Mikrogel-extrazelluläre Matrix-Komposit-Unterstützung für den eingebetteten 3D-Druck menschlicher neuronaler Konstrukte

Summary

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für den Freiform-eingebetteten 3D-Druck von neuralen Stammzellen in selbstheilenden, annealbaren Partikel-extrazellulären Matrixkompositen. Das Protokoll ermöglicht die programmierbare Strukturierung von miteinander verbundenen menschlichen Nervengewebekonstrukten mit hoher Genauigkeit.

Abstract

Der eingebettete 3D-Druck von Zellen in einem granularen Trägermedium hat sich in den letzten zehn Jahren zu einem leistungsstarken Ansatz für die Freiform-Biofabrikation von Weichteilkonstrukten entwickelt. Granulierte Gelformulierungen sind jedoch auf eine begrenzte Anzahl von Biomaterialien beschränkt, die die kostengünstige Erzeugung großer Mengen von Hydrogel-Mikropartikeln ermöglichen. Daher fehlten granularen Gelträgermedien im Allgemeinen die zelladhäsiven und zellinstruktiven Funktionen, die in der nativen extrazellulären Matrix (EZM) zu finden sind.

Um dieses Problem zu lösen, wurde eine Methodik zur Erzeugung von selbstheilenden annealbaren Partikel-extrazellulären Matrix-Kompositen (SHAPE) entwickelt. SHAPE-Verbundwerkstoffe bestehen aus einer granularen Phase (Mikrogele) und einer kontinuierlichen Phase (viskose ECM-Lösung), die zusammen sowohl einen programmierbaren High-Fidelity-Druck als auch eine einstellbare biofunktionelle extrazelluläre Umgebung ermöglichen. Diese Arbeit beschreibt, wie die entwickelte Methodik für die präzise Biofabrikation menschlicher neuronaler Konstrukte genutzt werden kann.

Zunächst werden Alginat-Mikropartikel, die als körnige Komponente in den SHAPE-Verbundwerkstoffen dienen, hergestellt und mit einer kollagenbasierten kontinuierlichen Komponente kombiniert. Dann werden menschliche neuronale Stammzellen in das Trägermaterial gedruckt, gefolgt vom Ausglühen des Trägers. Die gedruckten Konstrukte können wochenlang aufrechterhalten werden, um die Differenzierung der gedruckten Zellen zu Neuronen zu ermöglichen. Gleichzeitig ermöglicht die kontinuierliche Phase des Kollagens das axonale Wachstum und die Verbindung von Regionen. Schließlich liefert diese Arbeit Informationen darüber, wie Lebendzell-Fluoreszenzbildgebung und Immunzytochemie durchgeführt werden können, um die 3D-gedruckten menschlichen neuronalen Konstrukte zu charakterisieren.

Introduction

Der präzise und programmierbare 3D-Druck von zellbeladenen Hydrogel-Konstrukten, die Weichgewebe in vitro nachahmen, stellt eine große Herausforderung dar. Zum Beispiel sind Versuche, die auf der direkten Extrusion von weichen Hydrogelen basieren, von Natur aus problematisch, da die schlechten mechanischen Eigenschaften, die erforderlich sind, um die In-vivo-Mikroumgebung zu rekapitulieren, zu einem Mangel an struktureller Integrität, zu Verformungen der vordefinierten Merkmale oder zum vollständigen Kollaps der hergestellten Strukturen führen. Eine konventionelle Problemumgehung für dieses Problem besteht darin, ein Stützgerüst aus einem steiferen biokompatiblen Material zu drucken, das es dem endgültigen Konstrukt ermöglicht, seine Form beizubehalten. Dieser Ansatz schränkt jedoch die Gestaltungsmöglichkeiten stark ein und erfordert eine sorgfältige rheologische Feinabstimmung der angrenzenden Tinten.

Um die Einschränkungen des traditionellen schichtweise extrusionsbasierten 3D-Drucks zu überwinden, hat sich der eingebettete 3D-Druck in den letzten Jahren zu einer leistungsstarken Alternative für die Herstellung von weichem Material und Gewebe entwickelt 1,2,3,4,5,6. Anstatt die Tinte in der Umgebungsluft auf einer Oberfläche zu extrudieren, wird die Tinte direkt durch eine Spritzennadel in einem Stützbad abgeschieden, das im Ruhezustand feststoffartig ist, aber reversibel um die bewegliche Nadelspitze herum fluidisiert, um die präzise Abscheidung von weichem, zellbeladenem Material zu ermöglichen. Das abgeschiedene Material wird an Ort und Stelle gehalten, während sich der Träger im Nachlauf der Nadel wieder verfestigt. So ermöglicht der eingebettete 3D-Druck die hochauflösende Freiformherstellung komplizierter Strukturen aus weichen Biomaterialien mit erweiterten Gestaltungsmöglichkeiten ^7,8.

Granulare Gele wurden ausgiebig als Stützbadmaterialien für den eingebetteten 3D-Druck untersucht, da sie so formuliert werden können, dass sie glatte, lokalisierte und reversible Fest-Flüssig-Übergänge bei niedrigen Streckspannungen aufweisen 9,10,11. Während sie hervorragende rheologische Eigenschaften für den hochauflösenden Druck aufweisen, wurden granulare Gele bisher auf eine Handvoll Biomaterialien beschränkt¹². Die mangelnde Vielfalt an granulierten Gelformulierungen, die besonders deutlich wird, wenn man die breite Palette von Biomaterialien betrachtet, die für Hydrogel-Bulk-Formulierungen zur Verfügung stehen, wird durch die Notwendigkeit der kostengünstigen Herstellung einer großen Anzahl von Mikrogelen mit einfachen Chemikalien verursacht. Aufgrund der begrenzten Biomateriallandschaft granularer Gelträger stellt die Abstimmung der extrazellulären Mikroumgebung, die durch den Druckträger bereitgestellt wird, eine Herausforderung in diesem Bereich dar.

In jüngster Zeit wurde ein modularer Ansatz für die Erzeugung von eingebetteten 3D-Druckträgern entwickelt, der als selbstheilende annealable particle-extracellular matrix (SHAPE)-Verbundwerkstoffe^{bezeichnet wird 13}. Dieser Ansatz kombiniert die unterschiedlichen rheologischen Eigenschaften von granularen Gelen mit der biofunktionellen Vielseitigkeit von Bulk-Hydrogel-Formulierungen. Der vorgestellte SHAPE-Composite-Träger besteht aus gepackten Alginat-Mikropartikeln (granulare Phase, ~70% Volumenanteil) mit einem vergrößerten interstitiellen Raum, der mit einer viskosen kollagenbasierten ECM-Pregellösung (kontinuierliche Phase, ~30% Volumenanteil) gefüllt ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der SHAPE-Träger die hochauflösende Ablagerung von humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) ermöglicht, die nach dem Ausglühen des Trägerbades zu Neuronen differenziert und wochenlang aufrechterhalten werden können, um eine funktionelle Reifung zu erreichen. Der eingebettete 3D-Druck im Inneren des SHAPE-Stützbades überwindet einige der wichtigsten Einschränkungen im Zusammenhang mit herkömmlichen Techniken für die Biofabrikation von Nervengewebe und bietet gleichzeitig eine vielseitige Plattform.

Diese Arbeit beschreibt die Schritte für den eingebetteten 3D-Druck von hNSCs innerhalb des SHAPE-Trägers und ihre anschließende Differenzierung in funktionelle Neuronen (Abbildung 1). Zunächst werden Alginat-Mikropartikel durch Scherung während der internen Gelierung erzeugt. Dieser Ansatz ermöglicht die einfache Erzeugung großer Mengen von Mikropartikeln, ohne dass spezielle Geräte und zytotoxische Reagenzien erforderlich sind. Darüber hinaus ist Alginat eine weit verbreitete und kostengünstige Materialquelle für die Bildung biokompatibler Hydrogelsubstrate für eine Vielzahl von Zelltypen. Die erzeugten Alginat-Mikropartikel werden mit einer Kollagenlösung kombiniert, um das SHAPE-Komposit-Trägermaterial zu bilden. Anschließend werden die hNSCs geerntet und als zelluläre Biotinte für den 3D-Druck in eine Spritze geladen. Ein 3D-Biodrucker wird für den extrusionsbasierten eingebetteten Druck von hNSCs im Inneren des SHAPE-Verbundwerkstoffs verwendet. Die 3D-gedruckten Zellen werden zu Neuronen differenziert, so dass räumlich definierte und funktionelle menschliche neuronale Konstrukte entstehen. Schließlich beschreibt das Protokoll, wie die erzeugten Gewebekonstrukte mittels Lebendzellbildgebung und Immunzytochemie charakterisiert werden können. Zusätzlich werden Tipps zur Optimierung und Fehlerbehebung gegeben. Insbesondere konnten sowohl die Komponenten der granularen als auch der kontinuierlichen Phase mit anderen Hydrogelformulierungen ausgetauscht werden, um unterschiedliche biofunktionelle Einheiten, mechanische Eigenschaften und Vernetzungsmechanismen zu berücksichtigen, wie sie von anderen Zell- und Gewebetypen jenseits neuronaler Anwendungen benötigt werden.

Protocol

1. Vorbereitung der Puffer und Reagenzien

1. Stellen Sie Zellwachstumsmedium her, indem Sie DMEM/F12 die folgenden Ergänzungen mit L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid hinzufügen: 30 mM Glukose, 5 μM HEPES, 0,5 % w/v lipidreiches Rinderserumalbumin, 40 μM L-Alanin, 40 μM L-Asparagin-Monohydrat, 40 μM L-Asparaginsäure, 40 μM L-Glutaminsäure, 40 μM L-Prolin, 1 % N2-Ergänzung, 1 % Penicillin-Streptomycin und je 20 ng/l epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF). Führen Sie diese Schritte in einer LAF-Bank (Laminar Air-Flow) durch.
2. 1%ige w/v Alginatlösung in Reinstwasser unter kräftigem Rühren 4 h bei 60 °C herstellen. Sterilfiltrieren Sie die gelöste, heiße Alginatlösung mit einem 0,45 μm porengroßen Filter in einer LAF-Bank. Bei 4 °C lagern.
   Anmerkungen: Wenn die Temperatur der Alginatlösung unter 60 °C liegt, kann sie nicht durch den Filter geleitet werden.
3. Bereiten Sie eine 37 g/L NaHCO₃ Lösung in Reinstwasser vor. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit NaOH auf 9,5 ein und filtern Sie sie in einem LAF-Labor. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C.

2. SHAPE-Verbundwerkstoffvorbereitung

1. Erzeugung von Alginat-Mikropartikeln
   1. Bereiten Sie eine 2 mg/ml CaCO_3-Lösung in Reinstwasser in einem sterilen Becherglas zu. 1:1 mit der Alginatlösung mischen und 1 h bei Raumtemperatur mit einem Magnetrührer rühren.
   2. Fügen Sie Essigsäure im Verhältnis 1:500 hinzu und rühren Sie über Nacht bei 650 U/min.
      Anmerkungen: Die Alginatlösung beginnt sofort zu gelieren. Achten Sie darauf, einen Rührmagneten zu verwenden, der die gleiche Länge wie der Durchmesser der verwendeten Gläser hat, um ein optimales, homogenes Rühren des Formgels zu gewährleisten. Am nächsten Tag erscheint die durch Rühren während der Gelierung erzeugte Lösung viskos (Abbildung 2A).
   3. Fragmentieren Sie die gelierte Alginatlösung mechanisch in Mikropartikel, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 15.000 U/min mit einem Homogenisator in einer LAF-Bank homogenisieren (Abbildung 2B).
   4. Zentrifugieren Sie die Mikropartikel bei 18.500 × g für 20 min (Abbildung 2C) bei Raumtemperatur.
   5. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig in der LAF-Bank, resuspendieren Sie die Partikel in DMEM, die 2 mM NaOH und 1 % P/S enthalten, und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 4 °C (Abbildung 2D).
      Anmerkungen: Die Farbe der Aufhängung sollte wieder rot sein. Wenn die Suspension gelb bleibt, fügen Sie NaOH tropfenweise hinzu und mischen Sie, bis es rot wird (Abbildung 2E).
   6. Homogenisieren Sie die Partikel bei 15.000 U/min für 3 min und zentrifugieren Sie sie bei 18.500 × g für 10 min bei Raumtemperatur.
   7. Beobachten Sie das Pellet (Abbildung 2F) und entfernen Sie den Überstand vorsichtig.
      Anmerkungen: Das Pellet aus dicht gepackten Alginat-Mikropartikeln kann bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert werden. Wenn die Alginatlösung nicht filtersterilisiert wurde, sollten die Mikropartikel innerhalb von 1 Woche aufgebraucht werden.
2. SHAPE-Composite-Formulierung
   1. Am Tag vor dem Druck wird das Alginat-Mikropartikelpellet in der doppelten Menge des Wachstumsmediums, das 4 % HEPES (1 Mio. Material) und 4 % NaHCO_3-Lösung enthält, in einer LAF-Bank resuspendiert und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
   2. Zentrifugieren Sie die Mikrogelsuspension bei 18.500 × g für 10 min bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand.
   3. Neutralisieren Sie das Kollagen, das mit den Alginat-Mikropartikeln in einer LAF-Bank gemischt werden soll. Verdünnen Sie die Kollagenstammlösung, um eine Endkonzentration von 1 mg/ml zu erreichen, und neutralisieren Sie sie durch Zugabe von 4 % HEPES und 4 % NaHCO₃. Mischen Sie beispielsweise für 3 ml SHAPE-Komposit 2 ml Alginat-Mikropartikel mit 1 ml neutralisiertem Kollagen (0,12 ml HEPES, 0,12 ml NaHCO₃, 0,16 ml Wachstumsmedium und 0,6 ml Kollagen).
      Anmerkungen: Alle Materialien, die mit Kollagen gemischt werden, müssen auf Eis gehandhabt werden, um eine Kollagenpolymerisation zu vermeiden. Sobald das Kollagen neutralisiert ist, beginnt langsam die Polymerisation.
   4. Erzeugen Sie das SHAPE-Komposit, indem Sie das Alginat-Mikropartikelpellet mit dem verdünnten und neutralisierten Kollagen im Verhältnis 2:1 mischen. Mischen Sie das Gel gründlich, indem Sie es langsam auf Eis in einer LAF-Bank auf und ab pipettieren.
      Anmerkungen: Wirbeln Sie nicht, da dadurch Blasen in das Trägermaterial gelangen.
   5. In einer LAF-Bank wird das erzeugte Verbundmaterial in eine gekühlte Mikrotiterplatte oder einen geeigneten Druckbehälter überführt und innerhalb von 30 Minuten verwendet (Abbildung 3E, F).

3. hNSC-Kultur und Biotintenpräparation

1. Kultivieren Sie die Zellen in einem mit Basalmembranextrakt beschichteten T75-Kolben in Wachstumsmedium. Passieren Sie die Zellen nach dem Auftauen mindestens zweimal, bevor Sie sie für ein 3D-Druckexperiment verwenden.
2. Dissoziieren Sie die Zellen vor dem Drucken enzymatisch mit einer 0,025%igen Trypsinlösung für 5 min bei 37 °C, neutralisieren Sie das Trypsin mit Wachstumsmedium und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgesaugt und das Pellet in 2-3 ml Wachstumsmedium resuspendiert.
3. Führen Sie eine Zellzählung durch, zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 × g und resuspendieren Sie das Pellet in einem mit 0,1 % Xanthan angereicherten Wachstumsmedium (um eine Ablagerung der Zellen zu verhindern) in einer Endkonzentration von 9 × 10⁶ Zellen/ml.
4. Verwenden Sie eine stumpfe 21-G-Metallnadel, um 100 μl dicht gepackte Alginat-Mikropartikel in eine Spritze zu laden (Abbildung 3A).
   HINWEIS: Die Herstellung eines Stopfens mit den Alginat-Mikropartikeln dient zwei Zwecken: Es trägt zur Aufrechterhaltung der Extrusionsstabilität während des Drucks bei und ermöglicht die vollständige Extrusion der geladenen Zelltinte (kein totes Volumen).
5. Laden Sie mit derselben Nadel die vorbereitete Zellsuspension in die Spritze (Abbildung 3B).
   Anmerkungen: Achten Sie besonders darauf, dass während der Spritzenladeschritte keine Luftblasen entstehen. Luftblasen verursachen Instabilitäten während des Drucks.
6. Ersetzen Sie die Ladenadel durch eine stumpfe 27-G-Metallnadel, die zum Drucken verwendet wird (Abbildung 3C).

4. Eingebetteter 3D-Druck

1. Entwerfen Sie eine Struktur zum Drucken mit der referenzierten Software (siehe Materialtabelle).
   Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass Sie die Anfangshöhe der gedruckten Struktur so einstellen, dass sie innerhalb der Tiefe der SHAPE-Verbundstütze liegt. Ausführungsvorschläge finden Sie in Abbildung 4A (Spiral- und Holzstapelausführungen).
2. Generieren Sie einen G-Code, indem Sie auf Generieren klicken.
3. Führen Sie die mit Zellen beladene Glasspritze in einen volumetrischen Extrusionskopf auf einem extrusionsbasierten Biodrucker ein (Abbildung 3D).
4. Messen Sie die Nadellänge der zellbeladenen Glasspritze, indem Sie auf Nadellängenmessung klicken.
5. Legen Sie die Mikrotiterplatte oder den mit dem SHAPE-Komposit bestückten Behälter auf den Drucker.
   Anmerkungen: Halten Sie die Zellplatte oder den Behälter bis zum Druck bei 4 °C, um eine vorzeitige Vernetzung des Trägers zu verhindern.
6. Messen Sie die Oberflächenhöhe einer leeren Vertiefung innerhalb derselben Mikrotiterplatte oder desselben Behälters, in die das SHAPE-Gel geladen ist, indem Sie auf SHM (Oberflächenhöhenmessung) klicken.
   Anmerkungen: Alternativ können Sie die Oberflächenhöhe manuell bestimmen, indem Sie die Höhe der Vertiefung mit der Nadel messen.
7. Stellen Sie die Extrusionsrate auf 3,6 μL/min und die Vorschubgeschwindigkeit auf 0,3 mm/s ein.
   Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass Sie die Extrusion vor dem Drucken testen. Zellsedimentation kann zu einer Verstopfung der Düse führen und kann vermieden werden, indem ein kleines Volumen vor dem eigentlichen eingebetteten Druck vorextrudiert oder der volumetrischen Spritze ein Retraktionsvolumen hinzugefügt wird. In einigen Fällen muss die Vorschubgeschwindigkeit beim Einführen oder Verlassen des SHAPE-Gels unter 0,5 mm/s gehalten werden, um ein Ziehen der Tinte zu vermeiden.
8. Laden Sie den G-Code in die Benutzeroberfläche des Druckers.
   HINWEIS: Jedes Mal, wenn Änderungen an der entworfenen Struktur vorgenommen werden, muss ein neuer G-Code generiert werden.
9. Starten Sie den Druckvorgang, indem Sie auf Ausführen klicken (Abbildung 3G).
10. Unmittelbar nach dem Druck wird das SHAPE-Gel bei 37 °C für 30 min in einen Zellkultur-Inkubator zum Glühen gegeben.
11. Geben Sie das Nährmedium vorsichtig auf die geglühte SHAPE-Gelstütze.
12. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium am nächsten Tag durch ein Differenzierungsmedium, das wie folgt formuliert ist: DMEM/F12 mit L-Alanyl-L-glutamin-Dipeptid mit 30 mM Glukose, 5 μM HEPES, 0,5 % w/v lipidreiches Kälberserumalbumin, 40 μM L-Alanin, 40 μM L-Asparagin-Monohydrat, 40 μM L-Asparaginsäure, 40 μM L-Glutaminsäure, 40 μM L-Prolin, 1% N2-Supplement, 1% Penicillin-Streptomycin, 100 μM Dibutyrylcyclisches Adenosinmonophosphat (Dibutyryl-cAMP), und 2 ng/ml Gliazelllinien-abgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF).
    Anmerkungen: Achten Sie darauf, das Hydrogel während des Mediumwechsels nicht zu beschädigen. Kippen Sie die Platte und entfernen Sie das alte Medium vorsichtig. Geben Sie frisches Medium tropfenweise auf die Wand der Vertiefung, die das Gel enthält, anstatt direkt auf das Gel. Verwenden Sie keinen Absauger, um das Medium zu entfernen.
13. Aktualisieren Sie das Differenzierungsmedium alle 2 Tage bis zum experimentellen Endpunkt.

5. Lebendzell-Fluoreszenz-Bildgebung

1. Entfernen Sie überschüssiges Medium aus dem Gel.
2. Fügen Sie dem Volumen des Trägergels ein gleiches Volumen von 20 μM Calcein AM (verdünnt in Differenzierungsmedium aus der Stammlösung) hinzu.
3. 40 min bei 37 °C inkubieren.
4. Entfernen Sie die Calcein AM-Lösung und fügen Sie eine angemessene Menge frisches Differenzierungsmedium hinzu.
5. Übertragen Sie die Platte zur Bildgebung auf das Mikroskop.

6. Immunzytochemie

1. Entfernen Sie das überschüssige Medium aus dem Gel.
2. Übertragen Sie das Gel mit einem kleinen Spatel in einen größeren Behälter mit DPBS.
3. Waschen Sie den Teller dreimal für jeweils 20 Minuten mit DPBS und legen Sie den Teller in einen Abzug.
4. Entfernen Sie das DPBS, fügen Sie genügend 4%ige Formaldehydlösung hinzu, um das Gel zu bedecken, und inkubieren Sie es 1 Stunde lang bei Raumtemperatur.
5. Dreimal mit DPBS für jeweils 20 Minuten waschen.
6. Bereiten Sie eine Blockierlösung vor, die aus 5 % Eselsserum, 0,25 % Detergento und 0,02 % Natriumazid in DPBS besteht.
   Anmerkungen: Bereiten Sie das Dreifache des Volumens vor, das zum Abdecken des Gels erforderlich ist. Es wird später als Basis für die primären und sekundären Antikörperlösungen verwendet.
7. Nach dem Waschen mit DPBS die Blockierlösung in das Gel geben und 6 h bei Raumtemperatur inkubieren, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden. Schaukeln Sie den Teller vorsichtig.
8. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung vor, indem Sie den TUBB3-Antikörper in Blockierungslösung im Verhältnis 1:1.000 verdünnen.
9. Entfernen Sie die Blockierungslösung aus dem Gel, fügen Sie die primäre Antikörperlösung hinzu und inkubieren Sie sie 48 h lang bei 4 °C. Schaukeln Sie den Teller vorsichtig.
10. Dreimal mit DPBS für jeweils 20 Minuten waschen.
11. Die sekundäre Antikörperlösung wird durch Verdünnen von 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1:1.000) und des sekundären Antikörpers (1:200) in Blockierungslösung hergestellt.
12. Nach dem Waschen mit DPBS wird das Gel in der sekundären Antikörperlösung für 24 h bei 4 °C inkubiert. Schaukeln Sie den Teller vorsichtig.
13. Dreimal mit DPBS für jeweils 20 min waschen und bis zur Bildgebung bei 4 °C lagern.
14. Übertragen Sie das gefärbte Gel vor der Bildgebung mit einem Spatel in eine Schale oder eine Well-Platte mit einem dünnen Bildboden.

Results

Die Herstellung von Alginat-Mikrogelen durch Scherverdünnung während der internen Gelierung, gefolgt von mechanischer Fragmentierung, ergibt Alginat-Mikrogele, die polydispergiert und flockenartig geformt sind, wie in Abbildung 2G zu sehen ist. Die Größe dieser unregelmäßigen Partikel reicht von weniger als 1 μm bis zu einem Durchmesser von etwa 40 μm. Dicht gepackt bilden die Mikropartikel ein transparentes Schüttgut, das nur geringfügig undurchsichtiger ist als das entsprechende Zellkulturmedium (Abbildung 2F). Die Transparenz des Trägermaterials ist ein wichtiger Aspekt der Plattform, da sie die Visualisierung der gedruckten Strukturen während der Kultivierungsphase sowie die hochauflösende konfokale Mikroskopie von Konstrukten ermöglicht, die sowohl mit Lebendzellfarbstoffen als auch mittels Immunzytochemie markiert wurden. Wenn es in gepuffertem Zellkulturmedium eingeweicht wird, sollte das resultierende pH-angepasste Gel eine rote Farbe haben, die auf physiologische Bedingungen hinweist (Abbildung 2F). Es ist aus zwei Gründen wichtig, den pH-Wert der Alginat-Mikropartikel zu neutralisieren. Saure Mikropartikel können die Zellen direkt schädigen. Darüber hinaus verhindert ein saures Milieu das erfolgreiche Glühen des SHAPE-Kompositträgers, da es die Kollagenpolymerisation stören würde.

Das Drucken der hNSC-Tinte mit den oben beschriebenen Parametern ergibt ein Filament aus Zellen mit einem Durchmesser von ~200 μm (Abbildung 4A). Die programmierte Geometrie bleibt sowohl beim Drucken in einer Ebene als auch beim Drucken von Strukturen übereinander erhalten. Beim Mehrschichtdruck bleiben die gedruckten Strukturen intakt, mit einem Mindestabstand von Schicht zu Schicht von 200 μm¹³. Die Lebensfähigkeit der Zellen sollte während der Farbvorbereitung und Extrusion nicht wesentlich beeinträchtigt werden. Die gedruckten Stränge sind reich an lebenden Zellen, die eine runde Morphologie aufweisen (Abbildung 4B, links). Lücken in den gedruckten Strängen können am Tag nach dem Druck auftreten, auch wenn das fabrizierte Konstrukt unmittelbar nach dem Druck keine Verformungen aufweist. Dies ist höchstwahrscheinlich das Ergebnis einer inhomogenen Durchmischung des Trägers. Da die Zellen nicht mit den Alginat-Mikropartikeln interagieren, wandern sie von den alginatreichen Bereichen weg in die kollagen- und zellreichen Bereiche und verursachen so Brüche in den gedruckten Strängen. Des Weiteren sollte der SHAPE-Träger blasenfrei sein, da Lufteinschlüsse die Drucktreue beeinträchtigen können.

Eine erfolgreiche Differenzierung von hNSCs sollte 30 Tage nach dem Drucken neuronenreiche Strukturen ergeben, wobei die Zellen eine neuronale Morphologie mit kleinen Zellkörpern und langen, dünnen Fortsätzen aufweisen (Abbildung 4B, rechts). Wenn dichte Muster gedruckt werden, wie z. B. ein rechteckiges Zellblatt, sollten sich während der Differenzierung keine sichtbaren Lücken oder Aggregate bilden, sondern eine durchgehende Zellschicht intakt bleiben (Abbildung 4C). In diesem Protokoll wird ein Verfahren zur Fluoreszenz-Immunzytochemie der 3D-gedruckten Proben beschrieben. Die Färbung von TUBB3, einem zytoplasmatischen neuronalen Marker, ermöglicht die direkte Visualisierung der generierten neuronalen Netzwerke. Die Fluoreszenzmikroskopie der differenzierten Drucke sollte Strukturen aufdecken, die reich an TUBB3 sind und eine beibehaltene Geometrie aufweisen (Abbildung 4D, links). Während des Differenzierungsprozesses wandern die Zellen nicht aus den gedruckten Strängen heraus, wie bei der Färbung von Zellkernen mit DAPI beobachtet werden kann (Abbildung 4D, Mitte). Infolgedessen werden neuronale Körper innerhalb der Grenzen der gedruckten Geometrie beobachtet, mit axonalen Projektionen, die Hunderte von Mikrometern in den SHAPE-Träger ausstrahlen, der das Konstrukt umgibt. Die axonale Erkundung des umgebenden Volumens deutet darauf hin, dass die SHAPE-Unterstützung biofunktionelle Hinweise liefert, die eine axonale Wegfindung ermöglichen. Ausgereiftere neuronale Marker oder subtypspezifische Marker könnten in der Immunzytochemie verwendet werden, um die generierten neuronalen Populationen weiter zu charakterisieren. Des Weiteren konnte das gedruckte neuronale Konstrukt mittels RT-qPCR oder Elektrophysiologie¹³ charakterisiert werden. Beide Ansätze würden jedoch die Entfernung von Kollagen mittels Kollagenase erfordern, da die Hydrogelschicht sowohl die RNA-Extraktion als auch den physischen Zugang zu den Zellen mit einer Mikropipette behindert.

Abbildung 1: Konzeptionelle Darstellung des Embedded-Printing-Ansatzes von SHAPE. Eine Kollagenlösung wird mit Alginat-Mikropartikeln gemischt, um das SHAPE-Komposit zu bilden. Das SHAPE-Komposit wird als Trägermaterial für den eingebetteten 3D-Druck von hNSCs verwendet, die innerhalb des getemperten Trägers in Neuronen differenziert werden. Die biofunktionellen Eigenschaften des SHAPE-Komposits ermöglichen es den Neuronen, Projektionen zu erweitern und den leeren Teil des Trägers mit ihren axonalen Projektionen zu bevölkern. Diese Abbildung wurde von Kajtez et ^al.13 modifiziert. Abkürzungen: SHAPE = selbstheilende temperierbare Partikel-extrazelluläre Matrix; hNSCs = humane neurale Stammzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Herstellung von Alginat-Mikropartikeln . (A) Die Alginatlösung nach Gelierung über Nacht. (B) Die durch Homogenisierung erzeugten Alginat-Mikropartikel. (C) Das Partikelpellet nach dem Zentrifugieren. (D) Das Pellet wurde vor der pH-Einstellung und nach der pH-Einstellung in DMEM (E) resuspendiert. (F) Die Mikropartikel nach Inkubation in Medium über Nacht und Zentrifugation. (G) Ein Hellfeldbild der hergestellten Alginat-Mikropartikel. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Vorbereitung für den 3D-Druckprozess. (A) Ein Slurry-Pfropfen (~100 μL) wird in die Spritze geladen, gefolgt von (B) der Beladung der zellulären Biotinte (hier ergänzt mit farbigen Beads zu Visualisierungszwecken). (C) Die konische Kunststoffspitze (21 G), die zum Einlegen der Tinte verwendet wird, wird durch eine stumpfe 27-G-Nadelspitze aus Metall ersetzt. (D) Die Spritze wird in den 3D-Druckkopf eingeführt. (E,F) Das SHAPE-Komposit wird in eine Vertiefung einer 48-Well-Platte pipettiert. Der Schlauch mit dem SHAPE-Verbundwerkstoff wird auf Eis gehalten, wenn er nicht gehandhabt wird. (G) Die Drucknadelspitze wird in die SHAPE-Halterung eingeführt und der Druck des durch das Computerdesign definierten Pfads wird gestartet (hier ist der Druck einer Spirale dargestellt). Abkürzung: SHAPE = selbstheilende temperbare Partikel-extrazelluläre Matrix. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: 3D-gedruckte neuronale Konstrukte im Inneren des SHAPE-Verbundträgers. (A) Hellfeldbilder von gedruckten hNSCs im Inneren des Trägerhydrogels. Es werden Spiralkonstruktionen (links) und Holzstapelkonstruktionen (rechts) angezeigt. (B) Lebendzell-Bildgebung eines 3D-gedruckten Konstrukts am Tag nach dem Drucken (links) und nach neuronaler Differenzierung (rechts). (C) Ein 3D-gedrucktes quadratisches Konstrukt, das mit einem Spatel aus einem Kultivierungsbrunnen entfernt wurde, zeigt strukturelle Integrität. (D) Konfokale Fluoreszenzbilder desselben quadratischen Konstrukts, immunmarkiert für einen neuronalen Marker (TUBB3) und mit gegengefärbten Kernen (DAPI), die die erfolgreiche Differenzierung der hNSCs innerhalb der 3D-gedruckten Konstrukte bestätigen. Maßstabsbalken = 500 μm (A, rechts); 100 μm (B,D). Die Tafeln C und D in dieser Abbildung wurden von Kajtez et ^al.13 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Der SHAPE-Verbundwerkstoffansatz bietet einen vielseitigen Weg für die Formulierung von glühbaren und biofunktionalen Trägerbädern für den eingebetteten 3D-Druck von zellulären Tinten. Während dieses Protokoll ein Beispiel für den 3D-Druck neuronaler Konstrukte darstellt, könnte die SHAPE-Toolbox leicht an die Biofabrikation mit anderen Zellquellen angepasst werden, um eine Reihe von Zielgewebetypen präzise zu entwickeln. Der Druckansatz würde auch die präzise Strukturierung mehrerer Zelltypen ermöglichen, um ihre Interaktion zu untersuchen oder Gewebe mit einer definierten räumlichen Anordnung der zellulären Kompartimente (z. B. Neuronen und Gliazellen) zu manipulieren. Im Gegensatz zu den herkömmlichen granularen Gelen enthält das SHAPE-Komposit einen erweiterten interstitiellen Raum (~30% Volumenanteil für die in diesem Protokoll vorgestellte Formulierung). Die körnige Komponente dient als rheologischer Modifikator, der dem Verbundwerkstoff günstige Materialeigenschaften für den hochauflösenden Embedded-Druck verleiht. Dies eröffnet einen Weg zu einem rationalen Design der zellulären Mikroumgebung, indem die Formulierung der kontinuierlichen Komponente unter Beibehaltung der gleichen granularen Komponente geändert wird. So könnten beispielsweise andere funktionelle EZM-Moleküle in das Trägerbad eingebracht werden (z. B. Hyaluronsäure, Laminine, Fibronektin) oder andere Vernetzungsmechanismen genutzt werden (z. B. enzymatisch, lichtbasiert)¹³. Darüber hinaus könnte das Alginat in der Granulatkomponente durch Mikropartikel aus verschiedenen Hydrogelmaterialien (z. B. Gelatine⁸, Polyethylenglykol^14,15, Agarose ¹⁶) ersetzt oder in verschiedenen Größen und Formen hergestellt werden^, um den Anforderungen verschiedener Anwendungen im Bereich der Gewebezüchtung oder Krankheitsmodellierung gerecht zu werden. Das Verhältnis zwischen der körnigen und der kontinuierlichen Phase kann an die Anforderungen einzelner 3D-Druckprojekte angepasst werden, aber eine Erhöhung der kontinuierlichen Phase über 30 % hinaus kann die Drucktreue und -auflösung beeinträchtigen.

Während der Mikrogel-Produktionsschritte ist es entscheidend, dass das Rühren der Alginatlösung nach der Zugabe von Essigsäure über das gesamte Volumen der Gelierlösung wirksam ist. Wenn die Rührgeschwindigkeit zu niedrig oder der Magnetrührer zu klein ist, erreicht das Rühren möglicherweise nicht die oberen Schichten der Lösung, die sich in ein großes Volumen an vernetztem Hydrogel verwandeln, während die unteren Schichten geschert werden. Die Homogenisierung eines inkonsistent gescherten Alginat-Hydrogels führt zur Erzeugung von Alginat-Mikropartikeln, die für 3D-Druckanwendungen suboptimal sind. Darüber hinaus müssen die Alginat-Mikropartikel gründlich mit der Kollagenlösung vermischt werden, da eine inhomogene Mischung dazu führt, dass Stellen des Trägermaterials kein Kollagen enthalten. Diese Patches wären nicht getempert und hätten daher keine zellinteraktiven Funktionen. Es könnte auch Patches geben, denen Alginat-Mikropartikel fehlen und die daher das Drucken nicht unterstützen würden. Ein inhomogen gemischter Druckträger wäre daher nicht in der Lage, den High-Fidelity-Druck zu unterstützen, und wäre strukturell beeinträchtigt, da er nicht in seinem gesamten Volumen geglüht würde. Auch Blasen sollten vermieden werden, nicht weil sie schädlich für die Zellen sein könnten, sondern weil Lufteinschlüsse beim Drucken Verformungen verursachen und die Abbildung der Konstrukte stören könnten. Zwei häufige Quellen für Blasen sind das Vortexing (Mikrobläschen im kalten Träger, die sich während des Glühens des Trägers bei 37 °C ausdehnen) und das kräftige Pipettieren.

Der SHAPE-Kompositträger in dieser Arbeit wurde nicht als Opfermaterial formuliert, das nach dem Druck entfernt werden muss, sondern als langfristige biofunktionelle Unterstützung sowohl für die Stammzelldifferenzierung als auch für das neuronale Wachstum und die funktionelle Reifung. Im Vergleich zu granularen Gelen, die nach dem Druck nicht getempert werden, bieten die strukturelle Stabilität und Transparenz des getemperten SHAPE-Verbundmaterials eine schützende Umgebung für empfindliche neuronale Merkmale während des Prozesses der Fixierung und Immunmarkierung, so dass dieses Material die morphologische Charakterisierung durch die Visualisierung von Antigenen erleichtert. Fluoreszenzreporter könnten auch verwendet werden, um Veränderungen in der Zellmorphologie im Laufe der Zeit zu verfolgen sowie die Zellproliferation und -migration innerhalb des getemperten Druckträgers zu überwachen. Darüber hinaus könnten Calcium-Imaging-Ansätze verwendet werden, um Informationen über spontane zelluläre Aktivität (z.B. das Auslösen von Aktionspotentialen in Neuronen oder sogar die synchrone Aktivität neuronaler Netzwerke) zu erhalten. Die chemische Stimulation der künstlich hergestellten zellulären Konstrukte (z. B. neuronale Stimulation mit KCl) könnte jedoch aufgrund der Hydrogelschicht, die die Zellen umgibt, schwierig sein, was die Diffusion verlangsamt und die sofortige Modulation der zellulären Mikroumgebung verhindert. Die optogenetische Stimulation stellt eine bessere Option zur Kontrolle der Zellaktivität dar, da die SHAPE-Hydrogele den optischen Zugang zu den Zellen nicht behindern.

Sauerstoffempfindliche Beads könnten in die Biotinte oder in das Trägermaterial eingearbeitet werden (durch Direktdruck oder Dispergierung während der Kompositpräparation), um eine räumliche und zeitliche Live-Kartierung der Sauerstoffspannungsniveaus innerhalb und um die gedruckten Konstrukte mit hoher Empfindlichkeit zu ermöglichen¹³. Dieser nicht-invasive 3D-Sauerstoffkartierungsansatz, der auf Phosphoreszenz-Lebensdauermessungen basiert, bietet einen Weg zur Herstellung von Gewebekonstrukten mit verbesserter Sauerstoffversorgung und wahrscheinlich auch verbesserter Nährstoffversorgung. Eine schlechte Sauerstoffversorgung könnte zur Bildung nekrotischer Regionen innerhalb der gedruckten Konstrukte führen, die Differenzierung von Stammzellen stören und den neuronalen Stoffwechsel beeinträchtigen. Die Sauerstoffkartierung liefert eine Anzeige, auf deren Grundlage das 3D-Druckdesign geändert werden kann, um eine gleichmäßige Sauerstoffversorgung im gesamten Konstrukt, die Feinabstimmung des Sauerstoffgehalts an die physiologischen Bedingungen oder die Erzeugung von Sauerstoffgradienten zu ermöglichen.

Speziell entwickelte Kanäle können auch in den glühbaren Druckträger eingearbeitet werden, indem eine Opfertinte, wie z. B. Gelatine, gedruckt wird, die sich im kalten Stützbad verfestigt, aber bei 37 °C leicht evakuiert werden kann ^4,13. Kanäle wären erforderlich, um Gewebekonstrukte mit hoher Zelldichte oder Abmessungen, die die Möglichkeiten eines designbasierten Ansatzes zur Manipulation der Sauerstoffspannung übersteigen, mit Nährstoffen und Sauerstoff zu versorgen. Darüber hinaus könnten vaskuläre Kanäle genutzt werden, um Gradienten aus kleinen Molekülen zu erzeugen, die die Musterbildung der zellulären Identität steuern, die zelluläre Aktivität modulieren oder die Chemotaxis steuern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der eingebettete 3D-Druck im Inneren des SHAPE-Verbundwerkstoffs eine modulare Materialplattform bietet, die leicht anpassbar ist und ein vielseitiges Potenzial für die funktionelle Modellierung mechanisch empfindlicher Gewebe bietet. Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine detaillierte Erläuterung der notwendigen Schritte und Grundprinzipien, die erforderlich sind, um das Trägermaterial zu erzeugen und die zelluläre Tinte mit hoher Wiedergabetreue zu drucken. Der Ansatz nutzt erschwingliche Materialien und zugängliche Geräte und bietet gleichzeitig Raum für die Personalisierung des Ansatzes an die Bedürfnisse und Anwendungen der einzelnen Forscher.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL gasdichte Spritze 1001 TLL	Hamilton	81320
3DDiscovery 3D-Bioprinter	RegenHU
Essigsäure	Sigma-Aldrich	A6283
AlbuMAX	ThermoFisher	11020021
Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper	ThermoFisher	A-11001	Ziegen-Anti-Maus
Stumpfe Nadel, Sterican (21 g)	Braun	9180109
Stumpfe Nadel (27 G)	Cellink	NZ5270505001
BioCAD-Software	SolidWorks
Calcein AM	ThermoFisher	65-0853-39
Calciumcarbonat	Sigma-Aldrich	C5929
Dibutyryl-cAMP Natriumsalz	Sigma-Aldrich	D0627
Cultrex Rat Kollagen I (5 mg/mL)	R& D-Systeme	3440-100-01
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM/F-12, GlutaMAX	ThermoFisher	10565018
Eselserum	Sigma-Aldrich	D9663
DPBS	ThermoFisher	14190094
EGF	R& D-Systeme	236-EG
FGF	R& D-Systeme	3718-FB
Formaldehydlösung 4 %, gepuffert, pH 6,9	Sigma-Aldrich	100496
GDNF	R& D-Systeme	212-GD
Geltrex	ThermoFisher	A1569601
Glukose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES-Puffer (1 M)	ThermoFisher	15630080
L-Alanin	Sigma-Aldrich	5129
L-Asparagin-Monohydrat	Sigma-Aldrich	A4284
L-Asparaginsäure	Sigma-Aldrich	A9256
L-Glutaminsäure	Sigma-Aldrich	G1251
L-Prolin	Sigma-Aldrich	P0380
Magnetischer Rührer RET Basic	IKA	3622000
N-2-Ergänzung	ThermoFisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher	15140122
S25N-10G Dispersionswerkzeug	IKA	4447100
Natriumalginat (80–120 cP)	FUJIFILM Wako	194-13321
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2002
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich	S5761
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	S5881
T18 Digitaler ULTRA-TURAX-Homogenisator	IKA	3720000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trypsin/EDTA-Lösung	ThermoFisher	R001100
TUBB3-Antikörper	BioLegend	801213	Maus
Xanthan-Gummi	Sigma-Aldrich	G1253