Dette manuskript beskriver en totrinsprotokol til generering af patientspecifikke podocytter fra dermale fibroblaster via episomal omprogrammering til menneskeinducerede pluripotente stamceller (hiPSC’er) og efterfølgende differentiering i podocytter.
Podocytter er epitelceller, der sidder på urinstedet i den glomerulære filtreringsbarriere, der bidrager til glomerulus selektive filterfunktion. Mutationer i podocytspecifikke gener kan forårsage fokal segmental glomerulosklerose (FSGS), og podocytter påvirkes også i mange andre primære og sekundære nefropatier. På grund af deres differentierede natur er primære cellekulturmodeller begrænset til podocytter. Derfor anvendes almindeligt betinget udødeliggjorte celler. Disse betinget udødeliggjorte podocytter (ciPodocytter) har imidlertid flere begrænsninger: cellerne kan dedifferentiere i kultur, især når de når sammenløb, og flere podocytspecifikke markører udtrykkes enten kun lidt eller slet ikke. Dette sætter spørgsmålstegn ved brugen af ciPodocytter og deres anvendelighed til fysiologisk, patofysiologisk og klinisk rækkevidde. Her beskriver vi en protokol til generering af humane podocytter – inklusive patientspecifikke podocytter – fra en hudstansbiopsi ved episomal omprogrammering af dermale fibroblaster til hiPSC’er og efterfølgende differentiering til podocytter. Disse podocytter ligner in vivo podocytter meget bedre med hensyn til morfologiske egenskaber, som udviklingen af fodprocesser og ekspressionen af den podocytspecifikke markør. Endelig, men vigtigt, opretholder disse celler patienternes mutationer, hvilket resulterer i en forbedret ex vivo-model til undersøgelse af podocytsygdomme og potentielle terapeutiske stoffer i en individualiseret tilgang.
Podocytter er specialiserede, postmitotiske nyreepitelceller, der danner nyrens glomerulære filtreringsbarriere sammen med den glomerulære kældermembran (GBM), glomerulære endotelceller og glycocalyx. Fænotypisk består podocytter af en cellekrop og primære, mikrotubulusdrevne membranforlængelser samt sekundære forlængelser kaldet fodprocesser 1,2. Den glomerulære filtreringsbarriere, der filtrerer urin fra blodet, er bygget af fenestreret endotel, GBM og en specialiseret type intercellulær krydsning, der forbinder nærliggende podocytfodprocesser, kaldet spaltemembranen af podoctyes3. Under sunde forhold bevares proteiner, der er større end albumin, fra filtreringsbarrieren på grund af deres størrelse og ladning4.
Mutationer i cytoskeletal- eller podocytspecifikke gener såvel som cirkulerende faktorer, der påvirker podocytsignalveje, er kendt for at inducere podocytudsugning, løsrivelse eller apoptose, hvilket resulterer i proteinuri og glomerulær sklerose. Især cytoskeletal omlejring, ændringer i podocytpolaritet eller beskadigelse af fodprocesser med et tilhørende tab af spaltekryds er afgørende5. På grund af deres terminalt differentierede status kan podocytter næppe udskiftes efter frigørelse af GBM. Men hvis podocytter er fastgjort til GBM, kan de stadig komme sig efter udslettelse og reformere interdigiterende fodprocesser 6,7,8. Yderligere forståelse af de begivenheder, der fører til podocytskader i forskellige glomerulære lidelser, kan give nye terapeutiske mål, der vil hjælpe med at udvikle behandlinger for disse sygdomme. Podocytskader er et kendetegn ved forskellige glomerulære sygdomme, herunder fokal segmental glomerulosklerose (FSGS), diabetisk nefropati, minimal forandringssygdom og membranøs glomerulonefropati, der kræver pålidelige podocyt ex vivo-modeller for at studere de patologiske mekanismer og potentielle behandlingsmetoder for disse sygdomme 9,10. Podocytter kan undersøges ex vivo ved klassisk primær cellekultur baseret på isolering af glomeruli ved differentiel sigtning11. På grund af den terminalt differentierede tilstand med begrænset spredningskapacitet bruger de fleste forskere imidlertid muse- eller humane ciPodocyt-cellelinjer, der udtrykker temperaturfølsomme varianter af SV40 store T-antigen. Alternativt isoleres ciPodocytter fra transgene mus, der huser SV40-mærkets udødeliggørende gen 1,12.
CiPodocytter formerer sig ved 33 °C, men går ind i vækststop og begynder at differentiere ved 37 °C13,14. Det skal erindres, at eksperimentelle data opnået med disse celler skal fortolkes med en vis forsigtighed, da cellerne genereres ved hjælp af en unaturlig genindsættelse15. Da disse celler har et udødeliggørende gen, ændres den cellulære fysiologi på grund af igangværende spredning12. Podocytcellelinjer genereret af denne tilgang er for nylig blevet stillet spørgsmålstegn ved, da mus, mennesker og rotter ciPodocytter udtrykker mindre end 5% synaptopodin og nephrin på proteinniveau samt NPHS1 og NPHS2 på mRNA-niveau sammenlignet med glomerulær ekspression16. Desuden udtrykker de fleste podocytcellelinjer ikke nephrin17,18. Chittiprol et al. beskrev også en signifikant forskel i cellemotilitet og respons på puromycin og doxorubicin i ciPodocytter16. Podocytter kan findes i urinen efter løsrivelse fra GBM i forskellige glomerulære sygdomme 19,20,21,22. Levedygtige urinpodocytter kan dyrkes ex vivo i op til 2-3 uger, men de fleste celler gennemgår apoptose23,24. Interessant nok findes podocytter ikke kun i urinen hos patienter med glomerulær sygdom, men også i urinen hos raske forsøgspersoner, sandsynligvis når de er senescerende igen med et begrænset potentiale for replikation i kultur24. Desuden er det urinafledte podocytnummer begrænset, og cellerne dedifferentierer i kultur, viser mindre fodprocesser, ændrer morfologi og vigtigst af alt har begrænset spredningskapacitet. Ekspressionen af podocytspecifikke gener er fraværende, forsvinder inden for få uger eller varierer mellem disse cellekloner. Nogle celler, der er positive for den podocytspecifikke markør, udtrykte markøren for rørformede epitelceller eller myofibroblaster og mesangialceller, hvilket tyder på dedifferentiering og/eller transdifferentiering af de dyrkede urinpodocytter24,25.
For nylig er dannelsen af ciPodocytcellelinjer afledt af urinen hos patienter og raske frivillige ved transduktion med et termofølsomt SV40 stort T-antigen og hTERT blevet beskrevet26. mRNA-ekspression for synaptopodin, nestin og CD2-associeret protein blev påvist, men podocin mRNA var fraværende i alle kloner. Ud over problemerne med urinpodocytter indeholder disse celler også det indsatte udødeliggørende gen, hvilket resulterer i de ulemper, der er diskuteret ovenfor.
I modsætning hertil har humant inducerede pluripotente stamceller (hiPSC’er) en enorm kapacitet til selvfornyelse og differentiering i flere celletyper under passende forhold. Det har tidligere vist sig, at hiPSC’er kan tjene som en næsten ubegrænset kilde til podocytter27,28.
Her beskrives en totrinsprotokol til generering af patientspecifikke podocytter fra dermale fibroblaster af hudstansbiopsier med efterfølgende episomal omprogrammering til hiPSC’er og en endelig differentiering i hiPSC-afledte podocytter (figur 1).
Figur 1: Protokol til generering af patientspecifikke hiPSC-afledte podocytter. Grafisk oversigt over protokollen til generering af patientspecifikke podocytter fra dermale fibroblaster af en hudbiopsi ved omprogrammering til hiPSC’er og differentiering til podocytter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Som et første skridt blev somatiske dermale fibroblaster vokset ud af en hudstansbiopsi og omprogrammeret til hiPSC’er ved hjælp af en integrationsfri metode ved elektroporation med plasmider, der udtrykker transkriptionsfaktorerne OCT3/4, KLF4, SOX2 og c-MYC 29,30,31. Opståede hiPSC-kolonier blev efterfølgende udvalgt og udvidet. Differentiering begyndte med induktion af den mesodermale afstamning ved aktivering af WNT-signalvejen efterfulgt af generering af nefronstamceller, der stadig var i stand til at proliferere. Endelig blev cellerne differentieret til podocytter. I denne procedure ændrede og kombinerede vi tidligere offentliggjorte protokoller til episomal omprogrammering til generering af hiPSC’er af Bang et al.32 og Okita et al.33 samt en protokol til differentiering af hiPSC’er i podocytter af Musah et al.28,34,35.
Faktisk havde podocytter genereret af vores protokol en fænotype tættere på podocytter in vivo, hvad angår udviklingen af et særskilt netværk af primære og sekundære fodprocesser og ekspressionen af podocytspecifikke markører, som synaptopodin, podocin og nephrin. Ved brug af hiPSC-afledte podocytter opretholdes patientens genetiske baggrund under omprogrammering og differentiering. Dette muliggør patientspecifik podocytsygdomsmodellering og opdagelse af potentielle terapeutiske stoffer ex vivo i et næsten ubegrænset celleantal. Desuden er denne protokol minimalt invasiv, omkostningseffektiv, etisk acceptabel og kan fremme nye veje til udvikling af lægemidler.
Denne cellekulturbaserede protokol kombinerer episomale omprogrammering af humane dermale fibroblaster til patientspecifikke hiPSC’er og efterfølgende differentiering i hiPSC-afledte podocytter. Dette giver os mulighed for at studere mutationsrelaterede ændringer af podocytter fra patienter med genetisk glomerulær sygdom vedrørende podocytskade. Protokollen til omprogrammering af dermale fibroblaster med en integrationsfri metode ved elektroporation er tilpasset fra det offentliggjorte arbejde af Bang et al.32 og Okita et al.33. Protokollen til differentiering af podocytter fra hiPSC’er er tilpasset fra den offentliggjorte protokol fra Musah et al.28,34,35. Der findes allerede publikationer, der beskriver dannelsen af podocytter fra hiPSC’er 27,34,35. Imidlertid er protokollen, der leveres her, optimeret og billigere med hensyn til differentiering af hiPSC’er i podocytter. Sammenlignet med den offentliggjorte protokol fra Musah et al. testede vi denne protokol på forskellige belægningsreagenser, som vitronectin, laminin silke-511 og opløselig kældermembranmatrix. Koncentrationerne af vitronectin og laminin silke-511 kunne reduceres til 2.5 μg / ml i stedet for 5 μg / ml 28,34,35. Desuden var det muligt at reducere koncentrationerne af BMP7 og activin A-to meget dyre vækstfaktorer – med 50%, fra 100 ng / ml til 50 ng / ml.
Dette muliggør billigere differentiering. Nephron stamceller fra dag 7 spredte sig stadig, og muligheden for frysning blev vist før. Vi udvidede disse celler efter optøning og før endelig differentiering i basisk medium indeholdende Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) og B27 i flere dage, hvilket reducerede omkostningerne yderligere. Ud over differentieringstrinnene beskriver denne protokol udvæksten af fibroblaster fra hudbiopsier med efterfølgende generering af patientspecifikke hiPSC’er via episomal omprogrammering. Kombinationen af disse to metoder muliggør generering af patientspecifikke podocytter. Derfor gives her en komplet trin-for-trin-protokol til generering af patientspecifikke hiPSC-afledte podocytter, som ikke blev beskrevet før så detaljeret.
Da den overordnede protokol indeholder flere forskellige celletyper, er det afgørende at karakterisere de genererede celletyper på forskellige trin. Celler er i kultur i længere tid, så kvalitetskontrol skal udføres ved forskellige passager. Når man arbejder med hiPSC’er, er daglig fodring samt celleadfærd og morfologiovervågning nødvendig. Differentieringsmediets sterilitet skal sikres ved filtersterilisering gennem et 0,2 μm filter. Hele protokollen, fra hudbiopsi til hiPSC-afledte podocytter, tager flere måneder, men det er muligt at fryse cellerne på forskellige stadier af processen. Fibroblaster, udvalgte hiPSC-kloner og proliferative nefronstamceller efter 7 dage i nefronprogenitordifferentieringsmedium kan fryses, og der kan genereres en fungerende cellebank.
Selvom hiPSC-afledte sunde podocytter udvikler et særskilt netværk af primære og sekundære fodprocesser (figur 5A, B) og udtrykker typisk podocytspecifik markør (figur 6A-C), er karakteristiske spaltemembraner, som det ses in vivo, svære at efterligne i klassiske todimensionelle cellekulturmodeller. Desuden er intercellkommunikation med andre glomerulære celletyper ikke mulig i denne monokulturindstilling.
På grund af deres terminale differentierede tilstand og manglende proliferationskapacitet er det vanskeligt at studere podocytter ex vivo. Ved hjælp af betinget udødeliggørelse af primære podocytter er det muligt at overvinde denne begrænsning ved indsættelse af en termofølsom switch, hvilket resulterer i en cellekulturmodel, hvor celler formerer sig ved 33 ° C og differentierer ved 37 ° C13,14. Selvom disse ciPodocytter har et stort potentiale for podocytforskning, er der begrænsninger, som manglen på markørekspression, dedifferentieret morfologi og manglende dannelse af fodprocesser15,16.
Differentieringen af podocytter fra patientafledte somatiske celler muliggør generering og sammenligning af syge podocytter med sunde kontrolceller ex vivo. Dette gør det muligt for os at studere podocytskader på grund af mutationer i podocytspecifikke gener. Desuden har arbejdet med hiPSC’er potentialet til at skabe tredimensionelle cellekultursygdomsmodeller, eller rettere organoider43,44. Samdyrkning af hiPSC-afledte podocytter med andre glomerulære celler, som glomerulære endotelceller eller mesangialceller, kan føre til ny indsigt i intercellekommunikation i sundhed og glomerulær sygdom.
Desuden kan karakterisering og behandling af de patientspecifikke podocytter udføres ex vivo i high-throughput analyse. Den individualiserede tilgang åbner mulighed for at undersøge nye terapeutiske mål for specifikke mutationer og udføre individualiseret medicin i fremtiden.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af det tværfaglige center for klinisk forskning (IZKF) ved Friedrich-Alexander Universitet Erlangen-Nürnberg med bevillingsnummer M4-IZKF-F009 givet til Janina Müller-Deile og af Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) under projektnavnet STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, bevillingsnummer 01GM2202D givet til Janina Müller-Deile. Vi takker Annalena Kraus for støtten til at tage SEM-billeder.
0.2 µm sterile filter | Rotilab | P668.1 | for sterilization of differentiation medium |
all-trans retinoic acid | Stem Cell Technologies | 72262 | supplement for differentiation |
B27 supplement (50 x), serum free | Gibco | 17504044 | supplement for serum-free differentiation medium |
BG iMatrix-511 Silk | biogems | RL511S | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
Bovine serum albumin (BSA) | Roth | 8076.4 | |
CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL | Greiner bio-one | 82050-856 | cell culture plastics suitable for fibroblast culture |
CHIR99021 (5 mg) | Sigma-Aldrich | 252917-06-9 | supplement for differentiation |
Corning Matrigel hESC qualified matrix | Corning | 354277 | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix) |
countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | to count cells |
countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | to count cells | |
cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white | Sarstedt | 72380 | cryovials for freezing of cells |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Roth | A994.1 | for fibroblast freezing medium |
DMEM/F12 (1:1) (1 x) | Gibco | 11320074 | basic medium for differentiation |
DMEM/F12 + Glutamax | Gibco | 10565018 | basic medium for fibroblast medium |
EVOS M5000 Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | phase contrast microscope |
fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) | PAN Biotech | P301902 | serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium |
fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile | Fisherbrand | FB104 | cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap) |
fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | mounting medium containing dapi |
gauge needle (0.6 x 30 mm) | BD Microlance3 | 300700 | for separation of hiPSC colonies into small pieces |
human Recombinant Activin A Protein | 78001.1 | Stem cell technologies | supplement for differentiation |
human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) | Peprotech | 120-03P | supplement for differentiation |
human VEGF-165 Recombinant Protein | Thermo Scientific | PHC9394 | supplement for differentiation |
insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) | Gibco | 41400045 | supplement for podocyte maintenance medium |
LB medium | Roth | X964.1 | for sterility test of hiPSC culture |
lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit | Sigma Aldrich | MP0035-1KT | commercial mycoplasma detection kit |
microscope slides | Diagonal GmbH & Co.KG | 21,102 | |
microtube 1.5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
mTeSR1 Complete Kit | Stem Cell Technologies | 85850 | basic medium for serum-free hiPSC culture medium |
nalgene freezing container Mr.Frosty | Roth | AC96.1 | to ensure optimal freezing conditions |
normal goat serum | abcam | ab 7481 | for preincubation solution and antibody diluent |
nunc 24 well plates | Thermo Scientific | 142485 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc 48 well plates | Thermo Scientific | 152640 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc 6 well plates | Thermo Scientific | 140685 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc EasYDish Dishes 100 mm | Thermo Scientific | 150466 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 167008 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nutriFreez D10 Cryopreservation Medium | Sartorius | 05-713-1E | serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells |
Opti-MEM | Gibco | 11058021 | electroporation medium |
pCXLE-hMLN | Addgene | #27079 | plasmid for episomal reprogramming |
pCXLE-hOCT3/4 plasmid | Addgene | #27077 | plasmid for episomal reprogramming |
pCXLE-hSK plasmid | Addgene | #27078 | plasmid for episomal reprogramming |
penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | to avoid bacterial contamination |
plastic coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes |
ROTI Histofix | Roth | P087.3 | commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells |
RPMI 1640 + L-Glutamine | Gibco | 21875034 | basic medium for podocyte maintenance medium |
staining chamber StainTray Black lid | Roth | HA51.1 | |
stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs |
sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) | Gibco | 14190094 | used for washing and coating |
sterile water | Roth | T1432 | |
syringe without needle 20 mL | BD Plastipak | 300629 | to filter sterilize differentiation medium |
TC dish 100 mm | Sarstedt | 8,33,902 | sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture |
TC dish 35 mm | Sarstedt | 8,33,900 | sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy |
triton X 100 | Roth | 3051.3 | for preincubation solution |
trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | to count cells |
trypsin-EDTA (10 x) | Biowest | X0930-100 | dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells |
tube 15 mL | Greiner bio-one | 188271-N | |
tube 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
vitronectin ACF | Sartorius | 05-754-0002 | extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
Y-27632 dihydrochloride (10 mg) | Tocris | 1254 | to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting |
Primary antibodies | |||
OCT4 | Stem Cell Technologies | 60093.1 | pluripotency marker, dilution 1:200 |
SSEA-4 | Stem Cell Technologies | 60062FI.1 | pluripotency marker, dilution 1:100 |
Ki67 | Abcam | ab15580 | proliferation marker, dilution 1:300 |
synaptopodin | Proteintech | 21064-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:200 |
nephrin | Progen | GP-N2 | podocyte-specific marker, dilution 1:25 |
podocin | proteintech | 20384-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:100 |
Secondary antibodies | |||
goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21435 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A31634 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |