Génération de podocytes dérivés de patients à partir de biopsies cutanées

Les podocytes sont des cellules épithéliales rénales post-mitotiques spécialisées qui forment la barrière de filtration glomérulaire du rein avec la membrane basale glomérulaire (GBM), les cellules endothéliales glomérulaires et le glycocalyx. Phénotypiquement, les podocytes sont constitués d’un corps cellulaire et d’extensions membranaires primaires entraînées par microtubules, ainsi que d’extensions secondaires appelées processus du pied ^1,2. La barrière de filtration glomérulaire qui filtre l’urine du sang est construite en endothélium fenêtré, GBM, et un type spécialisé de jonction intercellulaire qui relie les processus voisins du pied podocytaire, appelé diaphragme à fente de podoctyes³. Dans des conditions saines, les protéines plus grosses que l’albumine sont retenues de la barrière de filtration en raison de leur taille et de leur charge⁴.

Les mutations dans les gènes spécifiques du cytosquelette ou du podocyte, ainsi que les facteurs circulants affectant les voies de signalisation des podocytes, sont connus pour induire l’effacement, le détachement ou l’apoptose des podocytes, entraînant une protéinurie et une sclérose glomérulaire. En particulier, le réarrangement cytosquelettique, les changements de polarité des podocytaires ou les dommages aux processus du pied avec une perte associée des jonctions fendues sont essentiels⁵. En raison de leur statut différencié en phase terminale, les podocytes peuvent difficilement être remplacés après le détachement du GBM. Cependant, si les podocytes sont attachés au GBM, ils peuvent encore se remettre de l’effacement et de la réforme des processus interdigitaux du pied ^6,7,8. Une meilleure compréhension des événements qui conduisent à des dommages aux podocytaires dans divers troubles glomérulaires peut fournir de nouvelles cibles thérapeutiques qui aideront à développer des traitements pour ces maladies. Les lésions podocytaires sont caractéristiques de différentes maladies glomérulaires, notamment la glomérulosclérose segmentaire focale (FSGS), la néphropathie diabétique, la maladie à changement minimal et la glomérulonéphropathie membraneuse, nécessitant des modèles ex vivo fiables de podocytes pour étudier les mécanismes pathologiques et les approches de traitement potentielles de ces maladies ^9,10. Les podocytes peuvent être étudiés ex vivo par culture cellulaire primaire classique basée sur l’isolement des glomérules par tamisage différentiel¹¹. Cependant, en raison de l’état de différenciation terminale avec une capacité de prolifération limitée, la plupart des chercheurs utilisent des lignées cellulaires ciPodocytes de souris ou humaines qui expriment des variantes sensibles à la température du grand antigène T SV40. Alternativement, les ciPodocytes sont isolés à partir de souris transgéniques hébergeant le gène immortalisant SV40 Tag ^1,12.

Les CiPodocytes prolifèrent à 33 °C, mais entrent en arrêt de croissance et commencent à se différencier à 37 °C^13,14. Il faut garder à l’esprit que les données expérimentales obtenues avec ces cellules doivent être interprétées avec une certaine prudence, car les cellules sont générées à l’aide d’une insertion de gène non naturelle¹⁵. Comme ces cellules hébergent un gène immortalisant, la physiologie cellulaire est altérée en raison de la prolifération en cours¹². Les lignées cellulaires de podocytes générées par cette approche ont récemment été remises en question, car les ciPodocytes de souris, d’humains et de rats expriment moins de 5% de synaptopodine et de néphrine au niveau des protéines, ainsi que NPHS1 et NPHS2 au niveau de l’ARNm par rapport à l’expression glomérulaire¹⁶. De plus, la plupart des lignées cellulaires de podocytes n’expriment pas la néphrine^17,18. Chittiprol et al. ont également décrit une différence significative dans la motilité cellulaire et les réponses à la puromycine et à la doxorubicine dans les ciPodocytes¹⁶. Les podocytes peuvent être trouvés dans l’urine après détachement du GBM dans différentes maladies glomérulaires 19,20,21,22. Les podocytes urinaires viables peuvent être cultivés ex vivo jusqu’à 2-3 semaines, mais la plupart des cellules subissent une apoptose^23,24. Fait intéressant, les podocytes ne se trouvent pas seulement dans l’urine des patients atteints de maladie glomérulaire, mais aussi dans l’urine de sujets sains, très probablement lorsqu’ils sont sénescents à nouveau avec un potentiel limité de réplication en culture²⁴. De plus, le nombre de podocytes d’origine urinaire est limité et les cellules se dédifférencient en culture, montrent moins de processus du pied, changent de morphologie et, surtout, ont une capacité de prolifération limitée. L’expression des gènes spécifiques aux podocytes est absente, disparaît en quelques semaines ou varie entre ces clones cellulaires. Certaines cellules positives pour le marqueur spécifique du podocyte ont co-exprimé le marqueur de cellules épithéliales tubulaires ou de myofibroblastes et de cellules mésangiales, ce qui suggère une dédifférenciation et/ou une transdifférenciation des podocytes urinaires en culture^24,25.

Récemment, la génération de lignées cellulaires ciPodocyte dérivées de l’urine de patients et de volontaires sains par transduction avec un antigène T SV40 de grande taille thermosensible et hTERT a été décrite²⁶. L’expression de l’ARNm pour la synaptopodine, la nestine et la protéine associée à CD2 a été détectée, mais l’ARNm de podocine était absent dans tous les clones. En plus des problèmes avec les podocytes urinaires, ces cellules contiennent également le gène immortalisant inséré, ce qui entraîne les inconvénients discutés ci-dessus.

En revanche, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPhi) ont une énorme capacité à s’auto-renouveler et à se différencier en plusieurs types de cellules dans des conditions appropriées. Il a déjà été démontré que les CSPhi peuvent servir de source presque illimitée de podocytes^27,28.

Ici, un protocole en deux étapes pour générer des podocytes spécifiques au patient à partir de fibroblastes dermiques de biopsies cutanées avec reprogrammation épisomique ultérieure en CSPhi et une différenciation finale en podocytes dérivés des CSPhi est décrit (Figure 1).

Figure 1 : Protocole de génération de podocytes dérivés de l’hiPSC spécifiques au patient. Vue d’ensemble graphique du protocole de génération de podrocytes spécifiques au patient à partir de fibroblastes dermiques d’une biopsie cutanée par reprogrammation en CSPhi et différenciation en podocytes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans un premier temps, les fibroblastes dermiques somatiques ont été dépassés par une biopsie cutanée et reprogrammés en CSPhi en utilisant une méthode sans intégration par électroporation avec des plasmides exprimant les facteurs de transcription OCT3/4, KLF4, SOX2 et c-MYC 29,30,31. Les colonies de CSP émergentes ont ensuite été sélectionnées et élargies. La différenciation a commencé par l’induction de la lignée mésodermique par l’activation de la voie de signalisation WNT, suivie de la génération de cellules progénitrices de néphron qui étaient encore capables de proliférer. Enfin, les cellules ont été différenciées en podocytes. Dans cette procédure, nous avons modifié et combiné des protocoles précédemment publiés pour la reprogrammation épisomique pour la génération de CSPhi par Bang et ^al.32 et Okita et al.33, ainsi qu’un protocole pour la différenciation des CSPhi en podocytes par Musah et al.28,34,35.

En effet, les podocytes générés par notre protocole avaient un phénotype plus proche des podocytes in vivo, concernant le développement d’un réseau distinct de processus primaires et secondaires du pied et l’expression de marqueurs spécifiques aux podocytes, comme la synaptopodine, la podocine et la néphrine. Avec l’utilisation de podocytes dérivés de l’hiPSC, le bagage génétique du patient est maintenu pendant la reprogrammation et la différenciation. Cela permet la modélisation de la maladie des podocytes spécifique au patient et la découverte de substances thérapeutiques potentielles ex vivo dans un nombre presque illimité de cellules. De plus, ce protocole est peu invasif, rentable, acceptable sur le plan éthique et peut faciliter de nouvelles voies pour le développement de médicaments.

Le protocole a été approuvé par le comité d’éthique de l’Université Friedrich-Alexander d’Erlangen-Nuremberg (251_18B), et tous les patients et probands ont donné leur consentement écrit. Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes. Pour la composition de tous les milieux et solutions utilisés ici, voir le tableau 1.

1. Excroissance des fibroblastes dermiques à partir d’une biopsie cutanée à l’emporte-pièce

1. Transférer la biopsie cutanée à l’emporte-pièce dans un tube conique stérile de 15 ml contenant 10 ml de milieu fibroblastique préchauffé.
2. Retirer le milieu et laver la biopsie cutanée trois fois avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x stérile préchauffée. Transférer la biopsie cutanée à l’aide d’une pince stérile sur une plaque de culture cellulaire de 10 cm et la couper en trois ou quatre morceaux avec un scalpel stérile, en laissant l’épiderme et le derme.
3. Transférer chaque morceau dans une boîte de culture cellulaire en plastique stérile de 35 mm et presser doucement sur la boîte de culture. Enlever l’excès de milieu autour des morceaux de biopsie. Laisser sécher pendant 5-10 minutes jusqu’à ce que le liquide s’évapore et que la biopsie soit fixée au plastique de culture cellulaire.
4. Ajouter 1 mL de milieu fibroblastique goutte à goutte avec une pipette de 1 000 μL autour de la biopsie et remplir soigneusement jusqu’à un volume final de 3 mL. Cultiver à 37 °C, 5% de CO₂ pendant 7 jours sans nourrir ni déplacer le plat. Changer soigneusement le milieu en milieu de fibroblastes frais et préchauffé. Après 7 jours, les fibroblastes fusiformes devenus trop grands peuvent être surveillés autour de la biopsie cutanée à l’aide d’un microscope à contraste de phase³⁶.
   REMARQUE: Lorsque les fibroblastes devenus grands atteignent le bord de la boîte, procédez à nouveau à l’étape 1.3 pour générer un autre lot de fibroblastes.
5. Pour l’expansion des fibroblastes dépassés, laver avec 2 mL de 1x PBS préchauffé, dissocier les fibroblastes avec 1 mL de 1x acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et incuber pendant 5 min à 37 °C, 5% CO₂. Transférer les cellules détachées dans un tube conique de 15 ml et laver la boîte de culture cellulaire avec 2 ml de milieu fibroblastique frais et préchauffé.
6. Introduire le produit de lavage dans le tube pour neutraliser l’agent de dissociation et centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 20 °C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de milieu fibroblastique frais et préchauffé. Compter les cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer ou d’un compteur cellulaire automatisé à l’aide de bleu de trypan et semer 2,5 x 10 3 à 5 x 10³ fibroblastes par cm² dans des flacons de culture de cellules fraîches.
7. Replacez les flacons dans l’incubateur et répartissez les cellules uniformément en déplaçant les flacons trois fois dans chaque direction. Le lendemain, remplacez le milieu par un milieu de fibroblastes frais et préchauffé. Changez le milieu deux fois par semaine et divisez-le lorsque les fibroblastes atteignent environ 80% de confluence.

2. Congélation des fibroblastes dermiques

1. Pour congeler les fibroblastes, lavez-les avec 5 mL de 1x PBS préchauffé. Aspirer le PBS et dissocier les fibroblastes avec 4 mL de 1x trypsine-EDTA. Replacer la fiole dans l’incubateur et incuber pendant 5-7 min à 37 °C à 5% de CO₂. Surveillez le détachement à l’aide d’un microscope à contraste de phase et tapotez contre le côté de la fiole pour détacher les cellules.
2. Transférer les cellules détachées dans un tube conique de 15 mL. Laver le ballon de culture cellulaire avec 5 ml de milieu fibroblastique frais préchauffé. Inscrire le produit de lavage dans le tube conique et centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 20 °C.
3. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 2 mL de milieu fibroblastique frais préchauffé. Compter les cellules et transférer 1 x 10⁶ cellules dans un nouveau tube conique. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 20 °C.
4. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de milieu de congélation de fibroblastes froids composé de 90 % de sérum de veau fœtal et de 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO). Transvaser dans un cryovial, placer dans un récipient congélateur et congeler toute la nuit à -80 °C. Pour un stockage à long terme, placez le cryovial dans un réservoir d’azote liquide le lendemain.

3. Reprogrammation épisomale des fibroblastes pour générer des CSPh

1. Pour la reprogrammation épisomique, utilisez 1,5 x 10⁶ fibroblastes du passage 4 au passage 8. Pour atteindre ce nombre de cellules, utilisez deux à trois flacons de 250 ml avec environ 70% de confluence.
2. La veille de la reprogrammation, divisez les fibroblastes dans un rapport de 1:2 pour assurer leur état prolifératif. Par conséquent, aspirer le milieu et laver les flacons avec 5 mL de 1x PBS préchauffé par fiole. Aspirer le PBS et dissocier les fibroblastes avec 4 mL de 1x trypsine-EDTA. Replacer les flacons dans l’incubateur et incuber pendant 5-7 min à 37 °C et 5% de CO₂. Surveillez le détachement à l’aide d’un microscope à contraste de phase et tapotez contre le côté de la fiole pour détacher les cellules de la surface en plastique.
3. Transférer les cellules détachées dans un tube conique de 50 ml et laver les flacons de culture cellulaire avec 5 ml de milieu fibroblastique frais et préchauffé. Inscrire le produit de lavage dans le tube conique et centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 20 °C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 6 mL de milieu fibroblastique frais préchauffé.
4. Préparer six nouvelles fioles de culture cellulaire en ajoutant 5 mL de milieu de fibroblastes frais préchauffés par flacon. Ajouter 1 mL de suspension cellulaire de fibroblastes dans chaque fiole. Replacez les flacons dans l’incubateur et répartissez les cellules uniformément en déplaçant les flacons trois fois dans chaque direction.
5. Pour la reprogrammation épisomique, enduire deux plaques de culture cellulaire de 10 cm adaptées à la culture de CSPhi avec 4 mL de solution d’enrobage à froid par plaque. Incuber les plaques pendant 1 h à 37 °C.
   REMARQUE : Pour mettre en culture des CSPh, différents plastiques de culture cellulaire et un revêtement supplémentaire de la matrice extracellulaire sont nécessaires (voir le tableau des matériaux).
6. Retirer le média des fibroblastes et laver avec 10 ml de 1x PBS préchauffé par fiole. Aspirer le PBS et dissocier les fibroblastes avec 4 mL de 1x trypsine-EDTA par fiole en incubant pendant 5-7 min à 37 °C. Surveiller le détachement à l’aide d’un microscope à contraste de phase et, si nécessaire, tapoter contre le côté de la fiole pour détacher les cellules de la surface en plastique.
7. Transférer les cellules détachées dans un tube conique de 50 mL. Lavez les flacons vides avec 6 mL de milieu fibroblastique préchauffé pour recueillir les cellules restantes et accumuler dans le tube conique. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 20 °C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 3 mL de 1x PBS frais et préchauffé.
8. Compter les cellules et transférer 1,5 x 10⁶ fibroblastes dans un nouveau tube conique. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 20 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 5 mL de milieu d’électroporation et centrifuger à nouveau. Pendant ce temps, aspirez la solution d’enrobage des plaques de culture cellulaire enrobées de 10 cm et ajoutez 7 mL de milieu fibroblastique préchauffé.
9. Après centrifugation, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans un milieu d’électroporation à une concentration de 1,5 x 10⁶ cellules dans 250 μL. Transférer la suspension cellulaire de 250 μL dans une cuvette d’électroporation avec une distance d’intervalle de 4 mm (voir le tableau des matériaux).
10. Préparer un mélange de transfection plasmidique en ajoutant 4 μg de chaque plasmide (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) à un volume total de 50 μL de milieu d’électroporation. Transférer dans la cuvette et mélanger en agitant doucement. Électroporate avec une impulsion à 280 V.
11. Couper une pointe de pipette à l’aide de ciseaux stériles et transférer 125 μL de fibroblastes électroporés dans chacune des plaques de culture cellulaire de 10 cm préparées. Répartir les cellules en agitant les plaques trois fois dans toutes les directions et les remettre dans l’incubateur. Incuber pendant une nuit à 37 °C avec 5% de CO₂ sans perturbation.
12. Pour éliminer les cellules mortes, remplacez le milieu le lendemain par 7 ml de milieu fibroblastique frais et préchauffé. Changez le milieu en milieu de culture hiPSC 2 jours après l’électroporation et remplacez-le tous les deux jours pendant les 20 jours suivants.

4. Sélection, expansion et contrôle de la qualité des CSPi générées

1. Surveiller les cellules quotidiennement pendant au moins 20 jours à l’aide d’un microscope à contraste de phase avec un objectif 10x ou 20x pour observer la formation de colonies de CSPhi après électroporation. Si les colonies de CSPhi ont un diamètre d’environ 300 μm avec des bordures distinctes et que les CSPh présentent un rapport noyau-corps élevé, les colonies de CSPhi sont prêtes à être sélectionnées par prélèvement (Figure 2B, C et Figure 3).
2. Avant la cueillette, enduire une plaque de 96 puits adaptée à la culture hiPSC avec 100 μL de solution de revêtement par puits et incuber pendant 1 h à 37 °C. Pendant l’incubation, marquez les colonies d’intérêt au fond de la boîte de culture cellulaire avec un stylo. Pour la préparation finale de la plaque de 96 puits, retirer la solution de revêtement et ajouter 100 μL de milieu de culture hiPSC préchauffé contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y27632 à chaque puits.
3. Laver les cellules avec 1x PBS préchauffé et ajouter un milieu de culture hPSC frais et préchauffé contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y27632 avant de prélever pour éliminer les cellules mortes. Pour choisir des colonies de hiPSC, utilisez une aiguille de calibre et divisez les colonies de hiPSC en petits morceaux en dessinant une grille dans chaque colonie.
4. À l’aide d’un microscope à contraste de phase, vérifiez que les colonies sont divisées avec succès en morceaux. Transférez-les avec une pipette de 100 μL dans la plaque préparée à 96 puits. Tenez la pipette verticale au-dessus de la colonie sans toucher les cellules pour éviter les rayures et la perte de la colonie.
5. Placez la plaque de 96 puits dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂ et laissez les cellules se fixer toute la nuit sans perturbation. Gardez les plats avec le mélange de fibroblastes et de hiPSC, au cas où la cueillette ne réussirait pas. Par conséquent, retirez l’inhibiteur de ROCK Y27632 en changeant le milieu pour le milieu de culture hiPSC et replacez les plaques dans l’incubateur.
6. Le lendemain, changer le milieu de la plaque de 96 puits à 200 μL de milieu de culture hPSC frais et le changer tous les deux jours. Surveillez la plaque de 96 puits le lendemain et marquez les puits avec des clones choisis avec succès.
   REMARQUE: Si les clones hiPSC prélevés ne sont pas entièrement sélectionnés après le premier essai et que les fibroblastes peuvent être trouvés dans le puits, répétez le prélèvement dans le puits 96 ou grattez les fibroblastes de la plaque.

5. Extension des clones hiPSC sélectionnés

1. Surveillez les clones hiPSC à l’aide d’un microscope à contraste de phase. Si les hiPSC sélectionnés atteignent environ 70% de confluence, les clones hiPSC sont prêts pour l’expansion.
2. Enduire une plaque de 48 puits adaptée à la culture hiPSC de 250 μL de solution de revêtement par puits pendant 1 h à 37 °C. Remplacer la solution d’enrobage par 200 μL de milieu de culture frais et préchauffé contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y27632.
3. Pour détacher les CSPh de la plaque de 96 puits, grattez la surface en plastique avec un embout de pipette de 1 000 μL. Transférer les CSPh détachées de la plaque de 96 puits vers une plaque de 48 puits. Changer le milieu le lendemain pour un milieu de culture de CSPhi frais et préchauffé pour éliminer les cellules mortes et l’inhibiteur ROCK Y27632.
4. Si les clones de hiPSC atteignent environ 70% de confluence, transférez les hiPSC dans une plaque de 24 puits. Par conséquent, enduisez une plaque de 24 puits adaptée à la culture hiPSC avec 400 μL de solution de revêtement par puits pendant 1 h à 37 °C. Remplacer la solution d’enrobage par 400 μL de milieu de culture frais et préchauffé de CSPhi contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y27632. Aspirer le milieu des 48 puits et laver avec 500 μL de 1x PBS préchauffé.
5. Remplacer le PBS par 100 μL de solution de décollement de cellules enzymatiques contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y27632 et incuber à 37 °C pendant 4 min. Rincer les CSPh de la plaque à l’aide d’une pipette de 1 000 μL. Transférer les cellules dissociées dans un tube conique de 15 mL. Laver la plaque vide de 48 puits avec un milieu de culture hiPSC contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y27632 et mettre en pool dans le tube conique.
6. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 20 °C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les CSPhi dans 1 mL de milieu de culture des CSPhi contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y27632 et transférer dans une plaque de 24 puits. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C à 5% de CO₂ et répartir les cellules en agitant la plaque trois fois dans tous les sens. Laissez les cellules s’attacher pendant la nuit sans perturbation.
7. Le lendemain, changer le milieu pour un milieu de culture hiPSC sans inhibiteur de ROCK Y27632.
   REMARQUE: Si les clones hiPSC atteignent une confluence d’environ 70%, transférez les hiPSC sur une plaque de 12 puits en répétant les étapes 5.4 à 5.7 avec des volumes accrus adaptés à un format à 12 puits. Si les hiPSC de la plaque à 12 puits atteignent une confluence d’environ 70%, transférez les clones de hiPSC sur une plaque à 6 puits avec des volumes accrus pour un format à 6 puits.

6. Congélation des clones hiPSC sélectionnés

1. Pour congeler les clones hiPSC sélectionnés, aspirez le milieu à partir d’une plaque à 6 puits. Lavez les puits avec 2 ml de 1x PBS. Aspirer et dissocier les CSPh avec 1 mL de solution de détachement cellulaire enzymatique contenant 10 μM Y27632. Replacer la plaque dans l’incubateur et incuber pendant 4 min à 37 °C et 5% de CO₂.
2. Rincer les CSPh de la plaque à l’aide d’une pipette de 1 000 μL et transférer les cellules détachées dans un tube conique de 15 mL. Laver la plaque avec 2 mL de milieu de culture frais et préchauffé contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y27632. Piscine dans le tube conique et centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min à 20 °C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 2 mL de milieu de culture frais et préchauffé de l’hiPSC contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y27632.
3. Compter les cellules et transférer 1 x 10⁶ cellules dans un nouveau tube conique. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 20 °C. Aspirer le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de congélation hiPSC froid et sans sérum et congeler dans un cryovial à l’aide d’un contenant de congélation pendant une nuit à -80 °C. Pour un stockage à long terme, placez le cryovial dans un réservoir d’azote liquide le lendemain.

7. Contrôle de la qualité HiPSC

1. Caractérisation de la morphologie des hiPSC
   1. Vérifiez la morphologie caractéristique de hiPSC à l’aide d’un microscope à contraste de phase avec un objectif 20x. Après reprogrammation, la morphologie cellulaire passe de longs fibroblastes fusiformes à de petits CSPh ronds, présentant un rapport noyau / corps élevé se développant dans des colonies avec des frontières distinctes (Figure 2C).
   2. Si les colonies de CSPhi deviennent trop denses et qu’une différenciation spontanée se produit, gratter les parties différenciées de la plaque à l’aide d’une pointe de pipette (Figure 3). Étant donné que les CSPh ont un taux de prolifération élevé, nourrissez les cultures de CSPhi tous les jours avec un milieu d’alimentation frais et préchauffé.
2. Caractérisation des marqueurs de pluripotence par coloration par immunofluorescence
   1. Pour vérifier le marqueur de pluripotence des CSPh générées par coloration par immunofluorescence, placer les lamelles de couverture en plastique dans une plaque de 24 puits et enduire de 250 μL de solution de revêtement pendant 1 h à 37 °C et 5% de CO₂. Remplacer la solution d’enrobage par 1 mL de milieu de culture hiPSC préchauffé contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y27632.
   2. Graine 1,9 x 10⁴ CSPh dissociées par 24 puits. Laisser les CSPhi se fixer pendant la nuit à 37 °C et 5 % de CO₂ sans perturbation. Voir les étapes 5.4 à 5.6 pour la dissociation des CSPh. Remplacer le milieu le lendemain par un milieu de culture hiPSC sans inhibiteur de ROCK Y27632.
   3. Pour la coloration, laver les cellules avec 1 mL de PBS 1x préchauffé et ensuite fixer les CSPhi avec 4% de paraformaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante. Laver les CSPh fixes avec 1x PBS et bloquer les sites de liaison non spécifiques avec 200 μL de solution de préincubation par puits pendant 1 h à température ambiante. Diluer les anticorps primaires Ki67 (1:300), OCT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) dans un diluant d’anticorps.
   4. Nettoyez une feuille de plastique avec de l’éthanol à 70% et placez-la dans une chambre de coloration remplie d’un réservoir d’eau. Placer des gouttelettes de dilutions d’anticorps primaires de 30 μL sur la feuille. Placer les échantillons fixés à l’envers dans la dilution et incuber pendant la nuit à 4 °C.
   5. Le lendemain, laver les échantillons trois fois avec 1x PBS pendant 5 minutes et placer 30 μL de gouttelettes de dilutions d’anticorps secondaires (1:1 000) sur des points propres sur la feuille. Placez les glissières de couvercle à l’envers dans la dilution. Incuber pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
   6. Après l’incubation, laver trois fois avec 1x PBS pendant 5 min. Montez les échantillons sur des lames de verre dans le support de montage contenant DAPI. Laisser sécher pendant la nuit à température ambiante et dans l’obscurité et imager les échantillons à l’aide d’un microscope confocal (Figure 4).
3. Exclusion de la contamination par les bactéries et les mycoplasmes
   1. Pour exclure la contamination bactérienne, transférer 500 μL de CSPh dissociées à 5 mL de milieu Luria-Bertani (LB) préchauffé. Voir les étapes 5.4 à 5.6 pour la dissociation des CSPh. Incuber pendant une nuit à 37 °C. Si le milieu LB semble trouble, une contamination bactérienne s’est probablement produite. Jetez les cellules.
   2. Pour exclure la contamination par les mycoplasmes, prélever le milieu qui n’a pas été remplacé pendant 2 jours dans 6 puits contenant environ 90% de CSPh confluentes. Utiliser la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR) pour détecter la contamination par les mycoplasmes. De nombreux kits commerciaux de détection de mycoplasmes sont disponibles à cet effet.

8. Différenciation des CSPhi en podocytes

1. Préparation et stockage des facteurs de croissance
   1. Pour préparer une concentration mère de 10 mM Y27632, reconstituer 10 mg de Y27632 (poids moléculaire de 320,26 g/mol) dans 3,12 mL d’eau stérile. Conserver 100 μL d’aliquotes à -20 °C et diluer 1:1 000 dans un milieu de culture cellulaire pour atteindre une concentration finale de 10 μM.
   2. Pour préparer une concentration mère de 30 mM CHIR99021, reconstituer 5 mg de CHIR99021 (poids moléculaire de 465,34 g/mol) dans 358,2 μL de DMSO stérile. Conserver 50 μL d’aliquotes à -20 °C et diluer 1:10 000 dans un milieu de culture cellulaire pour atteindre une concentration finale de 3 μM.
   3. Pour préparer une concentration mère de 100 μg/mL d’activine A, reconstituer 100 μg d’activine A dans 1 mL de 1x PBS contenant 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA). Conserver 100 μL d’aliquotes à -20 °C et les diluer au 1:2 000 dans un milieu de culture cellulaire pour atteindre une concentration finale de 50 ng/mL.
   4. Pour préparer une concentration mère de 100 μg/mL de protéine morphogénique osseuse 7 (BMP7), reconstituer 100 μg de BMP7 dans 1 mL d’eau stérile contenant 0,1 % de BSA. Conserver 100 μL d’aliquotes à -20 °C et les diluer au 1:2 000 dans un milieu de culture cellulaire pour atteindre une concentration finale de 50 ng/mL.
   5. Pour préparer une concentration de 100 μg/mL de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), reconstituer 100 μg de VEGF dans 1 mL d’eau stérile. Conserver 100 μL d’aliquotes à -20 °C et diluer 1:4 000 dans un milieu de culture cellulaire pour atteindre une concentration finale de 25 ng/mL.
   6. Pour préparer une concentration mère de 10 mM d’acide rétinoïque tout-trans, reconstituer 10 mg d’acide rétinoïque tout-trans dans 3,33 mL de DMSO stérile. Conserver 100 μL d’aliquotes à -20 °C et diluer 1:100 dans un milieu de culture cellulaire pour atteindre une concentration finale de 0,5 μM.
2. Activation de la voie de signalisation WNT pour induire la lignée du mésoderme
   1. Pour la différenciation des CSPhi en podrocytes dérivés des CSPhi, enrober des plaques ou des flacons de culture cellulaire adaptés à la culture de CSPhi avec solution d’enrobage pendant 1 h à 37 °C et 5 % de CO₂. Le volume total de la solution d’enrobage est de 1 mL par plaque de culture à 6 puits ou de 4 mL par plaque de culture cellulaire de 10 cm.
   2. Aspirer le milieu et laver les CSPh avec 1x PBS préchauffé. Aspirer le PBS et ajouter une solution de détachement de cellule enzymatique contenant 10 μM Y27632 à un volume total de 1 mL par plaque de culture à 6 puits ou de 4 mL par plaque de culture cellulaire de 10 cm.
   3. Replacer la plaque dans l’incubateur et incuber pendant 4 min à 37 °C et 5% de CO₂. Rincer les CSPh de la plaque à l’aide d’une pipette de 1 000 μL. Transférer les cellules détachées dans un tube conique.
   4. Laver la plaque avec un milieu de culture frais et préchauffé contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y27632. Regrouper le produit de lavage dans le tube conique pour neutraliser le réactif de dissociation. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 20 °C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 2 mL de milieu de culture frais et préchauffé de l’hiPSC contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y27632.
   5. Compter les cellules et semer 1 x 10⁴ hiPSCs/cm². Répartir les cellules en agitant trois fois dans toutes les directions. Laisser les CSPhi se fixer toute la nuit à 37 °C avec 5 % de CO₂ sans perturbation.
   6. Le lendemain, remplacer le milieu par 2 mL de milieu de différenciation du mésoderme préchauffé contenant 1x supplément de B27, 1% de pénicilline-streptomycine, 3 μM CHIR99021, 50 ng/mL d’activine A et 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y27632.
3. Différenciation en cellules progénitrices du néphron
   1. Après 2 jours, changer le milieu mésodermique à 2 mL de milieu de différenciation des progéniteurs de néphron préchauffé contenant 1x supplément de B27, 1 % de pénicilline-streptomycine, 3 μM CHIR99021, 50 ng/mL d’activine A et 50 ng/mL de BMP7 par plaque de culture à 6 puits ou 6 mL par plaque de culture cellulaire de 10 cm. Changez le support tous les deux jours pendant les 14 prochains jours.
      NOTE: Les cellules progénitrices du néphron prolifèrent et peuvent être passées et congelées après 7 jours de différenciation dans le milieu d’expansion du progéniteur du néphron.
   2. Pour diviser les cellules progénitrices du néphron, enduire de solution d’enrobage les plastiques de culture cellulaire adaptés à la culture hiPSC pendant 1 h à 37 °C. Remplacez la solution d’enrobage par un milieu d’expansion progéniteur de néphron. Aspirez le média et lavez les cellules avec 1x PBS préchauffé. Retirer le PBS et dissocier les cellules avec 1x trypsine-EDTA.
   3. Incuber pendant 5 min à 37 °C et 5% de CO₂. Surveiller le détachement des cellules à l’aide d’un microscope à contraste de phase. Si nécessaire, tapotez contre le côté du plastique pour détacher les cellules de la surface. Rincer les cellules de la plaque et transférer dans un tube conique. Laver la fiole ou la plaque vide avec le même volume de milieu d’expansion progéniteur du néphron préchauffé que le réactif de dissociation.
   4. Piscine le produit de lavage dans le tube conique. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 20 °C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 2 mL de milieu d’expansion progéniteur de néphron frais et préchauffé. Compter les cellules et semer 1,5 x 10⁴ cellules progénitrices du néphron par cm² pour une différenciation plus poussée.
      REMARQUE : Pour congeler les cellules progénitrices du néphron, remettre en suspension 1 x 10⁶ cellules dans 1 mL de milieu de cryoconservation sans sérum froid et transférer dans un cryovial. Congeler dans un récipient congélateur à -80 °C pendant la nuit et transférer dans un réservoir d’azote liquide pour un stockage à long terme.
   5. Replacez les plaques dans l’incubateur et répartissez les cellules uniformément par agitation trois fois dans toutes les directions. Changer le milieu le lendemain pour un milieu de différenciation des progéniteurs de néphron frais et préchauffé. Remplacer le milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules soient différenciées pendant 14 jours dans le milieu de différenciation des progéniteurs du néphron.
4. Différenciation terminale en podocytes dérivés de l’hiPSC
   1. Aspirer le milieu et ajouter 2 mL de milieu de différenciation des podocytes préchauffés contenant 1x supplément de B27, 1 % de pénicilline-streptomycine, 3 μM CHIR99021, 50 ng/mL d’activine A, 50 ng/mL de BMP7, 25 ng/μL de VEGF et 0,5 μM d’acide tout-rétinoïque par plaque de culture à 6 puits ou 6 mL par plaque de culture cellulaire de 10 cm. Replacez les plaques dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO₂. Changez le milieu tous les deux jours pendant 4 jours avec un milieu de différenciation des podocytes frais et préchauffé.
   2. Pour garder les hiPSC-podocytes en culture après différenciation, nourrir les cellules deux fois par semaine avec un milieu d’entretien podocytaire contenant 10% de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline-streptomycine et 0,1% d’insuline-transférrine-sélénium.
      REMARQUE: Les hiPSC-podocytes différenciés terminaux ne prolifèrent plus. Cependant, il est possible de les conserver en culture cellulaire jusqu’à 4 semaines.
5. Décongélation et expansion des cellules progénitrices du néphron congelées
   1. Enduire une nouvelle fiole de culture cellulaire en plastique adaptée à la culture hiPSC avec une solution d’enrobage pendant 1 h à 37 °C et 5 % de CO₂. Remplacer la solution d’enrobage par 5 mL de milieu d’expansion progéniteur de néphron.
   2. Préparer un tube conique de 15 mL avec 7 mL de milieu d’expansion progéniteur de néphron préchauffé. Décongeler les cellules congelées à 37 °C au bain-marie sans mouvement pendant environ 20 s. Retirez le cryovial du bain-marie lorsque la moitié des cellules sont décongelées et qu’il reste de la glace.
   3. Vaporiser le cryovial avec de l’éthanol à 70% et le placer dans une enceinte de biosécurité. Transférer les cellules décongelées dans le tube conique avec le milieu d’expansion progéniteur du néphron préchauffé. Utilisez une pipette de 1 000 μL et laissez les cellules couler très lentement le long de la paroi du tube.
   4. Laver le cryovide avec 1 mL de milieu d’expansion progéniteur de néphron pour recueillir les cellules restantes et les accumuler dans le tube conique. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 20 °C et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu d’expansion progéniteur de néphron frais et préchauffé.
   5. Transférer les cellules décongelées dans le ballon enrobé et changer le milieu le lendemain pour un milieu d’expansion progéniteur de néphron frais et préchauffé. Avant une différenciation ultérieure, laisser les cellules proliférer dans le milieu d’expansion progéniteur du néphron en changeant le milieu tous les deux jours, et procéder à partir de l’étape 8.3.5.

9. Caractérisation des podrocytes dérivés de l’hiPSC par coloration par immunofluorescence

1. Pour vérifier les podocytes différenciés pour le marqueur spécifique du podocyte par coloration par immunofluorescence, placer les lamelles de couverture en plastique dans une plaque de 24 puits et enduire de 250 μL de solution de revêtement pendant 1 h à 37 °C et 5% de CO2. Remplacer la solution d’enrobage par 1 mL de milieu d’expansion progéniteur de néphron préchauffé. Semence 2,5 x 104 cellules progénitrices de néphron dissociées par plaque de 24 puits. Voir les étapes 8.3.2 à 8.3.4 pour la dissociation des cellules progénitrices du néphron.
2. Laissez les cellules se fixer pendant la nuit à 37 °C et 5% de CO2 sans perturbation. Remplacer le milieu le lendemain par un milieu de différenciation des progéniteurs de néphron préchauffé.
3. Terminer la différenciation en changeant le milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules soient différenciées pendant un total de 14 jours dans le milieu de différenciation des progéniteurs du néphron et de 5 jours supplémentaires dans le milieu de différenciation des podocytaires.
4. Après la différenciation finale, laver les cellules avec 1 mL de PBS 1x préchauffé. Fixer les podocytes-hiPSC avec 4% de paraformaldéhyde pendant 10 min à température ambiante. Laver les cellules fixes avec 1x PBS et bloquer les sites de liaison non spécifiques avec 200 μL de solution de préincubation par puits pendant 1 h à température ambiante.
5. Diluer les anticorps primaires synaptopodine (1:200), podocine (1:100) et néphrine (1:25) dans un diluant d’anticorps et placer des gouttelettes de dilution d’anticorps primaires de 30 μL sur une feuille de plastique propre dans une chambre de coloration contenant un réservoir d’eau.
6. Placer les lames de couverture avec les podocytes hiPSC fixes à l’envers dans la dilution. Incuber pendant une nuit à 4 °C. Le lendemain, laver trois fois avec 1x PBS pendant 5 min. Diluer les anticorps secondaires (1:1 000) dans 1x PBS et placer des gouttelettes de dilution d’anticorps secondaires de 30 μL sur des points propres sur la feuille. Placez les glissières de couvercle à l’envers dans la dilution.
7. Incuber pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité. Après l’incubation, laver trois fois avec 1x PBS pendant 5 min. Montez les échantillons sur des lames de verre dans un support de montage contenant du DAPI. Laisser sécher toute la nuit à température ambiante et dans l’obscurité. Imagez les échantillons à l’aide d’un microscope confocal.

Avec ce protocole étape par étape qui combine la reprogrammation épisomique et la différenciation, il est possible de générer des podocytes porteurs de la mutation d’un patient dans un gène pertinent pour les podocytaires. Cela permet d’analyser ex vivo les altérations des podocytes spécifiques à la maladie. Le bagage génétique du patient est préservé pendant le protocole pendant toutes les différentes étapes cellulaires. En outre, la limitation du nombre insuffisant de cellules de podocytes non proliférants différenciés en phase terminale peut être surmontée en utilisant des podocytes dérivés de l’hiPSC. Bien qu’il faille plusieurs mois avant que les hiPSC-podocytes soient générés à partir de fibroblastes dermiques dépassés par reprogrammation en hiPSCs et différenciation ultérieure en podocytes, il est possible de congeler les cellules à trois étapes différentes du protocole (Figure 2). La congélation est possible pour les fibroblastes, les CSPhi et les cellules progénitrices du néphron après différenciation dans le milieu de différenciation des progéniteurs du néphron pendant 7 jours. Par conséquent, la génération de banques de cellules fonctionnelles et d’expériences à grande échelle est possible.

Figure 2 : Étapes individuelles du protocole à travers un microscope à contraste de phase. (A) Fibroblastes dermiques dépassés. (B) formation de colonies de hiPSC après reprogrammation. (C) Sélection de la culture hiPSC. (D) Cellules mésodermiques après 2 jours de différenciation. (E) Cellules progénitrices du néphron après 14 jours de différenciation dans le milieu de différenciation des progéniteurs du néphron. (F) Podrocytes dérivés de hiPSC différenciés en phase terminale. Les barres d’échelle représentent 300 μm (A, B, D-F) et 150 μm (C). Le flocon de neige met en évidence les étapes de gel possibles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Comme les podocytes générés dérivés de l’hiPSC traversent un long protocole avec des changements drastiques concernant le type cellulaire et la morphologie, la caractérisation cellulaire est obligatoire. La morphologie cellulaire, comme la taille et la forme cellulaire, ainsi que le comportement de croissance, peuvent être surveillés à l’aide d’un microscope à contraste de phase. Les fibroblastes présentent un long phénotype en forme de fuseau d’une taille de 150 μm à 300 μm (Figure 2A). Après reprogrammation, des colonies avec des hiPSC de 50 μm se produisent. Ces colonies présentent des frontières et des CSPhi distinctes qui se distinguent par un rapport noyaux/corps élevé et un taux de prolifération accru (figure 2C). Étant donné que les podocytes sont des cellules différenciées en phase terminale, le taux de prolifération diminue avec la différenciation progressive, et la morphologie cellulaire passe à des podocytes en forme d’étoile de 300 μm avec des processus proéminents du pied (Figure 2F).

La confluence est un point critique de la culture hiPSC, et une différenciation spontanée peut apparaître lorsque les colonies deviennent trop denses (Figure 3). Ces colonies doivent être enlevées avant le passage en grattant les parties touchées de la boîte de culture.

Figure 3 : Exemples de CSPh de qualité différente. Images de contraste de phase de (A) colonies de CSPh reprogrammées et (B) de CSPh sélectionnées, ainsi que (C) différenciation spontanée, (D, E) colonies non-CSPhi, et (F) culture de CSPhi trop dense. Les barres d’échelle représentent 300 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les différents types de cellules de ce protocole doivent être validés en ce qui concerne l’expression d’un marqueur spécifique. Après reprogrammation, les hiPSCs retrouvent leur capacité de pluripotence et expriment des marqueurs de prolifération et de pluripotence tels que SSEA4, OCT3/4 et Ki67 (Figure 4)38,39,40. On sait que la reprogrammation, ainsi que la longue culture des hiPSC et la différenciation, peuvent conduire à un caryotype anormal, ou plutôt induire des mutations41. Par conséquent, le fond génétique des cellules cultivées doit être surveillé au fil du temps et à différents passages par le g-banding et le séquençage de l’exome entier.

Figure 4 : Caractérisation des CSPh générées par coloration par immunofluorescence. Caractérisation des hiPSCs générées par coloration pour (A) le marqueur prolifératif Ki67, ainsi que les marqueurs de pluripotence (B) OCT3/4 et (C) SSEA4. Les barres d’échelle représentent 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Morphologiquement, les podocytes dérivés de l’hiPSC apparaissent en forme d’étoile et expriment un réseau distinct de longs processus primaires et secondaires du pied par rapport aux ciPodocytes (Figure 5). Les podocytes dérivés de l’HiPSC expriment des protéines marqueurs spécifiques aux podocytes comme la synaptopodine, la néphrine et la podocine (Figure 6A-C)42.

Figure 5 : Morphologie des podocytes dérivés de l’hiPSC par rapport aux ciPodocytes. Comparaison des podocytes dérivés de l’hiPSC (A,B) d’un donneur sain aux ciPodocytes (C,D) en ce qui concerne la morphologie cellulaire et les filopodies à l’aide d’un microscope à contraste de phase (A,C) et d’un microscope électronique à balayage (B,D). Les barres d’échelle représentent 150 μm (A,C) et 20 μm (B,D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Par conséquent, la comparaison des podocytes dérivés de l’hiPSC non seulement de donneurs sains, mais aussi de patients présentant des mutations dans des gènes spécifiques aux podocytes, permet une caractérisation individualisée de la mutation du patient ex vivo.

Figure 6 : Caractérisation d’un marqueur spécifique aux podocytes dans les podocytes et les ciPodocytes dérivés de l’hiPSC. Comparaison des podocytes dérivés de l’hiPSC (A-C) d’un donneur sain aux ciPodocytes (D-F) en ce qui concerne les protéines marqueurs spécifiques des podocytes, la synaptopodine (A, D), la néphrine (B, E) et la podocine (C, F). Les barres d’échelle représentent 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1. Composition de tous les milieux de culture cellulaire et solutions utilisées dans l’étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.