hvert indeks bestemt ved den analytiske entropimetode blev omfattende scoring udført, og den optimale behandlingstilstand for TBC blev bestemt som følger: TBC gennemblødes i 24 timer i fem gange mængden af højlandsbygvin, og tykkelsen af TBC er 1,5 cm. Valideringstestresultaterne viste, at de samlede DDA'er var henholdsvis 0,6963, 0,6793 og 0,7023 mg / g, og MDA-indholdet i tre sæt parallelle tests var 0,2096, 0,2237 og 0,2109 mg / g. Den gennemsnitlige omfattende scoring var 83. RSD mellem verifikationstesten og den forudsagte værdi var mindre end 1,8%, hvilket indikerer, at den optimerede forarbejdningsteknologi for TBC behandlet med højlandbygvin er enkel, gennemførlig og stabil og giver en reference for industriel produktion.
Figur 1: Repræsentative kromatogrammer for de fire karakteristiske komponenter efter indstilling af de kromatografiske betingelser, der er nævnt i trin 2.1 (n = 1). A) Typiske kromatogrammer for referenceopløsningen. Peak 1 er benzoylaconin, peak 2 er aconitin, peak 3 er 3-deoxyaconitine, og peak 4 er 3-acetylaconitin. B) Typiske kromatogrammer for prøveopløsningen. Peak 1 er benzoylaconin, peak 2 er aconitin, peak 3 er 3-deoxyaconitine, og peak 4 er 3-acetylaconitin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Den samlede score for enkeltfaktortesten af TBC forarbejdet med højlandsbygvin (n = 3). A) Mængde højlandsbygvin (gange) B) iblødsætningstid (h) (C) Skivetykkelse (cm). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: 3D-responsoverfladekort over effekten af interaktion mellem forskellige faktorer på omfattende scoring. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Betingelse | Parameter |
| Kromatografisk søjle | Ultimate ODS-3 C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) |
| Mobil fase | Acetonitril (A) - 0,04 mol/l ammoniumacetatopløsning (B) pH= 8,5 ± 0,5 |
| Eluering af forløb | 0-10 min, 0% -70% A; 10-15 min, 70-50% A; 15-30 min, 50-40% A; 30-38min, 40-15% A; 38-45 min, 15-15% A; 45-55 min, 15-70% A |
| Strømningshastighed | 1 ml/min |
| Kolonne temperatur | 30 °C |
| Registrering af bølgelængde | 235 nm |
| Prøvevolumen | 10 μL |
Tabel 1: De kromatografiske betingelser, der er fastsat i dette eksperiment. Oplysninger om den kromatografiske kolonne, den mobile fase, gradientelueringen, strømningshastigheden, kolonnetemperaturen, detektionsbølgelængden og prøvevolumenet.
| Indeks komponenter | Lineær ligning | Linearitetsområde (mg/ml) | R2 |
| Benzoylaconin | y=11.658.706,1677x +19.717,0872 | 1.036-0.0518 | 0.9995 |
| Aconitin | y=11.199.784,3030x -67.641,2429 | 1.313-0.05252 | 0.9999 |
| 3-Deoxyaconitin | y=11.214.550,3140x +59.795,9119 | 1.005-0.0402 | 0.9999 |
| 3-acetylaconitin | y=9.887.511,9074x +26.713,6359 | 0.2018-0.01009 | 0.9994 |
Tabel 2: Det lineære forhold mellem indekskomponenterne i TBC. De fire indekskomponenter i TBC havde et godt lineært forhold i et specifikt koncentrationsområde.
| Indeks komponenter | Kendt indhold (mg) | Tilføjelse af mængde (mg) | Målemængde (mg) | Inddrivelser (%) | Gennemsnitlige inddrivelser (%) | RSD (%) |
| Benzoylaconin | 0.1558 | 0.1295 | 0.2901 | 96.4 | 99.7 | 3.14 |
| 0.1574 | 0.1295 | 0.2849 | 98.46 | |||
| 0.156 | 0.1295 | 0.2871 | 101.24 | |||
| 0.1574 | 0.1295 | 0.2923 | 104.95 | |||
| 0.1449 | 0.1295 | 0.2736 | 99.38 | |||
| 0.1566 | 0.1295 | 0.2839 | 98.3 | |||
| Aconitin | 0.3099 | 0.3283 | 0.645 | 102.07 | 100.84 | 2.02 |
| 0.3153 | 0.3283 | 0.6371 | 98.02 | |||
| 0.2928 | 0.3283 | 0.6314 | 103.14 | |||
| 0.2969 | 0.3283 | 0.6325 | 102.23 | |||
| 0.3035 | 0.3283 | 0.6343 | 100.76 | |||
| 0.3094 | 0.3283 | 0.6339 | 98.84 | |||
| 3-Deoxyaconitin | 0.1789 | 0.201 | 0.3788 | 99.45 | 103.27 | 2.65 |
| 0.1793 | 0.201 | 0.3845 | 102.09 | |||
| 0.1741 | 0.201 | 0.3774 | 101.14 | |||
| 0.1635 | 0.201 | 0.3753 | 105.37 | |||
| 0.1708 | 0.201 | 0.383 | 105.57 | |||
| 0.1653 | 0.201 | 0.3783 | 105.97 | |||
| 3-acetylaconitin | 0.0169 | 0.02 | 0.0374 | 102.5 | 100.92 | 1.15 |
| 0.0168 | 0.02 | 0.037 | 101 | |||
| 0.0166 | 0.02 | 0.0366 | 100 | |||
| 0.0161 | 0.02 | 0.0365 | 102 | |||
| 0.017 | 0.02 | 0.0369 | 99.5 | |||
| 0.0171 | 0.02 | 0.0372 | 100.5 |
Tabel 3: Resultaterne af målingen af prøvegenvindingsgraden. RSD for genvindingshastigheden af benzoylaconin, aconitin, 3-deoxyaconitin og 3-acetylaconitin var henholdsvis 3,14%, 2,02%, 2,65% og 1,15%.
| Tal | Test af tilsætning af højlandsbygvin (tidspunkter) | Indhold af MDA'er (mg/g) | Indhold af Doha-udviklingsdagsordenen (mg/g) | Omfattende scoring/point |
| 1 | 2 | 0.1875 | 0.8254 | 58.98421777 |
| 2 | 3 | 0.1099 | 0.9847 | 0.056898711 |
| 3 | 4 | 0.2296 | 0.8487 | 71.12048666 |
| 4 | 5 | 0.2161 | 0.6894 | 94.6966946 |
| 5 | 6 | 0.2006 | 0.7472 | 78.22537224 |
Tabel 4: Resultaterne af enkeltfaktortesten af forholdet mellem højlandsbygvin og TBC.
| Tal | Test af iblødsætningstid (h) | Indhold af MDA'er (mg/g) | Indhold af Doha-udviklingsdagsordenen (mg/g) | Omfattende scoring/point |
| 1 | 6 | 0.236292609 | 1.047811476 | 59.67501032 |
| 2 | 12 | 0.193880685 | 1.164420534 | 23.10718817 |
| 3 | 24 | 0.229606225 | 0.848736346 | 53.86313899 |
| 4 | 36 | 0.151447388 | 0.701045217 | 79.15664943 |
| 5 | 48 | 0.193311963 | 0.767427412 | 68.88872066 |
Tabel 5: Resultaterne af enkeltfaktortesten af iblødsætningstiden.
| Tal | Test af skæretykkelse (cm) | Indhold af MDA'er (mg/g) | Indhold af Doha-udviklingsdagsordenen (mg/g) | Omfattende scoring/point |
| 1 | 0.5 | 0.1043 | 0.6190 | 66.96 |
| 2 | 1 | 0.1709 | 0.6992 | 75.05 |
| 3 | 1.5 | 0.1507 | 0.6954 | 66.23 |
| 4 | 2 | 0.1459 | 0.8347 | 20.66 |
| 5 | 2.5 | 0.1451 | 0.8298 | 21.79 |
Tabel 6: Resultaterne af enkeltfaktortesten af skivetykkelsen af TBC.
| Niveau | Faktor | ||
| A (mængde højlandsbygvin, gange) | B (iblødsætningstid, h) | C (skivetykkelse, cm) | |
| 1.0000 | 4.0000 | 24.0000 | 0.5000 |
| 2.0000 | 5.0000 | 36.0000 | 1.0000 |
| 3.0000 | 6.0000 | 48.0000 | 1.5000 |
Tabel 7: Box-Behnken design respons overflade niveau faktor tabel.
| Topareal i indekskomponenter | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD (%) |
| Benzoylaconin | 1281252 | 1290912 | 1198912 | 1256056 | 1256704 | 1266738 | 2.56% |
| Aconitin | 2861208 | 2881686 | 2785022 | 2790990 | 2859024 | 2799395 | 1.50% |
| 3-Deoxyaconitin | 2356317 | 2328383 | 2429059 | 2350987 | 2406114 | 2450374 | 2.04% |
| 3-acetylaconitin | 2008110 | 2021560 | 2014519 | 2015881 | 2015209 | 2012529 | 0.22% |
Tabel 8: Resultaterne af præcisionsmålingen. RSD for topområderne benzoylaconin, aconitin, 3-deoxyaconitin og 3-acetylaconitin var henholdsvis 2,56%, 1,49%, 2,03% og 0,22% (n = 6).
| Topareal i indekskomponenter | 0 | 2 | 4 | 8 | 12 | 24 | RSD (%) |
| Benzoylaconin | 191657 | 189590 | 193934 | 205135 | 196159 | 195954 | 2.76 |
| Aconitin | 312259 | 310240 | 294331 | 309104 | 312199 | 305360 | 2.22 |
| 3-Deoxyaconitin | 230174 | 246787 | 239760 | 249302 | 248806 | 243396 | 2.98 |
| 3-acetylaconitin | 17086 | 16953 | 16826 | 16914 | 16979 | 17896 | 2.31 |
Tabel 9: Resultaterne af stabilitetstesten. RSD for topområderne benzoylaconin, aconitin, 3-deoxyaconitin og 3-acetylaconitin var henholdsvis 2,76%, 2,21%, 2,98% og 2,31% (n = 6).
| Spidsareal for indekskomponenter | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD (%) |
| Benzoylaconin | 191067 | 192795 | 191058 | 192907 | 179103 | 192008 | 2.79 |
| Aconitin | 308142 | 313754 | 290487 | 294740 | 301515 | 307654 | 2.92 |
| 3-Deoxyaconitin | 249021 | 249456 | 243963 | 232781 | 240524 | 234661 | 2.92 |
| 3-acetylaconitin | 17465 | 17451 | 17247 | 16691 | 17608 | 17686 | 2.07 |
Tabel 10: Resultaterne af reproducerbarhedstesten. RSD for topområderne benzoylaconin, aconitin, 3-deoxyaconitin og 3-acetylaconitin var henholdsvis 2,79%, 2,92%, 2,92% og 2,07% (n = 6).
| Tal | A (tilsætning af højlandsbygvin, gange) | B (Iblødsætningstid, h) | C (Snittykkelse, cm) | Indhold af MDA'er (mg/g) | Indhold af Doha-udviklingsdagsordenen (mg/g) | Omfattende scoring/point |
| 1 | 4 | 36 | 0.5 | 0.1032 | 0.6882 | 28.2 |
| 2 | 5 | 48 | 1.5 | 0.1688 | 0.6588 | 56.49 |
| 3 | 6 | 24 | 1 | 0.1236 | 0.6535 | 33.02 |
| 4 | 5 | 24 | 1.5 | 0.2201 | 0.692 | 87.23 |
| 5 | 5 | 36 | 1 | 0.2094 | 0.6199 | 70.71 |
| 6 | 5 | 24 | 0.5 | 0.1809 | 0.5689 | 48.56 |
| 7 | 4 | 24 | 1 | 0.2016 | 0.7744 | 90.74 |
| 8 | 5 | 36 | 1 | 0.2169 | 0.6889 | 85.15 |
| 9 | 5 | 36 | 1 | 0.2103 | 0.6802 | 80.5 |
| 10 | 6 | 36 | 0.5 | 0.1036 | 0.5072 | 0.36 |
| 11 | 6 | 36 | 1.5 | 0.1089 | 0.5062 | 2.86 |
| 12 | 4 | 48 | 1 | 0.1789 | 0.6789 | 64.6 |
| 13 | 6 | 48 | 1 | 0.1036 | 0.5536 | 7.55 |
| 14 | 5 | 36 | 1 | 0.2062 | 0.6084 | 67.33 |
| 15 | 4 | 36 | 1.5 | 0.1832 | 0.6954 | 69.31 |
| 16 | 5 | 48 | 0.5 | 0.1759 | 0.5569 | 44.21 |
| 17 | 5 | 36 | 1 | 0.2161 | 0.6894 | 84.82 |
Tabel 11: Design og resultater af responsoverfladekonstruktionsprøvningen.
| Kilde | Summen af kvadrater | Df | Gennemsnitlig firkant | F -Værdi | P-værdi |
| Model | 14403.27 | 9 | 1600.36 | 30.8 | <0.0001 |
| En | 5463.26 | 1 | 5463.26 | 105.15 | <0.0001 |
| B | 939.61 | 1 | 939.61 | 18.08 | 0.0038 |
| C | 1117.7 | 1 | 1117.7 | 21.51 | 0.0024 |
| AB | 0.11 | 1 | 0.11 | 0.00216 | 0.9642 |
| AC | 372.68 | 1 | 372.68 | 7.17 | 0.0316 |
| F.KR | 174.11 | 1 | 174.11 | 3.35 | 0.1099 |
| A2 | 4133.52 | 1 | 4133.52 | 79.55 | <0.0001 |
| B2 | 28.63 | 1 | 28.63 | 0.55 | 0.482 |
| C2 | 1890.1 | 1 | 1890.1 | 36.38 | 0.0005 |
| Resterende | 363.71 | 7 | 51.96 | ||
| Manglende pasform | 93.28 | 3 | 31.09 | 0.46 | 0.7253 |
| Ren fejl | 270.43 | 4 | 67.61 | ||
| Kor i alt | 14766.99 | 16 |
Tabel 12: ANOVA for regressionsmodellen.
Supplerende fil 1: En detaljeret vejledning i Box-Behnken-designsoftwaren. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel S1: Stikprøvens topareal for udskæringstykkelsesprøven ved HPLC. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel S2: Indhold af MDA'er (benzoylaconin) og DDA'er (aconitin, 3-deoxyaconitin og 3-acetylaconitin) i skæretykkelsestesten. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel S3: Samlet bedømmelse af prøven af udskæringstykkelse. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som et almindeligt anvendt tibetansk lægemiddel med toksiske virkninger er den toksicitetsdæmpende virkning af behandlingen ekstremt vigtig for TBC's kliniske anvendelse25. I denne undersøgelse blev forarbejdningsteknologien for TBC behandlet med højlandsbygvin optimeret. Ved at gennemgå de vigtigste aktive ingredienser og relatere de farmakologiske virkninger af TBC fandt vi, at TBC-alkaloider har antiinflammatoriske og smertestillende virkninger og kan bruges til behandling af reumatoid arthritis. I denne undersøgelse blev en moderat toksisk MDA anvendt som den positive indikator. Det samlede indhold af Dohaudviklingsdagsordenen blev anvendt som negativ indikator. Entropimetoden blev anvendt til beregning af indeksvægtene og optimering af behandlingsteknologien26.
Under eksperimentet skal to punkter især bemærkes. For det første kræves tre parallelle sæt eksperimenter for hver betingelse af en enkelt faktor for at forbedre nøjagtigheden af efterfølgende resultater. For det andet multipliceres de standardiserede værdier for hver indikator ved beregningen af de omfattende score med vægtningsfaktoren i stedet for rådataene. Denne procedure sikrer nøjagtigheden af beregningsresultaterne. Derudover børR2-værdien i ANOVA være så tæt som muligt på en; Ellers er niveauerne af faktorer ekstremt tætte og har ringe indflydelse på resultaterne; Forskellen mellem niveauerne skal være moderat bred.
Selvom brugen af omfattende scoring med flere indekser kombineret med responsoverflademetoden sikrer præcis forudsigelse af behandlingsprocessen for TBC, har den begrænsninger. For det første, når laboratorier bruger HPLC til at måle angivne komponenter i medicinske materialer, kan der opstå menneskelige fejl på grund af den lille skala af eksperimenter. Mere overbevisende resultater kan opnås, hvis pilotevaluering udføres i en stor urteforarbejdningsfabrik. For det andet er Box-Behnken-designmetoden ikke egnet til optimering af hele processen. Efter import af eksperimentelle data til responsoverfladesoftwaren skal modeltermen være signifikant (p < 0,05), og manglen på pasform skal være ikke-signifikant (p > 0,05) i ANOVA-dataene. Hvis resultatet vendes, er processen uegnet til optimering ved denne metode.
Afslutningsvis, sammenlignet med den almindeligt anvendte enkeltfaktortest, ensartet design, ortogonalt design og stjernepunktdesign, er Box-Behnken-responsoverflademetoden en eksperimentel optimeringsdesignmetode, der bruger multivariat lineær og kvadratisk termmodeltilpasning27. Modellen forudsagt af Behnken-responsoverflademetoden har kontinuitet og høj eksperimentel nøjagtighed og forudsiger optimale punkter28,29. I det foreliggende eksperiment blev den foretrukne TBC-proces bestemt ved omfattende scoring baseret på enkeltfaktortesten, og den endelige valideringstest afveg ikke meget fra den forudsagte værdi, hvilket indikerer, at den valgte model er rimelig og kan give referencer til forarbejdningsteknologien for TBC behandlet med højlandsbygvin. Den optimerede behandlingsteknologi kan give information og vejledning til undersøgelse af den toksicitetsdæmpende virkning af behandling af andre giftige etniske lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev økonomisk støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 82130113), China Postdoctoral Science Foundation (nr. 2021MD703800), Science Foundation for Youths of Science & Technology Department of Sichuan-provinsen (nr. 2022NSFSC1449) og "Xinglin Scholars" Research Promotion Program fra Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (nr. BSH2021009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aconitine | Chengdu Push Biotechnology Co.,Ltd | PS000905 | |
| 3-Acetylaconitine | Chengdu Push Biotechnology Co.,Ltd | PS010552 | |
| 3-Deoxyaconitine | Chengdu Push Biotechnology Co.,Ltd | PS011258 | |
| Benzoylaconine | Chengdu Push Biotechnology Co.,Ltd | PS010300 | |
| Circulating water vacuum pump | Gongyi City Yuhua Instrument Co., Ltd | SHZ-DIII | |
| Design-Expert | State-East Corporation | 8.0.6 | |
| Electric constant temperature drying oven | Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd | 101-3-BS | |
| Electronic analytical balance | Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd. | FA1004 | |
| High performance liquid chromatography | Shimadzu Enterprise Management (China) Co., Ltd | shimadzu 2030 | |
| Highland barley rice | Kangding City, Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture, Sichuan Province | 20221015 | |
| Millipore filter | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd | φ13 0.22 Nylon66 | |
| Rotary evaporator | Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory | RE-2000A | |
| Starter of liquor-making | Angel Yeast CO., Ltd | BJ22-104 | |
| Ultra pure water systemic | Merck Millipore Ltd. | Milli-Q | |
| Ultrasonic cleansing machine | Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd | SB-8200 DTS |
References
- Zhang, J., et al. Study of quality standards for Aconitum pendulum Busch. Chinese Traditional Patent Medicine. 40 (9), 2100-2103 (2018).
- Liu, X. F., et al. Study on toxicity reduction and effect preservation of the compatibility of Tibetan medicine Aconitum pendulum Busch and Terminalia chebula Retz. Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica. 13 (3), 69-72 (2022).
- Luo, D. S. Chinese Tibetan herbs. 63, Ethnic publishing House. Beijing. (2007).
- Li, C. Y., et al. Aconitum pendulum Busch and A. flavum Hand-Mazz: A narrative review on traditional uses, phytochemistry, bioactivities and processing methods. Journal of Ethnopharmacology. 292, 115216 (2022).
- Yu, L. Q., et al. Traditional Tibetan medicine: therapeutic potential in rheumatoid arthritis. Frontiers in Pharmacology. 13, 938915 (2022).
- Zhang, Y., Fu, X. Y. UPLC Simultaneous determination of six esteric alkaloids components in Aconitum pendulum Busch. Asia-pacific Traditional Medicine. 16 (5), 62-65 (2020).
- Wang, Y. J., et al. Determination of alkaloid content in different medicinal parts of the folk medicine. Aconitum pendulum Busch. Chinese Traditional Patent Medicine. 32 (8), 1390-1393 (2010).
- Shao, C. L., Fu, J. L., Fu, S. X., Ma, H. W., Sun, X. D. Toxicity research and processing methods of Aconitum pendulum Busch. Asia-pacific Traditional Medicine. 10 (2), 32-34 (2014).
- Chan, T. Y. K.
- Li, S. L., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
- Zhao, M. Y. Study on identification and processing attenuation of Tibetan drug Bangna. Southwest Jiaotong University. , (2018).
- Tibet Autonomous Region Food and Drug Administration. Tibetan herbal medicine concoction specification. , Tibetan People's Publishing House. Lhasa. 135 (2008).
- Abd-El-Aziz, N. M., Hifnawy, M. S., El-Ashmawy, A. A., Lotfy, R. A., Younis, I. Y. Application of Box-Behnken design for optimization of phenolics extraction from Leontodon hispidulus in relation to its antioxidant, anti-inflammatory and cytotoxic activities. Scientific Reports. 12 (1), 8829 (2022).
- Quan, L., et al. Optimization of processing technology of stir-frying with vinegar of Curcuma Longa Radix by orthogonal design and Box-Behnken design-response surface based on entropy method. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (8), 1823-1828 (2018).
- Jia, F. C., et al. Research on the brewing technology of Tibetan traditional barley liquor based on response surface method. Food and Fermentation Industries. 45 (22), 171-178 (2019).
- Zhao, X. H., et al. Determination of osthol in different traditional Chinese medicines by HPLC. Chinese Journal of Pharmaceutics. 19 (5), 154-158 (2021).
- Feng, Z. G., et al. Processing methods and the underlying detoxification mechanisms for toxic medicinal materials used by ethnic minorities in China: A review. Journal of Ethnopharmacology. 305, 116126 (2023).
- Wang, D. M., Lu, Z. J., Wang, Y. H., Zhang, C. S. Applying grading methods of synthesizing multiple guidelines to optimizing alcohol-steam processing technology from Ploygonatum odordatum. Journal of Zhejiang A & F University. 30 (1), 100-106 (2013).
- He, N. L., Bao, M. L., Ba, G. N. Study on the best processing technology of Terminalia Decoction soaking iron. Journal of Medicine & Pharmacy of Chinese Minorities. 20 (9), 36-38 (2014).
- Liu, C., et al. Optimization of processing technology for Saposhnikoviae Radix by Box-Behnken design-response surface methodology. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 20 (5), 18-21 (2014).
- Ferreira, S. L. C., et al. Box-Behnken design: an alternative for the optimization of analytical methods. Analytica Chimica Acta. 597 (2), 179-186 (2007).
- Dong, R., Lu, Y., Wang, P. The process optimization of vinegar roasting of Bupleurum chinense by entropy weight method combined with Box-Behnken response surface method and its protective effect on mice liver injury. Science and Technology of Food Industry. 42 (23), 209-217 (2021).
- Li, W. J., et al. Analysis on the times of Polygonati Rhizoma steamed by multiple times based on entropy weight and gray relative analysis method. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 36 (11), 6764-6769 (2021).
- Huang, B. J., Liu, X. T., Mao, Y. M., Qi, B., Liu, L. Response surface methodology combined with analytic hierarchy process to optimize the processing technology of Custutae semen with wine. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 33 (8), 1890-1894 (2022).
- Wang, J., Meng, X. H., Chai, T., Yang, J. L., Shi, Y. P. Diterpenoid alkaloids and one lignan from the roots of Aconitum pendulum Busch. Natural Products and Bioprospecting. 9 (6), 419-423 (2019).
- Xie, H. H., et al. Metabolomics study of aconitine and benzoylaconine induced reproductive toxicity in Be Wo cell. Chinese Journal of Analytical Chemistry. 43 (12), 1808-1813 (2015).
- Han, Y. F., et al. Optimization of extraction process for Yangyin Runmu granules by Box-Behnken design based on entropy weight method-analytic hierarchy process method. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy. 39 (7), 896-903 (2022).
- Chen, F. G., et al. Optimization of the baked drying technology of Clinamomi Ramulus based on CRITIC combined with Box-Behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (8), 1838-1842 (2022).
- Pan, Y. L. Optimization of stir-baking process of Coix lacryma-Jobi Var.Mayuen Kernel by Box-Behnken response surface methodology. Shandong Chemical Industry. 51 (14), 73-75 (2022).
