Summary
Den foreliggende protokollen beskriver en effektiv metode for optimalisering av prosesseringsteknologien i Tiebangchui behandlet med høylandsbyggvin basert på en Box-Behnken-designresponsoverflate kombinert med entropimetoden.
Abstract
Behandlingen av giftige etnomedisiner er av stor betydning for deres sikre kliniske anvendelse. Dermed bør begrensningene i tradisjonell behandling tas opp, og behandlingsmetoden for etnomedisiner bør standardiseres ved hjelp av moderne forskningsmetoder. I denne studien ble prosesseringsteknologien til en vanlig tibetansk medisin Tiebangchui (TBC), den tørkede roten av Aconitum pendel Busch, behandlet med høylandsbyggvin, optimalisert. Diester-diterpenoid alkaloid (DDA) (akonitin, 3-deoksyakonitin, 3-acetylakonitin) og monoester-diterpenoid alkaloid (MDA) (benzoylakonin) innhold ble brukt som evalueringsindikatorer, og vektkoeffisienten til hver evalueringsindeks ble bestemt ved entropimetoden.
Enkeltfaktortesten og Box-Behnken-designet ble brukt til å undersøke påvirkningen av forholdet mellom høylandsbyggvin og TBC, skivetykkelse på TBC og behandlingstid. Omfattende skåring ble utført i henhold til objektiv vekt for hver indeks bestemt ved entropimetoden. De optimale behandlingsforholdene for TBC med høylandsbyggvin var som følger: mengden høylandsbyggvin er fem ganger TBC, en bløtleggingstid på 24 timer og en TBC-tykkelse på 1,5 cm. Resultatene viste at det relative standardavviket mellom verifikasjonstesten og den forventede verdien var mindre enn 2,55%, og den optimaliserte prosesseringsteknologien til TBC behandlet med høylandsbyggvin er enkel, gjennomførbar og stabil, og kan derfor gi en referanse for industriell produksjon.
Introduction
Tiebangchui (TBC), den tørkede roten av Aconitum pendel Busch, er en velkjent tibetansk medisin og ble opprinnelig registrert i den klassiske tibetanske medisinske boken "Four Medical Tantra"1,2. I henhold til "Drug Standards of the Ministry of the People's Republic of China (tibetansk medisin)", er TBC effektiv i å utvise kulde, lindre smerte, fjerne vind og beroligende sjokk, og brukes ofte til å behandle revmatoid artritt i klinikker 3,4,5.
TBC inneholder hovedsakelig alkaloider, inkludert svært giftige diester-diterpenoidalkaloider (DDA), og de moderat giftige monoester-diterpenoidalkaloidene (MDA)6,7,8. Disse kjemiske komponentene er aktive ingredienser med medisinske effekter, men er giftige. En av de mest kjente aktive og giftige ingrediensene, akonitin, forårsaker forgiftning når den overstiger 1 mg9. Derfor kan feil eller overdreven bruk av TBC føre til forgiftning og til og med død, og toksisitetsdemping og effektreservasjon av TBC er avgjørende for sikker klinisk anvendelse10,11.
Behandling er en effektiv metode for avgiftning av TBC. Ifølge gamle tibetanske medisinbøker er behandling med høylandsbyggvin en effektiv måte å dempe toksisitet og bevare effekten av TBC. TBC er dynket i høylandsbyggvin, lagret i en natt, tørket og tilsatt medisiner12. Den spesifikke prosesseringsteknologien og potensielle påvirkningsfaktorer rapporteres imidlertid sjelden, og den tradisjonelle prosesseringsprosessen er ofte avhengig av erfaring og mangler standardiserte metoder. Derfor er det behov for moderne vitenskapelige og teknologiske metoder for optimalisering og standardisering av prosesseringsprosessen.
Box-Behnken-designmetoden brukes til å undersøke interaksjoner mellom ulike faktorer og deres innflytelse på omfattende scoring gjennom kvadratisk polynomtilpasning. Denne utformingen tillater intuitiv observasjon av optimale forhold og har blitt mye brukt innen apotek13. For eksempel optimaliserte Box-Behnken-designmetoden, basert på entropimetoden, vellykket prosesseringsteknologien for steking med eddik av Curcuma Longa Radix14. I denne studien ble Box-Behnken-responsflatens eksperimentelle design kombinert med entropimetoden brukt til å optimalisere prosesseringsteknologien til TBC behandlet med høylandsbyggvin. Den optimaliserte prosesseringsteknologien forventes å sikre kvalitetskontroll og sikker klinisk bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denne studien ble prosesseringsteknologien til TBC behandlet med høylandsbyggvin optimalisert med en Box-Behnken-design kombinert med entropimetoden. DDA- og MDA-innhold ble brukt som evalueringsindikatorer, og vektkoeffisienten til hver evalueringsindeks ble bestemt av entropimetoden.
1. Eksperimentell forberedelse
- Forbered høylandsbyggvin15.
- Ta 500,00 g svart høylandsbyggris og tilsett fem ganger mengden vann. Kok risen til det gjenværende vannet er absorbert (~ 2 h). Hell den ut, vent til temperaturen faller til 37 °C, tilsett 4 g Jiuqu (se materialfortegnelse), bland godt, forsegl boksen, pakk beholderen med bomullsull og la den stuve i 7 dager.
- Tilsett 300 ml vann på den 7. dagen og tett igjen. På den 8. dagen, begynn å fjerne vinen og erstatt med 300 ml vann etterpå. Forsegl og gjær i 1 dag, ta vinen, og tilsett 300 ml vann igjen. Gjenta denne prosedyren tre ganger og kombiner brennevinene.
- Kok opp, reduser deretter varmen til en simmer, og fortsett å lage mat til det gjenværende vannet er absorbert.
- For å tilberede bearbeidede produkter, vei TBCen nøyaktig i en beholder, tilsett høylandsbyggvin og suge i 1 dag. Tørk deretter i en elektrisk tørkeovn med konstant temperatur.
MERK: Tørketemperaturen bør være mindre enn 40 °C for å unngå endringer i alkaloidsammensetningen. - Forbered testprøveløsning.
- Vei nøyaktig TBC-behandlet produktpulver (2 g) i en konisk kolbe, tilsett 40% ammoniakkoppløsning og utfør ultralydassistert ekstraksjon med isopropanol-etylacetat (1: 1) blandede løsningsmidler (50 ml) (effekt: 200 W, frekvens: 40 kHz, temperatur: 40 ° C) i 30 minutter.
NOTAT: For å forberede 40% ammoniakkløsning, overfør 40 ml ammoniakk til en 100 ml volumetrisk kolbe og fortynn deretter med rent vann. - Juster den ekstraherte løsningen til den opprinnelige vekten ved å tilsette en isopropanol-etylacetatblanding (1: 1 v / v).
- Overfør den ekstraherte oppløsningen (25 ml) nøyaktig til en rundbunnskolbe for gjenvinning av oppløsningsvæsken under redusert trykk til den er tørr.
- Overfør til slutt 0,05 % saltsyre-metanoloppløsning for å løse opp resten fra trinn 1.3.3 i en 5 ml volumetrisk kolbe og fortynn med 0,05 % metanolhydrokloridoppløsning. Filtrer oppløsningen gjennom et 0,22 μm mikroporøst membranfilter før injeksjon i HPLC-systemene (High Performance Liquid Chromatography).
MERK: Forbered 0,05% metanolhydrokloridsyre ved å tilsette 0,05 ml saltsyre til en 100 ml volumetrisk kolbe, og fortynn deretter med metanol.
- Vei nøyaktig TBC-behandlet produktpulver (2 g) i en konisk kolbe, tilsett 40% ammoniakkoppløsning og utfør ultralydassistert ekstraksjon med isopropanol-etylacetat (1: 1) blandede løsningsmidler (50 ml) (effekt: 200 W, frekvens: 40 kHz, temperatur: 40 ° C) i 30 minutter.
- Forbered en standardløsning ved å veie 5,18 mg benzoylakonin, 13,13 mg akonitin, 10,05 mg 3-deoksyakonitin og 10,09 mg 3-acetylaconitin nøyaktig, og legg deretter faststoffene i en 5 ml volumetrisk kolbe individuelt. Fortynn med 0,05% metanolhydrokloridoppløsning.
2. Kromatografisk tilstand
- Definer de kromatografiske forholdene som vist i tabell 1 for HPLC. Detaljer om instrumentene som brukes er gitt i materialfortegnelsen.
3. Test av systemtilpasningsevne
- Linearitetsområde
MERK: Først brukte vi HPLC for å bestemme toppområdene av benzoylakonitin, akonitin, 3-deoksyakonitin og 3-acetylaconitin i prøven, og deretter tilfeldig bestemt toppområdet av en kjent konsentrasjon av standardløsning. Deretter sammenlignet vi forskjellen mellom to toppområder (prøveløsning og standardløsning) for å estimere konsentrasjonen av benzoylakonitin, akonitin, 3-deoksyakonitin og 3-acetylaconitin i forskjellige prøver, og justerte deretter standardløsningen til et lineært område for å inkludere konsentrasjonen av prøven i kurven. Standard kurvekonsentrasjoner er vist i tabell 2.- Tilbered benzoylakonitin referanseoppløsninger inneholdende 1,036 mg/ml, 0,518 mg/ml, 0,2072 mg/ml, 0,1036 mg/ml og 0,0518 mg/ml.
- Klargjør akonitinreferanseoppløsninger inneholdende 1,313 mg/ml, 0,5252 mg/ml, 0,2626 mg/ml, 0,1313 mg/ml og 0,05252 mg/ml.
- Lag 3-deoksyakonitin referanseoppløsninger inneholdende 1,005 mg / ml, 0,5025 mg / ml, 0,201 mg / ml, 0,1005 mg / ml og 0,402 mg / ml.
- Klargjør 3-acetylaconitine referanseløsninger inneholdende 0,2018 mg / ml, 0,1009 mg / ml, 0,04036 mg / ml, 0,02018 mg / ml og 0,01009 mg / ml.
- Undersøk lineariteten til hver forbindelse ved å plotte toppområdet versus injeksjonskonsentrasjonen.
- For å utføre presisjonstesten, injiser 10 mikrol av hver referanseløsning i HPLC-systemet seks ganger daglig og bruk de samme HPLC-forholdene som beskrevet i trinn 2.1 for å kjøre prøvene Registrer toppområdet for hver komponent.
- Utfør stabilitetstesting intradag ved å injisere 10 mikrol av den tilberedte prøveoppløsningen via trinn 1.3 og bestem toppområdene etter 0 timer, 2 timer, 4 timer, 8 timer, 14 timer, 12 timer og 24 timer16.
- Utfør en reproduserbarhetstest ved å ta seks prøver av samme gruppe TBC for å klargjøre testprøveløsningen, i henhold til trinn 1.3. Injiser 10 mikrol av hver prøve i HPLC-systemet og kjør prøvene som beskrevet i trinn 2.1.
- Utfør gjenopprettingstesten for å evaluere nøyaktigheten av metoden. Legg til 100% av standardløsningen av hver indekskomponent (benzoylakonitin, akonitin, 3-deoksyakonitin og 3-acetylakonitin) i testløsningen for å beregne utvinningsgraden, henholdsvis. For eksempel, da innholdet av benzoylaconitine er 0,1524 mg / ml i TBC-prøven, veier nøyaktig 0,1524 mg benzoylaconitine standarder og legg til TBC-prøven, og lag deretter testprøveløsningen i henhold til trinn 1.3. Kjør disse eksemplene med de samme HPLC-forholdene som er beskrevet i trinn 2.1. Beregn utvinningsgraden ved hjelp av ligning (1):
(1)
Her er A mengden av komponent (benzoylakonitin, akonitin, 3-deoksyakonitin eller 3-acetylakonitin) som skal måles i prøveløsningen, B er mengden standard tilsatt (benzoylakonitin, akonitin, 3-deoksyakonitin eller 3-acetylakonitin), og C er den målte verdien av løsningen som inneholder standardløsningen og prøveløsningen (se tabell 3). Se trinn 2.1 for kromatografiske forhold for å utføre trinnene ovenfor. Utvinningsgraden gjenspeiler graden av tap av målkomponenten (benzoylakonitin, akonitin, 3-deoksyakonitin eller 3-acetylakonitin) under prøveanalysen; Jo høyere utvinningsgrad, desto lavere tap av målkomponenten.
(1)4. Enkeltfaktortest av TBC behandlet med høylandsbyggvin
MERK: Forholdet mellom høylandsbyggvin og TBC, skivetykkelse av TBC og bløtleggingstid vil påvirke oppløsningen av mer giftige komponenter (akonitin, 3-deoksyakonitin og 3-acetylakonitin) i TBC under TBC behandlet med høylandsbyggvin17. Enkeltfaktortesten og Box-Behnken-designet ble brukt til å undersøke innflytelsen av forholdet mellom høylandsbyggvin og TBC, skivetykkelse på TBC og bløtleggingstid.
- Utfør høylandsbyggvinstesten (A) ved å sette opp fem grupper av tester, hver med 30 g TBC, hvor mengden høylandsbyggvin er to, tre, fire, fem og seks ganger mengden TBC i oppskriften. Bløtleggingstiden er 12 t, og skivene er 1,0 cm tykke18.
MERK: Hver gruppe av samme tilstandstest skal behandles i tre parallelle grupper. - Utfør soaking time test (B) ved å sette opp fem grupper av tester, hver med 30 g TBC. Bløtleggingstidene er 12 timer, 24 timer, 36 timer og 48 timer. Mengden byggvin er fem ganger så stor som TBC, og skivene er 1,0 cm tykke19.
MERK: Hver gruppe av samme tilstandseksperiment skal behandles i tre parallelle grupper. - Utfør kutttykkelsestesten (C) ved å sette opp fem grupper av tester, hver med 30 g TBC. Skivene er 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 og 2,5 cm tykke, bløtleggingstiden er 24 timer, og mengden høylandsbyggvin er fem ganger så stor som TBC20.
MERK: Hver gruppe av samme tilstandseksperiment skal behandles i tre parallelle grupper. - Vei bearbeidede produkter for hver testgruppe nøyaktig for å klargjøre testprøveløsningen i henhold til trinn 1.3. Bestem toppområdet for hver prøve ved HPLC og bruk standardkurven til å estimere mengdene MDA og DDA. I standardkurven er y toppområdet og x er innholdet. Innholdet av MDA er benzoylakonitin, og innholdet av DDA er summen av akonitin, 3-deoksyakonitin og 3-acetylakonitin.
- Bruk det totale innholdet av DDA og innholdet i MDA som evalueringsindikatorer, og bestem vektkoeffisienten til hver evalueringsindeks og den omfattende skåringen via entropimetoden (avsnitt 5).
FORSIKTIG: TBC er giftig, og derfor bør det tas beskyttelsestiltak under behandlingen.
5. Entropi metode for å beregne omfattende scoring
MERK: Vi bruker eksperimentelle data fra kuttetykkelsestesten i enkeltfaktortesten som et eksempel for å illustrere beregningsprosessen i detalj. Vi bruker topparealet til komponentene i hvert utvalg i tilleggstabell S1 og standardkurven i tabell 2 for å beregne innholdet i MDA og DDA (se tilleggstabell S2). I den lineære ligningen er y toppområdet og x er innholdet. I denne studien ble moderat toksisk MDA (benzoylakonitin) brukt som positiv indikator, og det totale innholdet av DDA (akonitin, 3-deoksyakonitin og 3-acetylakonitin) med høy toksisitet ble brukt som negativ indikator. Innholdet av MDA er benzoylakonitin, og innholdet av DDA er summen av akonitin, 3-deoksyakonitin og 3-acetylakonitin. Hvert utvalg har to evalueringsindikatorer: i = 1,2,...,n og j = 1,2,... m21.
- Bruk ligning (2) til å standardisere innholdet i MDA22.
(2)
Således
MERK: Xij er verdien av den j-te indikatoren for det i-te utvalget. Xij* er den standardiserte verdien av Xij. For eksempel representerer i = 3 og j = 1, X31 verdien av den første indikatoren til den tredje prøven, og
er den standardiserte verdien av den første indikatoren i den tredje prøven. er vist i tilleggstabell S3. 
- Bruk ligning (3) for å standardisere det totale innholdet i DDAene23.
(3)
MERK: Her representerer i = 3, j = 2, den andre indikatoren for den tredje prøven.
er den standardiserte verdien av den andre indikatoren i den tredje prøven. 
er vist i tilleggstabell S3. - Bruk Ligninger (4) og (5) til å definere entropiverdien (Hj) for hver indikator23.
- Beregn sannsynligheten for det j-te forsøket under den i-te evalueringsindikatoren Pij ved hjelp av ligning (4).
(4)
For nummer 3,
MERK: Sannsynlighetsverdiene for den første indikatoren og den andre indikatoren for det tredje utvalget er henholdsvis 0,2374 og 0,2812.
er vist i tilleggstabell S3. - Beregn informasjonsentropien Hj.
(5)
MERK: H 1 er entropien til den første indikatoren (MDA) og H2 er entropien til den andre indikatoren (DDA) i kutttykkelsestesten.
- Beregn sannsynligheten for det j-te forsøket under den i-te evalueringsindikatoren Pij ved hjelp av ligning (4).
- Bruk Ligning (6) til å beregne indikatorvektene (Wj)23.
(6)
= 33,3%
= 66,7%
MERK: Wjer vektkoeffisienten til hver indikator. I skivetykkelsestesten er vektkoeffisienten til den positive indikatoren (MDA) og den negative indikatoren (DDA) henholdsvis 33,3% og 66,7%. - Bruk ligning (7) for å beregne den omfattende scoringen av indikatorene23.
(7)
For nummer 3,
MERK: Si er den omfattende scoringen av hver prøve. Vi må oppnå den høyeste poengsummen som det sentrale punktet i Box-Behnken-designet. S 1, S 2, S 3, S 4 og S5 vises i tilleggstabell S3.
(2)
er den standardiserte verdien av den første indikatoren i den tredje prøven. er vist i tilleggstabell S3. 
(3)
er den standardiserte verdien av den andre indikatoren i den tredje prøven. 
er vist i tilleggstabell S3.
(4)
er vist i tilleggstabell S3.
(5)
(6)
= 33,3%
= 66,7%
(7)
6. Box-Behnken design
- Gjennom enkeltfaktortesten bruker du tilstanden med høyest omfattende skåring (se tabell 4, tabell 5, tabell 6 og figur 2) som midtpunkt på responsflaten. Bruk mengden byggvin (A), bløtleggingstid (B) og skivetykkelse på TBC (C) som påvirkningsfaktorer og den omfattende skåringen som responsverdi24.
MERK: Basert på enkeltfaktordataene i tabell 4, tabell 5 og tabell 6, beregnes den høyeste omfattende skåringen med ligninger (2), (3), (4), (5), (6) og (7) i seksjon 5, og det beste punktet oppnås. Mengden høylandsbyggvin var fem ganger TBC, bløtleggingstiden var 36 timer, og skivetykkelsen var 1,0 cm.
7. Box-Behnken design programvare drift trinn
- Åpne programvaren (se Materialfortegnelse) og velg Ny design | Box-Behnken Design (se trinn 5.1; Tilleggsfil 1).
- Skriv inn antall påvirkningsfaktorer og skriv inn nivåinformasjon (tre-nivå-tre-faktor; se tabell 7). Box-Behnken-designet består av 17 eksperimenter i denne studien. Til slutt klikker du på Fortsett (se trinn 5.2; Tilleggsfil 1).
- Sett den omfattende skåringen (Y) etter ligninger (2), (3), (4), (5), (6) og (7) i seksjon 5 som svar. Skriv inn antall svarverdier (bildet viser bare én svarverdi) og klikk på Fullfør (se trinn 5.3; Tilleggsfil 1).
- Behandle TBCen med høylandsbyggvin i henhold til designresultatene og fullfør eksperimentet basert på de 17 scenariene designet for responsflaten.
- Klargjør eksempelløsningene ved å følge trinn 1.3, og beregn det totale innholdet av MDAene og DDAene av HPLC-systemet.
- Beregn den omfattende skåringen for hver gruppe etter ligninger (2), (3), (4), (5), (6) og (7) i trinn 5, og skriv inn poengsumresultatene (se trinn 5.4; Tilleggsfil 1).
- Klikk på analyser for å analysere dato og modellinformasjon (se trinn 5.4.1; Tilleggsfil 1).
- Utføre statistisk validering av polynomligninger og responsflateanalyse plottet i 3D modellplott oppnådd av programvaren.
- Klikk på ANOVA i toppmenyen og se resultattabellen.
- Klikk på Optimalisering for å se de anslåtte optimale prosessforholdene (se trinn 5.4.2; Tilleggsfil 1).
8. Valideringstest
- I henhold til resultatene som er spådd fra Box-Behnken-responsflatedesignet, i trinn 7.3, identifiserer du den optimale prosesseringstilstanden til TBC. Her er det som følger: TBC er gjennomvåt i 24 timer i fem ganger mengden høylandsbyggvin, og tykkelsen på TBC er 1,5 cm. Ta det optimale nivået av påvirkningsfaktorer som behandlingsbetingelser og sett opp tre parallelle sett med eksperimenter for å verifisere stabiliteten til prosesseringsteknologien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien indikerte presisjonen, stabiliteten, repeterbarheten og prøvegjenopprettingen av TBC at metoden er gjennomførbar. De fire indekskomponentene i TBC hadde et godt lineært forhold innenfor et spesifikt konsentrasjonsområde. Typiske kromatogrammer er vist i figur 1. Presisjonstestresultatene (tabell 8) viste at det relative standardavviket (RSD) for toppområdene var henholdsvis 2,56 %, 1,49 % og 2,03 % for benzoylakonin, akonitin og 3-deoksyakonitin, og 0,21 % for 3-acetylakonitin, noe som indikerer at instrumentets presisjon var god. Studien av stabilitet utført i 24 timer (n = 6) indikerte relative standardavviksverdier på 2,76 %, 2,21 %, 2,98 % og 2,31 % for henholdsvis benzoylakonin, akonitin, 3-deoksyakonitin og 3-acetylakonitin (tabell 9), noe som tyder på at prøveløsningen var stabil i 24 timer. Repeterbarhetstestresultatene (tabell 10) viste at RSD for toppområdene av benzoylakonin, akonitin, 3-deoksyakonitin og 3-deoksyakonitin var henholdsvis 2,80%, 2,92%, 2,92% og 2,07%, noe som viser at repeterbarheten av denne metoden var god. Resultatene fra gjenopprettingseksperimentet indikerte at gjennomsnittlig utvinningsgrad av benzoylakonin, akonitin, 3-deoksyakonitin og 3-deoksyakonitin var henholdsvis 99,7%, 100,84%, 103,27% og 100,92%.
Enkeltfaktortesten av TBC behandlet med høylandsbyggvin viste at mengden høylandsbyggvin var fem ganger så stor som TBC, bløtleggingstiden var 36 timer og skivetykkelsen var 1,0 cm (figur 2). Det eksperimentelle designet og resultatene av responsflatemodellen er vist i tabell 11. Resultatene fra den eksperimentelle ANOVA er vist i tabell 12. Faktorene tilpasses ved regresjon for å få en kvadratisk multinomisk regresjonsligning (8). A: Highland byggvin tillegg; B: bløtlegging tid; C: skivetykkelse. Resultatene viste at modellen var godt tilpasset og var i stand til å forutsi forholdet mellom omfattende scoring av høylandsbyggvin, bløtleggingstid og skivetykkelse. Rekkefølgen av faktorene etter styrken av effektene var høylandsbyggvin tilsetning > skivetykkelse av medisinske urter > bløtleggingstid.
(8)
Ifølge Equation (8) brukes analyseprogramvaren Design-Expert 8.0.6 til å plotte en 3D-kurve via trinn 7.2.1 (figur 3). En brattere helning av responsflaten indikerer et sterkere horisontalt samspill av faktorer, og en slakere skråning er det motsatte. P-verdien (p < 0,0001) i modellen i tabell 12 viser at modellen er signifikant, med en R2 på 0,9754 og et ikke-signifikant mistilpasningsbegrep (p = 0,7253), noe som indikerer at modellen passer godt og bedre reflekterer forholdet mellom høylandsbyggvintilsetningen, bløtleggingstid, skivetykkelse av medisinske urter, og samlet poengsum.
I henhold til den objektive vekten av hver indeks bestemt ved den analytiske entropimetoden ble det utført omfattende scoring, og den optimale prosesseringstilstanden for TBC ble bestemt som følger: TBC er gjennomvåt i 24 timer i fem ganger mengden høylandsbyggvin, og tykkelsen på TBC er 1,5 cm. Valideringstestresultatene viste at de totale DDAene var henholdsvis 0,6963, 0,6793 og 0,7023 mg / g, og MDA-innholdet i tre sett med parallelle tester var 0,2096, 0,2237 og 0,2109 mg / g. Snittet på scoringen var 83. RSD mellom verifikasjonstesten og den forutsagte verdien var mindre enn 1,8%, noe som indikerer at den optimaliserte prosesseringsteknologien til TBC behandlet med høylandsbyggvin er enkel, gjennomførbar og stabil, og gir en referanse for industriell produksjon.
Figur 1: Representative kromatogrammer av de fire karakteristiske komponentene etter innstilling av kromatografiske forhold nevnt i trinn 2.1 (n = 1). (A) Typiske kromatogrammer for referanseløsningen. Topp 1 er benzoylakonin, topp 2 er akonitin, topp 3 er 3-deoksyakonitin, og topp 4 er 3-acetylakonitin. (B) Typiske kromatogrammer av prøveløsningen. Topp 1 er benzoylakonin, topp 2 er akonitin, topp 3 er 3-deoksyakonitin, og topp 4 er 3-acetylakonitin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Den omfattende skåringen av enkeltfaktortesten av TBC behandlet med høylandsbyggvin (n = 3). (A) Mengde høylandsbyggvin (ganger); (B) Bløtleggingstid (h); (C) Skivetykkelse (cm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: 3D responsflatekart over effekten av samspill mellom ulike faktorer på omfattende skåring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Betingelse | Parameter |
| Kromatografisk kolonne | Ultimate ODS-3 C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) |
| Mobil fase | Acetonitril (A) - 0,04 mol/l ammoniumacetatoppløsning (B) pH = 8,5 ± 0,5 |
| Gradert eluering | 0-10 min, 0% -70% A; 10-15 min, 70-50% A; 15-30 min, 50-40% A; 30-38min, 40-15% A; 38–45 min, 15–15 % A; 45–55 min, 15–70 % A |
| Strømningshastighet | 1 ml/min |
| Kolonne temperatur | 30 °C |
| Oppdage bølgelengde | 235 nm |
| Prøvevolum | 10 μL |
Tabell 1: De kromatografiske forholdene som ble satt i dette eksperimentet. Detaljer om kromatografisk kolonne, mobilfase, gradienteluering, strømningshastighet, kolonnetemperatur, deteksjonsbølgelengde og prøvevolum.
| Indeks komponenter | Lineær ligning | Linearitetsområde (mg/ml) | R2 |
| Benzoylakonin | y=11 658 706,1677x +19 717,0872 | 1.036-0.0518 | 0.9995 |
| Akonitin | y = 11 199 784,3030x -67 641,2429 | 1.313-0.05252 | 0.9999 |
| 3-deoksyakonitin | y=11 214 550,3140x +59 795,9119 | 1.005-0.0402 | 0.9999 |
| 3-acetylaconitin | y=9 887 511,9074x +26 713,6359 | 0.2018-0.01009 | 0.9994 |
Tabell 2: Det lineære forholdet mellom indekskomponentene i TBC. De fire indekskomponentene i TBC hadde et godt lineært forhold i et bestemt konsentrasjonsområde.
| Indeks komponenter | Kjent innhold (mg) | Legge til mengde (mg) | Målemengde (mg) | Frisk (%) | Gjennomsnittlig restitusjon (%) | RSD (%) |
| Benzoylakonin | 0.1558 | 0.1295 | 0.2901 | 96.4 | 99.7 | 3.14 |
| 0.1574 | 0.1295 | 0.2849 | 98.46 | |||
| 0.156 | 0.1295 | 0.2871 | 101.24 | |||
| 0.1574 | 0.1295 | 0.2923 | 104.95 | |||
| 0.1449 | 0.1295 | 0.2736 | 99.38 | |||
| 0.1566 | 0.1295 | 0.2839 | 98.3 | |||
| Akonitin | 0.3099 | 0.3283 | 0.645 | 102.07 | 100.84 | 2.02 |
| 0.3153 | 0.3283 | 0.6371 | 98.02 | |||
| 0.2928 | 0.3283 | 0.6314 | 103.14 | |||
| 0.2969 | 0.3283 | 0.6325 | 102.23 | |||
| 0.3035 | 0.3283 | 0.6343 | 100.76 | |||
| 0.3094 | 0.3283 | 0.6339 | 98.84 | |||
| 3-deoksyakonitin | 0.1789 | 0.201 | 0.3788 | 99.45 | 103.27 | 2.65 |
| 0.1793 | 0.201 | 0.3845 | 102.09 | |||
| 0.1741 | 0.201 | 0.3774 | 101.14 | |||
| 0.1635 | 0.201 | 0.3753 | 105.37 | |||
| 0.1708 | 0.201 | 0.383 | 105.57 | |||
| 0.1653 | 0.201 | 0.3783 | 105.97 | |||
| 3-acetylaconitin | 0.0169 | 0.02 | 0.0374 | 102.5 | 100.92 | 1.15 |
| 0.0168 | 0.02 | 0.037 | 101 | |||
| 0.0166 | 0.02 | 0.0366 | 100 | |||
| 0.0161 | 0.02 | 0.0365 | 102 | |||
| 0.017 | 0.02 | 0.0369 | 99.5 | |||
| 0.0171 | 0.02 | 0.0372 | 100.5 |
Tabell 3: Resultatene av måling av utvinningsgrad i utvalget. RSD for utvinningsgraden av benzoylakonin, akonitin, 3-deoksyakonitin og 3-acetylaconitin var henholdsvis 3,14%, 2,02%, 2,65% og 1,15%.
| Nummer | Highland byggvin tillegg test (ganger) | Innhold av MDA (mg/g) | Innhold av DDA (mg/g) | Omfattende scoring/poeng |
| 1 | 2 | 0.1875 | 0.8254 | 58.98421777 |
| 2 | 3 | 0.1099 | 0.9847 | 0.056898711 |
| 3 | 4 | 0.2296 | 0.8487 | 71.12048666 |
| 4 | 5 | 0.2161 | 0.6894 | 94.6966946 |
| 5 | 6 | 0.2006 | 0.7472 | 78.22537224 |
Tabell 4: Resultatene av enkeltfaktortesten av forholdet mellom høylandsbyggvin og TBC.
| Nummer | Bløtlegging tid test (h) | Innhold av MDA (mg/g) | Innhold av DDA (mg/g) | Omfattende scoring/poeng |
| 1 | 6 | 0.236292609 | 1.047811476 | 59.67501032 |
| 2 | 12 | 0.193880685 | 1.164420534 | 23.10718817 |
| 3 | 24 | 0.229606225 | 0.848736346 | 53.86313899 |
| 4 | 36 | 0.151447388 | 0.701045217 | 79.15664943 |
| 5 | 48 | 0.193311963 | 0.767427412 | 68.88872066 |
Tabell 5: Resultatene av enkeltfaktortesten av bløtleggingstiden.
| Nummer | Tykkelsestest i skiver (cm) | Innhold av MDA (mg/g) | Innhold av DDA (mg/g) | Omfattende scoring/poeng |
| 1 | 0.5 | 0.1043 | 0.6190 | 66.96 |
| 2 | 1 | 0.1709 | 0.6992 | 75.05 |
| 3 | 1.5 | 0.1507 | 0.6954 | 66.23 |
| 4 | 2 | 0.1459 | 0.8347 | 20.66 |
| 5 | 2.5 | 0.1451 | 0.8298 | 21.79 |
Tabell 6: Resultatene av enkeltfaktortesten av skivetykkelsen på TBC.
| Nivå | Faktor | ||
| A (mengde høylandsbyggvin, ganger) | B (bløtlegging, h) | C (skivetykkelse, cm) | |
| 1.0000 | 4.0000 | 24.0000 | 0.5000 |
| 2.0000 | 5.0000 | 36.0000 | 1.0000 |
| 3.0000 | 6.0000 | 48.0000 | 1.5000 |
Tabell 7: Box-Behnken design response surface level factor table.
| Toppareal i indekskomponenter | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD (%) |
| Benzoylakonin | 1281252 | 1290912 | 1198912 | 1256056 | 1256704 | 1266738 | 2.56% |
| Akonitin | 2861208 | 2881686 | 2785022 | 2790990 | 2859024 | 2799395 | 1.50% |
| 3-deoksyakonitin | 2356317 | 2328383 | 2429059 | 2350987 | 2406114 | 2450374 | 2.04% |
| 3-acetylaconitin | 2008110 | 2021560 | 2014519 | 2015881 | 2015209 | 2012529 | 0.22% |
Tabell 8: Resultatene av presisjonsmålingen. RSD for toppområdene av benzoylakonin, akonitin, 3-deoksyakonitin og 3-acetylaconitin var henholdsvis 2,56 %, 1,49 %, 2,03 % og 0,22 % (n = 6).
| Toppareal i indekskomponenter | 0 | 2 | 4 | 8 | 12 | 24 | RSD (%) |
| Benzoylakonin | 191657 | 189590 | 193934 | 205135 | 196159 | 195954 | 2.76 |
| Akonitin | 312259 | 310240 | 294331 | 309104 | 312199 | 305360 | 2.22 |
| 3-deoksyakonitin | 230174 | 246787 | 239760 | 249302 | 248806 | 243396 | 2.98 |
| 3-acetylaconitin | 17086 | 16953 | 16826 | 16914 | 16979 | 17896 | 2.31 |
Tabell 9: Resultatene av stabilitetstesten. RSD for toppområdene av benzoylakonin, akonitin, 3-deoksyakonitin og 3-acetylaconitin var henholdsvis 2,76 %, 2,21 %, 2,98 % og 2,31 % (n = 6).
| Toppområde for indekskomponenter | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD (%) |
| Benzoylakonin | 191067 | 192795 | 191058 | 192907 | 179103 | 192008 | 2.79 |
| Akonitin | 308142 | 313754 | 290487 | 294740 | 301515 | 307654 | 2.92 |
| 3-deoksyakonitin | 249021 | 249456 | 243963 | 232781 | 240524 | 234661 | 2.92 |
| 3-acetylaconitin | 17465 | 17451 | 17247 | 16691 | 17608 | 17686 | 2.07 |
Tabell 10: Resultatene av reproduserbarhetstesten. RSD for toppområdene av benzoylakonin, akonitin, 3-deoksyakonitin og 3-acetylaconitine var henholdsvis 2,79 %, 2,92 %, 2,92 % og 2,07 % (n = 6).
| Nummer | A (Highland byggvin tillegg, ganger) | B (Bløtleggingstid, h) | C (Skivetykkelse, cm) | Innhold av MDA (mg/g) | Innhold av DDA (mg/g) | Omfattende scoring/poeng |
| 1 | 4 | 36 | 0.5 | 0.1032 | 0.6882 | 28.2 |
| 2 | 5 | 48 | 1.5 | 0.1688 | 0.6588 | 56.49 |
| 3 | 6 | 24 | 1 | 0.1236 | 0.6535 | 33.02 |
| 4 | 5 | 24 | 1.5 | 0.2201 | 0.692 | 87.23 |
| 5 | 5 | 36 | 1 | 0.2094 | 0.6199 | 70.71 |
| 6 | 5 | 24 | 0.5 | 0.1809 | 0.5689 | 48.56 |
| 7 | 4 | 24 | 1 | 0.2016 | 0.7744 | 90.74 |
| 8 | 5 | 36 | 1 | 0.2169 | 0.6889 | 85.15 |
| 9 | 5 | 36 | 1 | 0.2103 | 0.6802 | 80.5 |
| 10 | 6 | 36 | 0.5 | 0.1036 | 0.5072 | 0.36 |
| 11 | 6 | 36 | 1.5 | 0.1089 | 0.5062 | 2.86 |
| 12 | 4 | 48 | 1 | 0.1789 | 0.6789 | 64.6 |
| 13 | 6 | 48 | 1 | 0.1036 | 0.5536 | 7.55 |
| 14 | 5 | 36 | 1 | 0.2062 | 0.6084 | 67.33 |
| 15 | 4 | 36 | 1.5 | 0.1832 | 0.6954 | 69.31 |
| 16 | 5 | 48 | 0.5 | 0.1759 | 0.5569 | 44.21 |
| 17 | 5 | 36 | 1 | 0.2161 | 0.6894 | 84.82 |
Tabell 11: Design og resultater av responsflatedesigntesten.
| Kilde | Summen av kvadrater | Df | Gjennomsnittlig firkant | F-verdi | P-verdi |
| Modell | 14403.27 | 9 | 1600.36 | 30.8 | <0.0001 |
| En | 5463.26 | 1 | 5463.26 | 105.15 | <0.0001 |
| B | 939.61 | 1 | 939.61 | 18.08 | 0.0038 |
| C | 1117.7 | 1 | 1117.7 | 21.51 | 0.0024 |
| AB | 0.11 | 1 | 0.11 | 0.00216 | 0.9642 |
| AC | 372.68 | 1 | 372.68 | 7.17 | 0.0316 |
| F.KR | 174.11 | 1 | 174.11 | 3.35 | 0.1099 |
| A2 | 4133.52 | 1 | 4133.52 | 79.55 | <0.0001 |
| B2 | 28.63 | 1 | 28.63 | 0.55 | 0.482 |
| C2 | 1890.1 | 1 | 1890.1 | 36.38 | 0.0005 |
| Gjenværende | 363.71 | 7 | 51.96 | ||
| Manglende passform | 93.28 | 3 | 31.09 | 0.46 | 0.7253 |
| Ren feil | 270.43 | 4 | 67.61 | ||
| Cor Total | 14766.99 | 16 |
Tabell 12: ANOVA for regresjonsmodellen.
Tilleggsfil 1: En detaljert guide til designprogramvaren Box-Behnken. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S1: Eksempel på toppområde for skivetykkelsestesten ved HPLC. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S2: Innhold av MDA (benzoylakonin) og DDA (akonitin, 3-deoksyakonitin og 3-acetylakonitin) i skivetykkelsestesten. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S3: Omfattende skåring av kutttykkelsestesten. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som en vanlig tibetansk medisin med toksiske effekter, er den toksisitetsdempende effekten av behandlingen ekstremt viktig for TBCs kliniske anvendelse25. I denne studien ble prosesseringsteknologien til TBC behandlet med høylandsbyggvin optimalisert. Ved å gjennomgå de viktigste aktive ingrediensene og relatere de farmakologiske effektene av TBC, fant vi at TBC-alkaloider har antiinflammatoriske og smertestillende effekter og kan brukes til å behandle revmatoid artritt. I denne studien ble en moderat toksisk MDA brukt som positiv indikator. Det totale innholdet av DDAer ble brukt som negativ indikator. Entropimetoden ble brukt til å beregne indeksvektene og optimalisere prosesseringsteknologien26.
Under forsøket bør to punkter spesielt bemerkes. For det første kreves tre parallelle sett med eksperimenter for hver tilstand av en enkelt faktor for å forbedre nøyaktigheten av etterfølgende resultater. For det andre, i beregningen av de omfattende poengsummene, multipliseres de standardiserte verdiene til hver indikator med vektingsfaktoren i stedet for rådataene. Denne prosedyren sikrer nøyaktigheten av beregningsresultatene. I tillegg skal R2-verdien i ANOVA være så nær én som mulig; Ellers er nivåene av faktorer ekstremt nærme, og har liten innvirkning på resultatene; Forskjellen mellom nivåene skal være moderat bred.
Selv om bruken av multi-indeks omfattende scoring kombinert med responsflatemetoden sikrer presis prediksjon av prosesseringsprosessen til TBC, har den begrensninger. For det første, når laboratorier bruker HPLC for å måle angitte komponenter i medisinske materialer, kan menneskelig feil oppstå på grunn av liten skala av eksperimenter. Mer overbevisende resultater kan oppnås dersom pilotevaluering utføres i en stor urtbehandlingsfabrikk. For det andre er Box-Behnken-designmetoden ikke egnet for optimalisering av hele prosessen. Etter at eksperimentelle data er importert til responsflateprogramvaren, må modelltermen være signifikant (p < 0,05), og mangelen på tilpasning må være ikke-signifikant (p > 0,05) i ANOVA-dataene. Hvis resultatet reverseres, er prosessen uegnet for optimalisering ved denne metoden.
For å konkludere, sammenlignet med den ofte brukte enkeltfaktortesten, uniform design, ortogonal design og stjernepunktdesign, er Box-Behnken-responsflatetilnærmingen en eksperimentell optimaliseringsdesignmetode som bruker multivariat lineær og kvadratisk termmodell som passer27. Modellen forutsagt av Behnken-responsoverflatemetoden har kontinuitet og høy eksperimentell nøyaktighet, og forutsier optimale punkter28,29. I dette eksperimentet ble den foretrukne prosessen med TBC bestemt ved omfattende scoring basert på enkeltfaktortesten, og den endelige valideringstesten avvike ikke mye fra den forutsagte verdien, noe som indikerer at den valgte modellen er rimelig og kan gi referanser for prosesseringsteknologien til TBC behandlet med høylandsbyggvin. Den optimaliserte prosesseringsteknologien kan gi informasjon og veiledning for studiet av den toksisitetsdempende effekten av behandling av andre giftige etniske medisiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet økonomisk av National Natural Science Foundation of China (nr. 82130113), China Postdoctoral Science Foundation (nr. 2021MD703800), Science Foundation for Youths of Science & Technology Department of Sichuan Province (nr. 2022NSFSC1449), og "Xinglin Scholars" Research Promotion Program of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (nr. BSH2021009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aconitine | Chengdu Push Biotechnology Co.,Ltd | PS000905 | |
| 3-Acetylaconitine | Chengdu Push Biotechnology Co.,Ltd | PS010552 | |
| 3-Deoxyaconitine | Chengdu Push Biotechnology Co.,Ltd | PS011258 | |
| Benzoylaconine | Chengdu Push Biotechnology Co.,Ltd | PS010300 | |
| Circulating water vacuum pump | Gongyi City Yuhua Instrument Co., Ltd | SHZ-DIII | |
| Design-Expert | State-East Corporation | 8.0.6 | |
| Electric constant temperature drying oven | Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd | 101-3-BS | |
| Electronic analytical balance | Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd. | FA1004 | |
| High performance liquid chromatography | Shimadzu Enterprise Management (China) Co., Ltd | shimadzu 2030 | |
| Highland barley rice | Kangding City, Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture, Sichuan Province | 20221015 | |
| Millipore filter | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd | φ13 0.22 Nylon66 | |
| Rotary evaporator | Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory | RE-2000A | |
| Starter of liquor-making | Angel Yeast CO., Ltd | BJ22-104 | |
| Ultra pure water systemic | Merck Millipore Ltd. | Milli-Q | |
| Ultrasonic cleansing machine | Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd | SB-8200 DTS |
References
- Zhang, J., et al. Study of quality standards for Aconitum pendulum Busch. Chinese Traditional Patent Medicine. 40 (9), 2100-2103 (2018).
- Liu, X. F., et al. Study on toxicity reduction and effect preservation of the compatibility of Tibetan medicine Aconitum pendulum Busch and Terminalia chebula Retz. Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica. 13 (3), 69-72 (2022).
- Luo, D. S. Chinese Tibetan herbs. 63, Ethnic publishing House. Beijing. (2007).
- Li, C. Y., et al. Aconitum pendulum Busch and A. flavum Hand-Mazz: A narrative review on traditional uses, phytochemistry, bioactivities and processing methods. Journal of Ethnopharmacology. 292, 115216 (2022).
- Yu, L. Q., et al. Traditional Tibetan medicine: therapeutic potential in rheumatoid arthritis. Frontiers in Pharmacology. 13, 938915 (2022).
- Zhang, Y., Fu, X. Y. UPLC Simultaneous determination of six esteric alkaloids components in Aconitum pendulum Busch. Asia-pacific Traditional Medicine. 16 (5), 62-65 (2020).
- Wang, Y. J., et al. Determination of alkaloid content in different medicinal parts of the folk medicine. Aconitum pendulum Busch. Chinese Traditional Patent Medicine. 32 (8), 1390-1393 (2010).
- Shao, C. L., Fu, J. L., Fu, S. X., Ma, H. W., Sun, X. D. Toxicity research and processing methods of Aconitum pendulum Busch. Asia-pacific Traditional Medicine. 10 (2), 32-34 (2014).
- Chan, T. Y. K.
- Li, S. L., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
- Zhao, M. Y. Study on identification and processing attenuation of Tibetan drug Bangna. Southwest Jiaotong University. , (2018).
- Tibet Autonomous Region Food and Drug Administration. Tibetan herbal medicine concoction specification. , Tibetan People's Publishing House. Lhasa. 135 (2008).
- Abd-El-Aziz, N. M., Hifnawy, M. S., El-Ashmawy, A. A., Lotfy, R. A., Younis, I. Y. Application of Box-Behnken design for optimization of phenolics extraction from Leontodon hispidulus in relation to its antioxidant, anti-inflammatory and cytotoxic activities. Scientific Reports. 12 (1), 8829 (2022).
- Quan, L., et al. Optimization of processing technology of stir-frying with vinegar of Curcuma Longa Radix by orthogonal design and Box-Behnken design-response surface based on entropy method. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (8), 1823-1828 (2018).
- Jia, F. C., et al. Research on the brewing technology of Tibetan traditional barley liquor based on response surface method. Food and Fermentation Industries. 45 (22), 171-178 (2019).
- Zhao, X. H., et al. Determination of osthol in different traditional Chinese medicines by HPLC. Chinese Journal of Pharmaceutics. 19 (5), 154-158 (2021).
- Feng, Z. G., et al. Processing methods and the underlying detoxification mechanisms for toxic medicinal materials used by ethnic minorities in China: A review. Journal of Ethnopharmacology. 305, 116126 (2023).
- Wang, D. M., Lu, Z. J., Wang, Y. H., Zhang, C. S. Applying grading methods of synthesizing multiple guidelines to optimizing alcohol-steam processing technology from Ploygonatum odordatum. Journal of Zhejiang A & F University. 30 (1), 100-106 (2013).
- He, N. L., Bao, M. L., Ba, G. N. Study on the best processing technology of Terminalia Decoction soaking iron. Journal of Medicine & Pharmacy of Chinese Minorities. 20 (9), 36-38 (2014).
- Liu, C., et al. Optimization of processing technology for Saposhnikoviae Radix by Box-Behnken design-response surface methodology. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 20 (5), 18-21 (2014).
- Ferreira, S. L. C., et al. Box-Behnken design: an alternative for the optimization of analytical methods. Analytica Chimica Acta. 597 (2), 179-186 (2007).
- Dong, R., Lu, Y., Wang, P. The process optimization of vinegar roasting of Bupleurum chinense by entropy weight method combined with Box-Behnken response surface method and its protective effect on mice liver injury. Science and Technology of Food Industry. 42 (23), 209-217 (2021).
- Li, W. J., et al. Analysis on the times of Polygonati Rhizoma steamed by multiple times based on entropy weight and gray relative analysis method. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 36 (11), 6764-6769 (2021).
- Huang, B. J., Liu, X. T., Mao, Y. M., Qi, B., Liu, L. Response surface methodology combined with analytic hierarchy process to optimize the processing technology of Custutae semen with wine. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 33 (8), 1890-1894 (2022).
- Wang, J., Meng, X. H., Chai, T., Yang, J. L., Shi, Y. P. Diterpenoid alkaloids and one lignan from the roots of Aconitum pendulum Busch. Natural Products and Bioprospecting. 9 (6), 419-423 (2019).
- Xie, H. H., et al. Metabolomics study of aconitine and benzoylaconine induced reproductive toxicity in Be Wo cell. Chinese Journal of Analytical Chemistry. 43 (12), 1808-1813 (2015).
- Han, Y. F., et al. Optimization of extraction process for Yangyin Runmu granules by Box-Behnken design based on entropy weight method-analytic hierarchy process method. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy. 39 (7), 896-903 (2022).
- Chen, F. G., et al. Optimization of the baked drying technology of Clinamomi Ramulus based on CRITIC combined with Box-Behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (8), 1838-1842 (2022).
- Pan, Y. L. Optimization of stir-baking process of Coix lacryma-Jobi Var.Mayuen Kernel by Box-Behnken response surface methodology. Shandong Chemical Industry. 51 (14), 73-75 (2022).
