Wir präsentieren Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Erzeugung von Chimären Neugeborenen sowie die Präparation und Vorbereitung des Thymus für die Ex-vivo-Bildgebung durch 2-Photonen-Mikroskopie.
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Methodenartikel
In situ Imaging der Maus Thymus mit 2-Photonen-Mikroskopie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zwei-Photonen-Mikroskopie (TPM) ermöglicht es uns, Bild tief in den Thymus und dokumentieren die Ereignisse, die wichtig sind für die Thymozyten Entwicklung. Zu folgen, die Migration von Individuen in einer Menge von Thymozyten, generieren wir Neugeborenen Chimären, in denen weniger als ein Prozent der Thymozyten von einem Spender, dass transgene für ein ubiquitär ausdrückliche fluoreszierenden Proteins abgeleitet werden. Zur Erzeugung dieser partiellen hämatopoetischen Chimären sind neonatale Empfänger mit Knochenmark zwischen 3-7 Tage alt injiziert. Nach 4-6 Wochen wird die Maus getötet und die Thymusdrüse wird sorgfältig präpariert und bissected Erhaltung der Architektur des Gewebes, das abgebildet werden soll. Der Thymus ist auf einem Deckglas in der Vorbereitung für die Ex-vivo-Bildgebung von TPM geklebt. Während die Abbildung der Thymus ist in DMEM ohne Phenolrot mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid durchströmt wird, und erwärmt auf 37 ° C gehalten Mit diesem Ansatz können wir untersuchen, die Ereignisse für die Erzeugung von einem vielfältigen T-Zell-Repertoires erforderlich.
Protokoll
Adoptiven Transfer
Inject Neugeborenen mit 50-100 ul des Knochenmarks mit einer Insulin-Spritze 2-4 mal während der ersten 3-7 Tage des Lebens, mit einem letzten Donor-zu-Host-Verhältnis von 1:1. Ziel für eine Injektionsstelle unter dem Brustbein und Rippen, aber über dem Darm und Magen. Führen Sie die Nadel weit genug, um das Bauchfell, Achten Sie darauf, Punktion der Membran zu durchdringen. Es ist nicht ungewöhnlich für einen Teil der Knochenmark während der Injektion verloren zu sein. Sie können den Verlust durch Lösen Sie den Griff der Welpe zu reduzieren, wie Sie spritzen, um so lassen die Haut zu erweitern und dann langsam dem Entfernen der Nadel.
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Diskussion
Zwei-Photonen-Imaging in den Thymus ermöglicht es uns, in lebendige, intakte Organe der Wechselwirkungen und Migrationen, die Auswahl Ereignisse im Thymus zugrunde zu untersuchen.
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir bedanken uns bei Matt Paul und Jimmy Wu für die technische Unterstützung.
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Referenzen
- Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
